（劳动卫生与环境卫生学专业论文）微囊藻毒素分离鉴定及藻类污染预警系统的研究.pdf

郑州大学2 0 0 7 届硬士学位论文 中文摘要 微囊藻毒素分离鉴定及藻类污染预警系统的研究 硕士研究生杨松芹 导师崔留欣 郑州大学公共卫生学院环境卫生学教研室 郑州4 5 0 0 0 1 摘要 随着工农业生长的发展和人口的增长，大量的工业废水和生活污水源源不断的排放入 水体，使生活饮用水水源不断受到污染。水中氮、磷含量急剧增加，藻类获取了丰富的营养 物质而大量增殖，导致水华现象在世界各地频繁爆发。目前，淡水湖泊水华爆发的频率与严 重程度都呈现迅猛增长的趋势。美国、日本、印度、加拿大、南非、芬兰等国家都有湖泊、 水库水华爆发的报道。我国近2 0 年来水华现象异常严重，滇池、太湖、巢湖等曾多次爆发 水华。北方一些淡水湖泊也不同程度的受到了藻毒素的污染。水华不仅影响水体的感观性状， 而且对人类健康也产生了很大的威胁，已引起了全世界的关注和重视。 水华所产生的主要污染物质是各种藻毒素，由铜绿微囊藻、水华鱼腥藻、颤藻、念珠藻 等产生的微囊藻毒素是其中出现频率最高、毒性最强、急性危害最大的一种细胞内毒素。微 囊藻毒素不仅能够引起人体各种炎症损伤，如急性皮肤炎、肝炎、肾炎等，而且能够引发肝 癌。因此，开发早期藻毒素污染预警系统、监测系统和分析系统在水华研究中具有十分重要 的意义，既可以防治水华危害，减少水华爆发造成的经济损失，又能够有效的保护人们的健 康。本课题以郑州市生活饮用水源西流湖和黄河花园口段某调蓄池作为研究现场，检测水华 理化指标和指示指标，通过分析各理化指标与总藻细胞密度、叶绿素浓度、蓝藻细胞密度等 指示指标之问的关系，进而建立藻类污染预测模型；分离培养微囊藻细胞，检测基因序列并 对所提取毒素进行检测分析，从而为藻类污染防治提供了科学依据，为进一步开展微囊藻毒 素毒效应机制和去除研究奠定了坚实的基础。 材料与方法 郑州大学2 0 0 7 届硕士学位论文中文摘要 1 现场与采样 选择郑州市西流湖和黄河花园口调蓄池为研究现场。在西流湖水体设两处采样点：1 号 采样点为柿园水厂调蓄池入口处，2 号采样点为调蓄池外围1 0 0 0 m 处。采样时间为2 0 0 4 年 3 月1 0 月；黄河花园口调蓄池水源入口处为1 号采样点，水厂采水处为2 号采样点，采样 时间为2 0 0 5 年3 月2 0 0 6 年1 月。采样时避免下雨天气，每次采样均在上午9 ：o o 进行，采 样时用2 5 0 0 m l 采水器于水面下o 5 m 处共采集水样1 2 0 0 0 m l ，置于经过处理的2 5 0 0 m l 聚乙 烯瓶和1 0 0 0 m l 玻璃瓶中，用于分析水体理化指标、蓝藻细胞密度和总藻细胞密度。采样同 时记录水温、气温、光照度、透明度等理化指标。用2 5 号浮游生物网( 网孔直径为0 0 6 4 m m ) 在水体表面或水面下o 5 m 深处以每秒2 0 3 0 c m 的速度作倒8 字形循回采样，拖网时间根据 浮游藻类的密度选择，一般3 5 m i n 。将网徐徐提起，待水滤去，浮游藻类聚集在网头，取 盛标本的1 0 0 m l 塑料瓶在网头下接好，打开活塞，使浓缩藻类标本流入瓶中。每个采样点收 集3 0 4 0 m l 浓缩藻类样品，进行产毒蓝藻的分离培养、微囊藻纯毒素制备及毒素鉴定。 2 检测项目及方法 应用照度计法测定光照度( l i g h ti l l u m i n a n e e l i ) ；采用深水温度计法测定水温( w a t e r t e m p e r a t u r e ，w t ) ；采用塞氏盘法测定透明度( s e c c h i d e p t h ，s d ) ；采用酸性高锰酸钾法测定高 锰酸盐指数( c h e m i c a lo x y g e nd e m a n d ，c o d m 。；采用碱性过硫酸钾消解紫外分光光度法测定 总氮( t o t a ln i t r o g e n , t n ) 采用钼酸氨分光光度法测定总磷( t o t a lp h o s p h o r u s t p ) ；采用分光 光度法测定叶绿素a ( e h l o r o p h y l ia , c h l a ) ；采用血细胞计数板法测定各种藻细胞密度( a l g a ec e l l d e n s i t y , a c d ) 和蓝藻细胞密度( c y a n o b a c t e r i ac e l ld e n s i t y , c c d ) ；采用全细胞p c r 方法检测 产毒蓝藻( t o x i g e n i cc y a n o b a c t e r i a ) 相关基因藻青蛋白基因中间序y l j ( p h y c o c y a n i n i n t e r g e n i es p a c e r r e g i o n ，p c i g s ) 和微囊藻毒素多肽合成酶基因b ( m i c r o c y s t i ns y n t h e t a s e g e n e b ，m c y b ) ；采 用t 载体基因克隆和p c r 产物直接测序方法检测蓝藻基因序列；采用e l i s a 方法测定微囊 藻毒素( m i c r o c y s t i n , m c ) 总浓度；采用固相萃取( s o l i dp o l eo f e x t r a c t i o n ，s p e ) 方法对提取粗毒 素进行分离纯化；采用( h i g hp e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h y ，h p l c ) 方法检测各种毒素异构体 及其浓度。 3 ，藻细胞的分离培养 应用9 6 孔板结合极限稀释法对采集浓缩藻细胞进行分离培养。选择培养基为b g 一1 1 培 养基，光照2 5 0 0 l x ，光暗比1 2 h ：l o h ，温度2 5 i c ，每天早晚各振摇一次。 4 统计学处理 郑州大学2 0 0 7 届硕士学位论文 中文摘要 4 1 统计分析软件应用d n a s s i s t1 0 和d n a t o o l s5 i 对基因序列进行序列分析和比对分 析；b l a s t 软件提交基因序列与g e n b a n k ；e x c e l l 整理和输入数据：s p s s l l 0 进行多元回归 模型建立及浓度计算；m a t l a b 5 3 建立人工神经网络模型。 4 2 统计方法用评分法和综合营养状态指数法评价西流湖和黄河花园口调蓄池水体富营养 化现状；用l - m 算法改进的的b p 人工神经网络技术和多元逐步回归分析分析方法分析总藻 细胞密度、蓝藻细胞密度、叶绿素a 与理化指标的关系并建立水华藻毒素污染预测模型。 结果 1 西流湖和花园口调蓄池水体营养状况评价结果 评分法评价结果显示：西流湖春季为轻度营养状态，夏、秋季呈富营养状态；花园口调 蓄池四季均为富营养状态；全年评分指数变化趋势：西流湖三季依次由富营养的较d , l l 每界值、 富营养过渡到富营养的较大值；花园口调蓄池全年呈先逐渐升高然后逐渐降低的趋势。综合 评价两水体均为富营养型。 综合营养状态指数法评价结果显示：西流湖春季处于中度营养状态的较大值：夏季处于 轻度营养状态的较大值；秋季处于中度营养状态的较大边界值；花园口调蓄池全年均呈轻度 营养状态。全年综合营养状态指数变化趋势：西流湖由中度营养状态的较大值、轻度营养状 态的较大值过渡到中度营养状态的临界值；花园口调蓄池呈先下降然后升高再降低的趋势。 2 西流湖和花园口调蓄池各门类藻细胞计数结果 西流湖和花园口调蓄池污染藻类主要是硅藻、绿藻、蓝藻和裸藻，其他藻类较少。优势 藻门和藻细胞密度具有明显的季节变化趋势，春节浮游藻类种类较多，无明显优势藻门，a c d 和c c d 均较低；夏季和秋季种类较少，以蓝藻为优势藻门，a c d 和c c d 均较高：冬季浮 游藻种类和密度均为全年最低。 3 叶绿素a 、蓝藻细胞密度、总藻细胞密度与理化指标关系及微囊藻毒素污染预测模型的建 立结果 3 1 运用多元回归分析方法分析及模型建立结果 绘制各理化因子与c h l a 、a c d 、c c d 之间的散点图，t p 、“与叶绿素a 和c c d 不成线 性关系，因此，不能进入多元线性回归模型进行分析。剔除t p 、l i 因子，采用多元逐步回 归分析方法，建立郑州市生活饮用水源c h l a 、a c d 、c c d 的多元回归预测模型，预测方程 如下： ( 0 1 n ( c h l a + 1 ) = 0 6 2 6 - 0 7 1 7 t n + 0 6 4 4 c o d 巾= 0 8 5 5 , f = 9 6 2 1 3 , p = 0 o ) m 郑州大学2 0 0 7 届硕士学位论文 中文摘要 ( 2 ) i n ( a c d + i 户1 4 0 9 0 + 0 2 0 6 w t - 2 7 7 1 s d - 0 ，8 2 4 l i - 0 2 8 9 t n + 4 6 0 8 t e ( r = 0 8 7 3 ，f = 4 3 5 5 5 ，p = 司0 0 0 o ) l n ( c c d + d ：6 1 5 4 1 7 1 2 t n + 0 8 8 1 c o d ( r - - 0 8 5 4 。f = 9 5 8 4 9 ，p - - 0 o o o ) 结果显示：c h l a 与c o d 呈正相关，与t n 呈负相关；a c d 与s d 、l i 、 i n 呈负相关， 与w t 、t p 呈正相关；c c d 与t n 呈负相关，与c o d 呈正相关。所得回归方程的预测值与 实测值拟和相关系数均大于o 7 0 ，预测值与实测值基本吻合，可以适用于藻类污染预测研究。 3 2 采用l m 计算方法优化的b p 人工神经网络技术建立c h l a 、a c d 、c c d 预测模型结果 将6 个富营养化相关理化因子全部纳入预测模型的建立，c h l a 、a c d 、c c d 预测模型 训练误差分别为l c - l l 、l e - 3 、l e - 1 3 ，训练集、校验集、检验集训练误差几乎同时达到最低 点，预测值与实测值拟和结果如下： ( 1 ) a = o 0 8 2 t + 4 a 8( r = 田8 7 1 ) ( 2 ) a = 0 5 5 6 t + ( 3 1 6 e + 0 0 3 ) ( r - - - 0 8 3 8 ) ( 3 ) a = 0 6 0 8 t + 7 9 8 ( p 0 8 6 9 ) 所得三个预测模型拟和度较好，重要理化因素均进入模型进行分析，所得结果更符合实 际，是一种很好的藻类毒素污染预测模型建立方法。 4 微囊藻细胞分离培养结果 用9 6 孔细胞培养板结合极限稀释法自西流湖分得1 株微囊藻细胞m i c r o c y s t i s x l h ( 师 兄分离) ，自黄河花园口调蓄池共分离2 株微囊藻细胞m i c r o c y s t i s b m l 、b m 2 和1 株颤藻细 胞c 3 。 5 p c i g s 基因和m e y b 基因检测和序列分析结果 自西流湖分离的x l h 细胞株和黄河花园口调蓄池分离的2 株微囊藻细胞b m l 、b m 2 ， p c i g s 、m c y b 基因扩增均为阳性：颤藻p c i g s 扩增阳性，m c y b 基因扩增结果为阴性。构建 t 载体克隆水体微囊藻毒素合成酶基因p c r 扩增产物，用p c r 通用引物鉴定结果，在8 0 0 b p 左右有条带，成功克隆出菌株。取l m l 菌液封装，送上海生工进行测序，用b l a s t 提交测序 结果与g e n b a n k 序列比对，同源性最高9 9 1 5 ，克隆测序成功。所分离3 株微囊藻细胞m c y b 基因序列检测结果与g e n b a n k 报道m c y b 基因同源性达9 9 5 ；水体微囊藻毒素合成酶基因 序列与所分离微囊藻细胞株毒素合成酶基因序列同源性为9 9 ；将3 株微囊藻细胞株m c y b 基因序列提交美国生物信息中心基因库( g e n b a n k ) ，所得基因序列号分别为：e f 2 1 6 8 7 2 、 e f 2 1 6 8 7 3 、e f 2 1 6 8 7 4 。 6 毒素提取纯化及检测结果 i v 郑州大学2 0 0 7 届硕士学位论文中文摘要 以m c - l r 、m c - r r 毒素标准品对提取毒素进行h p l c 检测，结果显示：x l h 、b m i 、b m 2 所 含m c - l r 、粥一r r 两种异构体的比值分别为4 7 1 、1 3 0 9 、1 4 2 8 ，m c l r 几乎达到m c - r r 的 1 5 0 倍，表明该两个生活饮用水源水华产生藻毒主要为m c l r 。运用e l i s a 试剂盒对毒素总 浓度进行检测，结果显示：自西流湖分离的藻细胞株x l h 干粉产毒量为4 7 1 4 p g g ，而黄河 花园口段某调蓄池所分离的两株微囊藻细胞于粉产毒量均分别为1 0 6 8 4 p g g 和 4 6 9 7 2 p g g 。一般微囊藻干粉产毒量为3 0 0 p g g 2 0 0 0 p - g g ，b m 2 远远大于该平均水平。 结论 1 西流湖和黄河花园口调蓄池呈不同程度富营养化状态，均有微囊藻毒素污染。 2 应用9 6 孔板结合极限稀释法对水体藻细胞进行分离可以大大简化分离过程，提高水 华藻细胞分离效率。 3 全细胞p c r 方法可以用来鉴定水样和蓝藻细胞株产毒性。本实验室所分离的三株微 囊藻细胞为蓝藻种属，且能够产毒。 4 所分离三株微囊藻细胞主要毒素异构体为毒性较大的m c - l r ，均为水体微囊藻毒素 污染来源。 5 能够运用人工神经网络技术和多元回归分析方法建立藻类污染预测模型：改进的人工 神经网络技术较多元回归分析方法更为优良和实用。 6 为郑州市安全供水及水源卫生防护提供了科学依据，为深入开展微囊藻毒素毒效应机 毒4 和去除研究提供了基础数据和方法。 关键词：微囊藻毒素；多元回归分析；人工神经网络；固相萃取高效液相色谱； v 郑州大学2 0 0 7 届硕士学位论文 英文摘要 c h a r a c t e r i z a t i o na n de s t a b l i s h m e n to fe a r l yw a r n i n gs y s t e mo fm i e r o c y s t i n p o s t g r a d u a t ey a n gs o n g q i n s u p e r v i s o r c u il i u x i n 、 d e p a r t m e n to fe n v i r o n m e n t a lh e a l t h ， c o l l e g eo f p u b l i ch e a l t h ，z h e n g z h o uu n i v e 璐i t y ， z h e n g z h o u ，c h i n a ，4 5 0 0 0 1 a b s t r a c t m o r ea n dm o r ei n d u s t r i a le f f l u e n t sa n dd o m e s t i cs e w a g eh a v eb e e nd i s c h a r g e di n t os o u r c 君 w a t e rw i t ht h ed e v e l o p m e n to f i n d u s t r i a la n da g r i c u l t u r a lp r o d u c t i o na n dt h eg r o w t ho f p o p u l a t i o n ， w h i c hh a si n d u c e dp o l l u t i o no fs o u r c ew a t e ru n c e a s i n gu n i n t e r r u p t e d 1 1 l er a p i di n c r e a s i n go f n i t r o g e na n dp h o s p h o u r sh a so f f e r e dr e d u n d a n tn u t r i t i o nt oa l g a ef o rt h e i rg e n e r o u sp r o p a g a t i o n ， w h i c hi n d u c e dt h eo u t b r e a ko fb l o o ma l lo v e rt h ew o r l d t i l ln o wt h et e n d e n c yo ft h ef r e q u e n c y a n dg r a v e n e s so fb l o o mi nf r e s h w a t e rl a k es e e mt oi n c r e a s eq u i c k l y m a n yc o u n t r i e sh a v er e p o r t e d e x p l o s i o no fb l o o mi nl a k eo rr e s e r v o i rs u c ha sa m e r i c a n ，j a p a n ，i n d i a , c a n a d a , s o u t ha 衔c a n ， f i n l a n d t h ee u t r o p h i c a t i o nh a sb e e nm o r ea n dm o r es e v e r ei no u rc o u n t r ye v e rs i n c e1 9 9 0 sa n d t h em a i nr i v e ro f y a n g t z er i v e r , y e l l o wr i v e r , p r e s e r v e de g gf i v e ra n dt h em a i nl a k eo f t h et a il a k e ， n e s tl a k e ，b o y a n gl a k es h o wt ob ei nd i f f e r e n te u t r o p h i c a t i o n b l o o mh a sn o to n l yd e m o l i s h e dt h e v i e wc h a r a c t e ro fl a k ea n dr e s e r v o i rb u tt a k e nt h r e a t e nt ot h eh e a l t ho fp e o p l e b l o o mh a sb e e na s e r i o u sp r o b l e ma n dh a sp r o v o k e da t t e n t i o na n dr e c o n s t r u c t i o no f t h ew h o l ew o r l d t h em a i nc o n t a m i n a t i o nm a t e r i a lo fb l o o ma r ea l lk i n d so fa l g a e - t o x i n m i e r o c y s t i ni so n e k i n do fi n t r a c e l l u l a rt o x i n i t sf r e q u e n c yo fo c c u r r e n c ei st h eh i g l l e s ta n dt h r e a t e nt oh u m e ni st h e s e v e r e s t , w h i c hi sg e n e r a t e db ym i c r o c y s t i s ，a n a b e n a , o s c i l l a t o r i a , n o s t o c m i c r o c y s t i nc a l lc a u s e a l lk i n d so fh e a l t hl e s i o n ，e s p e i a l yl i v e rc a n c e r , t h ep r o b l e mo fe n v i r o n m e n t a lc o n t a m i n a t i o no f m i c r o c y s t i ns h o u l db er e c o n s t r u c t e db yu sa n di ti si m p o r t a n tt oe s t a b l i s hw a r n i n gs y s t e ma n d m o n i t o rs y s t e mo fm i c r o c y s t i n t h es t u d ys i t eo ft h i sr e s e a r c hw e r ex i l i ul a k ea n dh u a y u a n k o u p 0 0 1 t h ef o r c a s t i n gm o d e lo fm i c r o c y s t i nw a se s t a b l i s h e db ym e a n so fa n a l y s i so fp h y s i c a l c h e m i s t r yd a t aw i t hc o n - a l g a ec e l ld e n s i t y , c h l o r o p h y lc o n c e n t r a t i o na n dc y a n o b a c t e r i ac e l l d e n s i t ya n dt h es t r u c t u r a lo fm i c r o c y s t i nw a sa n a l y z e da n dt h eg e n eo r d e rw a sd e t e c t e da f t e rt h e 郑州大学2 0 0 7 届硕士学位论文英文摘要 m i c r o c y s t i sc e l lw a s i s o l a t e dc u l t u r e ，w h i c hh a dp r o v i d e ds c i e n t i f i cb a s ea n dm e a n sf o rr e s e a r c ho f p r e v e n t i o na n dc u r ea n de f f e c t i v e n e s sa n dr e m o v a lo f m i c r o c y s t i s m a t e r i a l sa n dm e t h o d s 1 s p o ta n ds a m p l i n g t h es t u d ys i t ew e r ex i l i ul a k ea n dh u a y u a n k o up 0 0 1 t h e r ew e r et w os a m p l i n gs p o t sa n d n o 1w a st h ei n g r e s so fw a t e rp l a n ts h i y u a na n dn o 2w n qt h ee x t e n to u t s i d e1 0 0 0m e t e r s s a m p l i n gw a sc o l l e c t e df r o mm a r c ht oo c t o b e ri n2 0 0 4 t h e r ew e r et w os i t e si nh u a y u a n k o up o o l a n dt h ew a t e rs o u r c ei n g r e s ss p o tw a sn o 1a n dw a t e rr e c i p e ds p o tw a sn o 2a n dt h es a m p l i n gw a s m a d ef r o mm a r c hi n2 0 0 5t oj a n u a r yi n2 0 0 6 r a i n yd a y ss h o u l db ea v o i d e df r o ms a m p l i n ga n d t h et i m es h o u l db ea t8 ：0 0t o9 ：0 0i nm o r n i n g s 1 2 0 0 m lw a t e rs a m p l ew a sc o l l e c t e db yo n e2 5 0 0 m l w a t e rs a m p l e rf r o mt h ew a t e rp l a n eu n d e rt h ew a t e rs u r f a c eo 5 m e t e r s t h e nt h ew a t e rs a m p l i n g w a sp u ti n t oo n e2 5 0 0 m lp o l y e t h y l e n eb o r l ea n d1 0 0 0 m lg l a s sb o t t l ef o rm e a s u r i n go fp h y s i c a l c h e m i cd a t aa n dt h ec o n - 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