秀丽隐杆线虫1433蛋白FTT2在咽部肌肉细胞中功能分析论文.pdf

厦门大学 硕士学位论文 秀丽隐杆线虫14-3-3蛋白ftt-2在咽部肌肉细胞中的功能分 析 姓名：余真 申请学位级别：硕士 专业：细胞生物学 指导教师：王亚梅 2012 摘要 摘要 1 4 3 3 蛋白是一个几乎在所有真核生物中表达的高度保守的蛋白质家族，它 们广泛参与了细胞凋亡、细胞周期调控、蛋白跨膜转运、信号转导等重要生命活 动的调节进程。众多的研究表明该蛋白家族的表达异常与多种疾病的发生都密切 相关。目前对于1 4 3 3 蛋白的结构以及与其他蛋白间的相互作用研究比较多， 而对于1 4 3 3 的亚型特异性功能和组织特异性调控的研究工作却很少。本研究 以秀丽隐杆线虫为模式生物来研究秀丽隐杆线虫中仅有的两个1 4 3 3 蛋白f n 2 和p a r 5 在功能上的差异。通过对构建的f t t 一2 和p a r - 5 表达模式互换的转基 因虫株的表型分析本研究发现：p a r 5 在某些功能上能够替代f t t - 2 ，例如：对 后代数目的调控；但是在另外些功能上无法替代f n 2 ，例如：对寿命的调控。 本研究还发现f t t - 2 在秀丽隐杆线虫咽部肌肉细胞中过量表达可以延长寿命， 减少产卵数，增强热抗性，调控体长并改变咽部结构发育。为进一步探讨 f n 2 蛋白不同结构域对不同表型的可能调控作用，本研究构建了在咽部肌肉 表达缺失部分结构域的f n 2 的转基因线虫并对其进行了表型分析。结果显示： 配体结合域可能对寿命、产卵量和咽部结构发育的调控起作用：二聚化区域和 配体结合域对抗热性增强是必须的；核输出信号区域影响f t t - 2 蛋白的亚细胞 定位；二聚化区域、配体结合域和核输出信号共同参与了f t t - 2 在咽部肌肉中对 体长发育的调控。最后本研究探讨了f 兀- 2 在咽部肌肉表达导致的寿命延长与 自噬作用之间的可能联系，初期结果显示自噬对f 兀- 2 在咽部肌肉表达延长寿命 是必需的。本文的研究结果将有助于加深人们对其他物种中1 4 3 3 蛋白功能的 认识。 关键词：秀丽隐杆线虫；1 4 3 3 ；结构与功能 a b s t r a c t a b s t r a c t t h e14 - 3 - 3p r o t e i n sa r eaf a m i l yo fc o n s e r v e dm o l e c u l e se x p r e s s e di nn e a r l ya u e u k a r y o t i cc e l l s t h e yp l a yi m p o r t a n tr o l e si naw i d er a n g eo fv i t a lr e g u l a t o r y p r o c e s s e s ，s u c h a s a p o p t o t i ec e l ld e a t h ，c e l lc y c l ec o n t r o l ，c e l ls i g n a l i n ga n d t r a n s m e m b r a n et r a n s p o r t n u m e r o u ss t u d i e sd e m o n s t r a t et h a tt h ea b n o r m a le x p r e s s i o n o fl4 3 3i si nc l o s er e l a t i o nt ot h eo e c u r r a n c eo fv a r i o u sd i s e a s e s s of a rt h es t r u c t u r e a n dp r o t e i ni n t e r a c t i o no f14 - 3 - 3a r ew e l ls t u d i e d ，h o w e v e r , t h er o l eo fd i f f e r e n t 1 4 - 3 3i s o t y p e sa n dt h e i rf u n c t i o n si ns p e c i f ct i s s u e sa r en o tw e l lu n d e r s t o o da n d w a i t i n gt ob er e s o l v e d t h e r ea r eo n l yt w om e m b e r si nce l e g a n s1 4 3 - 3f a m i l y ， f r 卜2a n dp a r 一5 ，w h i c hs h a r ev e r yh i g hs e q u e n c es i m i l a r i t y i nt h i ss t u d yw eu s e dc e l e g a n sa sm o d e lo r g a n i s mt oc o m p a r ef u n c t i o n so ft h et w oi s o t y p e sb yc r e a t i n g t r a n s g e n i cl i n e sw i t hi n t e r c h a n g e de x p r e s s i o np a t t e r no ff t t - 2a n dp a r - 5 r e s u l t s s h o w e dt h a tp a r 一5c o u l dr e p l a c es o m ef u n c t i o n so ff t t - 2a sa f f e c t i n gt h eb r o o ds i z e o c e l e g a n s , i tc o u l dn o ts u b s t i t u t ef t t - 2f o rl i f e s p a nr e g u l a t i o n r e s u l t sa l s o s h o w e dt h a to v e r e x p r e s s i n gf t t 2i nce l e g a n sp h a r y n g e a lm u s c l ec e l l sc o u l dc a u s e e x t e n e dl i f e s p a n ，d e c r e a s e db r o o ds i z e ，i n c r e a s e dt h e r m o t o l e r a n c e ，s h o r t e n e db o d y l e n g t ha n da b n o r m a lg r i n d e rs t r u c t u r ei nce l e g a n s i no r d e rt oi n v e s t i g a t et h e p o s s i b l er e g u l a t o r y r o l e so fd i f f e r e n ts t r u c t u r a ld o m a i n so ff t t - 2f o rt h o s e p h e n o t y p e s ，w ec r e a t e da n da n a l y z e dt r a n s g e n i cl i n e se x p r e s s i n gd i f f e r e n tf t t - 2 t r u n c a t i o n s r e s u l t ss h o w e dt h a tt h el i g a n db i n d i n gd o m a i nm a yb ei n v o l v e di nt h e r e g u l a t i o no fl i f e s p a n ，b r o o ds i z ea n dg r i n d e rs t r u c t u r ed e v e l o p m e n t ；d i m e r i z a t i o n d o m a i na n dl i g a n d b i n d i n g d o m a i na r ei n d i s p e n s a b l ei nt h e r m a l t o l e r a n c e ； d i m e r i z a t i o nd o m a i na n dn u c l e a re x p o i r ts i g n a l ( n e s ) m a yb er e l a t e dt ot h es u b c e l l u a r l o c a l i z a t i o no ff t | 2 ；a n dl i g a n db i n d i n gd o m a i na n dn u c l e a re x p o r ts i g n a lf n e s ) m a yt a k ep a r ti nt h eb o d ys i z er e g u l a t i o n f i n a l l y , w ee x p l o r e dt h ep o s s i b l e r e l a t i o n s h i pb e t w e e nt h el i f e s p a ne x t e n s i o nc a u s e db yf t t - 2e x p r e s s e di nce l e g a n s p h a r y n g e a lm u s c l ea n da u t o p h a g y o u rp r e l i m i n a r yr e s u l t si n d i c a t et h a ta u t o p h a g yi s n e c e s s a r yf o rf t t - 2e x p r e s s e di np h a r y n g e a lm u s c l ec e l l st oe x t e n dl i f es p a n t h e s e r e s u l t sw i l lf u r t h e rt h eu n d e r s t a n d i n go ff u n c t i o n so f1 4 - 3 3p r o t e i n si no t h e rs p e c i e s k e yw o r d ：ce l e g a n s ；1 4 3 3 ；s t r u c t u r ea n df u n c t i o n n 缩略词表 英文缩写英文名称中文名称 a m pa m p i c i l l i n c c dc a m e r a c h a r g e c o u p l e dd e v i c ec a m e r a c m d i c d n a f u d r g f p h i p t g l l l l 2 l 3 l 4 l b m i n m l m m n g m r n a i t n a i s c e n t i m e t e r d i f f e r e n t i a li n t e r f e r e n c ec o n t r a s t d e o x y r i b o n u c l e i ca c i d f l o x u r i d i n e g r e e nf l u o r e s c e n tp r o t e i n h o u r 氨苄青霉素 电荷耦合元件 图像传感器 厘米，长度单位 微分干涉相差 脱氧核糖核酸 氟脲嘧啶脱氧核苷 绿色荧光蛋白 小时，时间单位 i s o p r o p y l1 3 - d - 1 t h i o g a l a c t o p y r a n o s i d e异丙基- p d 硫代 l i t e r l a r v al l a r v a 2 l a r v a3 l a r v a 4 l u r i a b e r t a n ic u l t u r em e d i u m m i n u t e m i l l i l i t e r m i l l i m e t e r n e m a t o d eg r o w t hm e d i u m r i b o n u c l e i ca c i d r n ai n t e r f e r e n c e s e c o n d 吡喃半乳糖苷 升，体积单位 第一期幼虫 第二期幼虫 第三期幼虫 第四期幼虫 溶菌肉汤培养基 分，时间单位 毫升，体积单位 毫米，长度单位 线虫生长培养基 核糖核酸 i 矾a 干扰 秒，时间单位 前言 刖置 1 模式生物秀丽隐杆线虫简介 1 1 模式生物秀丽隐杆线虫研究进展 1 9 6 3 年，英国的b r e n n e r 发现秀丽隐杆线虫成虫细胞数不多，功能也不复杂， 身体透明，可以在显微镜下观察细胞分裂过程，是研究发育生物学和神经生物学 理想的模型动物。19 7 4 年，b r e n n e r 发现用乙基甲烷磺酸盐t h y l m a t h a n e s u l f o m t e ， e m s ) n - i 诱导秀丽隐杆线虫特异的基因突变。b r e n n e r 使用e m s 对一个野生型线 虫株系n 2 进行化学诱变，获得了约3 0 0 个在形态或行为上发生了变异的突变体。 这些突变被分别定位在线虫的6 条染色体上，影响到约1 0 0 个基因。他详述了秀 丽隐杆线虫的突变体筛选、基因定位等遗传操作方法，为以秀丽隐杆线虫为模式 生物进行动物个体发育的遗传研究奠定了基础f l j 。与此同时，s u l s t o n 等人也在进 行着一项前无古人的研究。s u l s t o n 使用微分干涉显微镜( d i f f e r e n t i a li n t e f e r i n g c o n t r a s t ，d i c ) 来研究秀丽线虫细胞的命运，绘制成了细胞谱系图。该图揭示了 雌雄同体线虫全部1 0 9 0 个细胞的身世和命运，从而使科学家们能够在活体线虫 的单个细胞水平上研究遗传发育的调控机制f 2 1 。在研究细胞谱系的过程中， s u l s t o n 发现在发育过程中，秀丽隐杆线虫共生成1 0 9 0 个细胞，其中1 3 1 个将会 死亡，所以，野生型秀丽隐杆线虫成虫有9 5 9 个细胞，并且每个细胞的位置固定 不变。秀丽隐杆线虫有5 对常染色体和l 对性染色体。秀丽隐杆线虫的全部1 0 9 0 个细胞中的1 3 1 个细胞以一种不变方式，在固定的发育时间和固定位置消失。这 一现象就是现在为世人熟知的细胞程序性死亡，即细胞凋亡，它是有基因控制的， 后来2 0 0 2 诺贝尔奖获得者也发现了调节器官发育和程序性细胞死亡的几个关键 因素，并证明相应的调节基因在高等动物和人体中也存在【4 1 。该发现对医学研究 极为重要，且对疾病发生的机理及新的治疗研究都有重要意义，使得秀丽新杆线 虫成为生物学和医学研究中的一个热门话题。 1 2 秀丽隐杆线虫的生物学特性 秀丽隐杆线虫的学名为c a e n o r h b d i t i se l e g a n s ，简称ce i e g a n s ，属于线形动 物门、线虫纲。它生活在泥土中，以细菌为食，容易人工养殖且对人和动植物没 有危害。秀丽隐杆线虫体型小，成虫只有l m m 左右【5 l 。 前言 从受精卵到孵化的过程称为胚胎发育期，这个时期使受精卵发育成l 1 期的 线虫，l l 时期的线虫在结构上与成虫相似，只是更小一些，约2 5 0 m m 长。胚胎 后期发育包括四个幼虫期即l l 期到l 4 期，最后一次蜕皮后变成成虫。在2 0 下胚胎发育期需要1 4 小时，其中开始的几个小时是在雌雄同体线虫体内。从 一个受精卵到发育成可以产卵的成虫，只需要三天。胚胎后期的生长发育是连续 的。当线虫处在高的数量密度和缺乏食物的情况下，会在第二次蜕皮后进入d a u e r 期。d a u e r 现象是线虫抵御外界不良环境如干燥等的一种手段，在解剖镜下我们 可以看到，d a u e r 期的线虫比l 3 期幼虫要瘦小一些，并能长时间保持静止状态， 但是当受到外界干扰时会比l 3 期幼虫运动的快。d a u e r 期可以在饥饿的板上持 续几个月的时间，当给予食物后，d a u e r 期的线虫可以蜕皮直接进入l 4 期。经过 幼虫发育的四个时期之后，线虫进入成虫期，野生型成虫的平均寿命约为半个月 左右( 图1 所示) 。 图l 秀丽隐杆线虫在2 2 1 2 下的生命周期 f i g u r e1l i f ec y c l eo fce l e g a l l $ a t2 2 ( f r o mw w w w o r m b a s e o r g ) 2 前言 秀丽隐杆线虫有两种性别：雌雄同体和雄性( w o r m b o o k ) 。两者可通过尾部的 形态差异来鉴别，雌雄同体虫体尾端较细长，雄虫尾端则较粗，显得比较钝圆。 雌雄同体可以自体繁殖，也可以与雄性交配繁殖。在正常培养条件下产生的后代 绝大部分为基因型与母本相同的雌雄同体，产生雄虫的概率约为1 o 。雌雄同体 与雄虫交配的后代中5 0 是雌雄同体，5 0 是雄性。 1 3 秀丽隐杆线虫作为模式生物的优势 秀丽隐杆线虫生命周期短，大约在1 2 小时左右开始胚胎发育。2 5 条件下， 受精卵发育成成虫只约需要2 5 天，寿命约为2 3 周。2 0 条件下，从受精卵到 繁殖期成虫，整个过程需要3 5 天，且在这一温度下线虫繁殖能力最好，一条成 虫4 天的时间大约能产生3 0 0 多个后代。1 5 条件下，卵到繁殖期成虫，整个过 程需要6 天。如果在一个培养皿上放上几只线虫，几天之后就可得到大量的后代， 非常适合实验室进行生物学研究【5 】o 在自然状态下，秀丽隐杆线虫绝大部分个体为雌雄同体( h e m a p h r o d i t e ) 。可 以人为控制线虫的繁殖方式，获得理想表型。自然产生的雄性秀丽隐杆线虫仅占 群体的千分之一，但在实验室可以用热激的办法来诱导产生雄性个体以用于遗传 交配【5 】o 由于具有雄性和雌雄同体这两种性别，秀丽线虫在遗传研究上也具有无 可比拟的优势。 秀丽隐杆线虫的一般培养采用b r e n n e r 所用方法：使用的线虫大多为雌雄同 体，饲养于标准线虫培养基( n e m a t o d eg r o w t hm e d i u m ，n g m ) 中，上面滴加了尿 嘧啶渗漏突变型的大肠杆菌o p 5 0 ，作为秀丽隐杆线虫的食物。在实验室中只要 有一台解剖显微镜，一只自制的铂金丝小铲，就可以进行线虫培养操作了。秀丽 隐杆线虫在实验室条件下可以像保存细胞和组织一样进行冷冻保存，在8 0 冰 箱或液氮中，储存时间分别长达1 2 年和2 5 年之久f 5 j 。这就为大量保存各种遗传 背景的秀丽线虫株系提供了极大的便利，这一优势也是其他模式动物，如果蝇和 小鼠等所不具备的。 秀丽隐杆线虫是一种典型的多细胞生物，又是唯一一个身体中所有细胞都能 被逐个盘点并各归其类的生物，它的幼虫含有5 5 6 个体细胞和2 个原始生殖细胞， 成虫则根据性别不同具有不同的细胞数，最常见的雌雄同体成虫成熟后含有9 5 9 个体细胞和2 0 0 0 个生殖细胞，而较少见的雄性成虫则有1 0 3 1 个体细胞和1 0 0 0 个生殖细胞；它通身透明，这就便于研究人员通过显微镜观察活的完整线虫的内 3 刖哥 部结构，而且能直接观察线虫发育过程中单个细胞的迁移、分裂以及死亡，从而 使人们能够了解线虫发育过程中每个细胞的命运【5 1 。作为一种真核生物，线虫与 更高等的生物体共有一些相似的细胞及分子结构以及调控通路。这样，从秀丽隐 杆线虫得到的生物学知识有可能可以直接应用于更加复杂的生物，包括人类自 身。 1 9 8 0 年代中期秀丽隐杆线虫基因组测序工作开始，到1 9 9 8 年秀丽隐杆线 虫的基因组序列测定完成，准确率9 9 ，剩下1 的缺口也于2 0 0 2 年1 0 月完成。 秀丽隐杆线虫基因组大小为9 7 x 1 0 7 碱基，大约是大肠杆菌基因组的2 0 倍，人类 的1 3 0 t 4 。编码序列占整个基因组的2 7 ，平均每个基因有1 个内含子。基因组 序列4 0 与人类同源。秀丽隐杆线虫是人类第一次完成的多细胞动物基因组序列 测定的动物，为科学家研究基因组的功能提供了一个强有力的工具，是研究人类 疾病极具吸引力的模型动物之一。 1 9 9 8 年f i r e 建立了线虫r n a 干扰技术【6 】。r n a 干扰( r n ai m e r f e r e n c e ) 是指一种分子生物学上由双链r n a 诱发的基因沉默现象，其机制是通过阻碍特 定基因的翻译或转录来抑制基因表达。当细胞中导入与内源性m r n a 编码区同 源的双链r n a 时，该m r n a 发生降解而导致基因表达沉默1 7 】o 与其它基因沉默 现象不同的是，在植物和线虫中，r n a i 具有传递性，可在细胞之间传播。秀丽 隐杆线虫的r n a i 使用方法操作简便，可采用喂食法，浸泡法和显微注射法。 更难能可贵的是，通过各国科学家的密切合作，线虫研究的资源共享体 系为研究人员提供了极大的方便，c g c ( c a e n o r h b d i t i sg e n e t i c sc e n t e r ) 贮藏 了大量的线虫品系，如特定基因的缺失突变体、各种转基因线虫等等，可供世 界各地的研究者免费使用，线虫的d n a 序列可以在n c b i 或w o r m b a s e 网站 上进行在线比对。 由上可知：培养方便、观察方便、遗传背景清晰、寿命短、自体受精、方便 进行多种生物化学与分子生物学实验等特点使秀丽隐杆线虫成为人们研究衰老 和寿命的首选模式生物。自b r e n n e r 开始，四十多年来，全世界的线虫研究者 始终坚持材料、资源、信息和数据的无偿共享，使这一领域的研究得以飞速 ! 发展。以秀丽线虫为模式生物的研究几乎涉生命科学的各个领域并取得了重 大突破，如m a p k 信号传导、细胞程序性死亡、r n a 干扰( r n ai n t e r f e r e n c e ， 4 前言 r n a i ) 、微r n a ( m i c r o r n a ，m r n a ) 、衰老和年龄及脂肪代谢等。其发育的 细胞过程被完全阐明。这些发现开启了探究人体细胞分化和演变的大门、并 对很多疾病发病机制的研究产生了深远的影响【3 】。 21 4 3 3 蛋白 2 11 4 3 - 3 蛋白的基本结构 1 9 6 7 年m o o r e 和p e r e z 进行牛脑神经元蛋白电泳时发现了一组酸性可溶性 同源异源二聚体蛋白，根据纤维素膜柱层析( d e a e ) q b 的片段数目和淀粉凝胶电 泳的迁移位置将这一蛋白家族命名为1 4 - 3 3 ，分子量约2 8 - - 一3 3 k d ，p i4 5 ，无 跨膜片段序列，广泛分布于真核生物中【9 1 。1 4 3 3 蛋白在大多数生物物种中由一 个基因家族来编码。哺乳动物有7 种亚型、b 、 r 、t l 、o 、百( 也称0 ) 和驴，q 、 6 亚型是b 、 亚型的磷酸化形式，植物至少有1 5 种亚型，酵母、果蝇和ce l e g a n s 也有两种亚型。各种、属之间的1 4 3 3 在氨基酸序列上高度同源，且不同种、 属的每个亚型序列也基本相同呈高度保守性。酵母的1 4 3 3 蛋白和人的1 4 3 3 专 在氨基酸序列水平上的相似性近7 0 ，说明在真核细胞中1 4 3 3 蛋白高度保守 【加】。1 4 3 3 是一种典型的胞浆蛋白，主要存在于神经组织内，在心、肝、肾、小 肠和睾丸等几乎所有组织中表达，也有少数存在于细胞膜、细胞核以及高尔基体、 线粒体、叶绿体等细胞器中【1 1 1 。1 4 3 3 的高度保守性和分布广泛性反映了它在真 核生物中的功能重要性。 1 4 。3 3 空间结构是一个内表面高度保守的兼性沟槽，能同时结合两个配体 【1 2 1 。配体的结合位点均位于其中，兼性沟槽是1 4 3 3 与靶蛋白相互作用的部位， 也是调节1 4 3 3 与靶蛋白结合的结构基础【13 1 。沟槽两侧是不对称的，一侧由0 【g 和a i 形成含有4 个l e u 侧链的疏水界面，另一侧由n c 形成3 个碱性侧链，a e 则 形成荷电极性集团，即螺旋c 和e 上的极性残基构成其极性面，螺旋g 和i 上 的疏水性残基构成其非极性面 1 4 j 。沟槽顶部的l y s 4 9 、a r 9 5 6 和a r 9 1 2 7 组成一 个碱性簇【1 3 】。 所有1 4 3 3 的三级结构都极其相似，哺乳动物1 4 3 3 蛋白是由两个单体连 接形成的杯状二聚体结构【i ，i ，每个单体由9 个a 螺旋( a a - - - - a i ) 组成，反向平行排 列成l 型结构，彼此间被一短环间隔【1 6 】，其中a c 和a d 的氨基酸序列最长( 3 0 - - 3 4 个氨基酸残基) ，它们跨越整个单体并连接形成一个卷曲的螺旋结构1 1 。二聚 5 体界面l i i 一个甲体的a al j 另个单体的o t c 和a d 构成，j t 中禽有疏水性残捧 和极性残基，形成高度保。、) ：的兼性沟槽( 1 4 3 3 与磷酸化和非磷酸化配体相吒作 用的结构域) 。也就是说，第1 4 螺旋形成二聚体的功能区，螺旋5 - 9 是与靶蛋白 质结合的功能k 【13 1 ( 图2 所示) 。 f r o n t t o p 图2 二聚体1 4 3 3 蛋白概观 f i g u r e2o v e r v i e wo ft h ed i m e r i c1 4 - 3 3s t r u c t u r e ( f r o my a f f e ，f e b sl e t t e r s ，2 0 0 2 ) 在1 4 3 3 家族中，c 末端短环序列的同源性很差，但该区域可与碱性簇相 h 作用，从而发挥稳定1 4 3 3 结合配体前结构的作用。一旦1 4 3 3 与配体结合， c 末端短环就与碱性簇解离并暴露在兼性沟槽的表面。因此，c 末端结构域具有 前言 调节1 4 3 3 蛋白的功能1 1 3 】。1 4 3 3n 末端的4 个螺旋( a a 一- - a d ) 位于同一平面上， 并在二聚体分界面中心形成一个小孔，大量的亲水性残基都排列在分界面上。而 与二聚体相关的氨基酸残基主要是疏水性的，并且在所有亚型中高度保守，说明 这些残基可能是温和异二聚化作用的基础，即1 4 3 3 能在不同亚型之间形成异 源二聚体。因此，n 末端参与了二聚体的形成，尤其是通过一个1 4 3 3 多肽单 体的a a ( 3 一- 1 7 位氨基酸残基) 与对应的另一个1 4 3 3 蛋白单体的a c ( 3 9 6 8 位氨 基酸残基) 和a d ( 7 5 - - - 1 0 7 位氨基酸残基) 的相互作用形成1 4 3 3 ( 二聚体的分界面 的1 1 3 1 。 2 21 4 3 3 蛋白的调节机制 1 4 3 3 蛋白调控靶蛋白的机制可归纳为以下几个方面：( 1 ) 改变靶蛋白与其他 结合蛋白的相互作用【l o l 。( 2 ) 抑制或增强靶蛋白的催化活性f l8 1 9 1 。( 3 ) 保护靶蛋白， 使其免于蛋白酶或磷酸酶的作用。如1 4 3 3 蛋白可使r a f - 1 、组蛋白、b a d 免于 磷酸酶的去磷酸化作用，使a r a b i d o p s i s 中的磷酸蔗糖合成酶( s p s ) 兔于蛋白酶的 水解【2 0 】。( 4 ) 改变靶蛋白的d n a 结合活性。在d n a 损伤后，1 4 3 3 蛋白可通过 与p 5 3 结合来增强p 5 3 的d n a 结合活性【2 l l 。( 5 ) 作为接头蛋白或支架蛋白介导两 个靶蛋白的相互作用。1 4 3 3 蛋白可以介导r a f 和b c r 、r a f 和p k c 、r a f 矛aa 2 0 的相互作用f 2 胡。( 6 ) 调控靶蛋白的核浆转运和亚细胞定位。1 4 3 3 蛋白可以促进 c y c l i n b l c d c 2 、n f a t 、f k h r l l 、m s n 2 、m s n 4 由细胞核向胞浆转运，促进 t l x 2 、t e r t 由胞浆向细胞核转运【2 3 】，介导钾离子通道蛋白由内质网向细胞质膜 转运1 2 4 1 。 以上几种调控机制并非相互独立存在，有时可以同时发生在同一种靶蛋白 上。例如，1 4 3 3 蛋白结合b a d 可以促使其与b c l 2 b c i x 1 分离并从线粒体转运 到细胞浆，同时又可以保护其免于被钙调磷酸酶( c a l c i n e u r i n ) 水解【l o l 。 2 31 4 3 3 蛋白的功能与重要性 1 4 3 3 蛋白具有多种生物学功能。1 4 3 3 蛋白独特的分子结构决定了其最主 要的功能是参与蛋白质蛋白质之间的相互作用。1 4 3 3 蛋白广泛参与了蛋白跨 膜转运、细胞分裂、细胞凋亡、信号转导等重要生命活动的调节进程。哺乳动物 的1 4 3 3 蛋白可以结合多形瘤病毒中间t 抗原【i o l 、刺激肾上腺嗜铬细胞依赖钙 离子的胞吐作用f 2 5 1 、促进物质向线粒体内运输( 2 6 j 、调节蛋白激酶c 的活力f 2 7 1 、 调节细胞膜上离予通道k c n k 的表达与分布【2 引、调节r a i l 激酶的活性【2 9 1 、与 7 前言 c d c 2 5 结合调节细胞周期【3 0 】、与信号分子c b l 作用【3 1 1 、与p a r 3 蛋白结合调节哺 乳动物上皮细胞的极性【3 2 】等。1 4 3 3 蛋白功能的一个重大突破是发现1 4 3 3 蛋 白在与c r a f - 1 作用时是通过直接与磷酸化苏氨酸结合来实现2 9 1 ，以及1 4 3 3 蛋 白与b a d ( p r o a p o p t o t i c p r o t e i n ) 【3 3 】和硝酸还原酶( n r ) 【3 4 1 等的作用。此外，大量研 究表明1 4 3 3 蛋白能与各种转录因子结合形成复合物调节相关基因的表达【3 5 。4 0 1 。 1 4 3 3 蛋白与多种疾病的发生相关( 图3 ) 。例如，a s y n u c l e i n 和1 4 3 3 蛋白 具有物理和功能上的同源性，q s y n u c l e i n 可以与1 4 3 3 蛋白及其配体结合。在 许多神经退化性疾病患者的轴突和l e w y b o d i e s 中会发生q s y n u c l e i n 累积，可以 作为帕金森症( p a r k i n s o n sd i s e a s e ，p d ) 着f ld i f f u s el e w y b o d i e s 症的病理学标记【4 i 4 引。x u 等人发现含有1 4 3 3 蛋白的可溶性0 【s y n u c l e i n 复合物含量在p d 患者的 黑质中显著增加【4 2 1 。1 4 3 3 蛋白还与克雅氏病( c r e u t z f e l d t j a c o b d i s e a s e ，c j d ) 有 关，并且患者脑脊液特定的1 4 3 3 蛋白异构体可作为c j d 诊断标志物【4 3 1 。在 阿尔茨海默病( a l z h e i m e r s d i s e a s e ，a d ) 中，1 4 3 3 蛋白位于神经纤维缠结 ( n e u r o f i b r i l l a r y t a n g l e ，n f t ) 中，n f t 含有微管结合蛋白t a u ，1 4 3 3 可以通过促 进t a u 磷酸化，导致微管不稳定和n f t 的形成，最后引起神经退化【4 5 l 。此外， 研究发现1 4 3 3 、”浓度在神经元遭到破坏的a i d s 患者的脑脊液中也升高， 当这些蛋白质从受到破坏的神经细胞中释放出来时，可以作为己受到破坏神经元 数量的实时标记物1 4 6 1 。1 4 3 3 a 和癌症发生密切相关。在多种肿瘤细胞中发现 1 4 3 3 0 基因中的“c p g 岛”发生高频率的甲基化，导致1 4 3 3 0 基因沉默或低表 达，从而引起g 2 期检控点损伤，基因缺陷积累，最后细胞发生恶性转化 2 1 , 4 7 1 。 此外，1 4 3 3 6 除了可以激活p 5 3 转录之外，还可以阻断m d m 2 介导的p 5 3 泛素 化和核输出，使p 5 3 表达稳定，进而发挥其抑制肿瘤细胞生长的作用f 4 3 1 。如在 乳腺癌m c f 7 细胞中，e f p ( 泛素连接酶e 3 ) 作用于1 4 3 3 a 并引起其降解，从而 促进乳腺癌细胞生长【4 引。在某些肺癌细胞中也发现1 4 3 3 基因缺失，导致g 2 期检控点损伤【5 0 】。研究同时发现1 4 3 3 p 、1 4 3 。3 t 肿瘤细胞中表达水平上调，因 此它们可能具有致癌特征【2 。 前言 细胞凋亡一 b a d 限数增殖 一r a f 细胞周期卜c d c 2 5 基因转录bf k h r l 损伤 米勒迪克综合症 图31 4 3 3 蛋白的功能及与其相关的疾病 f i g u r e31 4 - - 3 - 3p r o t e i nf u n c t i o n sa n di t sp o s s i b l er e l a t i o nw i t hd i s e a s e s 2 4 秀丽隐杆线虫1 4 3 3 蛋白的研究现状 在秀丽隐杆线虫中，已经确认仅有两种1 4 3 3 蛋白编码基因：似2 和 p a r 5 1 5 1 1 。它们表达都很广泛，而且两者编码的蛋白序列有高达8 6 2 的相同和 9 0 2 的相似。w a n g 等人用绿色荧光蛋白标记f 1 v r 2 与p a r 5 研究其表达，发 现f t t 2 ：g f p 和p a r 5 ：g f p 在秀丽隐杆线虫细胞的细胞质和细胞核中都有表 达，f t t 2 ：g f p 在转基因线虫的咽部和神经有强烈表达，而在肠道组织的表达 非常微弱，p a r 5 ：g f p 在转基因线虫的神经和肠道组织有强烈表达，f t t 2 和 p a r 5 在体壁肌肉都有微弱的表达【5 2 1 ( 图4 ) 。 图4f t t 2 ：g f p 与p a r - 5 ：g f p 的在体内的表达模式 f i g u r e4e x p r e s s i o no fp a r - 5 ：g f pa n df t t 2 ：g f p ( f r o mw a n ge ta 1 ，m e c h a n i s m so f a g e i n ga n dd e v e l o p m e n t ，2 0 0 6 ) 前言 目前，在秀丽隐杆线虫中，1 4 3 3 蛋白的研究围绕在其与其它靶蛋白的相互 作用及其调节机制与功能上。m o r t o n 纠5 3 1 人在2 0 0 2 年发现p a r - 5 是秀丽隐杆 线虫在早期胚胎发育过程中细胞不对称分裂所必需的。p a r 5 蛋白调节其它一些 蛋白的非对称皮层定位，如：调节p a r 1 和p a r 2 定位到皮层后部，调节p a r 一3 、 p a r - 6 和p k c 3 定位到皮层前部。用r n a 干扰的方式沉默p a r - 5 基因会造成 1 0 0 的胚胎致死。相对而言，肛2r n a i 则造成很少的胚胎致死，但胁2r n a i 之后产卵数显著下降，且成虫在开始产卵后的第5 天左右因虫卵在体内孵化 ( b a g ) 而陆续死亡。l i 等【5 4 j 人在2 0 0 7 年发现加2r n a i 增强了d a f - 2 基因介导 的d a u e r 形成( d a u e rf o r m a t i o n ) 表型，让作为胰岛素信号通路的主要下游效应 器的d a f 1 6 在核内聚集并加强d a f 1 6 下游基因的转录，p a r 5r n a i 对这些没 有影响。用r n a i 的方式将加2 和p a r 5 同时沉默后线虫出现叠加的表型，这说 明，尽管这两个同源蛋白的氨基酸序列有高度的相似性，但是它们在功能上是有 分化的。 。早在1 9 9 8 年l a k o w s k i 等人就发现在适宜的环境条件下，胰岛素信号通路 中的a k t 激酶进一步磷酸化转录因子d a f 1 6 确保d a f 1 6 存在于细胞质中【5 5 1 ， 而o h 等在2 0 0 6 年发现环境对虫株生存造成压力时，1 4 3 3 将未被磷酸化的 d a f 1 6 带入核中，加强了d a f 1 6 下游基因丌始转录，从而延长了寿命，并抵 御了逆境。同时，w a n g 等【5 2 1 人在2 0 0 6 年通过免疫共沉淀( c o i p ) 和基质辅助 激光解析电离飞行时问质谱技术( m a l d i t o f m s ) 的方法发现p a r 5 与s i r 2 1 存在直接的相互作用，并通过酵母双杂交的方法发现f t t 2 与s i r 2 1 存在直接 的相互作用和免疫共沉淀技术证实f t t 2 和p a r 5 都与d a f 1 6 有直接的相互 作用。这些结果提示了1 4 3 3 与d a f 1 6 和s i r 2 1 的直接作用关系。同时，w a n g 等人发现p a r 5r n a i 能够轻微的缩短野生型线虫的寿命，却能够强烈的抑制由 s i r 2 1 过量表达引起的长寿表型，而且p a r - 5r n a i 并不能影响由d a f - 2 突变引 起的长寿表型1 5 2 】。这个结果表明：1 4 3 3 蛋白表达水平的下降会特异地抑制由 s i r - 2 1 过量表达引起的长寿表型。另外，b e r d i c h e v s k y 等人还发现过量表达 s i r 2 1 能增强虫株对热与氧化压力的耐抗性，并且1 4 3 3 蛋白这种耐抗性增强 是必须1 5 6 1 。由此推测：1 4 3 3 与s i r - 2 1 相互作用并通过一条不同与胰岛素样生 长因子受体信号通路来调节d a f 1 6 的功能，从而影响秀丽隐杆线虫的寿命。 3 自噬 l o 前言 3 1 自噬简介 自噬( a u t o p h a g y ) 是细胞利用溶酶体降解自身受损的细胞器和大分子物质的 过程，是真核细胞特有的生命现象，在营养缺乏时对维持细胞分化和生存起着非 常重要的作用【5 7 - 5 9 1 。早在1 9 6 2 年，a s h f o r d 等【删就在胰高血糖素处理的小鼠肝 细胞中观察到了细胞自噬现象。1 9 6 3 年，d ed u v e 在国际溶酶体生物学论坛上首 次提出了细胞自噬的生物学概念：细胞在缺乏营养和能量供应时，部分细胞质与 细胞器被包裹进一种特异性的双层膜或者多层膜结构的自噬体中，形成的自噬体 再与溶酶体融合形成自噬溶酶体，胞质和细胞器成分在这里被降解为核苷酸、氨 基酸、游离脂肪酸等小分子物质，这些小分子物质可以被重新利用合成大分子或 者合成a t p ! 引l 。 2 0 世纪9 0 年代，人们在酵母中发现并鉴定了二十余种自噬相关基因。2 0 0 3 年，k l i o n s k y 等将这些基因统一命名为a t g ( a u t o p a h g yr e l a t e dg e n e s ，a t g ) 6 2 1 。酵 母的a t g 可以根据功能的不同分成三类：( 1 ) 一对泛素样蛋白结合系统，包括a t 9 8 和a t e , 1 2 。二者与自噬泡的延伸与形成有关；( 2 ) 磷脂酰肌醇3 磷酸激酶复合物 ( p 1 3 kc o m p l e x ) ；( 3 ) 一个丝、苏氨酸激酶复合物，包括a t g l 、a t g l 3 和a t g l 7 ，这 个复合物在酵母细胞中与自噬的诱导相关。 3 2 自噬的发生与调节 自噬作为细胞生存的一种机制，在很多生理过程如清除损伤、衰老细胞器以 及冗余蛋白上发挥着重要作用【6 3 1 。除营养和能量缺乏外，氧化应激、感染以及 蛋白质大量聚集等元素也可以诱导细胞发生自噬【5 8 j 。通过自噬，细胞可以在饥 饿条件下存活数天甚至数周m 1 。 自噬的生理过程包括信号刺激、自噬泡的形成、自噬泡与溶酶体融合、内容 物的降解以及降解产物的释放。在细胞的正常生理活动中，自噬维持在一个非常 低的水平以保持细胞稳态【6 5 1 。当细胞处于饥饿、营养因子缺乏的环境或者进行 结构调整以及降解胞内代谢产物及损伤细胞器的时候，细胞内的自噬水平会迅速 上调，r o s 、感染以及蛋白质产物的聚集都是细胞自噬的诱因。发生自噬时，细 胞内首先形成杯状的自噬泡。并随后将待自噬物质包裹起来。 3 3 自噬基因与寿命调控间的关系 酵母中的彳辔6 v p s 3 0 基因以及这个基因在多细胞生物中的同源基因在自噬 过程中发挥着重要的功能。哺乳动物与a t g 6 v p s 3 0 对应的同源蛋白是b e c l i nl 。 前言 研究发现，除了可以调节自噬过程外，b e c l i nl