（农产品加工及贮藏工程专业论文）南瓜叶蛋白加工方法及其制品的安全性评价研究.pdf

摘要 南瓜叶蛋白加工方法及其制品的 安全性评价研究 农产品加工及贮藏工程硕士研究生黄成 指导教师吴文标研究员 摘要 本研究以南瓜叶为研究对象，发展出一套工艺简单、便于工业化且效果好的浓缩南瓜叶 蛋白质的生产方法，重点对南瓜叶及其蛋白质制品的主要成分、有毒化合物和食用安全性进 行了研究。 实验研究首先比较了水洗脱法、酸洗脱法、醇洗脱法、水一醇洗脱法、酸一醇洗脱法制备 南瓜叶蛋白制品的效率。结果表明各种方法的浓缩效果为：酸一醇洗脱法 水一醇洗脱法 醇洗脱法 酸洗脱法 水洗脱法，其中酸醇洗脱法的最佳提取条件为；先用4 o 浓度的乙酸 1 0 0 浸提3m i n ，再用9 5 乙醇提5 h 时，提取的叶蛋白制品蛋白质含量和蛋白质得率综合 效果比其余方法都高，蛋白质含量为4 7 7 1 ，蛋白质得率达9 3 1 4 。因此，后续的实验中 选择此工艺参数制备南瓜叶蛋白制品。 然后，对南瓜干全叶样和浓缩叶蛋白样中植物多酚化合物和生物碱的含量进行了初步评 价，结果表明：南瓜干全叶样中含有1 0 9 4 m g 1 0 0 9 的多酚类化合物，浓缩南瓜叶蛋白中多 酚类化合物含量为2 7 4 m g l o o g 。南瓜干全叶样中含有7 3 3 6 m g 1 0 0 9 的生物碱，经过浓缩后 的叶蛋白制品的生物碱含量为1 9 3 6 m g 1 0 0 9 。上述结果表明在所有考察的方法中采用先酸洗 后醇洗生产浓缩叶蛋白的方法除去部分酚类化合物和生物碱的效果最佳。 急性毒性动物喂养实验结果表明：通过浓缩南瓜叶蛋白的四个剂量组，测出小鼠经口 l d 5 0 2 0 o e , k g b w ，根据我国食品安全性毒理学评价的6 级比标准，初步判断采用先酸洗后 醇洗生产的浓缩南瓜叶蛋白是无毒的。 七天和三十天、九十天、一百八十天喂养实验结果表明；试验期间动物未出现拒食现象， 动物生长活动正常，被毛浓密有光泽。南瓜叶全叶组、浓缩叶蛋白组动物体重、食物利用率、 主要脏体比与对照组比较差异无显著性( p o 0 5 ，t 检验) 。对照组、粮食组、全叶组及浓缩叶 蛋白组的白细胞计数、红细胞计数、血红蛋白等各项指标均在正常值范围内。大体解剖及组 织学检查未发现该受试物对各剂量组被检动物的受检脏器产生有意义的病理变化。 关键词：南瓜叶蛋白动物喂养实验食用安全性评价 a b s t r a c t p r o c e s s i n gm e t h o d sa n dd i e t a r ys a f e t ye v a l u a t i o no f p u m p k i n ( c u c u r b i t am o s c h a t a ) l e a fp r o t e i np r o d u c t s c a n d i d a t e ：w e ih u a n g s u p e r v i s o r ：p r o f w e n b i a ow u a bs t r a c t t h i se x p e r i m e n t a t i o nh a sb e e nc a r r i e do u tt om a i n l yd e v e l o p 锄e a s yo p e r a t i n gm e t h o do f p r o c e s s i n gap r o t e i nc o n c e n l r a t e ，w h i c hs h o u l dr e a d i l yb ei n d u s t r i a l i z e d ，b yu s i n gp u m p k i nl e a v e s a sl a wm a t e r i a l s ，a n a l y z et h en u t r i t i o n a lc o m p o n e n t sa n dp o i s o n o u sc o m p o u n d so fl e a fp r o d u c t s a n de v a l u a t et h e i rd i e t a r ys a f e t y f i r s t l y , t h ec o m p a r i s o no ft h ee f f i c i e n c yo ft h ef i v ek i n d so ft e c h n i q u e sf o rp r e p a r i n gp r o t e i n p r o d u c t sa r ee n g a g e di nt h ee x p e f i m e n t ，w h i c ha r ew a t e re x t r a c t i o n , a c i de x t r a c t i o n ，e t h a n o l e x t r a c t i o n , w a t e r - e t h a n o le x t r a c t i o na n da c i d e t h a n o le x t r a i o n t h er e s u l t si n d i c a t et h a tt h e e f f e c t i v eo r d e ro ft h e mi sa st h ef o l l o w i n g ：w a t e re x t r a c t i o n a c i de x t r a c t i o n e t h a n o le x t r a c t i o n 南瓜 叶蛋白 紫花苜蓿叶蛋白 大豆蛋白，表明南瓜叶蛋白的氨基酸平衡性优于紫花苜蓿叶蛋白和 大豆蛋白，接近鸡蛋蛋白( 见表1 8 ) 。 1 3 2 已报道过的南瓜叶蛋白的加工研究 蛋白质是南瓜叶的主要营养成分，它是体现南瓜叶价值的主要因素，但是，至今为止， 世界上关于其基础研究和加工利用方面的研究报道并不多见。 学者n w o r g u 8 1 曾直接将南瓜鲜叶经研磨、压榨、过滤后直接添加入饲料中对火鸡进行饲 喂实验，其结果表明：添加的南瓜叶蛋白最高剂量组( 1 2 0 m l 1 ) 在8 周的饲喂期内，在增重 量、收益、成本收益率及每公斤增重所需成本方面效果最好。a l e t o r 9 1 等将打碎后的南瓜叶浆 液加热至8 0 9 0 c 提取1 0 r a i n ，经分离得到的浓缩蛋白，其粗蛋白含量达到5 4 9 。 1 3 3 南瓜叶蛋白的食用安全性 1 3 3 1 人类的食用实践 南瓜叶常常被当做蔬菜食用，土家族名菜懒豆腐就是以大豆和南瓜叶为原料制成的，更 有词“椒木擂钵磨豆浆，青青瓜叶入鲜汤。一。川菜中也有用南瓜叶做的菜式，其中南瓜叶酱 汤就是比较出名的一道。除了我国现在许多地方将其做蔬菜食用外，世界上其它国家或地区， 例如非洲的尼日利亚等地也将其当蔬菜食用。 7 卓 一i 两南大学硕卜学位论文 南瓜叶还被用于人体治疗实践，据闽东本草中记载，南瓜叶水煎后服用可治疗风火 痢，南瓜叶干粉可用于外敷治疗刀伤；岭南草药志中也记载，南瓜叶与腥豆叶、剃刀柄， 晒干研末，蒸猪肝服，可治小儿疳积。从其所涉及的组织愈合和调节肠胃系统功能来看，它 不仅具有一定的食用安全性，可能还含有重要的人体营养因子。 1 3 3 2 来自其它方面研究的启示 大量研究表明，植物中存在着些毒性物质，这些物质虽对人体具有一定功效，可同时 也对人体产生巨大的毒害作用，虽然在蛋白质提取的过程中，多酚化合物的含量会因为洗脱 而减少，但在叶蛋白的提取物中仍然会存在着多酚化合物及生物碱类化合物等毒素物质，这 些化合物的存在会影响到叶蛋白的食用安全性，对这些物质进行毒理研究，是为更合理的应 用这些物质寻找到一定的科学依据。 1 3 3 2 1 生物碱类化合物 生物碱大多数具有毒性。长期摄入一定量的生物碱，对人体中枢神经系统，呼吸系统， 消化系统和生殖系统等有影响。到目前为止，引起过人体中毒的生物碱主要有甾族生物碱、 双吡咯啶生物碱、胺类生物碱、嘧啶葡萄糖苷和嘌呤碱( 如咖啡因) 掣1 们。 ( 1 ) 甾族生物碱 目前发现这类物质主要存在于茄科的马铃薯、番茄、茄子和颠茄等植物中，它是一种糖 苷生物碱，是带糖苷键的含氮甾族化合物。此类生物碱在生理上是一种乙酰胆碱酶抑制剂， 会导致神经损伤的症状。王亚维 1 1 - 1 2 】等发现b 谷甾醇进入昆虫体内后使消化系统中的肠脂酶 的活力降低，中肠中的酶蛋白含量增加，体内总糖和血淋巴中总糖含量增加，而血淋巴中蛋 白质含量降低。在历史上有记载食入这类生物碱而导致中毒死亡和致畸型的事件发生。甾类 生物碱还可能会破坏细胞膜，给消化系统及其它正常代谢带来不良的影响。 ( 2 ) 嘧啶葡萄糖苷 已发现此类毒素存在于蚕豆种子中，另外在许多豆科植物的花粉中也有发现。此类生物 碱对某些人群，尤其是具有过敏症的人群来说，具有一定的毒性。摄入该毒素后，可以导致 急性溶血性贫血症。 ( 3 ) 其它生物碱 咖啡因摄入过多会使人的大脑处于过度兴奋状态而引起不良反应，甚至可导致死亡。另 外，帖类生物碱、海豚毒素、毒腈类化合物、烟碱等生物碱都具有一定的毒性，对人体或多 或少都有影响。 a k u b u e l l 3 1 等的研究发现。南瓜叶经烘干后用石油醚、苯、氯仿、丙酮、乙醇和水浸提， 2 第l 章文献综述 蒸发出溶剂后得到浓缩蛋白，其中，将氯仿和水提取的叶蛋白以1 0 0 m g k g 的计量进行灌胃， 结果表明其具有较强的毒性，经测定氯仿提取的叶蛋白中主要毒性物质为生物碱，含量为浓 缩蛋白的0 6 6 。其它溶剂提取的叶蛋白无急性毒性，但是，在乙醇和水浸提物中均检测出 一定量的生物碱。当然，具有争议的是：实验物是浓缩制品，与南瓜叶或南瓜叶蛋白的情况 有很大的不同，过量的维生素也是有毒的。 1 3 3 2 2 植物多酚类化合物 植物多酚( p l a n t p o l y p h e n 0 1 ) 又称为单宁( t a n n i n s ) ，是由没食子酸( 或其聚合物) 的葡 萄糖醇( 及其多元醇) 、黄烷醇及其衍生物的聚合物以及两者的混合物共同组成的植物多酚， 是天然植物中分离提纯的多种酚类化合物的复合体【1 引。它们广泛存在于植物叶、木、皮、 壳和果肉中。 长期食用一定量的植物多酚，可能引起微量元素的吸收及蛋白质的消化障碍。一般情况 下，多酚化合物与蛋白质以氢键或疏水键结合，这种结合大多是可逆的。当植物多酚以疏水 键和多点氢键与蛋白质或酶( 特别是消化道中的酶) 结合时，就会降低食物的消化吸收利用 率。b r u n e t l l 4 1 等报道多酚化合物在肠道内与食物蛋白质和消化酶发生不可逆的结合，并且还 会和体内血浆蛋白质结合。 此外，如黄酮，虽然具有抗氧化作用，但其氧化作用往往大于其还原作用，从而对人体 细胞产生毒作用。在高浓度时，一些黄酮类化合物成为促氧化剂，产生自由基，造成d n a 损伤，包括大部分黄酮醇在a m e s 试验及其他体外试验中都表现出了遗传毒性 1 5 - 1 6 】。另外， 某些黄酮化合物的促氧化作用能损伤人红细胞膜膜蛋白的构象2 2 1 。更有学者认为黄酮类化合 物是抗营养因子，他们用不同多酚含量的水生植物饲养同种动物，发现多酚含量高的植物对 动物生长具有明显的抑制作用。并且黄酮与体细胞酶作用还可以引起致癌物质的活性，异黄 酮的摄入还会打乱人体的内分泌，对人体造成生殖毒性。 刘清波等人以乙醇为浸提液用超声波法提取南瓜叶中总黄酮，其测定结果表明：南瓜 叶中总黄酮含量为2 5 1 。a k u b u e ”】等用水等溶剂浸提南瓜叶干叶的研究结果还显示：以水 提取的南瓜叶蛋白具有急性毒性，其中含有皂角苷和多酚类物质，总含量为4 7 。鉴于之前 这些学者的研究结果，对南瓜叶的植物多酚的总量进行测定及分析是有必要的。 1 4 南瓜叶蛋白研究与发展的不足 研究得知南瓜叶的主要营养成分是蛋白质，对叶蛋白进行开发很有应用前景。虽然各个 国家的学者对南瓜叶开展了些研究，但是还很不全面，仍有许多地方没有涉及。由此可见 南瓜叶各方面的评价研究还将继续下去。其研究方面的不足主要表现在： 在毒性评价方面，在已有的南瓜叶蛋白毒性试验报道中，他们使用的试毒材料是从南瓜 9 西南大学硕上学位论文 叶中的萃取物，并且处于高度浓缩状态，不能说明南瓜叶及其蛋白制品的毒性。对其叶蛋白 制品中的生物碱和多酚化合物等含量都有测定数据【1 3 1 ，但是不同的加工方法去毒或浓缩毒素 的能力是不一样的。这也说明了关于南瓜叶蛋白制品的毒性评价各方面还有很多亟待解决的 疑问和研究的方向，特别是关于南瓜叶蛋白制品的亚急性、亚慢性和慢性毒性方面的研究资 料，以及针对不同的加工方法对南瓜叶蛋白食用安全性方面的研究，没有形成系统连贯的研 究，这些方面都是急需加强的。 功能评价方面，关于南瓜叶蛋白的分散性、乳化性、起泡性方面a l e t o r 曾做过一些研究， 但是其研究内容比较少，也相对基础。而关于纤维形成性、蛋白酶活性等其它方面未见相关 报道。如果加以研究，指导南瓜叶蛋白的加工技术研究，将可能带来南瓜叶蛋白加工技术方 面的突破性进展。这样既弥补了蛋白质不足，又增加了食品风味、种类、优化了食物结构。 应用方面，目前大部分都是把南瓜叶用作动物饲料成分，有明显的增加动物胴体重量的 效果，在饲喂过程中，起到了减少饲料消耗的作用，增加了经济效益。由于受脱色、脱味和 纯化技术的限制，南瓜叶蛋白制品在食品中应用不多。目前技术水平条件下，在食品中添加 的应用技术也还有待于进一步研究；如何利用南瓜叶蛋白制品生产优质的水解蛋白或调味品 等同样有待于进一步研究。作为保健食品或化妆品中的抗氧化因子等，这些方面的应用较少。 1 5 未来研究建议 l 、蛋白质的功能特性对加工后的食品质构有重要作用。对叶蛋白的各种功能特性尚无统 一的测定方法。在实验室小范围内测定的方法差异使得试验结果差异很大，学术交流困难， 建议研究和发展比较规范且能准确地测定南瓜叶蛋白质功能特性的方法。 2 、食用南瓜叶蛋白的提纯现在正处于实验室试验阶段，关于工艺流程的研究国内尚未见 报道，如何规模化生产等问题尚待进一步研究。 3 、开发研制专门针对叶蛋白生产的工艺与设备。 4 、进一步开展南瓜叶蛋白在食品领域中的应用研究。 5 、开展南瓜全叶及其蛋白的急性毒性、亚急性、亚慢性、慢性致毒性以及致癌作用等研 究。 6 、开展不同的加工方法对南瓜叶全叶及其蛋白的急性毒性、亚急性、亚慢性、慢性致毒 性以及致癌作用的影响的研究。 1 6 本项目的研究内容及预期结果 由于受人力、时间和资金等多方面的限制，本项目只能针对南瓜叶蛋白的加工方法以及 其蛋白制品的亚慢性致毒性的研究。 1 0 第1 章文献综述 根据已报道的研究结果，醇提物具有很强的毒性，因此，可以推断乙醇提取对南瓜叶具 有脱毒作用，再加上它具有脱色和脱味的作用，可以拓宽产品的应用范围。所以，本项目决 定开展以乙醇为基础的不同加工方法对南瓜全叶及其蛋白制品的亚慢性致毒性的影响方面的 研究。 1 6 1 南瓜浓缩叶蛋白的制备 本研究将对南瓜浓缩叶蛋白的制备工艺进行比较研究，筛选出最适用于工业化生产的方 法。 1 6 2 南瓜全叶及其蛋白制品中有毒物质的分析 本研究将检测南瓜全叶及南瓜浓缩叶蛋白中所含有的生物碱、酚类化合物的含量，为初 步判断南瓜全叶及南瓜浓缩蛋白的毒性提供依据。 1 6 3 南瓜叶蛋白的急性毒性试验 本研究将通过观察用南瓜叶全叶及叶蛋白产品对小鼠进行灌喂处理后的毒性反应，测定 其l d 5 0 ，为下一步毒性试验的剂量选择提供依据。 1 6 4 南瓜叶蛋白的亚慢性试验 本研究将通过观察小鼠采食南瓜全叶及叶蛋白制品7 天、1 个月、3 个月、6 个月的生长 情况、脏器的变化、血液的生化指标变化等，以判断其毒性的性质和强度，为南瓜叶蛋白制 品的应用研究提供依据。 1 7 本项目的创新之处 1 7 1 本研究对不同的加工方法浓缩南瓜叶蛋白制品的效果进行比较，并且发展出一种经济 有效的新的工业化加工方法。 1 7 2 在本研究过程中，以将南瓜全叶及叶蛋白制品的食用安全性评价结果和蛋白质的浓缩 效果结合在一起作为判断优良的加工方法的科学依据，国内外文献中还未见这方面的研究报 道。 1 7 3 本研究的动物喂养试验，进行了为期约6 个月的时间，对于全叶及叶蛋白制品方面的 毒性研究尚未见此期限的研究报道。 第2 章南瓜叶蛋白制品的制备 2 1 前言 第2 章南瓜叶蛋白制品的制备 目前应用于其它叶蛋白制品的制备方法比较多，但是关于南瓜叶蛋白产品的制备工艺， 至今为止没有人进行研究。天然蛋白的分离和提取应依据人们的利用目的及提取蛋白含量和 品质以及成本为考虑。 南瓜叶鲜叶蛋白含量为7 3 4 ，除去水分干全叶蛋白质含量为3 5 6 8 。南瓜叶鲜叶除去 水分，使得鲜叶中各种营养物质的浓度提高，起到了浓缩的作用，提高了蛋白质含量，便于 储存；如果无毒，这种产品具有一定的应用范围。 传统叶蛋白的提取工艺主要包括压榨取汁液、汁液中蛋白质的絮凝和叶蛋白的浓缩干燥 等，其中蛋白质的絮凝和分离是叶蛋白提取工艺的核心。然而这种传统的方法所采用的工艺 流程复杂，不适合工业生产。所以，本次实验中未采用这类加工工艺。 本实验以低成本高效率为初衷，通过直接加热法使南瓜叶中各种酶失活及软化叶片后， 经有机溶剂、乙醇依次对南瓜叶中的蛋白质进行进一步的提纯研究，为南瓜叶蛋白进一步开 发利用提供科学依据。 2 2 实验材料与方法 2 2 1 实验材料 南瓜叶：采自西南大学黄树村 2 2 2 实验设备 电阻炉：4 - 9 0 箱式电阻炉，沈阳市节能电炉厂 恒温箱：d h g 9 1 4 0 a 电热恒温鼓风干燥箱，上海齐欣科学仪器有限公司 水浴锅：h h - 2 数显恒温水浴锅，江苏省金坛市荣华仪器制造有限公司 分析天平：万分之一光学分析天平，上海第二天平仪器厂 凯式定氮装置：重庆北碚化学仪器厂 2 2 - 3 实验主要试剂 无水乙醇：分析纯( a r ) ，重庆川东化工有限公司生产 冰乙酸：分析纯a r ，重庆川东化工有限公司 盐酸：分析纯a r ，国营重庆无机化学试剂厂 1 3 西南大学硕十学位论文 i i 浓硫酸：分析纯a r ，重庆川东化工有限公司 硼酸：分析纯a r ，重庆川东化工有限公司 硫酸钾：分析纯a r ，重庆北碚化学仪器厂 硫酸铜：分析纯a r ，重庆川东化工有限公司 氢氧化钾：分析纯a r ，重庆川东化工有限公司 氢氧化钠：分析纯a r ，重庆川东化工有限公司 无水碳酸钠：分析纯a