（基础兽医学专业论文）高分子电解质分离碱性蛋白的方法及碱性多肽sdspage条件的优化.pdf

摘要等电点沉淀( i s o e l e c t r i cp r e c i p i t a t i o n ) 和聚合高分子电解质沉淀( p o l y e l e c t r o l y t ep r e c i p i t a t i o n ) 是蛋白质分离纯化的基本技术和常用方法，用于蛋白质分离纯化的前期处理，具有设备简单，处理量大，廉价和蛋白质不变性等特点。本试验研究了聚丙烯酸( p o l y a c r y l i e a c i d ，p a a ) 分离纯化苦瓜种仁碱性蛋白和蜜蜂毒素碱性多肽的方法及其影响因素。同时，研究了丙酮对苦瓜种仁和蜜蜂毒素脂类物质的清除作用，以及碱性多肽的s d s - p a g e 分离和分析方法。丙酮与苦瓜种仁或蜜蜂毒素研磨匀浆，过滤并用丙酮洗涤，室温干燥形成蛋白丙酮粉，与水抽提法比较，蛋白一丙酮粉的水溶性高、脂类含量少，利于蛋白质的进一步分离纯化。等电点沉淀试验表明，在p h 7 0 3 0 范围内，苦瓜种仁的中、酸性蛋白沉淀析出，上清液中等电点p ，值大于8 6 5 的碱性蛋白种类和含量与粗提液相似，而等电点p ，值为g 6 5 的碱性蛋白含量随溶液p h 值的降低而减少。等电点沉淀与酸介质密切相关。以柠檬酸( c i t r i ca c i d ) 调节苦瓜种仁租提液的酸碱度，在p h 7 o 6 0 之间的等电点沉淀作用明显，其中p h 6 0 时1 4 6 2 的苦瓜种仁蛋白被沉淀；以盐酸( h y d r o c h l o r i ca c i d ) 调节租提液酸碱度，在p h 7 o 4 0 之间的等电点沉淀作用明显，其中p h 4 0 时3 2 4 9 的苦瓜种仁蛋白被沉淀。醋酸( a c e t i ca c i d ) 的等电点沉淀作用呈现阶段性特点，在p h 7 o 6 0 和p h 5 o 4 0 之间的等电点沉淀作用明显，其 p h 6 0 和4 0 时分别有2 6 1 7 和3 8 7 2 的苦瓜种仁蛋白被沉淀。p a a 选择性沉淀苦瓜种仁碱性蛋白，与酸介质、p a a 浓度和p h 值的密切相关。醋酸、盐酸和柠檬酸处理的l m l 苦瓜种仁粗提液，p a a ( 1 ) 选择性沉淀碱性蛋白( 等电点为8 6 5 9 3 0 ) 的最佳用量分别为1 0 0 p 1 、1 2 0 p 1 和1 0 0 山。s d s p a g e 结果表明队a 沉淀醋酸处理的苦瓜种仁粗提液碱性蛋白的效率高于沉淀盐酸和柠檬酸处理的苦瓜种仁粗提液的碱性蛋白的效率。以醋酸分别调节苦瓜种仁粗提液p h 至5 0 、4 0 和3 0 ，等电点沉淀后的上清液用p a a 沉淀碱性蛋白，当p a a 用量为1 6 0 i _ t l m l 提取液时，p h 5 0 和3 0 样液分别有3 3 7 7 和4 3 5 6 蛋白质被沉淀：当在队a 用量为1 2 0 p l m l 提取液时，p h4 0 样液中3 0 8 3 蛋白质被沉淀。p a a 一蛋白质复合物溶解于碱性溶液( p h 9 o ) ，溶解性与n a c i 浓度的有关，当溶液n a c i 浓度为3 o 时，溶液蛋白质浓度最高。p a a 选择性沉淀的苦瓜种仁碱性蛋白经s e p h a d e xg 7 5 柱层析分离，分别在1 7 5 m i n 和3 0 0 m i n 出现2 个主峰i 和i i 。s d s p a g e 和i e f 分析表明主峰i 的分子量约为3 0 k d a ，p i 值约为9 3 ，主峰的分子量约为1 0 k d a ，p i 值约为9 5 。丙酮处理形成蜂毒一丙酮粉水溶液，p a a 选择性沉淀的碱性多肽经s e p h a d e xg 一2 5 凝胶层析分离，形成二个独立吸收峰i 和峰i i ，s d s p a g e 显示其分子量分别约为2 8 0 0 d a和1 0 0 0 d a ，i e f 显示峰i 含有等电点p i 为9 0 的碱性多肽。高交联度( c 6 0 ) 的尿素s d s p a g e 是多肽分离纯化和分析检测的主要技术，因碱性多肽的分子量和电荷特性，常用酸性电泳分离纯化和分析检测。本试验初步研究了低交联度的s d s p a g e 分析蜂毒碱性多肽的方法及有关条件的优化。s d s p a g e 结果表明，凝胶交联度c 为0 6 7 时，样品和m a r k e r 中低分子成份堆积在凝胶前沿，不能分离；凝胶交联度为1 2 0 0 , 时，样品中的低分子量成分不能分离；m a r k e r q b低分子量多肽( 分子量1 6 9 5 0 d a ) 基本分离；凝胶交联度c 为1 5 5 时，样品和m a r k e r中的低分子量成分分离良好；凝胶交联度c 为2 0 0 时，样品和m a r k e r 中低分子量多肽不能分离；当凝胶交联度 3 0 0 时，样品和m a r k e r 中低分子量多肽分离不理想。关键词：聚合高分子电解，聚丙烯酸，苦瓜，蜂毒，碱性蛋白，碱性多肽，s d s p a g e ，i e f2a b s t r a c tb o t hi s o e l e c t r i ca n dp o l y e l e c t r o l y t ep r e c i p i t a t i o nh a v e b e e ns h o w nt ob ee f f e c t i v ea n ds u r p r i s i n g l ys e l e c t i v ei ns e p a r a t i n gp r o t e i n sf r o mt h ee x t r a c t so f v a r i o u sh o s t s b e c a u s ei ti sas i m p l eu n i to p e r a t i o n , r e l a t i v e l yi n e x p e n s i v ea n ds t r a i g h t f o r w a r dt ob es c a l e d - u p ，p r e c i p i t a t i o ni so f t e nu s e di nt h ee a r l ys t a g e so f p r o t e i np u r i f i c a t i o np r o c e s s e sf o rp r o t e i nr e c o v e r ya n dp u r i f i c a t i o n i nt h i ss t u d y ，p o l y a c r y l i ca c i d ( p a a ) w a su s e dt oi s o l a t ea n dp u r i f ya l k a l e s e e n c ep r o t e i nf r o mm o m o r d i c ac h a r a n t i al s e e d sa n da l k a l e s c e n c ep e p t i d e sf r o mb e ev e n o m b e s i d e s t h ee f f e c to f a c e t o n eo nf a ta n da n a l y s i so f a l k a l e s c e n c ep e p t i d e sb ys d s - p a g ew e r ea l s oe v a l u a t e di nt h i sp a p e r a c e t o n ea n dm o m o r d i c ac h a r a n t i a s e e d s ( b i t t e rm e l o ns e e d s lo rb e ev e n o mw e r eh o m o g e n a t e d , f i l t r a t e da n dw a s h e d ( w i t ha c e t o n e ) t h ea c e t o n ep o w d e rw a so b t a i n e db ye v a p o r a t i o n c o m p a r e dt ow a t e re x t r a c t i o n ，p r o t e i nb ya c e t o n ee x t r a c t i o nw a sm u c hw a t e r - s o l u b l ew i ml i r l ef a t w h i c hc o n t r i b u t e dt or e c o v e r ya n dp u r i f i c a t i o no f p r o t e i n b yt h ei s o e l e c t r i cp r e c i p i t a t i o n ，t h en e u t r a la n da c i d i cp r o t e i nf r o mm o m o r d i c ac h a r a n l i al s e e d sw a sr e m o v e da tt h ep h7 o 3 0 i nt h eu p p e rs o l u t i o n t h ek i n d sa n dc o n t e n to ft h ea l k a l e s c e n c ep r o t e i n 、v i t l lp ，a b o v e8 6 5w a st h es a m et ot h ee x t r a c t i o n t h ea l k a l e s c e n c ep r o t e i nw i t hp l8 6 5d e c r e a s e dw i t hp hf a l l i n g t h ei s o e l e c t r i cp r e c i p i t a t i o nw a sr e l a t e dt oa c i dm e d i u m w h e nt h em o m o r d i c ac h a r a n t i a 工s e e d se x t r a c t i o nw a sa d j u s t e db yt h ec i t r i ca c i d t h ei s o e l e c t r i cp r e c i p i t a t i o nw a so b v i o u sd u r i n gt h er a n g eo fp h 7 o 6 0 a n d14 6 2 p r o t e i np r e c i p i t a t e da tp h 6 0 w h e nt b ee x t r a c t i o nw a sa d j u s t e db yt h eh y d r o c h l o r i ca c i d ，t h ei s o e l e c t r i cp r e c i p i t a t i o nw a so b v i o u sd u r i n gt h er a n g eo fp h 7 o 4 0 a n d3 2 4 9 p r o t e i np r e c i p i t a t e da tp h 4 0 w h e nt h ee x t r a c t i o nw a sa 由u s t e db yt h ea c e t i ca c i d ，t h ei s o e l e c t r i cp r e c i p i t a t i o nw a so b v i o u sd u r i n gt h er a n g eo fp h 7 0 6 0a n dp h 5 o 4 0 a n d2 6 17 a n d3 8 7 2 p r o t e i np r e c i p i t a t e da tp h 6 0a n dp h 4 o r e s p e c t i v e l y p r e c i p i t a t i o no fp a aw i t ha l k a l e s c e n c ep r o t e i nf r o mm o m o r d i c ac h a r a n t i al s e e d sw a si n f l u e n c e db ya c i dm e d i u m ，p a ac o n c e n t r a t i o na n dp h i nt h es o l u t i o n ( 1m e ) a d j u s t e db ya c e t i ca c i d ，h y d r o c h l o r i ca c i da n dc i t r i ca c i d ，p a a ( 1 ) w a sa d d e da t1 0 0 m ，1 2 0 _ t la n d1 0 0 “1 s d s p a g es h o w e dt h a tp a ap r e c i p i t a t i o np r o t e i ni ne x t r a c t i o na d j u s t e db ya c e t i ca c i dw a sm o r ee f f i c i e n tt h a nh y d r o c h l o r i ca c i da n dc i t r i ca c i d t h ee x t r a c t i o nw a st i t r a t e dt op h5 0 ，p h34 0 ，a n dp h3 0b ya c e t i ca c i d a f t e ri s o e l e c t r i cp r e c i p i t a t i o n , t h ep a ap r e c i p i t a t i o np r o t e i nw a sp e r f o r m e d w h e nc o n c e n t r a t i o no f p a aw a s1 6 0 p 1 r n l ，t h ep r o t e i nd e c r e a s e di nt h es u p e m a t a mw a s3 3 7 7 a tp h5 0a n d4 3 5 6 a tp h3 0 w h e nc o n c e n t r a t i o no fp a aw a s1 2 0 1 a m l ，t h ep r o t e i nd e c r e a s e di nt h es u p e m a t a n tw a s3 0 8 3 a tp h4 0 p a a - p r o t e i nc o m p l e xc o u n l dr e d i s s o l v ei na l k a l i n ec o n d i t i o u s ( p h 9 0 ) a n dt h es o l u b i l i t yw a sr e l a t e dt on a c lc o n c e n t r a t i o n w h e nt h en a c lw a s3 o t h ep r o t e i nm o s t e a s i l l yr e d i s s o l v e d t h eb l u e rm e l o ns e e d se x t r a c t i o na f t e rp a ap u r i f i c a t i o nf l o w e dt h r o u g ht h es e p h a d e xg 一7 5c o l u m n s t h ep e a k sia n d1 1w e r eo b t a i n e da f t e r1 7 5 m i na n d3 0 0 m i n r e s p e c t i v e l y s d s p a g ea n di e fa n a l y s i ss h o w e dt h a tt h em o l e c u l ew e i g h tf r o mp e a k s1w a s3 0 k d aw i t hp 1 9 3 ，p e a k sil o k d aw i t h 9 5 t h eb e ev e n o me x t r a c t i o na f t e rp a ap u r i f i c a t i o nf l o w e dt h r o u g ht h es e p h a d e xg 一2 5c o l u m n s t w op e a k sw e r eo b t a i n e d t h e i rm o l e c u l ew e i g h t sw e r ea b o u t2 8 0 0 d aa n d1 0 0 0 d ai e fs h o w e dt h a tp e a kii n c l u d e dt h ep r o t e i nw i t hp 9 0 s d s p a g ew i t i lu r e aa n dh i 曲c r o s sl i n g k i n g ( c ，c 6 o ) h a sb e e nu s e dt os e p a r a t ea n de x a m i n et h ea l k a l e s c e n c ep e p t i d e s b e c a u s eo fi t sc h a r a c t e r i s t i c so fm o l e c u l ew e i 曲ta n dc h a r g e ，t h ep o l y a c r y l a m i de l e c t r o p h o r e s i si na c i de n v i r o n m e n ti st h em e t h o da c c u s t o m e d t h i ss t u d ye v a l u a t e dt h ee f f e c to fs d s p a g ew i t ht h el o wcs e p a r a t i n ga l k a l e s c e n c ep e p t i d e su n d e rt h ed i f f e r e n tc o n d i t i o n s s d s - p a g es h o w e dt h a t ，t h el o wm o l e c u l ew e i g h tp e p t i d e si ns a m l ea n dm a r k e ra c c u m u l a t e di nt h ef r o mo f t h eg e lw i t ht h ec0 6 7 0 , 6 w h e nt h ev a l u eo f cw a s1 2 0 ，t h o u 曲t h el o wm o l e c u l ew e i g h tp e p t i d e si ns a m l ew e r en o ts t i l ls e p a r a t e d , t h ep e p t i d e s ( m r s 9 0 ) ，当溶液n a c 浓度为3 ，0 0 , 6 时，溶液蛋白质浓度最高。p a a 选择性沉淀的苦瓜种仁碱性蛋白经s e p h a d e xg 7 5 柱层析分离，分别在1 7 5 m i n 和3 0 0 r a i n 现2 个主蜂i 和i 。s d s - p a g e 和i e f 分析表明主峰i 的分子量约为3 0 k d a ，p l 值约为9 3 ，主蜂的分子量约为1 0 k d a ，p 堪约为9 5 。关键词：聚丙烯酸，碱性蛋白，s d s p a g e ，i e f ，苦瓜a l k a l e s c e n e ep r o t e i np u r i f i c a t i o nf r o mb i h e rm e l o n ( m o m o r d i c ac h a r a n t i a ) s e e d sb yp o l y a e r y l i c a e i dp r e c i p i t a t i o na b s t r a c t ：i nt h i ss t u d y ，p o l y a c r y l i c a c i dp r e c i p i t a t i o na l k a l e s c c n c ep r o t e i nf r o mm o m o r d i c ac h a r a n t i al s e e d s w a ss t u d i e d ，a n d t h ee f f e c t o f c o n d i t i o n s o n e x p e d m e n t w a sa l s o e v a l u a t e d i s o e l e c t r i cp r e c i p i t a t i o n i sa c h i e v e db ya d j u s t i n gt h ep ho f ap r o t e i ns o l u t i o na n di sb a s e do nt h a tap r o t e i n ss o l u b i l i t yi sa tm i n i m u ma ti t sp t h es a m p l ew a st i t r a t e dw i t hc i t r i ca c i d p r e c i p i t a t i o nw a so b v i o u sa tp h 7 ，0 - - 6 0a n da tp h 6 ，0 1 4 6 2 p r o t e i n sp r e c i p i t a t e d w t hh y d r o c h l o r i ca c i d t h ei s o e l a c t r i cp r e c i p i t a t i o nw a so b v i o u sa tp h 7 o 4 0a n da tp h 4 0 ，3 2 4 9 p r o t e i n sp r e c i p i t a t e d rw i t ht h ea c e t i ca c i d t h ei s o e l e c t r i cp r e c i p i t a t i o nw a so b v i o u sb o t ha tp h 7 o 6 0a n dp h 5 0 4 0 a tp h 6 。0 ，2 6 1 7 a n da tp h 4 0 ，3 8 7 2 p r e c i p i t a t i n g ，r e s p e c t i v e l y i nt h es o l u t i o n ( im l ) a d j m t e db ya c e t i c2 5a c i d ，h y d r o c h l o r i ca c i da n dc i t r i ca c i d ，p a a ( 1 ) w a sa d d e da t1 0 0 p l ，1 2 0 p 1a n d1 0 0 p 1 s d s p a g es h o w e dt h a ta c e t i ca c i dw a sm o r ee f f i c i e n tt h a nh y d r o c h l o r i ca c i da n dc i t r i ca c i d t h ee x t r a c t i o n ( 1m l ) w a st i t r a t e dt 0p h5 0 ，p h4 0 ，a n dp h3 0b ya c e t i ca c i d a f t e ri s o e l e c t r i cp r e c i p i t a t i o n ，t h ep a ap r e c i p i t a t i o np r o t e i nw a sp e r f o r m e d w h e nc o n c e n t r a t i o no fp a aw a s1 6 0 p l m l ，t h ep r o t e i nd e c r e a s e di nt h es u p e m a t a n tw a s3 3 7 7 a tp h5 0a n d4 3 ，5 6 越p h3 0 w h e nc o n c e n t r a t i o no f p a aw a s1 2 0 脚m l ，t h ep r o t e i nd e c r e a s e di nt h es u p e m a t a n t w a s3 0 8 3 a tp h4 0 p a a - p r o t e i nc o m p l e x c o u n l dr e d i s s o l v e i n a l k a l i n ec o n d i t i o n s ( p h 9 o ) a n dt h ep r o t e i nm o s te a s i l l yr e d i s s o l v e dw h e nt h en a c lw a s3 o t h eb i t t e rm e l o ns e e d se x t r a c t i o na f t e rp a ap u r i f i c a t i o nf l o w e dt h r o u g ht h es e p h a d e xg - 7 5c o l u m n s t h ep e a k sia n d1 1w e l eo b t a i n e da f t e r1 7 5 r a i na n d3 0 0 m i n ，r e s p e c t i v e l y s d s p a g ea n di e fa n a l y s i ss h o w e dt h a tt h em o l e c u l ew e i g h tf r o mp e a k s1 w a s3 0k d a w i t hp 1 9 3 p e a k s 1 0 k d a w i t hp 1 9 5 k e yw o r d s ：p o l y a c r y l i ca c i d ；a l k a l e s e e n c ep r o t e i n ；s d s - p a g e ( s o d i u md o d e c y l s u l f a t e rp o l y a c r y l a m i d eg e le l e c t r o p h o r e s i s ) ；i e f ( i s o e l e c t r i cf o c u s i n g ) ；m o m o r d i c ac h a r a n t i al 聚合高分子电解质含有大量的阳离子或阴离子，通过静电作用结合带相反离子的蛋白质，形成聚合高分子电解质一蛋白质复合物，电解质一蛋白质复合物相互作用或疏水作用形成沉淀颗粒( n i e d e r a n e ra n dg l a t z , 1 9 9 2 ) 。聚合高分子电解质沉淀技术具有聚合高分子电解质用量少( o 0 5 。0 1 ，w n ) 、选择性强的特点，沉淀后蛋白质保持生物活性，能被重新溶于水，并可形成高浓度的蛋白质溶液。聚丙烯酸( p o l y a c r y l i c a c i d ，p a a ) 是带阴离子的聚合高分子电解质，常被用于分离溶菌酶( s t e m b e r ga n dh e r s h b e r g e r , 1 9 7 4 ；c h e n m i n gz h a n g , e ta 1 ，2 0 0 5 ) 。s t e m b e r g 和h e r s h b e r g e r ( 1 9 7 4 ) ) 羁p a a 从鸡蛋清中成功分离溶菌酶，分离物的酶活力提高9 倍，p a a 对溶菌酶沉淀作用受溶液p h 影响；c h e n m i n gz h a n g ( 2 0 0 5 ) 等以蛋清溶菌酶为模式分子，在p h5 时的等电点沉淀后的上清液中，1 5 m gp a a 能沉淀0 8 5 m g 的溶菌酶。苦瓜种子中含有a 一苦瓜素( a - m o m o r c h a r i n , o , - m m c ) 、i s - 苦瓜素( 1 3 - m o m o r c h a r i n ，i b - m m c ) 、苦瓜激素、苦瓜抑制剂以及核糖体失活蛋白和苦瓜免疫缺陷病毒i 型抑制剂等多种碱性蛋白，由1 7 种氨基酸组成( l e e h u a n g s ，e t a l ，1 9 9 0 ；c h a r t w ye t a l ，1 9 9 4 ；m u f i o z r ，甜a 1 ，2 0 0 1 ；a i i t k ，“a 1 , 2 0 0 0 ；p u ，e l a l ，1 9 9 6 ；p a u l ，e t a l ，1 9 9 9 ) 。苦瓜种仁碱性蛋白的传统分离纯化方法是离子色谱、凝胶色谱、亲和色谱及其组合，这些方法大多都根据电荷效应和分子大小来分离纯化，分离时间长，最终收率也不理想( y e u n ghw ：e ta l ，1 9 8 8 ；f o n g ，e la 1 ，1 9 9 6 ；v a l b o n e s i ，e ta 1 ，1 9 9 9 ；m e n gy a n f a ，e ta 1 ，1 9 9 9 ；傅明辉，2 0 0 2 ；w a n gj i a n h u a ，e t a l ，2 0 0 2 ；w a n g b i n x i a n g ，e t a l ，2 0 0 4 ) 。2 6本试验以丙酮去除苦瓜种仁脂类物质，首次研究了苦瓜种仁脱脂蛋白溶液在不同酸介质和不同p h 条件下的等电点沉淀曲线，同时研究了p a a 对苦瓜种仁碱性蛋白的选择性沉淀作用，以及p h 、p a a 用量、n a c i 等因素的影响。l 材料与方法1 1 主要材料、试剂与仪器苦瓜种仁( 浙江大学疏菜研究所提供) ，牛血清白蛋白( b o v i n es e r u ma l b u m i n ，b s a ) ( s i g m a 产品) ，二喹啉甲酸( b i c i n c h o n i n i ca c i d ，b c a ) ( b i o b a s i ci n c ，) ，聚丙烯酸( p o l y a c r y l i ca c i d ，b 气a ) ( al i n e a ra c r y l i ca c i dp o l y m e ro f a v e r a g em o l e c u l a rw e i g h t2 4 00 0 0 ) ，s d s 标准分子量蛋白和瑾f 标准蛋白分别购自s i g m a 公司p h a r m a c i a 司，s e p h a d e xg 一7 5 ( p h 锄a c i a 产品) ，m u l t i s k a nm k 3 酶标仪( t h e r m ol a b s y s t e m sc o ，l t d ) ，l k b 多相电泳系统( l k b ) 。1 2 方法1 2 1 苦瓜种仁粗提液的制各取2 6 9 苦瓜种仁加入5 0m l 丙酮磨碎，过滤，并用1 5 0m l 丙酮洗涤，室温干燥得1 5g 种仁丙酮粉，溶于2 6 0m l 重蒸永，1 7 0 0 0r p m ，4 离心3 0m i n ，上清液即为苦瓜种仁脱脂粗提液，4 保存。1 2 2 苦瓜种仁蛋白的等电点沉淀各取2 0 m l 粗提液分别放入3 支洁净的离心管中，其p h 都为6 8 6 。分别用盐酸、醋酸和柠檬酸调p h 值至5 9 、4 8 、3 8 和3 0 ，每次调p h 后于8 0 0 0r p m ，4 离心5r a i n ，上清液转移至另一洁净的离心管中，记录体积，并留o 5 m l 检测蛋白含量、分子量和等电点。1 2 3p a a 对苦瓜种仁蛋白质的选择性沉淀及其影响因素1 2 3 1酸介质对p a a 沉淀作用的影响各取1 5 m l 粗提液分别放入3 支洁净的离心管中，分别用醋酸、盐酸和柠檬酸调p h值至4 0 ，8 0 0 0r p m ，4 c 离心5m i n ，取各种酸处理的上清液l m l 分别放入5 个1 5 m le p p e n d r o f 管，每个离心管中分别加入1 p a a8 0 山、1 0 0 斗1 、1 2 0 p 1 、1 4 0 p 1 、1 6 0 b t l ，混匀并置室温静止1 5 m i n ，3 0 0 0r p m 离心5m i n ，取上清检测蛋白等电点和分子量。2 71 2 3 2p a a 浓度和p h 值对p a a 沉淀作用的影响各取1 5 m l 粗提液分别放入3 支洁净的离心管中，用醋酸分别调p h 值至5 0 、4 0 和3 0 ，8 0 0 0r p n d 4 cn 心5m i n ，取每个p h 值的上清液l m l 分别放入5 个1 5 m l e p p e n d r o f管，每个离心管中分别加入1 p a a8 0 1 x l 、 0 0 r d 、1 2 0 1 t l 、1 4 0 p 1 、1 6 0 9 l ，混匀并置室温静止1 5 r a i n ，3 0 0 0r p m 离心5r a i n ，取上清检测蛋白含量。1 2 3 3n a c i 对p a a 蛋白质复合物溶解性的影响取1 0 0 m l 粗提液，以醋酸调节p h 值至4 0 ，8 0 0 0r p r r d 4 * c 离心5r a i n ，上清液转移至另一洁净的离心管，加入1 0 p a a1 4 m l ，室温静止1 5 r a i n ，3 0 0 0r p m 离心5m i n ，收集沉淀溶于6 0 m l 水中，n a 2 c 0 3 ( 1 t o o l l ) 调节p h 值至9 7 。各取1 0 m l 分别放入6 个离心管中，依次加入0 、0 , 0 5 、o 1 、0 2 、o - 3 、o 4 、o 5 9 n a c l ，再加入3 0 0 耻1 c a c l 2 溶液( 2 0 ) ，h c l 调p h 值至5 0 ，3 0 0 0 r p m 44 c 离心3m i n ，检测上清液的蛋白质浓度。1 2 4 苦瓜种仁蛋白质的分离纯化取2 0 r a l 粗提液，用醋酸调p h 值至4 0 ，8 0 0 0 r p m 4 c 离心5r a i n ，上清液转移至另一洁净的离心管，加入1 0 p a a2 8 0 肛1 ，混匀，室温静止1 0 m i n ，3 0 0 0 r p m 离心5m i n ，收集沉淀溶于1 2 m l 重蒸水中，以n a 2 c 0 3 溶液( 1 m o l l ) 谓 节p h 值至9 7 、加入0 6 9n a c l( 终浓度为3 ) ，再加入4 0 0 t 1c a c l 2 溶液( 2 0 ) ，h c l 调p h 值至5 0 ，3 0 0 0 r p m 4 c 离心3m i n ，上清液即为碱性蛋白溶液。经p a a 沉淀的碱性蛋白溶液 ：s e p h a d e xg 一7 5 ( 2 o x 5 0 o ) ，用5m m o l lp b s ( p h7 0 ，含0 4 n a c i ) 缓冲液洗脱，流速是1 8 m l h ，分别收集各个洗脱峰，检测各洗脱蜂蛋白的分子量和等电点。1 2 5 蛋白质含量、分子量和等电点的检测参照s m i t h 的方法( s m i t h , e ta 1 ，1 9 8 5 ) ，用二喹啉甲酸( b i c i n c h o n i n i ea c i d ，b c a ) 法检测样品蛋白质浓度，2 m g m l 的结晶牛血清白蛋白为标准液；s d s p a g e 检测分子量，等电聚焦( i s o e l e c t r o f o c u s i n g ，i e f ) 电泳检测等电点p h ( p i 值) ( 郭尧君，2 0 0 5 ) 。2 结果与分析2 1 苦瓜种仁蛋白的等电点沉淀曲线经丙酮处理的苦瓜种仁粗提液蛋白浓度为6 7 2 m g m l ，p h 为6 8 6 。以柠檬酸( c i t r i ca c i d )调节苦瓜种仁粗提液的酸碱度，在p h 7 o 6 0 之间的等电点沉淀作用明显，其中p h 6 02 8时1 4 6 2 的苦瓜种仁蛋白被沉淀；在p h 6 0 3 0 之间几乎没有沉淀作用。以盐酸( h y d r o c h l o r i ca c i d ) 调节粗提液酸碱度，在p h 7 o 4 0 之间的等电点沉淀作用明显，其中p h 4 0 时3 2 4 9 的苦瓜种仁蛋白被沉淀；在p h 4 o 3 0 之间的等电点沉淀作用减弱。醋酸( a c e t i ca c i d ) 等电点沉淀作用呈现阶段性特点，在p h 7 o 6 0 和p h 5 o 4 0 之间的等电点沉淀作用明显，而p h 6 o 5 0 和p h 4 0 3 0 之间几乎没有沉淀作用；其中p h 6 0 和4 0时分别有2 6 1 7 和3 8 7 2 的苦瓜种仁蛋白被沉淀( 图1 ) 。等电点沉淀试验结果表明盐酸和醋酸的等电点沉淀作用的效果优与柠檬酸。图1 柠檬酸、盐酸和醋酸对苦瓜籽蛋白的等电点沉淀作用f i g 1h o e l e c t r i ep r e c i p i t a t i o np r o f i l e so f n a t i v ep r o t e i nf r o mm o m o r d i c ac h a r a n t i am i t t e rm e l o ns e e d s ) t h ey - a x i si n d i c a t e st h ew e i g h tp e r c e n t a g eo fp r o t e i nf r o mm o m o r d i c ac h a r a n t i a ( b i t t e rm e l o ns e e d s ) r e m a i n i n gi nt h es o l u t i o na f t e rp r e c i p i t a t i o na td i f f e r e n tp h t h ee x t r a c tp hw a st i t r a t e dw i t hc i t r i ca c i d ，h c io ra c e t i ca c i d等电聚焦电泳结果显示，分别以盐酸、醋酸和柠檬酸为酸介质的等电点沉淀上清液中，酸性、中性蛋白的种类和含量随溶液p h 值的降低显著下降，等电点值大于8 6 5的碱性蛋白的种类和含量与粗提液相似，而等电点p ，值为8 6 5 的碱性蛋白含量随溶液p h值的降低而减少，这种减少作用以柠檬酸处理样品最明显( 图2 ) ，说明以盐酸，醋酸和柠檬酸为酸介质的等电点沉淀过程中，上清液中的酸性、中性蛋白形成沉淀，离心分离的上清液以碱性蛋白为主。等电聚焦电泳结果表明在p h 7 0 3 0 范围内，盐酸、醋酸等电点沉淀能有效除去苦瓜种仁粗提液中的酸性和中性蛋白，保留碱性蛋白。一摹_)暮=；io”u，警iu啊辟蓦u10图2 等电点沉淀后上清液蛋白质的i e f 图谱。1 ，2 、3 和4 分别为p h 3 0 、4 0 、5 0 和6 0 的盐酸处理上清液；5 、6 、7 和s 分别为p h 30 、4 0 、5 0 和6 0 的醋酸处理上清液i9 、t o 、j l 和1 2 分别为p h 50 、4 0 、3 0 和6 , 0 的柠檬酸处理上清液；】3 、1 4 为租提液；m 为i e f 标准蛋白f i g 2i e fp r o f i l e so fp r o t e i ni nt h eu p p e rs o l u t i o na f t e ri s e e l e e t r i cp r e d p i t a t i o n l a n e1 2 3a n d4 ：p h 3 0 ，4 0 ，5 0a n d6 0b e i n gt i t r a t a t e db yh y d r o c h l o r i ca c i d ；l a n e5 、6 ，7a n d8 ：p l d 0 4 0 5 0a n d6 0b e i n gt i t r a t a t e d 峥a c e t i ca c i d ；l a n e9 1 0 ，1 1a n d1 2 ：p h 5 0 ，4 仉3 0a n d6 0b e i n gt i t r a t a t e d b ye i t r i ca c i d ；l a u c l 3a n d l 4 ：c r u d ee x t r a c t ；l a e m ：i e f p r o 证i n m a k m r2 2 醋酸、盐酸和柠檬酸对苦瓜耔碱性蛋白沉淀的影响醋酸处理的苦瓜种仁粗提液( 1 m l ) 经8 0 9 l 、1 0 0 9 l ，1 2 0 脚、 4 0 p l 、1 6 0 9 l 的l p a a 沉淀后，1 0 0 dp a a ( ) 沉淀后的上请灌i e f 电泳结果未显示等电点p h 为8 6 5 9 3 碱性蛋白；盐酸处理的苦瓜种仁租提提液( 1 m l ) 经8 0 p l 、1 0 0 r d 、1 2 0 p l 、1 4 0 p l 、1 6 0