（生药学专业论文）灵芝液体发酵产漆酶研究.pdf

p e 妊h gu n i 。 m e d i c n lc o n e g e c h h 髓e c n d e 哪o | m e d i c 口ls c i 吼c e s 摘要 摘要 漆酶( b e l l z e n e d i o l ：o x y g e no x i d o r e d u c t a s e 苯二醇：氧氧化还原酶，e c l 1 0 3 2 ) 是一种含铜的多酚氧化酶，近年来，有关漆酶的研究已引起人们的广泛关注。目 前对真菌漆酶的研究多集中于少数几种真菌，有关灵芝漆酶的研究较少。 本文比较研究了热变性法和冰浴法终止酶活反应对灵芝漆酶活性测定的影 响，结果显示采用热变性法作为终止反应方法是可行的，相对于冰浴法，具有可 靠、可重复、简便快捷的特点。 对灵芝液体发酵产漆酶的培养基和培养条件进行研究，以发酵液中灵芝胞外 漆酶活性为衡量指标，正交试验结果得出最佳培养基组成为( 1 l ) ：葡萄糖( 碳浓 度为1 0m o l l ) 、棉花o 2 、磷酸氢二铵( 氮浓度为o 0 1m o l l ) 、干酪素o 5 、 吐温- 8 00 1 5m l ；优化培养基液体发酵液中灵芝漆酶活性是液体发酵基础培养基的 2 5 7 2 倍；最佳培养条件为：初始p h5 5 、装液量7 5m l 、接种量1 2 5 、菌龄5 2 4 h r 、培养时间9 2 4h r 。优化条件下灵芝胞外漆酶活性是未优化培养条件下的2 1 2 倍，是液体发酵基础培养基的4 9 2 6 倍。 由p a g e 电泳酶谱推断，液体发酵培养过程中，灵芝胞外漆酶是单一酶，并 不产生其他灵芝漆酶同工酶，且灵芝漆酶活性的升高与其表达量的增加呈正相关。 c u 2 + 、z n “、m n 2 + 和f e 2 + 等四种金属离子均不同程度地有利于灵芝胞外漆酶 的合成。c u “浓度的变化对灵芝漆酶活性影响最大，其最高值约为对照的3 4 7 倍， 其次是m n “，z n 2 + 和f e 2 + 浓度变化的影响相对较小。c u “、z n 2 + 和f e 2 + 均在较低 浓度起作用，而m n 2 + 对灵芝漆酶起促进作用的浓度相对较高。 香兰素、愈创木酚、阿魏酸和邻甲苯胺等四种诱导剂的诱导作用主要在于使 发酵液中灵芝漆酶活性达到峰值的时间发生变化，而不是诱导其表达量的增加。 阿魏酸的作用结果显示有别于其他三种诱导剂，暗示其可能存在不同的诱导机理。 关键词：灵芝；漆酶：液体发酵；培养基；培养条件；正交试验；聚丙烯酰 胺凝胶电泳：金属离子；诱导 q 坚坐墨丝堂型生丛堕丝! 堂箜垒堕里! 垒盟 z n 2 + a n df e 2 + c u 2 + z n 2 + a n df e 2 + r e a c t e do nl o wc o n c e t i a t i o w h i l et h ee f f i c i e n t c o n c e n t r a t i o no fm n 2 + w a s r e l a t j v e l yh i g h t h ei n d u c t j o no ff b u ri n d u c e r s ：v a n i l l i n ，g u a i a c o l ，f 色r u l i ca c i da n d0 一t o l i d j n ew a s s t u d i e d t h er c s u l t si n d j c a t e dt h a t t h em a i ne f f c c to ft h ef o u ri n d u c e r sw a so nt h et i m e o fi h em a x i m u m ，n o ti h ev a l u eo ft h em a x i m u m t h ed a t u m0 ff e r u l i ca c i ds h o w e d d j f f b r e n c e sf h ) mo t h e rt h r e ej n d u c e r s ，a n dw h i c hi m p l j e dt h a tt h e r ew o u l db ea d i f ! i e r e n tm e c h a n i s m k e yw o r d s ：g 口h o d e 堋口z h c 协m ；h c c a s e ；l i q u i df e r m e n t a t i o n ；c u l t u r em e d i u m ； c u l t u r ec o n d i t i o n ；0 r t h o g o n a le x p e r i m c n t ；p o l y c r y l a m i d eg e le l e c t r o p h o r e s i s ( p a g e ) ； m e t a l l i ci o n ：l n d u c e 。 3 事 童鲢 x 罩；蠹”q l 擎 莲! ! h _ 毫薯f ：；i 川筻蕈争f ! 目三8 = 鼙巷窭菲9 8 j 萎曩；薹l i i ：j 手；i l i 气i 吾i 耋自i 日i 备吾二 ；i ； ；雪垂蔫霆 ；暮i 羹 i 基| 1l 岛“l 藩i q 钆 箱“= _ | i 司i ；f i 嚣| 骂冀霎、o d 霸螬霾= i ：二i 一 ；n 自j = i 毒j 搴 亏i 目蕈i j ：；耋l 嚣赢罄i 具；堡ij _ i ! ；，2 1 、i j ； 羞；g j 登j ；手芏；g g i ； “* ! ；二睡瑟薹薹j | 墨 罨蘸爱一= = i i ；i i ； # 己蓁! i g 霪! f iq ；| j 目l g 譬基霉蠢 誊垂 摹；i ；e 萝 i | 誊：l 墅；j j i | ：! 冀警善善；二i ! j ； 吐 苫l 彗而! 摹# 蠹e f i ! 二；i i 毫目字i 霉j 蘑 i 垂l i 一蠹 q i i ：g l 萼! ；一鬈! ；萤；i l 私量l h | o l n 电! d 孽；酽薹薹? i 耋j ii i ；i ；i 霉i ；! i ；r ；薹ih q l l 蚤；h l j jn 7 扣i ；fi 蔓毒毒；i j i ； 至藿姜蒌 ；? ；* i j i i i 参；3 ；毽妻雾! 霆i ii 塞塞毒l “g l | 1 5 。= i ；墓蒜塞= el t t 昂：墓i 则叫； ! 墓i | ! ；耋薹l l ；j 喜事妻i 写蚕 童芎i 一塞爿：a孬目s 爱! i 堑 i _ ! ! l i | b i ；j ；自ii ! i ；二；一l 季1 d 日 j 鼍 弓? i 。 ； j 一”；! ! ； r 嚏j 童；琴自i i 垂 婪邛至；0耋霎 ；曩i f ；重鸯i 童；茹：；露g 摹1 。i j g ； e 耍s s z ； ii i i l ；薯| 目鼍 自； l ；1 ji 蔷； t j i 毛 耄熹 争二；g 璺莹| 豸至二季蓦兰孽i ；事i i ￥| j i i l 丕主 | 譬f ；自；女j ；：j i i 喜 i ；甜j 暑! ! 5 譬! ? ；i i 二 妻i q ；耄! 鼍鼍耋耋；! 亨l 髫i 藩。譬? 誊；二j 善? 喜；手i ：i 囊静i i 堂皇蠹目自# ；! 塞i 羹蓄矗釜疆冀冀i ；* 差 曼替 笔露瑙笺二鎏j 毒；毒目美章! ! 霉i 薯! 笔；茎垂目孽 鏖，莹s 薹g j j l ti 蓑! 殳； 二二二j ! 委i 辛越；4 嚣蠢l 薹：l 薹l 鳓# j f | | 彗；i 耋 ￥；l l ；l 二g ! 蔓i 登；琏；方l 蓬洱捌彗f 耋 j 名；室目路 一基莹i j i 苎亍蠡蠢 i ；i 王毒t i ：； a 2 1 2 4 ：二i 薹孽；i ； i ! ；蕈= 霸j ；：鼍l 强| i ；匿r 妻：募j ；l li ；蠹? j ；! i 室蔓；基 蔓；j 自妻謦a 二囊l ；l 晴i - ； 事i j j 臻t ：$ 霉 謦i ；耋霉l 圣i l i f = 耋，l l l fi | 眭e ；毒i j = ；卓g i j 雾i 蓥薹j 蚕鍪雪誊；l 辇i 鳘霹； 彗彗：霾l 筘瘫e 嚣= 至；i ! 引! i 圭h _ 蠢ii g 主；黎 ；鞋# 勰1 4 基i 主i ；二l i 罩量稚拦藿鞋i 薹圣i 瑚l ! 彗；妻踅；露茜l i 量 占交；i ，；i ii ；l = i 菱l 雩鬟“毫i 善i i ! = j 丢羹嚣；i i ij 鬻争i 蚕目g ；l j 墓謦翟塞 i ；：il ；j 瞢百薯t 号；l 耐堕堕萎! 二曩￥爷；芝i i i i ； i 手i x p 如n g u n i 0 r i 缸d 证矗l c d k g e 劭如b 爿c 口咖伊o ，朋j d 妇，f 明c 文献综述 p 叫泐n 口凹“s ) 漆酶p 0 x b 和p 0 x d 以a b t s 【2 ，2 - a z i n o - b i s - ( 3 一e t h y l b e n z o t h j a z o l j n e 6 s u l f o n i ca c i d ) ，2 ，2 连氮一双( 3 乙基苯并噻唑6 一磺酸) l 为底物时的最适反应 p h 均在2 5 左右，而以2 ，6 - 二甲氧基苯酚为底物时，最适反应p h 分别为6 o 和7 o ：g a r z j l i oa m 等【2 2 】在研究糙皮侧耳漆酶和真毛栓菌( 打口肌e f 船肋耳“) 漆酶时发 现，当作用底物不同时，其最适p h 值不同。p o z d n y a k o v an 等【2 3 】纯化得到的糙 皮侧耳( 只舵口f “sd 1 ) 漆酶为一黄色漆酶，在6 1 0 n m 处并无吸收峰。该漆酶 以丁香醛连氮为底物时最适p h 值是7 0 ，以邻苯二酚为底物时为8 o ，而以a b t s 为底物时为4 o 。 1 2 3 等电点真菌漆酶多为酸性蛋白质，等电点p i 在3 0 6 o 之间。由于蛋 白质等电点大小取决于其氨基酸的类型，因此等电点的差异大小能反映不同漆酶 分子组成结构的同源性1 1 0 1 。 p a i m i e r ig 等| 2 4 l 从糙皮侧耳中分离的白色漆酶p o x a l 的等电点为6 7 ，接近 中性。2 0 0 0 年s h i nk s 和k e yj 【2 5 1 从毛云芝( c o r f o m s 沁“f “s ) 中纯化一种新漆 酶，其等电点为7 4 ，显示其与其它真菌漆酶在氨基酸组成和序列上有差异。 1 2 4 底物专一性 真菌漆酶具有广泛的底物专一性，可降解与木质素结构单元 相似的有机芳香污染物和某些非芳香有毒化合物【2 6 j ，按底物的化学结构不同可分 为：( 1 ) 酚类及其衍生物：对苯二酚、邻苯二酚等多元酚及其衍生物，a 萘酚和 某些一元酚的衍生物等；( 2 ) 芳香胺及其衍生物：多氨基苯及其衍生豆酸、咖啡酸 和对氨基水杨酸等；( 5 ) 甾体激素和生物色素：a 卵胞激素、雌甾二醇、醌茜素、胆红素及苏木色精等；( 6 ) 偶氮类人工合成色 素：活性橙9 6 、活性黑5 、活性紫5 等：( 7 ) 金属有机复合物：二茂铁及其衍生 物：( 8 ) 其它非酚类底物：亚铁氰化物、抗坏血酸、1 苯基2 ( 3 ，4 二 甲氧基苯基) 乙二醇及吲哚的衍生物等1 2 1 ，2 7 ，28 1 。1 2 5 酶动力学常数 实验室常以a b t s 、愈创木酚、邻甲氧基苯酚和丁香醛连 氮为底物测定酶动力学常数k m 值。底物相同时，不同来源漆酶的氧化能力即k m值差异很大，即使是同一种菌不同菌株产生的漆 酶k m 值也存在很大差异【2 9 】；同一漆酶对不同底物的氧化能力不同。因此，在实 x p e k i n gu n 洒m e m c a lc 。l t e 弘 c h m e s e c n 赴唧o l m e d k dsci饼ces耍南张京迹 t 2 厂】1 3 c u 三核中心位点积累，整个反应过程需要四个连续的单电子氧化作用来使 漆酶充分还原，充分还原的漆酶再将氧分子还原为水【1 1 ，3 9 1 。漆酶催化作用中存在 电子的积累过程，被称为“分子电池”。前两个步骤实际上是偶联的，在反应中同 时发生，将其为两个步骤可使反应过程更为清晰。( 3 ) 第二底物的还原作用。第 二底物即氧分子结合于t 2 厂r 3 c u 三核中心，充分还原的漆酶逐步将电子转移给氧 分子，最初还原型t 3 c u 传递两个电子形成0 2 2 ，随后t 1 c u 传递一个电子形成第 一个水分子和o 基，最后t 2 c u 传递第四个电子将o 基还原为第二个水分子【4 1 】。 三、漆酶的生理学功能 不同种属的真菌所产生的漆酶出现在其生长发育的不同阶段，因而具有不同 的生理功能，主要有以下几种：( 1 ) 与色素的合成有关，如构巢曲霉( 爿s p e 信f f ，“s ，l 胁如n s ) 可产生两种功能不同的漆酶，都与色素合成有关。一种漆酶是由v a 基 因编码，参与分生孢子绿色色素的形成，另一种漆酶局部分布在泡状包被细胞和 壳细胞原始闭囊壳中，也参与色素的合成。w a l t o nf e l j c i aj 等【4 1 l 对人担子菌病原 菌新型隐球酵母( c 唧细c d c c h 5n e o ，d r m 口淞) 的黑色素形成进行了研究，黑色素是 病原菌毒性的重要原因，结果表明漆酶基因是黑色素的合成基因；( 2 ) 与菌索的 形成有关，如蜜环菌( 爿r 珊订肠r 胁m e 4 ) 漆酶；( 3 ) 与子实体的发育有关，如裂 褶菌( & 如印正眵z m m m e ) 漆酶；( 4 ) 与真菌的致病性有关，如松根异担子 菌( 胁f p r d 6 口5 删硼口月加s “m ) 漆酶参与真菌的入侵，灰葡萄孢菌( 肋打y 出c 拥p 腭4 ) 漆酶可引起胡萝卜和黄瓜等多种农作物的软腐病；( 5 ) 与木质素的降解有关，漆 酶将木质素降解为小分子为菌体生长提供营养；( 6 ) 与菌体的呼吸作用有关，漆 酶是一种重要的末端氧化酶，通过c u 2 + 向c u + 进行电子传递。在菌体中漆酶的大 量存在有利于呼吸过程中电子传递的正常运行【2 1 ，2 7 ，4 引。 四、漆酶的分子生物学研究进展 1 9 8 8 年，f r o h m a l l 等首次从糙皮侧耳中克隆到漆酶p o xi 基因【3 8 】以来，已经克 隆、测序并分析了多个漆酶的d n a 序列，有的已经初步实现了重组基因的异源表达。 y a v e rd 等【4 3 1 克隆了灰盖鬼伞( c 印r 抽“sc 加p 陀n 5 ) 的3 个漆酶基因l c c l 、1 c c 2 和l c c 31 对其序列结构进行了研究。其中l c c l 含7 个内含子，大小为5 4 7 0 b p ， 1 0 a 蛳g 踟f o n f 础妇fo 如萨 c h i 舵s e a c 口赴r 哆o i m d k 口lscienccs囊筒缘遵 成熟蛋白约5 2 1 个氨基酸。l c c 2 和l c c 3 均有1 3 个内含子，表达出的成熟蛋白氨基 酸同源性8 0 。实现了l c c l 基因在米曲霉( 爿印e 喁i z 缸jd r 弦n e ) 中的异源表达。 s o d e nd m 等研究了来自漏斗状侧耳( 弛球m m sj e ，d ，。c 口胁) 的四种漆酶同工 酶基因，比较了这四种同工酶在氨基酸水平与其他担子菌漆酶的同源性，指出p s c l a c 4 的相似性最高( 8 5 ) 。p s c l a c3 最低( 5 2 5 7 ) 。二甲氧基苯甲酸和1 羟 基苯并三唑( h b t ) 可诱导真菌漆酶表达；碳源、氮源、铜、锰和两种芳香族化 合物( 2 ，5 一二甲代苯胺和阿魏酸) 可在基因转录水平对单个漆酶同工酶基因进行诱 导。p s cl a c 3 基因为组成型表达。实现了p s cl a c 4 基因在甲醇营养型酵母表达系统 巴氏毕赤酵母( 尸f 曲抽p 口s f d ，妇) 中的异源表达，纯化并分析了重组漆酶蛋白p s c l a c 4 的理化性质【4 4 ，4 5 1 。应用a f r p c r ( a m p l i f i e df 1 a n k i n gr e g i o n p c r ) 技术克 隆了该四个同工酶基因的启动子区，分析可能存在的转录反应元件，如金属反应 元件、集成电路反应元件和抗氧化剂反应元件等，指出这些元件可能参与p s 咖r c q 加漆酶基因表达的转录调控【4 6 l 。 o k a m o t ok 等1 4 7 l 从日本收集的糙皮侧耳野生型菌株中克隆、测序和分析了漆 酶编码基因i c c k ，长度为2 9 2 9 b p ，编码区有1 9 个内含子，上游具有c a a t 和t a t a 元件。i c c kc d n a 包含一个1 5 9 9 b p 的开放阅读框和编码5 3 3 个氨基酸的基因。l c c k c d n a 的核苷酸序列显示其与其他担子菌漆酶的高度同源性。f a r a c ov 等1 4 8 j 研究 了糙皮侧耳中漆酶基因启动子的金属应答元件( m e t a l - r c s p o n s i v ee l e m e n t s ，m r e s ) ， 指出糙皮侧耳漆酶基因p o x c 和p o x a l b 的启动子区含有多个m r e s ，且这些m r e s 与真菌蛋白之间复合物的形成不需要金属离子的存在。g o n z a l e zt 等【4 9 j 应用 m i m p c r ( m u l t j p l e x r e v e r s et r a n s c r i p t i o n p c r ) 方法研究了栓菌属( m m e f 船够 i 6 2 ( c e c t 2 0 1 9 7 ) ) 漆酶基因家族的表达。分析3 ，4 一二甲氧苄基乙醇及其两个同 分异构体( 2 ，5 二甲氧苄基乙醇和3 ，5 二甲氧苄基乙醇) 对m m e f e s5 弘i 6 2 菌株 漆酶基因的差异表达，结果发现2 ，5 二甲氧苄基乙醇是漆酶最好的诱导剂且基因 表达量增加最高；3 ，5 二甲氧苄基乙醇是第二好的诱导剂。在这三个诱导剂存在时， 每个转录物数量产生很大的波动，但漆酶m r n a s 的总量似乎受到不同基因协同 调控机制的调节。l y o n sj 等【5 q 研究了美国东南部沼泽地区子囊菌漆酶基因序列的 多样性。以漆酶铜结合位点基因为靶基因分析了1 0 个种2 4 个隔离群体，得到3 9 个不同序列和1 5 个不同的漆酶序列类型，证明了天然真菌群落的功能基因具有高 1 1 p e 妊n gu n 0 nm e d i c q lc o n e g e c 抽船e c “删yd ，埘0 舭口，蛔c 酷文献综述 度的序列多样性。 p i s c j t e l l i a 等1 5 1 】研究了糙皮侧耳漆酶p o x c 和p o x a l b 在两种酵母菌乳酸克 鲁维酵母( 刚“”e ，d 小y c e s 肠“括) 和啤酒酵母( c e m v 妇妇e ) 中的重组表达，这两 种转化宿主都分泌具有活性的重组漆酶，但kk c f 括比sc e 地v 括缸e 更为有效。 p o x a l b 转化子比p o x c 转化子具有更高的活性。对k 缸c f 括分泌的重组漆酶进 行了纯化和性质分析。未重组和重组p o x a l b 的活性相似。然而，重组p o x c 的 活性却远低于未重组p o x c 漆酶，可能是因为不完全或者不正确的折叠导致。建 立可行的重组表达系统能更好地了解漆酶的结构功能之间的关系。 m i s s a l l1 a 等1 5 2 】对来自新型隐球酵母( cn e d ，打川口n s ) 的两种真菌漆酶基因 l a c l 和l a c 2 进行了研究，cn c o 厂d r m n n s 漆酶参与合成黑色素，并对其毒性及 在巨噬细胞中的存活有作用。研究了在氧化和亚硝基化压力下，添加硫醇过氧化 物酶，硫醇特异的抗氧化剂t s a l 时，cn e d ，d ，m 口n s 的抗性机制。r e a l t i m ep c r 结 果显示，两种漆酶基因表达对氧化和亚硝基化压力的应急变化相似，但l a c 2 基 因的表达规律受到t s a l 的影响。两种漆酶以左旋多巴( l d o p a ) 为底物产生黑色 素，并定位于细胞的不同位置。删除单个l a c l 或l a c 2 基因，对h 2 0 2 或n 0 的敏感性没有影响。但是，删除l a c l 或l a c 2 时，同时删除t s a l 基因，导致 对h 2 0 2 的轻微敏感性，并且l a c 2 t s a l 缺陷菌株对n o 敏感。另外，两漆酶基因的 同时删除呵降低cn e d ，d r m n n s 在初级巨噬细胞中的存活几率。 j o 】i v a l tc 等1 5 3 】研究了云芝漆酶l i l b 在解脂耶氏酵母菌( 翰，r d w 抽啦1 0 驴打c 口) 中的异源表达。全长c d n a 由1 5 6 1 b d 的开放阅读框组成，编码l a c i i l b ，即一个 4 9 9 氨基酸的蛋白质和一个2 1 氨基酸的信号肽。转化酵母分泌的漆酶活性水平与 未经诱导的野生型zv 盯s f c d f o r 菌株相似。结果显示，重组蛋白的分子量比相应成 熟的zy e 船f f d r 漆酶i l i b 稍大( 5 k d a ) ，暗示一定程度的过度糖基化。 张银波等【5 4 】对灵芝( g 口n o 如圳口m c f 也m ) 漆酶基因进行了克隆及序列分析， 灵芝漆酶结构基因编码区全长21 0 7b p ，含有9 个内含子，其长度从5 1 7 8b p 不 等，其中最长的为内含子，最短的为内含子i i ，且所有的内含子序列都符合5 g t n n gc 1 a g3 规则。在起始密码子处有k o z a k 序列，一3 位为嘌呤g ，+ 4 位为g 。分别在起始密码子上游2 0 4 b p 和1 2 2 b p 处有g 钆玎框和1 肖r a 盒，这是 真核启动子的典型结构。在终止密码子下游没有发现真核基因的加尾信号 p h n gu n i o nm ed l c n lc 。1 1 2 瞽 。抽出e 一曲如叫盯肘删蛔l c 甜 文献综述 a a l - a a a ，可能是片段太短还没有到达加尾信号处的原因。经同源分析，灵芝漆 酶与已发表的金针菇( 砌m m “砌口v e z h 印部) 漆酶( a a r 2 1 0 9 6 ) 相似性最高，为7 3 。 五、漆酶的应用研究进展 5 1 食品工业 在食品工业中，漆酶的研究涉及啤酒、果汁等饮料的生产、酒 类的酿造过程及食用菌的栽培等多个方面。由于酚类或芳胺类物质的存在，啤酒 和天然果蔬汁饮料在贮存期间会出现浑浊或沉淀，用漆酶处理饮料可专一性除去 酚类，改善果汁的色泽并防止出现浑浊，有助于饮料的稳定。苹果汁用固定化漆 酶处理并过滤后，能除去其中的儿茶素、绿原酸、根皮苷等酚类物质，使果汁长 期贮存，保持澄清。固定化漆酶处理鲜葡萄汁和葡萄酒也有同样效果，并且用漆 酶预先处理麦芽汁除去其中酚可提高啤酒质量和透明度，利用灰葡萄孢菌漆酶可 控制葡萄酒的氧化褐变。 漆酶能使食品分子间发生交联形成凝胶态，如通过阿魏酸的氧化胶联形成甜 菜胶、使阿拉伯木聚糖溶液凝胶化聚合乳清蛋白等；在肉制品的生产中，漆酶可 将肉片胶粘在一起，便于切成薄片；可缩短生面团的制作时间、改善面团的品质， 使之更耐搅拌、干而不粘。 漆酶在食品工业中的各类应用取得了多项专利，包括用漆酶去除食品变味以 及添加到酱油中增加其风味、以一种包含漆酶的化合物用作食品防腐剂、向油或 含油产品( 如色拉调味品) 中加入有效量的漆酶使之脱氧等等。利用漆酶活性高 的白腐菌株处理农工废弃物如秸秆等，通过漆酶对木质素的特异降解，制取有优 越生理功能的功能性食品添加剂膳食纤维，现已取得具实用价值的结果【5 5 1 。 b r i n c hd s 和p e d e r s e np b 等1 5 6 j 对在米曲霉中表达的薄盖大孔云芝( 尸b z 阳d r h s p f n 5 池s ) 漆酶进行了毒理学研究，实验结果显示该漆酶不引起鼠伤寒沙门氏菌 ( 勋拥d h e 砌卯 拥h r f “小) 的基因突变及人淋巴细胞染色体的异常；未找到吸入 性中毒或对皮肤和眼睛有刺激性作用的证据；给小鼠口服一定剂量漆酶，连续1 3 周，未产生任何副作用；认为该漆酶可用于在食品工业中，并建议在果汁生产中 使用的漆酶剂量为5 0l a c u l ( l a c c a s eu n j t s ，l ，漆酶活力单位升) 。s h l e e vs v 等【5 7 l 用酪氨酸酶和漆酶及电化学的方法快速测定红酒中多酚类化合物的含量，间 接评价红酒的抗氧化作用，该方法的准确率高于7 5 ，可用于工业生产。 p e h n gu 咖nm e a i c 越c o l k g e 曲m 船p 一出w 巧埘l d 妇，妇馏文献综述 漆酶还可用于食用菌的生产。在食药用菌制种过程中加入漆酶制剂能加速木 质素的分解，并作为末端氧化酶参与呼吸过程中的电子传递，为菌丝生长提供养 料和能量，促使菌丝内的物质合成、运转和积累，加快菌丝吃料，缩短培养时间： 接种时加入酶制剂，还能够促使菌丝扭结，形成更多的子实体原基，提高菇类产 量。漆酶制剂能将酚氧化为醌，作为抵抗杂菌的毒素，抑制杂菌污染，可提高成 功率1 5 酊。漆酶还参与子实体形成的调控作用。h 6 l i oh s u g u j m o t o 等【5 8 l 的研究表明， 在原生质和担子果形成过程中产生大量漆酶，在菌丝体生长及真菌分化阶段3 ， 4 二甲氧苄基乙醇可刺激糙皮侧耳漆酶产生并参与子实体的发育，在担子果成熟 时漆酶活性显著下降，证明漆酶在子实体形成过程中具有一定的生理学功能。因 此在食用菌生产中添加漆酶可加速菌丝体的生长和分化，促进子实体的形成。此 外，可利用漆酶和木质素作为培养菇类的材料，使菇类的液体培养成为可能【4 射。 利用漆酶活性高的白腐菌株处理秸秆等可制取有优越生理功能的功能性食品添加 剂如膳食纤维，现已取得具实用价值的结果【5 6 】。 l u d w i gr o l a n d 等1 5 9 1 在用纤维二糖脱氢酶催化生产乳糖酸时，加入漆酶可使反 应中的电子受体持续再生，在漆酶再生系统中还包括苯醌、a b t s 、高铁氰化物或 二茂铁等氧化还原介质。k u u v at 等i 删用漆酶诱导甜菜胶的凝胶化，且酶活性越 高果胶分子间的交联度越大，形成的凝胶硬度越大。 5 2 工业染料脱色工业废水中的许多合成染料无法通过传统的降解方法进行 有效脱色，直接排放会对自然界造成严重的污染。研究发现漆酶及产漆酶真菌对 工业染料具有很好的脱色作用。 z i l l y a 等1 6 1 】研究的巴西风尾菇菌株( 纠e h r o m 5 p “加d n 口，f h s ) 只产生漆酶这一 种酚氧化酶，对多种染料都有脱色作用，可完全或部分脱去氨基黑、刚果红、锥 虫蓝、甲基绿、考马斯亮蓝r 、甲基紫、乙基紫、亮酚蓝等染料，但对亚甲基蓝 和p o l y r 4 7 8 无脱色作用。m a x i m o c 等1 6 2 】比较了地霉属( g e o t r j c h u ms p ) c c m l 1 0 1 9 与其它白腐真菌对工业活性染料的转化作用，结果表明6 叠d 川c | l l “m 跟可迅速 转化黑色染料并具有持续转化大量染料的能力，漆酶参与了这一转化过程。 p a p i n u t t iv l 和f o r c h j a s s i nf 【”j 研究了层孔菌( 凡聊盯5 c 把r d 出删e s ) 对孔雀石绿 ( m g ) 的脱色作用，结果显示fs c k 加出m e “s 可在高浓度m g 中生长并使之脱 色脱毒。用含有高活性漆酶的上清液处理m g 产生脱色产物d m g ，d m g 对黄孢 1 4 p e 娃“gu n i o nm d i c 口lc 。l | e 萨 c h i n e w c 4 d e 哪o m 豳c o ls c 洒c e s 如燃 原毛平革菌( pc r y 舳印d r 诅州) 和其它所试真菌无毒性。l k v i n 等研究了来 自阿根廷的2 6 株自腐真菌的脱色能力，鉴定了一种新的真菌：c b ，f d z “jv e 坩f c d z o r 棚招您f 把“j ，其1 8 天培养物1 小时内可分别使二甲代苯胺、p 0 1 yr 一4 7 8 、考马斯 亮蓝r 、m g 和靛蓝胭脂红脱色2 8 、3 0 、4 3 、8 8 和9 8 。漆酶活性为 o 1 3 u m l ，但在1 8 天培养物的胞外分泌液中未检测到木质素过氧化物酶和锰过氧 化物酶。 t a u b e rm m 等i 砧l 研究了漆酶与超声波对含氮染料的降解作用，漆酶脱色效率 高但不能作用于所有所试活性染料，且高阴离子强度会导致酶失活，超声波处理 高能量输入3 小时可使所试染料脱色，延长时间可形成无毒的离子。并首次指出 漆酶和超声波处理具有协同效应，共同作用可提高降解效率。 5 3 造纸工业漆酶在造纸工业中的应用研究主要集中在制浆、漂白和造纸废 水处理三个方面。制浆时需要去除木质素以降低纤维间的结合力使之解离成浆状； 木质素的存在影响了纸浆的颜色，因此纸浆漂白也需要去除木质素【6 6 】。处理纸浆 时单独使用漆酶的效果较差，实际中常用漆酶中介物系统( l m s ) 。有报道羟基苯 并三唑是较有效的中介物且安全无毒，能有效促进云芝漆酶降解木素【6 7 1 。c a m i n a l g 等【6 8 1 用云芝处理纸浆使之脱毒脱色，实验中只检测到漆酶活性，指出漆酶产量 和还原脱毒作用具有相关性。 连海兰等【6 9 】研究了漆酶碳源系统( l c s ) 预处理对稻草碎料板性能的影响， 结果表明，l c s 完全可以代替昂贵的l m s 来降解稻草中木质素，与粗碎料板相比， 酶处理对细碎料板的各项力学性能均有显著改善。 与传统方法相比，漆酶可选择性地降解木质素而不影响纤维素和半纤维素， 提高了纸浆得率，且漆酶制浆的过程在常温常压下进行，节约了设备和能耗1 7 0 1 。 经漆酶处理的纸浆制得的纸张具有良好的抗张强度和平滑度【6 7 】。另外，漆酶可有 效作用于造纸废水中有机氯化物等，降低废液毒性，减少污染。刁颖辉等以具有 活性酯基的聚乙烯醇为载体在温和条件下固定了紫革耳( 尸n 一船c d n 曲口m s ) 漆酶， 使之具有较高的稳定性和活性1 7 l ，7 射。 5 4 环境的生物修复生物修复是目前认为的较为可取且很有应用前景的技术 之一，它是利用生物的方法修复被污染的局部环境，使之重现生机的过程，具有 就地处理，操作简单，处理效果好且污染物转化后无二次污染等众多优点1 7 ”。真 p e 娃“gu n 洒m e d i c 口tc o h e g e 曲抽饿如哗。，m 妇f 把n c 雌文献综述 菌漆酶可降解环境中多种有毒物质，对污染的局部环境进行生物修复。 a m i t a i 等1 7 4 】用糙皮侧耳漆酶进行了有机磷农药的生物降解试验，结果表明， 真菌漆酶可分解三种有机磷杀虫剂：o ，o 一二乙基s ( n ，n 二异丙胺乙基) 磷酰硫醇 ( d i p r a m t i o n ) 、o - 乙基一s ( n ，n - 二异丙胺乙基) 甲基磷酰硫醇( v x ) 和o 一异丁基一s - ( n ， n 二乙基胺乙基) 甲基磷酰硫醇( r v x ) ，并认为这是彻底氧化降解此类神经毒素的 有效方法。a g g e l i sg 等【7 5 】研究了糙皮侧耳生物反应器去除橄榄工厂废水( o l i v eo i l m j l lw a s t e w a t e r ，简称o m w ) 中酚类物质的过程，结果表明，漆酶可去除其中的 酚类化合物，降低o m w 毒性，解除其对环境中微生物的抑制作用。d a v j dc b r e s s l e r 等对粗毛革孔菌( c d r 幻却口括占口f f f c 口) 漆酶的研究表明，该酶可完全去除咔唑 和n 乙基咔唑，转化芴和二苯并噻吩化合物。k v i nl 等【7 7 】研究了白腐担子菌真 毛栓菌( zf 雠f f ) b a f c4 6 3 菌株降解硝基苯和蒽的能力，1 2 2 4 天内培养基中 9 0 以上的有机污染物被除去，并具有高活性稳定的漆酶和较低含量的锰过氧化 物酶。s u z u k ik 等1 7 8 】的研究发现用漆酶h b t 处理1 小时，可去除1 7 - b e t a 雌二醇 ( es u b ( 2 ) ) 和乙炔基雌二醇( e es u b ( 2 ) ) 8 0 以上的雌激素活性，延长时间至8 小时，可使这两种甾类激素完全失活。v a nh a m m ej d 等1 7 9 】研究了毛栓菌( z f 船m ) 、黄孢原毛平革菌、云芝和瘤盖干酪菌( 印，口州y c p s p 口，“s 即括) 等多种白腐 真菌对二苄硫化物( d b s ) 的代谢作用，结果显示漆酶参与了这一代谢过程，且 a b t s 的存在有利于漆酶的脱硫作用。e r o d f i g u e z 等【8 0 】研究指出侧耳属漆酶可有 效转化芳香族污染物2 ，4 一d c p ( 2 ，4 一d j c h o r o p h e n 0 1 ) 和苯芘【b ( a ) p 】，当a b t s 或h b t 存在时，漆酶的氧化作用显著提高。h i a ih 等( 2 0 0 4 ) 【8 l l 发现云芝漆酶一h b t 可 有效催化化学杀虫剂甲氧滴滴涕( m c ) 氧化脱氯，产生无毒产物。r o s a l e se 等1 8 2 】 用毛栓菌漆酶处理食物废弃物如苹果皮、桔子皮和土豆皮等，z 柚苫“招利用土豆 皮产生的漆酶活性最高，在第八天时酶活超过5 0 0 0 u l ( u n i t s l ，酶活力单位升) ： 实验表明，不仅可利用这些经济原料为微生物提供营养，更重要的是可以解决污 染问题。 s o n o k it 等1 8 3 墉云芝漆酶引入烟草植物中得到转基因植物f l 4 ，其根部可分 泌漆酶，以达到去除土壤中有机污染物的目的。结果显示f l 4 对土壤有机污染物 双酚a 或五氯苯酚的去除效率明显高于对照组。 j u n 曲a n n sc 等对分离自壬基酚污染的河水中的有丝分裂真菌u h h1 6 1 8 1 6 h k 、m gu n i d i c n lc o h e g e 凸抽村p 一曲幽掣盯肘删踊c 盱文献综述 - 4 和水生丝状真菌( a q u a t i ch y p h o m y c e t e ) c 蚀v 口r 嘲粥括口口h 口f f c 口降解壬基酚作用 进行了试验。对降解代谢产物的分析表明，细胞内1 2 t n p 异构体的壬基被羟基化， 壬基支链的缩短及4 羟基苯甲酸被确定为u h h1 6 1 8 4 中t n p 的断裂产物。u h h1 - 6 - 1 8 4 中t n p 的降解效率高于c 口驰口“c 口，u h h1 6 1 8 4 对t n p 单体的 降解特异性低于c 口倒口“c 口。两种真菌中，c u s 0 4 和香草酸混合物可大大增加漆 酶的产生。漆酶催化转化t n p 导致产物具有比母体化合物更高的的分子量。这些 结果强调了真菌的一个功能，水生生态系统中通过内分泌作用降解水污染物，这 在以前并没有研究过。更重要的是，结果支持分离自水生环境真菌的两种降解t n p 机制：在单体t - n p 异构体壬基支链上的羟基化及在部分异构体烷基链上的进 一步断裂；胞外漆酶对t n p 的攻击，漆酶使初级产物发生氧化偶合形成高分子的 复合物。 5 5 其它方面的作用 漆酶可用于高分子化合物的有机合成，1 9 8 2 年e c k e n m d e f 等【8 5 l 用真菌漆酶催化合成对白血病有特殊疗效的长春花碱；2 0 0 3 年a k t a sn 等 | 8 6 j 用云芝漆酶合成多聚邻苯二酚，其中邻苯二酚单位以醚键交联，在多聚物结构 中邻苯二酚的热稳定性有效增加。 m a t t j n e nm a i j a l j i s a 等【8 7 1 研究了在阿魏酸存在或缺失情况下，漆酶对酪氨酸 与含酪氨酸肽链的催化聚合作用。漆酶参与氧化酪氨酸和含有酪氨酸的肽链。化 合物以醚键相连。在聚合体中只检测到少数双酪氨酸键。当f a 添加到反应混合体 中，它可促使形成聚合体结构。因此，除同( 均) 聚物外，反应中也形成含有2 个或4 个f a 的不同异( 杂) 聚物。 漆酶还可用于生物传感器和免疫检测，人们已经利用固定化漆酶制成的生物 传感器来检测茶叶加工过程中儿茶酚的变化及检测来自煤炭、石油、天然气、造 纸等工业污水中的木素和酶类等物质。医学中已利用固定化漆酶制成的电位免疫 传感器进行胰岛素分析【6 9 】。0 l d a i rd h i t e 等【8 8 】研究发现，在生物传感器检测儿 茶酚胺中使用糙皮侧耳漆酶过氧化物酶组成的双酶系统可有效增加传感器信号。 o s i n ama 等【8 9 】用云芝漆酶分别与邻苯二酚、多巴胺和2 氨基4 氯苯酚形成的复 合物作为生物传感器电极测定溶液中低浓度酚类物质的含量，其中与2 氨基4 氯 苯酚形成的复合物作为电极的灵敏度最高。 黄俊水等f ”l 用四氨基酞菁铜( c u t a p c ) 包覆在f e 3 0 4 纳米粒子表面的纳米复 1 7 p e gu 咖nm e m c n lc o n e g e o 椭删一曲咖，d ，m 硎，s c f 删c 曲文献缝整 合粒子，并用此纳米复合粒子通过戊二醛交联法固定了漆酶，固定后的酶比游离 酶具有更好的贮存稳定性及操作稳定性。 姜德生等以戊二醛为交联剂制备了磁性壳聚糖微球作为载体固定漆酶。固 定化漆酶最适温度比游离酶降低5 ，在6 0 条件下保温2 1 0m j n ，固定化酶保留 酶活力7 4 ，而在相同条件下游离酶酶活力仅保留1 9 4 。固定化酶连续进行1 0 次操作后，酶活力仍保持8 0 以上，漆酶使用效率明显提高，且该固定漆酶具有 良好的存储稳定性。 蒲军等【9 2 l 将漆酶应用到黄芪皂苷的提取中，结果表明，漆酶是提高提取率的 主要因素。植物类药材的有效成分往往被包裹在结构复杂、难以降解的木质素中， 影响了中药有效成分的提取利用。而漆酶可以有效地降解木质素，将其应用于中 药的提取可以解脱木质素的束缚，大大增进中药有效成分的释放，如果再加入纤 维素酶和果胶酶将中药材中的相应杂质酶解掉，更可大幅度提高中药的提取效率。 实验结果也提示，其他植物类中药材均可通过漆酶酶解提取法来提高其有效成分 的提取效率，尤其是以木质纤维素为主要成分的中药材。 0 n y a y a ra l i 等【9 3 】研究了云芝和硬毛栓孑l 菌( 凡n 口z 妇f ，d g “) a t c c2 0 0 8 0 0 生 物活性水提物对h e l a 细胞和成纤维细胞株( f i b m b l a s tc e l ll i n e s ) 的细胞毒性作用， 结果显示，ff 加昌“和cv e ”f c d 如r 提取物对这两株细胞株均有细胞毒作用，并 且ff ，d g “提取物中漆酶和过氧化物酶活性暗示其对癌细胞的抑制作用。w a n gh x 和n gt b 【1 2 1 研究的杏鲍菇子实体漆酶显示有h i v - 1 逆转录酶抑制活性，其半致死 计量l c 5 0 为2 2 m m 。其n 末端序列与之前分离自相同物种菌丝体的漆酶同工酶 不同。 由于漆酶特殊的催化机理，漆酶可用于构建“分子电池”，具有微型高效无污 染等特点 2 1 】；漆酶还可作为标记酶用于酶法免疫分析，具有更高的灵敏度和更好 的稳定性1 9 。 六、展望 目前，真菌漆酶的理论和应用研究日盏深入，但仍存在许多问题。在理论研 究中，主要集中于对高产漆酶菌株的筛选、培养条件的优化及漆酶理化性质的研 究，而漆酶结构、催化机理、分子生物学等方面的研究则较为薄弱。需加强对不 1 8 h m gu n 油m e d i c o lc o l l e g e c h l e 辩a c n d 甜嘴o jm c d i c 口lsci帆ces囊：葙o绿连 同漆酶分子的晶体结构研究，通过比较其结构异同来研究漆酶的性质与功能；通 过研究不同漆酶分子活性中心的序列与结构差异研究不同漆酶间不同的催化机 制，为高活性漆酶在蛋白质水平的改造提供依据；加强分子生物学及分子遗传学 领域的研究：了解漆酶基因的结构、功能及其在转录、翻译等各个水平的表达调 控机制，进而从基因水平对漆酶及产酶菌株进行优化。在应用研究方面，漆酶及 漆酶生产菌的研究涉及工业、农业、医学、环保等多个方面，利用漆酶进行高分 子化合物的有机合成和生物检测等方面的研究需迸一步加强；进行漆酶的固定化 研究，提高酶稳定性和催化效率，使漆酶能够重复利用，降低酶制剂成本；