（分析化学专业论文）新型抗体和核酸适配子构建的电化学生物传感器.pdf

硕士学位论文 摘要 随着生命科学的飞速发展，生化分析发挥着越来越重要的作用。电化学传感 器以其响应信号丰富，检测对象广泛，选择性好，灵敏度高，并能实现实时检测 等特点而成为了生化分析的重要手段之一。寻找选择性好，灵敏度高且稳定性好 的分子识别体系已经成为了电化学传感领域中公认的前沿方向。因此本文基于抗 体和核酸适配子的特异性识别能力，利用纳米、电催化等技术，构造了一系列新 型电化学传感器，并将其应用于实际样品的生化分析。 第2 章发展了一种非标记的电化学免疫传感器用于检测不含氧化还原活性 中心的蛋白的分析方法。通过电聚合的方式构造一种含金纳米颗粒的多层复合膜 用于转移介导电荷，并利用亚甲基蓝作为催化剂，实现了对电化学信号的扩增。 该方法检测下限低，灵敏度高，选择性好，是一种可以广泛应用的非标记免疫分 析方法。 基于富g d n a 的构型转换，第3 章构建了开关型纳米电子器件。巯基化、氨 基修饰的富g d n a 固定于金电极表面，然后标记电化学活性物质二茂铁( f c ) 。 此表面固定的d n a 序列能够在刚性四元g 四股螺旋与弹性单链结构间相互转 换。这种较大的形态改变使得d n a 序列能够象尺蠖一样做伸一缩运动，产生了电 流变化。因钾离子能够与g 四股螺旋发生特异性结合，使用这种无试剂的电化学 传感界面，不需任何额外的检测试剂，就可实现对钾离子的简便、快速、选择性 检测。 关键词：电化学生物传感器；电化学免疫传感器；抗体；核酸适配子 a b s t r a c t w i t ht h er a p i dd e v e l o p m e n to fl i f es c i e n c e ，b i o a n a l y s i sp l a y sm o r ea n dm o r e v i t a lr o l e si ni t e l e c t r o c h e m i c a l b i o s e n s o r sa t t r a c tp a r t i c u l a ri n t e r e s t s a n dh a v e d e v e l o p e di n t oo n eo ft h em o s ti m p o r t a n tt o o l sa st h e yh a v ee x c e l l e n tc h a r a c t e r i s t i c s s u c ha s ：m u l t i p l er e s p o n s em e c h a n i s m s ，h i g hs e l e c t i v i t y ，h i g hs e n s i t i v i t y ，r e a l 。t i m e d e t e c t i o na n de x t e n s i v ea n a l y t e sr e c o g n i t i o n p u r s u i n gs t a b l e m o l e c u l a rr e c o g n i t i o n s v s t e mw i t hh i g hs e l e c t i v i t ya n ds e n s i t i v i t yb e c o m e st h ef r o n t i e r i nt h ea r e ao f e l e c t r o c h e m i c a lb i o s e n s i n g i nt h i st h e s i s ，s e v e r a ln o v e le l e c t r o c h e m i c a lb i o s e n s o r s h a v e b e e nd e v e l o p e db a s e do ns p e c i f i c i t yo fa n t i b o d ya n da p t a m e r ，u s i n gn a n o m a t e r l a l ， e l e c t r o c a t a l y r t i ct e c h n i q u e s ；a n d t h e i ra p p l i c a t i o ni na n a l y s i so fr e a l b i o c h e m i c a l s a m p l e sh a v eb e e ni n v e s t i g a t e d i nc h a p t e r2 ，al a b e l f r e ee l e c t r o c h e m i c a l i m m u n o s e n s o rf o rt h ed e t e c t i o no f p r o t e i na n a l y t e sw i t h o u tr e d o x a c t i v ec e n t e r si sf o rt h ef i r s tt i m ed e v e l o p e db a s e d o n t h ec o m b i n a t i o no fg o l dn a n o p a r t i c l e sa n dt h em e d i a t e dc h a r g et r a n s p o r tt h r o u g ht h e m u l t i l a v e rf i l m st h a ti sr e l a t e dt oa ne l e c t r o c a t a l y t i cp r o c e s s g i v e nt h el o wd e t e c t i o n l i m i t ，h i g hs e n s i t i v i t ya n ds e l e c t i v i t y ，t h e s u c c e s sa c h i e v e dh e r es e e m sp l a u s i b l yt o s e r v ea sas i g n i f i c a n ts t e pt o w a r dt h ed e v e l o p m e n to f v e r s a t i l el a b e l - f r e ei m m u n o a s s a y i nc h a p t e r3 ，an o v e lo n o f fe l e c t r o n i cn a n o s w i t c hi sc o n s t r u c t e db a s e do nt h e c o n f 0 珊a t i o n a lc h a n g eo fd n as e q u e n c ew i t has in g l eg u a n i n e ( g ) - r i c h s t r e t c h a t h i 0 1 a t e d a m i n e c o n t a i n i n gg r i c hd n as e q u e n c ei s i m m o b i l i z e do nt h es u r f a c eo f g o l de l e c t r o d e a n di st h e nl a b e l e d w i t hr e d o x a c t i v ef e r r o c e n em o l e c u l e s t h e s u r f a c e - c o n f i n e dd n as e q u e n c ei sa b l e t oc h a n g ei t sc o n f i g u r a t i o nb e t w e e nr i g i d t e t r a m o l e c u l a r g q u a d r u p l e x a n df l e x i b l e s i n g l e s t r a n d e d s t r u c t u r e s t h el a r g e c o n f o r m a t i o n a lc h a n g ee n a b l e s t h e p r o b e s t o p e r f o r m a ni n c h w o r m l i k e e x t e n d i n g s h r i n k i n gm o t i o n ，w h i c hi sr e f l e c t e db yt h ef l u c t u a t i o n i nc u r r e n ti n t e n s i t y s i n c ep o t a s s i u mi o nc a ns p e c i f i c a l l yb i n d t og q u a d r u p l e x ，u s i n gt h i sr e a g e n t l e s s r e u s a b l ee l e c t r o c h e m i c a ls e n s i n gp l a t f o r m ，t h es i m p l e ，r a p i da n ds e l e c t i v ed e t e c t i o no f p o t a s s i u mi o nc a nb ea c c o m p l i s h e dw i t h o u tt h eu s e o fe x o g e n o u sr e a g e n t s k e y w o r d s ：e l e c t r o c h e m i c a l b i o s e n s o r s ；e l e c t r o c h e m i c a l i m m u n o s e n s o r ； a n t i b o d y ；a p t a m e r 硕士学位论文 1 1 生物传感器概述 第1 章绪论 随着信息技术与生物工程技术的发展，生物传感器得到了极为迅速的发展， 当今各发达国家都把生物传感技术列为2 l 世纪的关键技术，给予特别的重视和 支持。生物传感器是由生物、化学、物理、医学、电子技术等多种学科互相渗 透成长起来的高新技术，它是以生物活性单元( 如酶、抗体、核酸或活细胞) 作为 敏感基元，通过各种物理、化学换能器捕捉目标物与敏感基元之间的反应，然后 将其转换成连续或离散的电信号或光信号，再经电子仪器对这些信号进行处理， 从而成为人们可以掌握的信息1 2 3 j 。 生物传感器由产生信号的敏感元件和处理信号的辅助仪器两部分组成( 图 1 1 ) 。其中敏感元件是传感器的核心，由敏感基元和换能器组成。敏感基元是 对目标物进行选择性作用的生物活性单元，最早被使用的是具有高度选择催化活 性的酶。随着生物传感技术的发展，人们成功地把抗体、核酸适配子( 特定d n a 或r n a 序列) 、细胞受体和完整细胞等具有特异选择性作用功能的生物活性单 元用作了敏感基元。换能器是捕捉敏感基元与目标物之间的反应过程，并将其表 达为物理信号的元件。最早应用的换能器是电化学传感器，但随着各种物理手段 的引入，基于热效应、压电效应、光效应的换能器不断发展和完善。 换能器。 上上 1 p r r 微电子线路 分析样品 一鬻茹裂瓮 电化学 卜一光学 压电等 卜一信号 图1 1 传感器工作原理 基于抗体和核酸适配子构建新型电化学生物传感器 因为电化学换能器具有较高的灵敏度，易微型化，能在浑浊的溶液中操作等 许多优势，并且所需的仪器简单、便宜，所以被广泛应用于传感器的制备中【4 5 1 。 本文将着重论述以抗体和核酸适配子作为敏感基元，以电极作为换能器的新型电 化学生物传感器。 1 1 1 电化学生物传感器的原理 电化学生物传感器( e l e c t r o c h e m i c a lb i o s e n s o r ) 是以生物活性物质为分子识 别物，并以适当的电极将浓度信号转换成电信号，以电势、电流或电容为特征检 测信号的生物传感器。电化学生物传感器是在化学传感器的基础上发展起来的， 也是电化学分析和生物技术研究最为活跃的领域之一。它具有选择性好、灵敏度 高、分析速度快、操作简便、可实现在线分析和活体分析等特点，已广泛用于生 命科学、环境分析、药物分析等领域，在分析化学的研究中起着越来越重要的作 用。近年来，纳米技术、表面科学等方法引入电化学生物传感器的研究，极大地 促进了电化学生物传感器基础和应用研究的快速发展。 1 1 2 电化学生物传感器的分类 根据固定在电极表面的敏感元件的不同，电化学生物传感器可分为酶传感器 【6 1 ，免疫传感器【7 1 ，核酸传感器【8 1 和微生物传感器【9 1 等。 根据所检测到的电信号的不同，电化学生物传感器又可分为电流型、电位型、 电导型、场效应传感器等【1 0 ，1 1 】。电流型传感器是在电极上加上恒定电压作为溶 液中电活性成分进行电子传递反应的外加动力，而流过电化学池的电流大小与溶 液中电活性成分的浓度具有一定相关性，从而通过检测电流大小来分析相应被测 物的浓度大小及变化。该法具有操作简单，响应线性好等优点。电位型传感器是 根据电极平衡时，通过测定指示电极和参比电极的电位差值与响应离子活度的对 数呈线性关系来确定物质活度的一类电化学传感器。电位型传感器在某种程度上 可以看成电流法当其工作电流趋向无穷小的一种极限情况。电导型传感器是将被 测物氧化或还原后电解质溶液的电导变化作为信号输出，从而实现离子检测的电 化学传感器。场效应传感器则是将溶液中电解质的离子活度转换成电信号输出的 场效应晶体管传感器。 1 1 3 生物分子在电极表面的固定方法 对于电化学生物传感器，敏感基元在电极表面的固定量和活性直接影响传感 器的灵敏度和选择性。为了在电极表面有效连接生物识别分子，保持其对待测分 子的特异结合活性，往往需要借助特定的物理或化学方法。就目前而言，其固定 方法大致可以分为以下几类： 硕士学位论文 1 1 3 1 吸附法 吸附法通常是利用非共价键作用将生物分子吸附到电极表面【1 2 】。主要分为： 物理吸附、静电吸附、化学吸附。该方法的主要优点是形成的生物膜能保持好的 生物活性并且制作简单。但其缺点是由于吸附作用相对较弱，容易使生物分子从 电极表面脱落导致电极响应降低。 1 1 3 2 自组装膜法 自组装膜是构膜分子通过分子间及其与基体材料间的物理化学作用而自发形 成的一种热力学稳定、排列规则的单层或多层分子膜【1 2 】。在构建电化学生物传感 器中，通常在金电极表面构建含s h 的自组装单分子层，再在该自组装单分子层上 共价键合或吸附固定d n a ，该方法可取得良好的效果。或先将d n a 进行衍生化反 应，在d n a 上连接上s h 基，然后将衍生化的d n a 直接自组装固定在金电极上，得 到结合牢固、排列有序、分布均匀的d n a 自组装膜。 1 1 3 3 涂渍法 将溶解在适当溶剂中的聚合物涂覆于电极表面，待溶剂蒸发干固后，生成一层 致密聚合物膜覆盖于电极表面，从而达到化学修饰的目的。 涂渍法的具体操作方法有以下三种：( a ) 将电极浸入修饰液中，取出后使附 着于电极表面的溶液干固成膜；( b ) 用微量注射器把一定已知量的修饰液注射到 电极表面，然后干固成膜；( c ) 电极在修饰液中旋转，使其溶液附着于电极表面， 然后干固成膜。显然b 法涂膜的量可以控制，另两种方法无法控制成膜的量。 该方法可将具有氧化还原中心的聚合物、具有离子选择性和透过性的聚合物、 配位分子、高分子电解质、具有光敏效应的聚合物、导电性共轭高分子、粘土类 无机高分子等涂渍于电极上。此外，还将聚合物与电活性物质同时制成涂膜液涂 渍于电极表面，用该法制备化学修饰电极具有广泛的应用前景。 1 1 3 4 共价键和法 利用化学反应将修饰试剂共价结合到电极表面的方法，叫做共价键合法。该方 法主要有以下两个步骤：首先将电极表面进行化学或物理预处理，然后将修饰物 分子与电极表面的活性基团在适当条件下进行化学反应使其固定于电极表面。 ( 1 ) 电极的活化预处理 金属电极先用a 1 2 0 3 ( 0 3i - t m - - - 0 6 m ) 悬浊液抛光，然后依次用浓硝酸、稀 王水及二次蒸馏水充分洗净，再浸入lmh 2 s 0 4 溶液中5m i n 后，在电极电位+ 1 9v ， 电流lp a e m _ 2 以下进行电解约1 0s - - 2 0s ，然后从电解液中取出电极用二次蒸馏水 洗净，再用丙酮洗涤干净。此时电极表面就含有羟基活性基团。 ( 2 ) 共价键合修饰 基于抗体和核酸适配予构建新型电化学生物传感器 金属及其氧化物电极可以先与有机硅化合物作用，把化学活性基团的物质键合 到电极表面，再利用电活性基团与化学活性基团r 作用，将电活性基团修饰到电极 上去。h y u n 等【l3 】用胱胺对金电极胺基化，然后将经1 0 4 一氧化后带有大量醛基的葡 萄糖氧化酶( g o d ) 和带有许多氨基的树枝状的聚酰胺基胺交替键合到金电极表 面上，形成层状结构。电极制作简单，其敏感度和膜的厚度可控制，固定化酶可 以是一种也可以是多种。 1 1 3 5 电化学聚合法 将预处理好的电极放入含有一定浓度的单体和支持电解质的体系中，通过电化 学氧化还原引发，使电活性的单体就地在电极表面发生聚合，生成聚合物膜，达 到修饰目的的方法称为电化学聚合法。 由于化学修饰电极表面有许多氧化还原中心，又称为氧化还原聚合物化学修饰 电极。在电化学聚合法中，恒电流法应用较广，因可根据聚合过程中的聚合电量 估算聚合物薄膜的厚度，结果重现性好；恒电位法不能控制电聚合的速度，影响 到电极的重现性；循环伏安法( c v ) 能获得良好的聚合物膜修饰电极，并能根据 连续c v 图现场观察聚合物膜的形成，便于了解聚合过程。随着循环扫描周数的增 加，伏安图上相应蜂电流不断变化是形成聚合物膜的特征。d i a z 在19 7 9 年首次报导 了电化学氧化吡咯在电极表面形成聚吡咯( p p y ) 。随后又在电极表面修饰了聚噻 吩( p t h ) 、聚苯胺( p a n ) 及其相应的衍生物等【14 1 。s k o m p s k a 等【1 5 】在p t d g 极上电 化学聚合n 乙烯基咔唑。o y a m a 等t 1 6 】曾制得聚4 乙烯基吡啶、季碱化聚4 乙烯基吡 啶修饰电极，并利用聚合物中配位基团的吡啶部分，通过配位取代反应再把配阴 离子或配阳离子结合上去。 1 2 电化学免疫传感器 电化学免疫传感器是基于抗原抗体反应的，可进行特异性的定量或半定量分 析的自给式的集成器件。抗原抗体是分子识别元件，与电化学传感元件直接接触， 并通过传感元件把化学物质浓度信号转变为相应的电信号【l7 1 。具有生物传感器选 择性好，种类多，测试费用低，适合联机化等优点；又具有电化学体系可实现在 体检测，不受样品颜色、浊度的影响，所需仪器设备相对简单，具有简便、快速、 体积小等特点【l8 】；由于抗原和抗体的特异性反应，免疫传感器较其他生物和化学传 感器有更高的专一性和选择性，是生物传感器中最为成熟、应用最广泛的一种，能 广泛应用于医疗、食品分析、工业生产、环境检测等领域。 根据测量信号的不同，电化学免疫传感大致可分为：电流型、电位型和电容 或电导型。 硕上学位论文 1 2 1 电流型免疫传感器 电流型免疫传感器是研究比较活跃的一个领域。它通过测定恒定电压下 待测物氧化还原反应在传感电极上产生的电流，以获得待测物浓度。此类传感器 具有高灵敏度以及响应信号与浓度线性相关等优点。但由于抗原一抗体本身不具备 电活性，所以对于电流型免疫传感器，常需借助于抗原或抗体的酶标来反映电极 上的抗原一抗体的结合反应，从而达到间接测定待测物的目的。这就使得检测过程 相对复杂，同时由于绝缘性的抗体或抗原蛋白在电极表面的结合，也减弱了电极 的导电性。 电流型免疫传感器的测定过程一般包括两个步骤：先通过一个竞争式或夹心式 韵免疫反应，将酶标记物键合在传感器表面；然后通过一个酶催化反应引起测试体 系的电流变化。l9 8 0 年a i z a w a 将a f p 抗体固定于醋纤膜上，并将此膜紧贴在电流型 氧电极的透氧膜表面，组装成测定a f p 的免疫电极，用过氧化物酶标记a f p ，竞争法检 测a f p 线性范围达到l o 。1 1 1 0 。8g m l 1 引。不过该测定系统易受样品溶解氧及p h 的影 响，工作电位较高，背景较差。虽然通入气体氩能有效消除溶解氧，但无形中又增添了 许多麻烦。第二代酶标记电流型免疫传感器使用电活性物质替代分子0 2 ，基本克服 了上述问题。这些电活性物质包括二茂铁衍生物、苯醌、氯醌、亚甲基蓝、血红 素等。c i a n a l 2 2 】选择对羟基磷酸苯为碱性磷酸酶的底物，结合流动注射分析使a f p 检 测下限达到0 0 7n g m l 。 近年来，由于电流型免疫传感器的高选择性、高灵敏度等特点，免疫传感器在 医疗、环境检测和食品分析上应用越来越广泛。 1 2 2 电位型免疫传感器 电位型免疫传感器是基于测量电位变化来进行免疫分析的生物传感器。2 0 世纪 6 0 - 7 0 年代，随着酶联技术的发展，电位型免疫传感器也逐渐兴起1 2 3 1 。这种传感器 通常以离子选择电极、气敏电极作为基础电极，酶作为标记物来催化底物反应， 使底物释放出离子或气体，待测抗体( 或抗原) 的浓度与酶催化产物在基体电极 上的响应相关【2 4 五8 1 。但在电位型酶联免疫分析程序中，一般涉及到异相分离和二 抗，而且灵敏度不高。 1 2 3 电容型免疫传感器 基于电容( 或阻抗) 测量技术的电容型( 或阻抗型) 免疫传感器，由于其具 有高灵敏度及无须标记的特点，近年来得到较大的发展【2 9 3 2 】。在传感器领域里有 着极大的研究和应用意义。电容型免疫传感器原理是将抗体固定在电极表面，当 抗原抗体在电极表面结合时，由于极性小的生物大分子吸附到电极表面，显著降 基于抗体和核酸适配子构建新型电化学生物传感器 低界面电容，据此检测抗原的量。 1 2 4 电导型免疫传感器 化学反应中产生或消耗的离子，能使溶液的导电能力发生改变。因此基于免 疫反应引起溶液或薄膜的电导发生变化的免疫传感器被称为电导型免疫传感器。 由于电导法易受待测样品离子强度和缓冲液容积的影响，且难以克服非特异吸附， 使得其应用受到局限【l8 1 。 1 3 基于核酸适配子的电化学传感器 适配子( 适体，a p t a m e r ) 是【3 3 。3 5 1 利用体外筛选技术指数富集的配体系统 进化技术( s y s t e m a t i ce v o l u t i o no fl i g a n d sb ye x p o n e n t i a le n r i c h m e n t ，s e l e x ) ，从核 酸分子文库中得到的寡核苷酸片段一一单链d n a 或r n a 序列，可与靶物质分子高 特异性、高亲合力结合。由于适配子与靶物质结合具有高的特异性和亲和力，加 上其稳定性方面和s e l e x 技术上的优势，在过去十几年中，采用s e l e x 技术已经 筛选出能和小分子、多肽、蛋白质，甚至对整个细胞均有良好识别能力的适配子。 核酸适配子的出现及其相关研究的迅速发展【3 6 3 引，意味着核酸探针在生化分析中 发挥着越来越重要的作用。 适体生物传感器( a p t a s e n s o r ) 是将适体作为分子识别元件固定在信号转换器上 组成的分析器件，按照检测方法不同分为：适体电化学传感器、适体光学传感器和适 体质量型传感器等。由于电化学生物传感器具有选择性好、灵敏度高、响应快、 操作简便、价格低廉等优点，结合适体的高特异性、高选择性，而成为研究热点。 1 3 1 适配子电化学生物传感器的原理及分类 适体电化学生物传感器是指将适体作为分子识别物质固定在电极上，根据适体 与目标分析物一配体结合前后电化学信号的变化来进行检测的电化学传感器。其 过程一般包括以下四步：一是适体的固定化；二是适体特异性识别靶物质，即适体与 靶物质的结合；三是将适体识别靶物质的信息转换为可测定的电化学信号；四是电 化学信号的检测【3 9 1 。适体电化学生物传感器根据是否需要标记，分为非标记型和标 记型两种。非标记型指对适体不标记，直接根据适体识别前后引起电阻、电流或电 位的变化进行检测的传感器。这类传感器的优点是无需标记、操作简单、实时检 测方便、假信号率低，对适体的活性没有损伤；缺点是灵敏度较低。标记型是指对适 体进行标记，根据识别前后标记物电化学信号的变化进行检测。标记物分为三种：一 是电活性物质，如，二茂铁、亚甲基蓝等；二是酶，如，辣根过氧化物酶；葡萄糖脱氢酶。 三是纳米粒子，如，铂纳米粒子、量子点纳米粒子、金纳米粒子等。标记型的优点是 灵敏度高，缺点是识别物需要标记、操作步骤多、较繁琐。下文将着重介绍标记型 硕士学位论文 适配子电化学传感器。 1 3 2 标记型适配子电化学生物传感器 标记型适体电化学生物传感器是基于适配子识别靶物质前后适体构象的变化， 导致标记在适体上的电活性物质电荷转移效率发生改变，从而引起检测的电流信号 变化的原理而检测靶物质的浓度。亚甲基蓝和二茂铁具有良好的电化学活性，是 最常用的适配子标记物。 x i a o 等【4 0 】报道将标记亚甲基蓝的凝血酶适体( 3 2 个碱基) 自组装固定在金电极 表面，与凝血酶结合前，适配子具备高动态性，使得亚甲基蓝与电极表面保持高 频率碰撞，电子传导能力强，因此电流响应大；与凝血酶结合后，由于适配子形 成稳定刚性g 四股螺旋结构，导致标记的亚甲基蓝与电极的距离增大，电流响应 显著减小，根据电流信号的减少对凝血酶进行检测，属于信号抑制( s i n g a lo f f ) 型。 ( 见图1 2 ) 信号抑制型的优点是电极的表面可以更新，不足之处在于其易得到假 阳性结果。 测原理 图1 3 信号放大型检测原理 随后，他们又设计了信号放大型的电化学传感器【4 u ：通过巯基自组装作用将2 7 个碱基的凝血酶核酸适配子固定在金电极表面，另一条部分互补的5 端标记了亚 甲基蓝的d n a 链与之杂交。杂交后，亚甲基蓝距离电极表面较远，电子传递能力弱， 亚甲基蓝的还原电流很小；当加入凝血酶后，凝血酶与适体强烈的结合力使杂交双 链部分解离，从而释放标记了亚甲基蓝d n a 序列的5 端，使得亚甲基蓝离电极表 基于抗体和核酸适配子构建新型电化学生物传感器 面的距离变近，亚甲基蓝的还原电流增大。该法测定的灵敏度为3n m o l l 。s i g n a lo n 型克服了s i g n a lo f f 型可能会检测到的假阳性结果，提高了检测的灵敏度。但是， s i g n a lo n 型的电极只能在2 4h 内保持稳定，电极无法更新，需要每天更换。 1 4 电化学生物传感器的发展趋势及展望 现代生物技术、生物电子学和微电子学最新成果的不断渗透和发展，对电化 学生物传感器的发展有着深远影响。通过对生物识别分子筛选，传感器件的构造 和电化学响应机理的改进，以期开发出类似嗅觉器官、味觉器官那样更灵敏、更 新颖的生物传感器，如专业化的电化学生物传感器、微型化的电化学生物传感器、 集成式及智能化的电化学生物传感器等，可以预见，未来的电化学生物传感器将 具有以下特点： ( 1 ) 智能化与集成化：未来的电化学生物传感器必定与计算机紧密结合，自 动采集数据、处理数据，更科学、更准确地提供结果，实现采样、进样、结果一 条龙，形成检测的自动化系统。同时，芯片技术将越来越多地进入传感器领域， 检测系统的集成化、一体化，电化学生物传感器不断与其他分析技术联用互相取 长补短向体内监测、在线监测方向发展。 ( 2 ) 多功能化：未来的电化学生物传感器将进一步涉及医疗保健、疾病诊断、 食品检测各个领域。目前，生物传感器研究中重要内容之一就是研究仿生传感器。 ( 3 ) 微型化：随着微电子机械系统技术和纳米技术不断深入到传感技术领 域，电化学生物传感器将不断微型化，各种便携式电化学生物传感器的出现使人 们在家中进行疾病诊断。 ( 4 ) 、高灵敏度、高稳定性、高寿命和低成本：电化学生物传感器技术的不 断进步，必然要求不断降低产品成本，提高灵敏度、稳定性和延长寿命。电化学 生物传感器必将在发展中不断完善，成为分析化学领域发展的巨大推动力。 1 5 本文构思 分析化学在生命科学中相关领域的研究，目前主要集中在核酸、蛋白质、抗 体等生物大分子、生物药物、超微量、超痕量生物活性物质、活体分析及其在信 号传导中的作用等各方面的分析研究。综合生物传感器相关最新文献报道，结合 本实验室原有工作基础，本论文利用核酸适配子、抗体等生物大分子作为高度选 择性的分子识别体系，结合电化学传感器的简易实用、快速准确、高灵敏和低成 本等特点，拟开展如下几项研究工作： ( 1 ) 以人的i g e 为目标分析物，构建基于金纳米粒子和复合膜的介导电子传输 介导而的分析平台，并利用m b 还原铁氰化钾的电催化作用实现了信号扩增。构建 硕十学位论文 了一种高灵敏，非标记的电化学免疫方法用于检测不含电化学活性中心的蛋白质。 ( 2 ) 将末端富g 核酸序列固定于电极表面，发展一种可逆的电子开关，为纳 米器件的构建提供一种新的思路。这种电子开关可直接应用于钾离子的简便检测。 ( 3 ) 在电化学适配子传感器研究方面致力于寻找稳定的固定化方法和灵敏的 电化学标记物，探索新的检测原理。我们希望借助稳定性好、重现性高的酪胺电 聚合膜，比表面面积大的g n p s 自组装层，电化学活性好的二茂铁；利用核酸适配 子的构型转换机制，目标物的结合引起检测探针的脱落而导致峰电流的降低，构 建用于腺苷检测的高灵敏可再生型电化学传感器。 基于抗体和核酸适配了构建新型电化学生物传感器 第2 章基于电催化扩增的电化学免疫传感器 2 1 前言 在蛋白质组学时代，科学家们在提出高效的蛋白质定性和定量分析方法时， 总是面临着严峻的挑战【4 2 1 。金纳米粒子在生物学研究中表现出了巨大的吸引力 1 4 引。通过应用纳米材料，电化学传感系统在检测痕量生物分子上拥有很大的潜 力1 4 4 ，45 。在适当的电压下，亚甲基蓝( m b ) 可以还原为无色亚甲基蓝( l b ) 。 反过来，l b 还可被铁氰化钾溶液氧化，导致更多的电子流向m b + ，获得增强的 电流。m b 对铁氰化钾的电催化还原特性已用于检测d n a 的单碱基错配【4 6 ，4 7 1 。 免疫球蛋白e ( i g e ) 是一种仅存在于哺乳动物体中的抗体，它可以产生最强的 免疫反应【4 引。因此，i g e 的检测具有重要价值【4 9 1 。在本文中，我们以人i g e 为目 标分析物，提出了一种高灵敏，非标记的电化学免疫方法用于检测没有电化学活 性中心的蛋白质。这个分析平台是基于金纳米粒子和复合膜的介导电子传输介导 而构建的，并利用m b 还原铁氰化钾的电催化作用实现了信号扩增。该电化学免 疫传感方法显示了光明的应用前景。 2 2 实验部分 2 2 1 仪器和试剂 实验所用的扫描电镜( s e m ) 为j s m 5 6 0 0 l v 电子显微镜( 日本电子公司， 日本) 。交流( a c ) 伏安，交流( a c ) 阻抗和循环伏安法的检测是在安装了传 统的三电极系统的c h i7 6 0 b 电化学工作站进行( 上海，中国) 。 人血清免疫球蛋白e 购于子午线生命科学公司( 明尼苏达，美国) 。单克隆 的鼠抗人i g e 抗体( i g e a b ) 购于天津生物技术( 天津，中国) 。金纳米颗粒是 按照以前报道的方法由柠檬酸还原氯金酸制备【5 0 1 。蛋白溶液是在1 0m m 的磷酸 盐缓冲溶液中配制( p b s ，2 0 0m mn a c l ，l m mm g c l 2 和2 7m mk c i ，p h7 4 ) ， 并在4 存储。 2 2 2 传感界面的构造 根据前一个工作所报道方法【5 1 1 ，我们将金电极进行了抛光。示意图2 1 描绘 了传感器界面的制备过程。我们将清洁的金电极表面浸入含有5m m 邻苯二胺单 体和0 4 m m 亚甲基蓝( m b ) 的聚合溶液中，通过循环扫描实现电聚合。扫描电 压为0n + o 8 v ，电压变化速率为5 0m v s 。然后，在聚合物膜修饰的金电极上 硕士学位论文 滴加2 0 0 1 t l 的纳米金溶液，浸润6 0 m i n 。随后，再将一滴1 0 9 l 的i g e a b 溶液( 5 2 j r t g m l ) 滴于电极表面，并在水饱和的大气中保持4 0 m i n 。用lm g m l 的牛血清 白蛋白将电极表面的非选择性位点封闭后，用于分析i g e 的传感界面 ( p p d m b ( 3 n p 抗体，电极a ) 就组装完成了。 f o ( c n ) 6 】3 。 i g e - l - f o ( c n ) 6 t - f e ( c i ) 6 3 - f e ( c n ) 6 】4 一 示意图2 1 金电极的表面修饰过程以及i g e 的电催化检测 2 3 结果与讨论 2 3 1 邻苯二胺韵电聚合 我们利用了典型的循环伏安法监测了整个电聚合过程。经过几个循环周期， 单体的氧化峰几乎消失了，这表明氧化反应是完全不可逆的。这个结果与以前报 道的在基本相同条件下( 除了未添加m b ) 获得的结果无显著差异【5 2 1 。该实验结 果表明在选择的聚合电压下m b 不会表现电活性。因此，在电聚合液中添加m b 是可行的。 2 3 2 电极表面的形貌 为了确认生物识别层是否成功地制备，我们用扫描电镜表征了 p p d m b g n p 抗体电极在不同的制备阶段的形貌特征。相对于裸金电极( 图 2 1 a ) ，掺杂m b 的p p d 修饰电极表面具有均匀，光滑的块状( 图2 1 b ) 。该 聚合物薄膜的形态与f u 等人报道的相似【53 1 。在接触了金纳米粒子后，纳米级粒 子在电极表面均匀分布，如图2 1c 所示，纳米粒子吸附上抗体后，使得其表面 光滑并增大( 图2 1 d ) 。工作电极表面形态的变化进一步证明了电极修饰的成 功。 喜千、号 一 一一。 皋于抗体和核酸适配了构建新型电化学生物传感器 图2 1 电极表面在制备过程中不同阶段的扫描电镜( s e m ) 图( a ) 裸金电极；( b ) p p d m b 膜修 饰的电极；( c ) 组装了纳米金的电极；( d ) 修饰了抗体的电极 2 3 3 循环伏安表征 3 芒 乏 毫 o p o t e 棚a lm 图2 2 传感器界面与含7 2p g m li g e 样品接触前( a ) 后( b ) 的k 3 f e ( c n ) 6 k 4 f e ( c n ) 6 循环 伏安图。插图为电极在正电位下的循环伏安图。扫描速率为1 0 0m v s 图2 2 记录了电化学生物传感器在i g e 存在或不存在的情况下的 k 3 f e ( c n ) 6 k 4 f e ( c n ) 6 】循环伏安图。尽管i g e 分析物的引入会显著地减少电极 1 2 硕士学位论文 表面的电流强度，但是当扫描电压低于0 v 的时候，几乎观察不到m b 的氧化还 原电流峰。此图与先前用错配d n a 双链修饰电极在掺杂m b 和铁氰化钾的混合 物中获得的循环伏安图相似1 54 。然而，当扫描电压在0 0 5 v 的范围内，循环伏 安图显示出一个明显的可逆电流峰( 图2 2 ) ，并且i g e 的免疫吸附对峰电流强 度有显著的抑制作用。这个实验结果表明可以利用现有装置在正电压扫描的情况 下，通过测定氧化还原电流变化来测定i g e 。 2 3 4 电化学信号放大 图2 3 不同的传感器界面与7 2i l g m ll g e 的样品接触前( 实线) 后( 虚线) 的基线校正的 k 3 f e ( c n ) 6 k 4 f e ( c n ) 6 】交流伏安图。工作电极为p p d - m b g n p 抗体电极( a ) ，p p d g n p 抗体 电极( b ) ，p p d m b g a 抗体电极( c ) 和p p d g a 抗体电极( d ) 我们构造了几个具有类似结构的传感器。通过比较这些传感器的信号强度， 我们进一步证实这个免疫生物传感器的可行性。按照在2 2 中描述的p p d m b g n p 抗体电极( 电极a ) 完全相同的制备方法，我们去除了聚合液中的m b ，从而制备了 p p d g n p 抗体电极( 电极b ) 。用戊二醛( g a ) 作为交联剂代替金纳米颗粒构造了 p p d m b g a 抗体电极( 电极c ) 按照电极c 的制备方法，再去除聚合液中的m b ， 我们获得了p p d g a 抗体电极( 电极d ) 如图2 3 所示，由于i g e 在传感器界面的免 霉-bl置e6 基于抗体和核酸适配子构建新型电化学生物传感器 疫吸附，电极a 的电流强度减少了9 0 ，而电极c 仅减少2 8 。如此截然不同的结果 可能是由以下两个原因导致的。首先，相对不导电的g a 分子，导电的金膜促进了 传感器界面的电子传输。因此，在未与i g e 接触前，传感器可以获得较高的峰电流。 其次，i g e a b 修饰的金纳米粒子具有大的比表面积可以吸附大量i 拘l l g e 【55 。，从而形 成对亚铁氰化钾铁氰化钾氧化还原电流的有效抑制。另一方面，如果聚合物膜不 含m b ( 图2 3 b 和d ) ，氧化还原峰电流的变化就不明显。这些数据说明m b 掺杂的 聚合物膜可以促进界面电子的传输，并且这种电子传输很容易被免疫吸附的蛋白 所抑制。虽然真正的响应机理仍然还不明确，但是很明显的是m b 和金纳米粒子的 协同效应能够明显地增强电流。 2 3 5 传感器的响应特性 孑 2 ： c 錾 j o p o t e n t i a l ( 图2 4 由免疫反应导致的k 3 f e ( c n ) 6 k 4 f e ( c n ) 6 】交流伏安图的变化。箭头所指为响应曲线 随i g e 浓度变化而变化的方向。 为了保证现有的分析平台能够灵敏准确的定量检测目标蛋白，我们测定了不 同浓度i g e 所产生的电流响应。如图2 4 所示，引入i 拘l l g e 会导致峰电流的减小，原 因在于i g e 与i g e a b 形成的抗原抗体绝缘层抑制了铁氰根离子的氧化还原1 5 引。以分 析物浓度的对数为x 轴，峰电流为y 轴做图，我们构建的电化学免疫传感器能够在 15 4 至9 4 5n g m l 浓度范围内对分析物线性响应。拟合的方程式y = 9 4 4 5 1 0 9 x + 2 0 8 7 ，相关系数为0 9 8 7 7 。我们可以很容易地检测出i g e 浓度为7 7n g m l ( 约4 0 5 p m ) 的样品，该浓度低于正常人血浆样品的i g e 浓度。我们发现基于抗体的免疫传 感器比以前报道的基于d n a 适配子的传感器更灵敏【5 7 ，5 8 1 。即使一般认为作为识别 因子d n a 适配子优于抗体【58 1 。为了评估该免疫分析方法的重现性，我们使用不同 硕士学位论文 批次的生物传感器测定了i g e 浓度为9 4 5n g m l 样品。重复测定5 次所获得结果的标 准偏差r s d 为7 9 如果以目标分析物i g e 的峰电流响应为10 0 计算，牛血清白 蛋白( 1 9l a g m l ) ，人血清白蛋白( 1 8i t g m l ) 和免疫球蛋白g ( 18i t g m l ) 的峰 电流响应大约都为9 0 。 2 4 小结 我们结合了m b 的催化作用和金纳米粒子独特性质，发展了一种灵敏的电化 学传感器用于检测i g e 。该方法无需制备信号分子标记的抗体和额外的信号扩增 技术，从而避免了很多相关的问题，并且在i g e 的分析中显示了令人瞩目的分析 性能。虽然这还只是一个初步检测方法，但该方法作为一个富有前景的非标记的 电化学免疫分析平台，有望打开了免疫传感器发展的新领域。 基于抗体和核酸适配了构建新型电化学生物传感器 第3 章核酸四股螺旋可逆电子开关的构建 3 1 前言 及用于钾离子的检测 纳米尺寸运动的控制与具有特定功能纳米器件的构建，在多种领域中具有及 其重要的作用【5 9 1 。，d n a 由于具备独特的分子识别性能，而成为构建新型纳米尺 寸器件的理想材料【6 0 l 。因此，d n a 纳米器件的研究近年来日益受到关注【6 0 - 7 2 】。几 种纳米尺寸的运动，例如，闭合一开启、伸展一收缩、旋转与位移，均能使d n a 形态发生改变而产生特定功能。为了启动纳米器件，一般需要借助体系外的d n a 序列。例如，中部是两段刚臂序列、末端是弹性序列的剪刀型杂交d n a 与“f u e l ”单 链d n a 杂交，形成紧密型结构复合物； “a n t i f u e l ”单链d n a 能使其恢复疏松型结 构，原因是“f u e l ”单链d n a 与“a n t i f u e l ”单链d n a 结合力较强而优先杂交【6 1 ，7 3 1 。可 是这些纳米器件能被形态反复转换过程中产生的废品所毒化，逐渐失去再生效率。 富g u a n i n e ( g ) - d n a 能够折叠成特殊的二级结构，g 四股螺旋。众所周知，特定的 蛋白质、小分子与单价金属离子能使这种结构能更加稳定。由于分子内结构折叠 的独特性，相对于普通的d n a 序列，富g d n a 序列在构建纳米器件上具有更多的 优势。因此，不同类型的富g d n a 纳米器件被先后相继报道【7 4 。7 9 1 。然而，如