（发酵工程专业论文）云芝液体深层发酵产胃蛋白酶抑制剂的研究.pdf

摘要 摘要 本论文主要对云芝液体深层发酵产胃蛋白酶抑制剂的发酵条件及其优化、分离纯 化、基本特性和应用初探进行了研究，主要结果如下： 对韩芝、甜芝、赤芝g 8 、云芝4 株菌进行液体深层发酵，生物量以云芝最高，达 1 2 9 7g l ，是韩芝的2 5 6 倍；比较这4 种菌株细胞破壁后对胃蛋白酶的抑制效果，仍以 云芝发酵组最好，可达2 5 1i u m l ；云芝发酵液超声细胞破碎前后对胃蛋白酶的抑制效 果显示，破碎后对胃蛋白酶的抑制活力由破碎前的1 0 9i u m l 提高到2 3 9i u m l ，说明 胃蛋白酶抑制剂为云芝胞内产物。 利用单因素实验，找到云芝发酵产胃蛋白酶抑制剂主要影响因子为装液量、接种量 和起始p h 。在此基础上，以马铃薯为培养基，采用正交实验对培养条件进行优化，得 最佳培养条件：发酵周期1 2 0h ，发酵温度2 8 ( 2 ，转速1 8 0r m i n ，起始p h5 6 ，装液量 7 0m l 2 5 0 m l ，接种量1 2 。优化后抑制剂产量5 6 5i u m l ，比优化前提高了2 0 8 倍。 云芝发酵液经超声细胞破碎，离心和大孔树脂脱色后冻干得粗抑制剂，再经 d e a e - 5 2 、m o n o q 离子交换层析和u l t r o g e l a c a 5 4 凝胶过滤后得到纯化的胃蛋白酶 抑制剂( 命名为c v p p i ) ，纯化倍数达3 8 7 。经s d s p a g e 与u l t r o g e l a c a 5 4 凝胶过滤 测定c v p p l 是单亚基，相对分子量为2 2 3 1k d a 。 c v p p i 的成分为蛋白质，氨基酸组成结果表明：酸性氨基酸( 天冬氨酸和谷氨酸) 的相对含量较高，分别达3 7 1 和1 2 4 ：活性实验分析表明抑制剂本身不是蛋白酶， 也不能被胃蛋白酶水解；最佳抑制反应时间为1 小时；热稳定性较好，1 0 0 保温1 小 时后抑制活性几乎没有任何损失；抑制效果受温度影响不大，1 0 * c 6 0 活性基本稳定； p h 稳定范围为3 0 7 0 。 c v p p i 对胃蛋白酶表现出较高的特异性抑制作用，对蛋白酶a 也具有一定的抑制 活性；它对胃蛋白酶和蛋白酶a 的半抑制浓度i c 5 0 值分别约为2 6 2 6 1 t g m l 和 15 2 4 1 t g m l ，对二者抑制作用的幻值分别为0 8 7 6 p m o l l 和2 7 7 p m o v l ；c v p p i 是胃 蛋白酶的非竞争与反竞争混合型抑制剂，是蛋白酶a 的非竞争性抑制剂；反应机理表明： c v p p i 与胃蛋白酶混合后形成复合物，推测反应机理可能是抑制剂与胃蛋白酶并列相 伴，在酶的活性基团形成氢键并封锁酶与底物的结合部位，从而抑制胃酶的活性。 利用d e a e 5 2 离子交换层析和u l t r o g e l a c a 5 4 凝胶过滤从土豆汁中分离得到一种 与c v p p l 分子量最接近的天冬氨酸蛋白酶抑制剂( 命名为p a p i ) ，其分子量为1 8 9k d a ， 经验证得到两种抑制剂的分子量、反应机理、成分和特异性均不相同，确定c v p p i 与 土豆中的抑制剂并不相同。 对c v p p i 进行应用初探得到其对1 号和2 号商品小麦蛋白水解酶的最佳抑制反应 时间为0 5 小时；两种小麦蛋白酶酶抑比与抑制率不成线性关系，当抑制率达到5 0 时，酶抑比分别为1 0 ：1 和4 ：1 。推测c v p p i 可改善小麦的面团流变性和发酵耐力，预 期其有在食品添加剂等行业的应用潜力。 摘要 关键词：云芝、液体深层发酵、胃蛋白酶抑制剂、正交实验、分离纯化、半抑制浓度、 动力学分析、反应机理 a b s t r a c t a b s t r a c t t h er e s e a r c hm a i n l yf o c u s e do nt h ef o l l o w i n ga s p e c t sa b o u tp e p s i np r o t e a s ei n h i b i t o rf r o m c o r i o l u sv e r s i c o l o rb ys u b m e r g e df e r m e n t a t i o n ，i n c l u d i n gf e r m e n t a t i o nc o n d i t i o n s ，e x t r a c t i n g ， p u r i f i c a t i o n ，t h eb a s i cp r o p e r t i e sa n da p p l i c a t i o n c o m p a r e dt h eb i o m a s so fd i f f e r e n tf u n g ib ys u b m e r g e df e r m e n t a t i o n ，t h em y c e l i u md r y w e i g h to fc o r i o l u sv e r s i c o l o ri st h em o s th e a v y1 2 9 7 9 l ，a b o u t2 5 6t i m e so fg a n t h e r a m l u c i d u m ；c o m p a r e dt h ei n h i b i t i o nr a t eo fe x t r a c t i n ge f f e c to np e p s i n ，c o r i o l u sv e r s i c o l o ri s s t i l lt h eb e s to n e ；c o m p a r e dt h ei n h i b i t i o nr a t eo fc o r i o l u sv e r s i c o l o rb r o t l lb yp r e a n dp o s te e l l d i s r u p t i o ne f f e c to np e p s i n ，a f t e rc e l ld i s r u p t i o nt h ei n h i b i t i o nr a t ei m p r o v e df r o m1 0 9i iy m i ，t 0 2 3 9i u m l ，i tw a ss u g g e s t e dt h a tt h ep e p s i ni n h i b i t o rw a st h ei n t r a c e l l u l a rp r o d u c t i o n t h em a i ni n f l u e n c i n gf a c t o r sw e r ed e t e r m i n e da so p e r a t i o n a lv o l u m e ，i n o c u l u l t is i z ea n d i n i t i a lp hb yu s i n gs i n g l e - f a c t o re x p e r i m e n t a lm e t h o d a sp o t a t of o rc u l t u r em e d i u m ，t h eo r t h o g o n a le x p e r i m e n ta n ds i n g l e f a c t o rt e s t e df o rt h e b e s tc u l t u r ec o n d i t i o n si n d i c a t e dt h a tf e r m e n t a t i o nt i m ei s12 0h f e r m e n t a t i o nt e m p e r a t u r ei s2 8 ，r o t a t es p e e di s18 0r m i n ，i n i t i a lp hi s6 2 ，o p e r a t i o n a lv o l u m ei s7 0m l 2 5 0m l i n o c u l u m s i z ei sl2 ；1 1 1 ei n h i b i t o r ya v t i v i t yw a si m p r o v e dt o5 6 5 砌m l ，i n c r e a s i n gb y2 0 8t i m e s p e p s i ni n h i b i t o rp r o d u c e di nl i q u i ds t a t ef e r m e n t a t i o nb yc o r i o l u sv e r s i c o l o rw a s p r e t r e a t e db yu l t r a s o n i cc e l ld i s m p t i o n , c e n t r i f u g a t i o n ，d e c o l o r i z e db ym a c r o p o r o u sr e s i n ，a n d t h e ni s o l a t e db yd e a e - 5 2 ，m o n oqi o n - e x c h a n g ec h r o m a t o g r a p h ya n du l t r o g e l a c a 5 4 g e l f i l t r a t i o n ( b en a m e dc v p p i ) ，t h ep u r i f i c a t i n gt i m e sw a s3 8 7 i tw a si d e n t i f i e dt ob ea p r o t e i na n ds h o w e das i n g l es u b u n i tb yt h em e t h o d so fu l t r o g e l a c a 5 4g e l f i l t r a t i o na n d s d s p a g e t h er e l a t i v em o l e c u l a rw e i g h tw a s2 2 3lk d a c v p p lw a sc o n s i s t e do f p r o t e i n a m i n oa c i dc o m p o s i t i o n d a t ei n d i c a t e dt h a ti tw a sr i c hi n a c i d i ca m i n oa c i d ( a s p a r t i ca c i da n dg l u t a m i ca c i d ) ，r e a c h i n gt o3 7 1 a n d 1 2 4 ； e x p e r i m e n t a t i o ni n d i c a t e dt h a tt h ei n h i b i t o rw a sn o tp r o t e i n a s e ；t h eb e s tr e a c t i n gt i m ew a s1h ： t h ei n h i b i t o rs h o w e dar e m a r k a b l eh e a ts t a b i l i t y , i tr e t a i n e di t si n i t i a la c t i v i t ye v e na tu pt o 1 0 0 f o r1h ：t h ep hs t a b i l i t yr a n g eo f i tw a sa b o u t3 0 - - 7 0 b yi n v e s t i g a t i n gt h ei n t e r a c t i o nb e t w e e nc v p p ia n dv a r i e t yo fp r o t e i n a s e s ，i ti si n d i c a t e d t h a tt h ei n h i b i t o rw a sm o r es p e c i f i ca g a i n s ta s p a r t i ca c i dp r o t e i n a s e ( s u c ha sp e p s i na n dy e a s t p r o t e i n a s ea ) t h a no t h e rp r o t e i n a s e s ；t h ec o n c e n t r a t i o nr e q u i r e df o r5 0 i n h i b i t i o n ( i c 5 0 ) t o p e p s i na n dp r aw e r e2 6 2 6p g m la n d15 2 4p , g m l ；t h ed i s s o c i a t i o nc o n s t a n t s ( 鼬) f o rt h e t w ow e r e0 8 7 6 t m o l la n d2 7 7 i ，t m o l l ；t h ed i s s o c i a t i o nc o n s t a n t s ( ) f o rt h et w ow e r e 0 9 9 6 i _ t m o l la n d3 1o “m o l l ；k i n e t i cs t u d i e s ( l i n ew e a v e r - b u r km e t h o d ) s h o w e dc v p p lw a s ak i n do fn o n c o m p e t i t i v ea n da n t i c o m p e i t i t v ei n h i b i t o rt o p e p s i nw h i l en o n c o m p e t i t i v e i n h i b i t o rt op r a ；t h ec o m b i n e dm o d eo fc v p p ia n dp e p s i nw a s i tm a y b ef o r m e dh y d r o g e n b o n d si nt h ea c t i v eg r o u p so ft h ep e p s i na n db l o c k e d b i n d i n gs i t e so ft h ep e p s i na n ds u b s t r a t e al ( i n do fa s p a r t i ca c i dp r o t e a s ei n h i b i t o r ( b en a m e dp a p l lw a si s o l a t e db yd e a e 5 2 i o n - e x c h a n g ec h r o m a t o g r a p h ya n du l t r o g e l a c a - 5 4g e l f i l t r a t i o nf r o mp o t a t oj u i c e ，t h e r e l a t i v em o l e c u l a rw e i g h tw a s18 9k d a b ye x p e r i m e n t a t i o ni n d i c a t i n gt h e i rm o l e c u l a r w e i g h t ， r e a c t i n gm e c h a n i s m ，c o m p o s i t i o na n di n h i b i t i o nw e r ea l ld i f f e r e n t ，s ot h a tc v p p lw a sd i f f e r e n t i i i a b s t r a c t f r o mp a p i b ya p p l y i n g ，i t sb e s tr e a c t i n gt i m et on o 1a n d2p r o t e i n a s e sw a s 0 5h t h er a t i o sa b o u tt h e t w op r o t e i n a s e st oc v p p lw e r en o tl i n e a r i t y , a st h ei n h i b i t i o n a t er e a c h i n gt o5 0 ，t h er a t i o s w e r e10 ：1a n d 4 ：1 m a y b ec v p p ic o u l di m p r o v et h er h e o l o g i cc h a r a c t e r i s t i c so fw h e a tf l o u r , t h e r ew o u l db ea p p l y i n gp o t e n t i a li nf o o da d d i i t i v ei n d u s t r y k e y w o r d s ：c o r i o l u sv e r s i c o l o n s u b m e r g e df e r m e n t a t i o n ，p e p s i ni n h i b i t o r , t h eo r t h o g o n a l e x p e r i m e n t ，p u r i f i c a t i o n ，i c 5 0 ，k i n e t i cs t u d i e s ，r e a c t i n gm e c h a n i s m i v 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是苯人在导师指导下进行的研究工作及取 得的研究成果尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文 中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含本人为获得江南 大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料与我一同工作的同志 对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意 签名： 纠舀 日 期： 12 ：垒：兰 关于论文使用授权的说明 本学位论文作者完全了解江南大学有关保留、使用学位论文的规定： 江南大学有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允 许论文被查阅和借阅，可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库 进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文， 并且本人电子文档的内容和纸质论文的内容相一致 保密的学位论文在解密后也遵守此规定 签名：灶导师签名： 日 期： 第一章绪论 第一章绪论 1 1 研究背景 在全球医疗卫生迅速发展的今天，艾滋、恶性肿瘤等仍然是困扰医学界的重大难题， 目前还没有很好的手段来治愈这些疾病。 获得性免疫缺陷综合症，又称艾滋病( a i d s ) 【l 】。由于临床症状复杂和死亡率高， 被视为“超级癌症 和“世界瘟疫【2 】。它是由一种被称为人类免疫缺陷病毒( h i v ) 所引起的。位于t 淋巴细胞上的c d 4 分子是病毒的受体。hi v 蛋白酶是人类免疫缺陷 病毒产生的，这类蛋白酶专门负责病毒及其酶的前体清除工作。正是在这种酶的作用下 产生了成熟的、易感染的病毒【lj 。 h i v 蛋白酶是天冬氨酸蛋白酶，它的底物是肽。在水解过程中，一个水分子被天 冬氨酰残基的羧基活化，水分子中的氧原子亲核进攻要断裂的酰胺键的羰基，产生 一个四面体型过渡中间体，然后分裂形成氨基和羧基化合物( 图1 1 ) p l 。 ；j j h 肽底圹p 邑2 s ， 过渡态 俚 m v _ 1 蛋白酶 h 、o p ， 一文c 洲h 2 n 寸 产物p 1 图1 1 h i v 蛋白酶与肽底物的结合和水解 f i g 1 1c o m b i n a t i o na n dh y d r o l y z a t i o nf o rh i va n dp e p t i d es u b s t r a t e 目前抗h i v 药物的研究重点主要集中在hi v 蛋白酶、逆转录酶、整合酶及病毒吸 附、融合等几个靶点【4 】。其中hi v 蛋白酶和逆转录酶都是天冬氨酸蛋白酶，之外天冬 氨酸蛋白酶还包括：胃蛋白酶、血管紧张肽原酶、蛋白酶a 、组织蛋白酶d 、天冬氨酸 膜内裂解蛋白酶等，这些蛋白酶的生物学功能主要体现在：消化食物蛋白、降解抗原、 促进其他酶的活化、位点特异性水解逆转录酶病毒前体蛋白以产生病毒体复制所必须的 酶蛋白、调整血压等等。天冬氨酸蛋白酶是导致艾滋病、恶性肿瘤、高血压等世界上几 种难治疾病的发病因素之一【5 】，深入了解天冬氨酸蛋白酶抑制剂，对治疗这些顽固性疾 病将有一定的帮助。 蛋白酶抑制剂是泛指对蛋白酶具有抑制作用的一类物质，它可以是大分子的蛋白， 江南大学硕士学位论文 小分子的有机物，或者是寡聚核苷酸，参与生物体内的蛋白酶解活动的控制【6 j ，对于维 持正常的生命活动具有重要意义。它的来源十分广泛，在很多的动植物的组织器官及某 些微生物中都有存在。按照其抑制的目标蛋白酶的活性中心的不同，大致可以分为以下 几种：丝氨酸蛋白酶抑制剂( s e r p i n ) ：如胰蛋白酶抑制剂( t r y p s i ni n h i b i t o ri t ) ；半 胱氨酸蛋白酶抑制剂( c y s c ) ：如木瓜蛋白酶抑制剂；天冬氨酸蛋白酶抑制剂：如h i v 蛋白酶抑制剂，胃蛋白酶抑制剂、蛋白酶a 抑制剂和血管紧张肽原酶抑制剂；金属蛋白 酶抑制剂：如羧肽酶抑制刘7 】、血管紧张素转化酶( a c e ) 抑制剂等【8 - 9 1 。 云芝是我国传统的名贵药材，富含丰富的营养及多种生物活性成分，具有药用保健 作用，是一种具有广泛药理活性的药用真菌。云芝液体深层发酵的发酵产物复杂，主要 为云芝多糖和云芝糖肽。 云芝多糖是良好的生物效应调节剂，具有抑制肿瘤、调节免疫、降低放射、化疗毒 副反应等多种药理作用，并有抗艾滋病毒活性【lo 】，能调节人体的免疫功能，增强巨噬细 胞的吞噬作用【1 1 。1 4 】。云芝糖肽是一种有效的免疫增强剂，抗肿瘤、镇痛【1 5 】、免疫调节、 抗缺氧、促进多种细胞因子、抗乙肝病毒的产生；云芝或灵芝糖肽与螺旋霉素合用，具 有潜在的抗弓形虫感染的效果。 云芝深层发酵易于规模化、大量生产，以土豆汁作为培养基具有取材易，成本 低，使用安全，杂质相对较少，应用广泛等优点【l6 1 ，因此利用云芝发酵产蛋白酶抑制剂 将有良好的应用前景。 1 2 研究现状 1 2 1 云芝深层发酵的研究 云芝( c o r i o l u sv e r s i c o l o r ) 又称为采绒革盖菌、彩纹云芝、千层蘑、彩云革盖菌等， 属于担子菌多孔科云芝属，别名杂色云芝。云芝味甘、淡，性微寒，有健胃利脾，止咳 平喘，清热解毒，抗肿瘤的功效。现代药理研究表明云芝多糖为该菌的主要有效组分， 具有抑制肿瘤、抗溃疡、保肝、抗病毒、降血脂、抗衰老等多种药理作用i l7 。2 刚，现已正 式投产，并广泛应用于临床。 云芝的各种活性成分大多是从其子实体中分离提取的，即使利用现代人工栽培技术 也很难做到规模化生产，所以云芝液体深层发酵技术近年来得到较快发展。江南大学余 晓斌、尤蓉、胡卫珍【2 7 】等对云芝菌丝体多糖的分离纯化、云芝糖肽的液体发酵及控铝i j p h 值对云芝发酵罐液态培养的影响进行了研究；新乡医学院郭伟云【2 8 】等对云芝产漆酶发酵 条件进行了研究；深圳职业技术学院黄志立、张丽君、刘纠2 9 j 等研究了p h 值对云芝菌 丝体生物量及s o d 活性的影响；南京工业大学林晓霞、熊强、陆利霞【3 0 】等进行了云芝糖 肽的液体发酵培养基的研究；河南工业大学徐淑霞【3 l j 等进行了杂色云芝漆酶和发酵液降 解对苯二酚的研究；天津师范大学马海燕、郭成金1 3 2 】对云芝菌丝体液体培养基进行筛选； 陕西省资源生物重点实验室邓百万、陈文吲3 3 】对云芝液体培养及富集硒进行了研究：华 南理工周少奇【3 4 】等研究了云芝菌丝体发酵清液的流变特性与表面张力；安徽师范大学潘 继红【3 5 1 等研制了云芝保健饮料；浙江大学吴坤、朱显掣3 6 1 对杂色云芝产漆酶的发酵进行 2 第一章绪论 了研究等等。 由以上研究可看出，云芝大规模生产可以利用发酵法进行，它代表了云芝研究和开 发的一种发展趋势：既从野生采集到人工栽培，再应用到生物工程新技术，把真菌学与 工业发酵技术相结合形成液体深层发酵的新兴产业。这种生产方式能够大大缩短生产周 期，扩大生产规模，简化生产工艺，降低生产成本等。 1 2 2 蛋白酶抑制剂的研究 上一节所讲抑制剂是按照其抑制的目标蛋白酶的活性分类，按照其作用的方式来看 可分为：不可逆性抑制剂，可逆性抑制剂，后者又可分为竞争性抑制剂，非竞争性抑制 剂，和反竞争性抑制刘3 7 】和混合性抑制刘3 8 1 。竞争性抑制剂作用的特点是在抑制剂( i ) 存在时，i 与底物( s ) 竞争酶( e ) 的结合部位，但不能形成e i s _ 三元络合物，此时最大酶 反应初速度( ) 不受影响，而表观值增大；非竞争性抑制剂作用的特点是i 和s 可 同时独立地与e 结合形成三元络合物，但络合物无活性，不能催化反应，此时表观 不变，减小；反竞争性抑制剂作用的特点是1 只能和e s 络合物结合，使反应体 系的平衡趋向于e s 的形成，因此，i 的存在反而增加了e 与s 的亲和力，此时，和 都以同等程度下降【3 9 】；混合性抑制剂1 3 8 】是指底物对酶的亲和力大于对酶抑制剂， 而所形成的e i s 为无活性的，不能分解出产物。它是以上三种中任意两种的结合型。 自从1 9 7 9 年一种广泛用于降血压的药品血管紧张素抑制剂( c a p t o p r i l ) 研制出来以 后，蛋白酶抑制剂在临床上的使用已达2 0 多年之久，c a p t o p r i l 是通过“药品研制”( 就是 通过一步步的完善和重复试验对药品进行精细调制) 所开发的第一种蛋白酶抑制剂。 1 9 9 6 年首先在美国等西方国家采用了一种防治艾滋病的蛋白酶抑制剂，使得美国h i v 病 毒感染导致死亡的人数降低了7 0 以上。如今已有五种h i v 蛋白酶抑制剂陆陆续续研制 出来，并得到美国食物药品管理局的认可，现已被加入到艾滋病药品“鸡尾酒”中【4 0 j ，这 五种抑制剂分别是a m p r e n a v i r ，i n d i n a v i r ，n e l f i n a v i r ，r i t o n a v i r 和s a q u i n a v i r ，它们和血管紧 张肽原酶抑制剂虽然在结构上不同但在化学成分上却称得上是血管紧张肽原酶抑制剂 的后代。另外在治疗恶性肿瘤方面，蛋白酶抑制剂的研究也在进行当中，依据l i o t t a 提 出的肿瘤细胞浸润模型：肿瘤细胞必须附着于细胞外基质，降解并越过基质，由于 蛋白酶能水解破坏周围组织、因此在浸润中起一定作用。人尿中提取的u t i ( 人尿 胰蛋白酶抑制剂) 可与肿瘤细胞上u t i 受体结合，调节纤维蛋白酶活性，从而抑制 肿瘤细胞的浸润和转移【4 1 1 。从人尿牛肺或牛胰腺中提取的抑肽酶、黄豆中提取的大 豆胰蛋白酶抑制剂及人工合成的甲磺酸肌己苯酯及其衍生物，可用作胰蛋白酶的抑 制剂，起到保护胰脏的作用。 在农业上，蛋白酶抑制剂也有较广的应用。从植物中提取到的蛋白酶的抑制剂 可以抑制昆虫消化道内的蛋白酶，使食物无法正常的消化，从而导致害虫死亡【4 2 。 1 2 3 天冬氨酸蛋白酶抑制剂的来源 天冬氨酸蛋白酶的活性中心一般是由两个天冬氨酸残基所组成，目前主要包括 胃蛋白酶( p e p s i n ) 、胃亚蛋白酶( g a s t r i c s i n ) 、凝乳酶( c h y m o s i n ) 、溶酶体( 组织蛋白酶 江南大学硕士学位论文 d 和e ) 、肾素( r e n i n ) 、蛋白酶a ( p r o t e i n a s ea ) 及艾滋病病毒( h i v ) 蛋白酶等1 4 川。 各种生物体的生命活动少不了酶的参与，也同时会适时产生能调节其活性的因子， 其中就包括各种酶的抑制剂。其中天冬氨酸蛋白酶抑制剂广泛存在于动植物的组织器官 及某些微生物中，所以除了通过人工合成外，也可从生物体内提取得到。 国外曾有人从马铃薯、番茄及豆科植物中提取出天冬氨酸族蛋白酶抑制剂l 4 4 书j ；本 实验室曾从灵芝发酵全粉中提到g l p i a l 和g l p i a 2 两种蛋白酶a 抑制剂【i 7 1 ，并从马铃 薯块茎中提取一种蛋白酶a 抑制刹1 8 】。在微生物方面，如果利用一些药用真菌发酵产 生天冬氨酸蛋白酶抑制剂，将会有很好的应用前景。 然而真菌这方面活性成分的研究并不多见，相关报道主要集中在灵芝酸的作用上。 1 9 9 8 年日本科学家发现g a n o d e r i o lf 和灵芝酮二醇( g a n o d e r m a n o n t r i 0 1 ) 有较强抑制 h i v - 1 蛋白酶活性的能力i 舶1 ；1 9 9 9 年英国k i m 发现灵芝提取液具备葡糖醛酸酶抑制活 性和保肝作用1 4 ；2 0 0 6 年江南大学徐鹏等进行了添加中药的灵芝发酵及其酪氨酸酶抑 制活性的研究【4 引；本实验室田亚平、李屹松等曾从灵芝发酵全粉中提取出两种蛋白酶a 抑制剂【4 9 。真菌能产生各种活性成分，其中一定也不乏存在一些酶抑制剂，在灵芝提取 液的各种药理作用如调节、增强人体免疫力，对神经衰弱、风湿性关节炎、冠心病、高 血压、肝炎、糖尿病、肿瘤等有良好的协同治疗作用，抗疲劳，美容美颜，延缓衰老， 防治艾滋病等功效【5 m ，7 】中，可能也会存在抑制剂的协同作用。目前国内外还没有利用真 菌发酵制备天冬氨酸蛋白酶抑制剂的相关报道。 1 2 4 天冬氨酸蛋白酶抑制剂的应用 基于天冬氨酸蛋白酶在消化食物蛋白、降解抗原、促进其他酶的活化、位点特异性 水解逆转录酶病毒前体蛋白以产生病毒体复制所必须的酶蛋白、调整血压等方面的活性 功能，这些蛋白酶是导致艾滋病、恶性肿瘤、高血压等世界上几种难治疾病的发病因素 之一【5 】，因此天冬氨酸蛋白酶抑制剂对治疗这些顽固性疾病将有一定的帮助( 如从一种放 线菌发酵液中提出的胃蛋白酶抑制剂- - p e p s t a t i n 可用作胃溃疡、关节炎、高血压等的抗 性药物【5 8 】) 。 小麦面筋蛋白质对于面粉的流变特性和食用品质起着决定性作用。我国小麦蛋白质 的平均含量为1 5 1 0 【5 9 l ，高于美国普通小麦蛋白质含量的平均值1 2 9 2 ，也高于澳大 利亚( 1 4 9 0 ) 和阿根廷( 1 4 8 0 ) 的小麦蛋白质含量。然而研究表明，国产小麦面粉的蛋 白质含量对于小麦食用品质的表征能力差。许多高蛋白质含量( 因其蛋白酶含量也相应 较高) 的国产小麦呈现粉力弱和发酵能力差的特征，出现了高蛋白质小麦不能满足高筋 力要求的面制品( 如馒头、面包等) 生产需要的状况。 许多研究表明小麦在发芽过程中不仅淀粉在淀粉酶的作用下发生降解【6 0 捌】，而且胚 乳蛋白质也会受到蛋白水解酶的作用，逐步降解成低分子肽1 6 2 j 。由此，人们逐渐认识到 蛋白水解酶在影响面粉品质及食用品质方面的重要性，并开始研究小麦及其面粉在贮藏 过程中蛋白水解酶活性的变化情况及其对面筋蛋白质的作用1 6 3 j 。 将蛋白酶抑制剂加入到从小麦面粉提取的蛋白酶当中，可能对蛋白酶活性有抑制作 用，这样既可满足小麦蛋白质含量保持较高的水平，又可保证小麦有较好的面团流变性 4 第一章绪论 和良好的发酵耐力。 除医药、食品领域，天冬氨酸蛋白酶抑制剂也可用在食品添加剂方面。如蛋白酶a 抑制剂可用于增强纯生啤酒的泡沫稳定性【i ”。 1 2 5l ；胃蛋白醇作为天车氨酸蛋白醇抑制剂筛选靶酶的意义 h i v 蛋白酶、血管紧张肽原酶、蛋白酶a 、组织蛋白酶d 、天冬氨酸膜内裂解蛋白 酶等都与胃蛋白酶一样，在活性中心都含有天冬氮酸，因此都类属于天冬氨酸族蛋白酶， 它们的抑制剂都属于天冬氨酸蛋白酶抑制剂。我们知道，这些蛋白酶是导致艾滋病，恶 性肿瘤、高血压等世界上几种难治疾病的发病因素之一例，因此深入了解天冬氢酸蛋白 酶抑制剂，对治疗这些顽固性疾病将有一定的帮助。 对酶的结构及其氨基酸序列进行译解，能看到酶话性部位的外貌，重建酶和底物之 间发生的实际的化学反应。这为针对特定的酶制造或寻找抑制化合物提供了有力的工 具。因此，在寻找蛋白酶抑制剂的过程中，有必要确定蛋白酶的结构，在这几种天冬氨 酸蛋白酶当中以胃蛋白酶的结构最为明确，早在1 9 3 4 年国外就有人拍摄出第张胃 蛋白酶的x _ 光晶体图片咿】。所以我们选择胃蛋白酶作为天冬氨酸蛋白酶抑制剂筛选的 靶酶。下面是几种天冬氨酸蛋白酶的三维结构示意图。从中我们可以看到，它们确实有 着及其相似的空问结构。 圈12h i v 蛋白酶6 5 - 5 6 1 f i 9 12 h i v p r o t e i n a s e 图i3 蛋白酶a i f i g 】3p m t e i n a s e a 图i4 胃蛋白酶 f i 9 14p e p s i n 江南大学硕士学位论文 以胃蛋白酶作为靶酶的另一个原因是，胃蛋白酶最容易获得，而且价格低廉、无毒 等。 1 3 立题意义 天冬氨酸蛋白酶抑制剂在食品保健及医药行业中应用非常广泛【5 1 ，如抑制肿瘤细 胞增殖、增强免疫力和抗癌等，对胃溃疡、降血压、艾滋病、中风、老年痴呆症等 的治疗具有明显的疗效 4 3 1 。而化学法合成天冬氨酸蛋白酶抑制剂往往因其药理毒性 和安全性得不到保证( 如h i v p i 沙奎那韦可导致脂代谢紊乱综合症) ，所以在食品 及医药行业中的应用受到很大的限制【4 。 目前国内外报道的天冬氨酸蛋白酶抑制剂大多数都是通过化学法合成的，由于限制 了其应用，因此从天然产物中开发此类蛋白酶抑制剂日益受到人们的关注。利用云 芝发酵制备天冬氨酸蛋白酶抑制剂，除了对天冬氨酸蛋白酶具有抑制作用外，还可能兼 有云芝多糖和云芝糖肽等的活性功能，保证了其应用的安全性，在医药保健及食品饮料 等方面将有广泛的应用前景。 真菌药物是我国中药的组成部分，具有悠久的历史。随着人们生活水平的提高 和科学技术的发展，云芝生产已从野生采集到人工栽培，现己发展到应用生物工程 新技术，把真菌学与工业发酵技术相结合形成液体深层发酵的新兴产业，这种生产 方式能大大缩短生产周期，扩大生产规模，简化生产工艺，降低生产成本，充分利 用发酵产物的生理活性，这是云芝研究开发的走向和热点。 云芝属于天然生物，营养成分丰富且营养价值高，国内外研究工作者已从云芝 中分离得到数十种如多糖、多肽、三萜、核苷、生物碱、甾醇和灵芝蛋白质等生理 活性物质，而且已经证实这些生理活性物质有抗肿瘤，抗衰老，提高人体免疫机能 等作用。 马铃薯( s o l a n u mt u b e r o s u m ) 块茎中含有多种蛋白类蛋白酶抑制剂，含量占所含可溶 性蛋白的5 0 以上【郇】。以其作为培养基具有取材易，成本低，使用安全，杂质相对较 少，应用广泛等优点【1 6 1 。因此以马铃薯作为培养基，采用云芝发酵来制取蛋白酶抑 制剂不但具有很好的药用前景，而且有潜在的经济效益、环境效益和社会效益。 1 4 本论文主要研究内容 本论文的研究重点是对云芝液体深层发酵产胃蛋白酶抑制剂的发酵条件进行优化， 并利用层析手段对胃蛋白酶抑制剂进行分离纯化，以及对其基本组成和特性做进一步的 研究，并对其应用进行了初探。 本文的主要研究内容： 1 对云芝发酵产胃蛋白酶抑制剂发酵条件进行优化； 2 利用层析手段对胃蛋白酶抑s i f t 进行分离纯化； 3 对纯化后的抑制剂进行组成和基本性质研究； 4 对抑制剂的应用进行了初步探索。 6 第二章材料与方法 第二章材料与方法 2 1 主要材料 2 1 1 供试菌株 韩芝、甜芝、赤芝g 8 、云芝( 均购自华中农业大学菌种实验中心) ，4 c 冰箱保存， 每6 个月转管一次。 2 1 2 培养基 斜面培养基( p d a ) ：新鲜马铃薯2 0 ( 切丝加热煮沸3 0 m i n ) ，葡萄糖2 ，k h 2 p 0 4 o 3 ，m g s 0 4 7 h 2 00 1 5 ，琼脂2 ，p h 自然，1 2 1 灭菌2 0m i n 摇瓶种子培养基：新鲜马铃薯汁9 5 ，麸皮5 ，p h 自然，1 2 1 灭菌3 0m i n 摇瓶发酵培养基：纯新鲜马铃薯汁( 捣碎离心取清液) ，1 2 1 灭菌2 0m i n 2 1 3 主要试剂 胃蛋白酶( a r )中国医药( 集团) 上海化学试剂公司 f o l i n 一酚试剂自配 血红蛋白( a r ) 上海丽珠东风生物技术有限公司 d e a e - 5 2 安玛西亚生物技术有限公司 m o n oq 安玛西亚生物技术有限公司 u l t r o g e la c a - 5 4安玛西亚生物技术有限公司 丙烯酰胺f l u k a 公司 甲叉双丙烯酰胺 f l u k a 公司 考马斯亮蓝r - 2 5 0f l u k a 公司 十二烷基磺酸钠( s d s ) 德国默克公司 三羟甲基氨基甲烷( t r i s )中国医药集团上海化学试剂公司 1 3 巯基乙醇 中国医药集团上海化学试剂公司 溴酚兰上海试剂三场 四甲基7 , - - 胺( t e m e d ) 上海前进试剂厂 p r a 活性干酵母中提取 胰蛋白酶( a r )上海伯奥生物技术有限公司 中性蛋白酶( a r )国药集团化学试剂有限公司 碱性蛋白酶( a r )国药集团化学试剂有限公司 木瓜蛋白酶( a r ) 国药集团化学试剂有限公司 1 号商品小麦粉大润发超市 2 号商品小麦粉大润发超市 硫酸铵国药集团化学试剂有限公司 其余为国产分析纯试剂 7 江南大学硕士学位论文 2 1 4 主要仪器 隔水式电热恒温培养箱 h y g i ia 回转式恒温调速摇瓶柜 d s - 1 高速组织捣碎机 立式压力蒸汽灭菌器 h i m a c c r 2 2 g 高速冷冻离心机 低温冰箱 c q 2 5 1 2 超声波破碎机 电热恒温水浴锅s h z 2 2 w 2 0 1 d 恒温水浴锅 c j 8 8 - 1 强力搅拌器 7 2 2 型光栅分光光度计 真空冷冻干燥机 h l i 恒流泵 8 8 2 3 a 紫外检测仪 b s 1 0 0 a 自动部分收集器 x w t o s 小型台式记录仪 z h d a 核酸蛋白检测仪 m i n i p r o t e i n 3 电泳槽 g e ld o cx r 凝胶成像仪 电子天平a l 2 0 4 s h z 2 2 型水浴恒温振荡器 p h s 2 5 型p h 计 透析袋( 1 0 0 0 0d 幻 2 2 主要方法 2 2 1 培养方法 2 2 4 1 菌种的活化 用综合p d a 培养基做试管斜面， 2 2 4 2 种子培养 上海欣蕊自动化设备有限公司 上海欣蕊自动化设备有限公司 上海标本模型厂制造 上海花线医用核子仪器有限公司 日本日立h i t a c h i 公司 日本三菱电器株式会社 宁波新芝科器研究所 上海医疗器械五厂 上海申顺生物科技有限公司 金坛市恒丰仪器厂 上海精密科学仪器有限公司 v i r i t i s 上海市沪系仪器厂 北京市新技术应用研究所 上海市沪西仪器厂 上海自动化仪表三场 南京智明( 生化) 实验技术研究所 b i o r a d 公司 b i o r a d 公司 m e t t l e r 江苏太仓市医疗器械厂 上海雷磁仪器厂 m i l l i p o r e 公司 活化试管保藏菌种。 在5 0 0m l - - - 角瓶中装入1 5 0 m l 种子培养基，高压灭菌后冷却至室温，于无菌条件下 接种由p d a 斜面保藏的各株菌，置于摇床上，在2 6 。c ，1 6 0r m i n 的条件下进行培养。 2 2 4 3 液体深层发酵 2 5 0m l = 角瓶装8 0m l 发酵培养基，灭菌后冷却至室温。接种各菌株种子液1o ， 在2 6 。c ，1 6 0r m i n 的条件下进行培养。 8 第二章材料与方法 2 2 2 不同菌株的生物量比较 将各菌株的发酵液置于h i m a c c r 2 2 g 冷冻离心机上，以4 0 0 0r m i n 的速度离心 1 0 m i n ，收集菌丝体沉淀，用蒸馏水洗涤沉淀后再4 0 0 0r m i n 离心1 0m i n ，重复三次， 最后将所得菌丝体于5 5 。c 烘干至恒重，计算各菌株的生物量( 以菌丝体干重g l 发酵液 计) 6 9 】。 2 2 3 不同菌株发酵产胃蛋白酶抑制剂的比较 将各菌株相同条件下的发酵液，进行同样的超声波细胞破碎处理，1 4 0 0 0r m i n 离心 2 0m i n ，取上清液，比较细胞破碎后对胃蛋白酶的抑制效果。 2 2 4 细胞破碎前后云芝发酵液成分及抑制活性比较 取5 0 m l 云芝发酵液，进行超声波细胞破碎，1 4 0 0 0r m i n 离心2 0m i n ，取上清液，比 较细胞破碎前后组分变化及抑制活性。 2 2 5 云芝发酵条件的优化 2 2 5 1 发酵周期的确定 在装液量8 0 m l 2 5 0 m l 三角瓶，接种量( 1 0 ) ，温度( 2 6 ) ，搅拌频率( 1 6 0 r m i n