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文档简介
细胞生物学研究思路的探讨,1,2,研究背景,Waardenburg综合征(Waardenburgsyndrome,WS)是最常见的综合征型遗传性耳聋,主要遗传方式是单基因致病的常染色体显性遗传伴不全外显。主要临床特征:耳聋与着色异常(虹膜、皮肤、毛发),3,神经嵴发育不全:由于神经嵴细胞(neuralcrestcells,NCC)发育缺陷或障碍而导致神经嵴出现异常的增殖、生存、迁徙和分化。由于NCC发育不良导致的这些组织和细胞的病变统称为神经嵴病。,研究背景,4,研究背景,5,研究背景,本研究Waardenburg综合征病例基因型和表型特征,6,研究背景,7,基因组水平:WS致病基因突变检测,后基因组水平:WS致病基因功能检测,分子水平:WS发病机制,临床水平:WS基因型如何导致表型,研究目的,前期研究,本文研究,表型基因型,基因型表型,?,8,研究内容,1,2,3,4,5,invitro,9,课程提纲,蛋白质加标签(Tag);定点突变;转染亚细胞定位;Reporterassay;DNA-蛋白质相互作用;蛋白质相互作用;蛋白质半衰期。,10,蛋白质加上标签(Tag),Why:便于检测;市场上有很好的针对标签蛋白的抗体。What:Flag:DYKDDDDK;HA:YPYDVPDYA;c-Myc:EQKLISEEDL;V5:GKPIPNPLLGLDSTHow:前提是不能影响蛋白质的功能,11,课程提纲,蛋白质加标签(Tag);定点突变;转染亚细胞定位;Reporterassay;DNA-蛋白质相互作用;蛋白质相互作用;蛋白质半衰期。,12,定点突变site-directedmutagenesis,QuikChangeSite-DirectedMutagenesisKit(Stratagene公司),13,突变引物设计,GoogleSearch“Quikchangeprimerdesign”,14,原始质粒,原始质粒改造,突变质粒构建,DNA测序鉴定,15,课程提纲,蛋白质加标签(Tag);定点突变;转染;亚细胞定位;Reporterassay;DNA-蛋白质相互作用;蛋白质相互作用;蛋白质半衰期。,16,转染-transfection,TransfectionisamethodoftransportingDNA,RNAand/orvariousmacromoleculesintoaneukaryoticcellbyusingchemical,lipidorphysicalbasedmethods.,17,Transfectionmethods,DEAEdextranCationicpolymerCalciumphosphate磷酸钙Electroporation电穿孔Microinjection显微注射Cationicliposome,18,DEAE-dextranDiethylaminoethyl(DEAE)-dextranisoneoftheoldestmethodsforintroducingnucleicacidsintoculturedmammaliancells.ThepositivelychargedDEAE-dextranmoleculeinteractswiththenegativelychargedphosphatebackboneofthenucleicacid.TheDNADEAEdextrancomplexesappeartoadsorbontothecellsurfaceandbetakenupbyendocytosis.优缺点:仅适合瞬转(transienttransfection),不适合稳转;细胞毒较高;重复性较好。,19,Cationicpolymer,Branched(A)andlinear(B)polyethyleneimine(PEI),商品名:ExGen500,Turbofect,20,CalciumPhosphate磷酸钙TheprincipleinvolvesmixingDNAinaphosphatebufferwithcalciumchloride.Theresultingcalcium-phosphateDNAcomplexesadheretothecellmembraneandenterthecytoplasmbyendocytosis.优缺点:适合稳转;重复性较差,主要影响因素包括溶液的pH值;一些细胞不适合磷酸钙转染。,21,CationicLiposome脂质体Theliposomescurrentlyinusetypicallycontainamixtureofcationicandneutrallipidsorganizedintolipidbilayerstructures.Transfection-complexformationisbasedontheinteractionofthepositivelychargedliposomewiththenegativelychargedphosphategroupsofthenucleicacid.TheuptakeoftheliposomeDNAcomplexesmaybemediatedbyendocytosis.品牌:Lipofectamine(Invitrogen)。优缺点:转染效率高;重复性好;转染时需降低血清浓度,从而提高了细胞毒性;,22,23,ElectroporationCellsinasuitablecuvettearesubjectedtoashorthigh-voltagepulsethatcausesthemembranepotentialofthecellstobreakdown.Asaresult,poresareformedthroughwhichmacromoleculessuchasDNAcanenter.优缺点:适合几乎所有的细胞;瞬转、稳转;需要DNA量大;高达5070%细胞死亡;,24,Microinjection,DirectMicroinjection:Useofafineneedle.HasbeenusedfortransferofDNAintoembryonicstemcells.,25,研究结果,野生/突变PAX3蛋白表达,野生/突变SOX10蛋白表达,A,B,26,课程提纲,蛋白质加标签(Tag);定点突变;转染;亚细胞定位;Reporterassay;DNA-蛋白质相互作用;蛋白质相互作用;蛋白质半衰期。,27,ReporterAssay:fortranscriptionalfactors(TF),Promoter,Geneofinterest,TF:transcriptionalfactorAD:activationdomainDBD:DNA-bindingdomain,ReporterGene:Agenewithareadilymeasurablephenotypethatcanbeeasilydistinguishedoverabackgroundofendogenousproteins.,28,Reportergenes,CAT:chloramphenicolacetyltransferase-gal:(-galactosidase)SEAP:(secretedalkalinephosphatase)LuciferaseGFP:GreenFluorescentProtein,29,CAT:chloramphenicolacetyltransferase氯霉素乙酰转移酶,1streportergeneusedtomonitortranscriptionalactivityincells;:Bacterialenzymethattransfersacetylgroupsfromacetyl-CoAtochloramphenicol,detoxifyingit;Reactionquantifiedusingradiolabeledsubstrates(14C-chloramphenicol)orbyELISA(non-radioactive).,30,CATassay:acetylated定点突变;转染;亚细胞定位;Reporterassay;DNA-蛋白质相互作用;蛋白质相互作用;蛋白质半衰期。,41,亚细胞定位subcellularlocalization,免疫荧光(immunofluorescence);细胞器分离。,42,Immunofluorescence,利用免疫荧光(immunofluorescence)技术染色目标蛋白;利用细胞器特异性抗体或者标记物染色细胞器;激光共聚焦显微镜观察,,43,44,Subcellularfraction,45,研究结果,1.野生/突变PAX3蛋白亚细胞定位,ZhangH,etal.HumGenet,2012,131:491-503.,46,研究结果,2.野生/突变SOX10蛋白亚细胞定位,ZhangH,etal.HumGenet,2012,131:491-503.,47,课程提纲,蛋白质加标签(Tag);定点突变;转染;亚细胞定位;Reporterassay;DNA-蛋白质相互作用;蛋白质相互作用;蛋白质半衰期。,48,DNA-蛋白质相互作用,ElectroMobilityShiftAssay(EMSA)DNAprecipitationChIP:Chromatinimmunoprecipitation,49,EMSA:Principle,R.Voll09/01,Adouble-strandedoligonucleotidecontainigaNF-B-bindingsiteislabeledwitharadioactiveisotopeandincubatedwithanuclearextract.Duringgel-electrophoresis,NF-Bboundtotheoligonucleotidecausesashiftcomparedtothefreeprobe.,NF-B,FreeProbe,RadioaktivelylabeledoligonucleotidewithNF-B-bindingsite(probe)andboundNF-B,RadioactivelylabeledoligonucleotidewithNF-B-bindingsite(probe),Nuclearextractofnon-activatedcells,Nuclearextractofactivatedcells,50,R.Voll09/01,Supershift,Adouble-strandedoligonucleotidecontainigaNF-B-bindingsiteislabelledradioactiveandincubatedwithanuclearextract.Duringgel-electrophoresis,NF-Bboundtotheoligonucleotidecausesashiftcomparedtothefreeprobe.,p50/p65,Freeprobe,RadioaktivlabelledoligonucleotidewithNF-B-bindingsite(probe)andboundNF-B,RadioactivlabelledoligonucleotidewithNF-B-bindingsite(probe),Nuclearextractofactivatedcells,Nuclearextractofactivatedcellswithanti-p50antibody,p50/p65+anti-p50,51,CompetitionwithUnlabeledOligos,IncreasingamountsofunlabeledoligoscontainingtheNF-kBbindingsiteorunlabeledoligoswithamutatedbindingsitewereaddedtothereactionmixpriortogelelectrophoresis.Specificbindingisextinguishedonlybythenon-mutatedoligo.,p50/p50,Freeprobe,p50/p65,WildtypeoligoMutatedoligo,GGGGACTTTCCC,GGAGACTTTCCC,52,BiotinylateddsDNA,Celllysate,Streptavidin-agrose,DetectproteinlevelwithWesternblot,53,MITFPAX3SOX10,54,ChIP:染色体共沉淀,55,56,课程提纲,蛋白质加标签(Tag);定点突变;转染;亚细胞定位;Reporterassay;DNA-蛋白质相互作用;蛋白质相互作用;蛋白质半衰期。,57,Proteininteraction,Glutathione-S-Transferase(GST)pulldownYeastTwo-hybridCo-ImmunoprecipitationFluorescenceResonanceEnergyTransfer(FRET)SurfacePlasmonResonance(SPR),58,融合蛋白pull-down实验,融合蛋白pull-down技术基本原理是将一种蛋白质固定于某种基质上(如Sepharose),当细胞抽提液经过该基质时,可与该固定蛋白相互作用的配体蛋白被吸附,而没有被吸附的“杂质”则随洗脱液流出。被吸附的蛋白可以通过改变洗脱液或洗脱条件而回收下来。为了更有效地利用pull-down技术,可以将待纯化的蛋白以融合蛋白地形式表达,即将“诱饵”蛋白与一种易于纯化地配体蛋白相融合。1988年Smith等利用谷胱甘肽S转移酶(glutathione-S-transferase,GST)融合标签从细菌中一步纯化出GST融合蛋白。GST融合蛋白在经过固定有GSH(glutathione)的色谱柱时,就可以通过GST与GSH的相互作用而被吸附。当再有细胞抽提物过柱,就可得到能够与“诱饵”蛋白相互作用的兴趣蛋白。,59,洗脱(2),结合(3),检测(6),收集(5),洗脱(4),固定诱饵蛋白(1),60,GSTpulldown,61,免疫共沉淀,62,酵母双杂交,63,SurfacePlasmonResonance(SPR,表面等离子体共振),Oneinteractionpartner(Y)isboundtothemetalfilmwhiletheother(redballs)partnerIsinjectedoverthesurface.Amountofboundproteinisquantifiedbaseduponangleofreflectedlight.Realtimeassociationanddissociationofaprotein-proteininteractioncanbequantified.,64,SurfacePlasmonResonance(SPR),65,Frster/FluorescentResonanceEnergyTransfer(FRET),anon-radiative,dipol
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