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一氧化氮对神经干细胞脯体细胞分化的影响中文摘要 一氧化氮对神经干细胞前体细胞分化的影响 中文摘要 目的： 通过减少内源性一氧化氮( n i t r i c 傩i d c ，n o ) 或者增加外源性n 0 的方式，探讨 n 0 对体外培养状态下的新生大鼠神经干细胞前体细胞( n c u r a ls t c mc c l l s j u r a l p r 咖瑙。瑙，n s c s 小咿s ) 分化的作用 方法： 1 采用常规方法分离新生大鼠脑室下带( s u b 、，t r i c i l l 盯z c ，s v z ) 组织，进行 n s q 仃帅s 体外培养、扩增，并添加5 - 溴2 一脱氧尿嘧啶核苷( 5 - b r o m 0 - 2 - d c o x ”珊i l i c ， b r d u ) 标记增殖的细胞。 2 用n 硝基l 精氨酸甲酯( n n i t 胁l a r g i n i n cm 岫y l c s i c r ，l m 妣) 作为神经 元型一氧化氮合酶( n c u r o n a ln i t f i c 慨i d es y n 也a ，n n o s ) 抑制剂，观察内源性n 0 的减少对n s c s 僵旺s 分化的影响。 3 用二乙烯三胺一氧化氮聚合物( d i e t h y l c n e m 姗i n 洲0 ，d e l r a n 0 ) 作为外 源性n 0 供体，观察外源性n o 的增加对n s c s 栅s 分化的影响。 4 用免疫细胞化学方法，观察n s q - s 标志物一巢蛋白( n 伽i o c p t h c l i a l s t 锄 c e l lp r o t e i n ，n e s t i n ) 、神经元标志物p i 型微管蛋白( p - 一t l l b i l l i n ，1 - 1 ) 和星 型胶质细胞标志物胶质原纤维酸性蛋白( g l i a l 肋r i l l a r y i d i cp r o t c i n ，g f a p ) 的 表达；观察b r d u 和n n o s 表达情况。 5 用g r c i s s 还原法检测培养液中总n o 的浓度。 结果： 1 从s v z 分离的细胞，经过5 7 天体外培养，可形成神经球。原代或次代培养 的神经球均为n e s 咖阳性，同时可检测到b f d u 阳性的细胞。在不施加任何处理因素 的情况下，原代或次代神经球均可分化出t l l j 1 阳性的神经元和g e a p 阳性的星形胶 质细胞。 2 在体外培养的n s c s 肘p s 中加入l 广n a m e5 天后，1 0 0 m 、1 5 0 p m 、2 0 0 肛m 一氧化氮对神经干细胞脯体细胞分化的影响 中文摘要 l m 辐证实验组培养液中n o 浓度分别为2 8 4 3 0 m 、2 7 9 2 7 m 、2 5 2 4 4 p m ， 较对照组( 3 4 1 2 7 口m ) 减少( p o 0 5 ) ；相应实验组分化的神经元数分别为3 4 5 5 2 、3 3 8 5 7 、3 2 6 7 2 ，较对照组( 4 0 8 6 7 ) 减少( p 0 0 5 ) ； 1 5 0 p m 、2 0 0 p m 实验组分化的星型胶质细胞数分别为2 7 5 4 1 、2 7 o 7 5 ，较 对照组( 3 6 2 4 3 ) 也减少( p 0 0 5 ) 。另外，1 0 0 m 、1 5 0 p m 、2 0 0 肛m i 广n a 实验组分化细胞表达的n n o s 阳性率分别为1 9 0 5 3 、1 8 0 3 o 、1 7 8 4 9 ， 也较对照组( 2 5 9 6 4 ) 减少( p o 0 5 ) 3 在体外培养的n s c s n p s 加入d 】玎n 05 天后，4 0 ，l m 、5 0 m 、印p m 啷a 悄o 实验组培养液中分别释放出6 2 0 6 4 p m 、“8 1 5 7 p m 、6 8 5 1 1 6 m 的n 0 ，较对照组( 2 5 6 1 6 4 m ) 显著增加( p o 0 1 ) ；相应实验组分化的神 经元数分别高达5 3 1 4 7 、5 4 1 6 9 、6 3 8 9 5 ，而分化的星型胶质细胞数 分别只有3 6 6 6 3 、3 8 2 6 7 、4 1 1 0 5 结论： n o 对体外培养的n s c s 膻岬s 的作用主要是促使其分化，特别是诱导其向神经元 方向分化。 关键词： 一氧化氮；神经干细胞，前体细胞；d e t ：a ，n 0 ；l n 舢订e ；分化；体外培养 h 作者：萨拮燕 指导教师：郭试瑜教授 蒋星红教授 一氧化氮对神经干细胞脯体细胞分化的影响 英文摘要 t h ee f f e c to fn i t co x i d eo nt h ed i 储e r e n t i a t i o no f n e u 翰ls t e mc e l l s n e u n lp 聆c u 礴o r s a b s t r a c t o b j e c t l w t o0 b s e n ，et h ec 晚do fi n l i i b i t 彻o fe n d 9 9 c 肿u sn 硒co x i d c ( n o ) p r o d u c i i 伽锄d c x o g c u sn i t r i c 帆i d c 咖t h cd i 疵此n t i a t i o no fn c u r a ls t c l nc e u s n 饥r a lp 砌脚培 s c s n p s ) 肺m n 怕佻伽v 咖 m e t l h o d s 1 ( = 0 n v t i o n a lc i l l t 呲m c l h o d 啪s 惦e dt oi l a t e 鲫b v t r i c l l l 缸z e ( s v z ) r c g i o fn 唧b o mm t s 五眶n s c 鲫旧s l t u 怫5 b m l n o 2 d c o x y 嘣d i n e ( b r d u ) w 鹞 i l l c o i p o m t c dt om a r kp m l i f e m t j l l g l l s zn - n i tr _ o - i ，a 咖i n em e t h y l c s t 盯( b n a m e ) ，i n h i b i t 讲o fn e 啪n a ln i t r i c 雠j d c s y l l t h a ( n n o s ) ，w 猫u s e dt oo b s e n r et h ce 凰do fi n l l i b i h i t i o f 蛐d o g c 舯u sn o p l d d u c t i o n m ed i 疵咖t i a t i o fn s c s n p s 3 d i e t l l v l 如c t i i 锄i n e n 0 ( d e l = 村o ) ，n od o n o r w 勰u s c dt oo b s c r v ct h cc 彘c to f e x o g c n 叫sn 硒co x i d e t l l cd i 腧聆n i i a t i 伽o fn s c s ，n p s 4 t h ei 锄u n o c y 妣h e m i s t r yw 勰啦e dt oi d e n t i f yi h ec x p 圮s s i o f 鹏s l i n ( am a 血c r o fn s c 洲p s ) 卢一m t i i b i l l i n ( 1 u j 1 ，am a r l ro fn e u 删略) ，g l i a lf i 蜥l l a r ya d d i cp r o t e j i l ( g e a p ，am a r k 盯o f 嬲协d c ”e s ) ，b r d u 翘dn n o s 5 t h er d e a o fn ow 舔m e 鹊u r c db yg 他i 豁躐a yi nm c d i u m r 咖l 缸 1 c c l l si s 0 1 a t c d 抽ms v z u l df b 咖n c u 瞄p h m so fp r o i i 触俩gc e l l sa f i c r5 - 7 d a y s 加“加p r i m a r yo r 蛐b c i l l t u r c dn 蹦m s p h e s 、地n e s t i n p 吲t i v c 卸dm o 吼c c l l so f n c 啪s p h e r 伪w e b r d u - p o s i t i v e m e 卸w h i l c ，n 伽r o s p h c r 髂c o u l d d i f 艳啪t i a 忙i n t o n e u r sw h i c hw e 坞1 - 1p o s i t i v c 柚da s t i o c y t e sw h j c hw e 佗g f a pp i t i v c 2 a r c r 仃c a 岫e n tw 汕1 0 0 p m 、1 5 0 p m 柚d2 0 0 肛ml ，n a m ef o r5d a y s ，t h e c o n c c n t 姐t i o fn 0r c l e a s c dw 弱2 8 4 3 o m 、2 7 9 2 7 m 柚d2 5 2 4 4p m ， r e 渺c i i v e l y ，w h i c hw a sd c c r e 髂e ds i 印i f ! l n t l ya sc o m p a r e d w i t ht h a to ft l l cc o n t r o lg r o u p ( 3 4 1 2 7 m ) ( p 0 0 5 ) 1 r h ep e r c e n t a g co fd i f f c f e n t i a t e dn e u r o n sw a s 3 4 5 5 2 i 一氧化氮对神经干细胞疗体细胞分化的影响 英文摘要 、3 3 8 5 7 卸d3 2 6 7 2 a t1 0 0 p m 、1 5 0 m 柚d2 0 0 p ml n a m e ，r c s p e c t i v c l y ， w h i c hw 硒d 删c ds i 鲥f i c a n n y 俨 o 0 5 ) 鹞锄p a r 耐w i t ht h a to f t h c 咖t r o lg u p ( 4 0 8 6 7 ) n ep 盯c c n t a g eo f d i 虢砌l t i a t e d 弱t m c y t c sw 鹊2 7 5 4 1 柚d2 7 7 5 a l1 5 0 弘m 柚d2 0 0 ml m 蛳e ，螂p c c t i v d y ，w h i c hw 嬲a l s i 倒f i c 鲫t l y 伊 o 0 5 ) 鹪m p a 硎w i mt h to f t l l e 咖仃o lg r o u p ( 3 6 2 4 3 ) n e “p 麟s i o n o f l l n o s i n t h c d i 自晒呤n t i a t c dc c n s w 舔1 9 o 5 3 、1 8 3 3 o 锄d 1 7 8 4 9 a t l o o 川、1 5 0 p m 卸d2 0 0 ，ml ，n a m e ，r 鹤p c c t i v e l y ，w l l i c hw 鸹d e c 犯a s c ds i 印i f i 啪t l y ( p 0 0 5 ) 船 c o m p a r e d w i mt l l a to f t l i ec o n t m lg 姗l p ( 2 5 9 6 4 ) 3 a n c r 仃c a t n l c n tw i t h4 0 m ，5 0 m 柚d6 0p md e t 悄of o r5d a y s ，t l l c n c e m 阳t i 衄o f n or e l e a dw 弱6 2 o 6 4 m 、6 4 8 1 5 7 m 粕d6 8 5 1 1 6 p m ， r c s p e c t i v c l y ，w h j c hw 猫i n c r e 雒c ds i 印i f i 啪n y ( p 0 0 1 ) 雒c o m p 眦dw i l ht l l a to ft h c n 仃0 l 口m p ( 2 5 6 1 6 4 m ) t h cp e 脚t a g eo f d i 彘r e n t j a t c dn c u 啪sa t t a i n c d5 3 1 4 7 、5 4 1 6 9 粕d6 3 8 9 5 a t4 0 m 、5 0 m 锄d 6 0 m 嘲： n o ，w h i l c n 圮p c r c e n t a g co fd i 由f c r c n t j a t c d 嬲t r o c 蚋咚w 舔1 y 3 6 6 6 3 、3 8 2 6 7 锄d 4 l 1 0 5 a t4 0 p m 、5 0 p m 锄d6 0 p md e r a 艉o ，s p c c i i v c l y c 0 n d u s i 伽 n 00 0 u l dp m m o t ct h cd i 跏弓n t i a t i o no fn s c 洲p s 伽咖：d ，p a n i c i l l a l l yi n t on c u 啪s k e y w o r d s n 蹦co x j d c ；n c u i a ls t 锄c c l l 咖e u r a l 晔u 瑚鹉；d 刚o ；i 广n a m e ；d i 彘咖t i 枷伽； c u l t l 玎| e 伽p 细竹 w h t t e nb ys az h e y a n s u p e n ，i s e db yp r o f g u os h i y u p f o f j i a n g n g i l o n g 一氧化氪对神经干细胞质体细胞分化的影响 缩略词袁 缩略词表( a b b r e v i a t i 伽) a b c a v i d i n - b i 埘n 咖p l c x b d n fb r i i n d e m c dn e u r o 仃o p h i c 触盯 b m b 伽e m o r p h o g c n i cp m t c i n b r d u 5 - b 咖n o 2 - d x ”r i d 沁 d a bd i a m i n o b e n z i d i n e d e ，瑙悄od i e t l i y l c 仃i a m i n e 小o d gd c m a t eg y n l s e g f 印i d e 咖a l 孕响他f t o r e n o s如d o t l l e l i a ln i t f i co x i d cs ”t h a f r r cf l u 呲s c c i ni t h i y n a t c g d n f 班i a l - d e r i v c d 鹏u f o 咖p h i c 的o r g e a p g l i a l 矧啪n a r ya c i d i cp t e i n i g f 1 i 璐u l i n l i k c 伊o w t hf 缸i o r - 1 i i ，6i n t e n 吼i k i l l - 6 i n o si n d u c i b l en i 伍c j d cs ”t h 撇 l n m e n - n i t r 0 l 鲫咖j i l cm c t h y l c s i c r n c s t i n 肿u f o 印t h c l i a i 吼e mc c np r o t c j n n e u n n c 哪一s p e c i f i c 删d c 缸p r o t e i n n n o s n c u f o n a ln i t r i c 麟i d cs y n t h 髂c n on j t r i c 似i d e n o sn i t r i co x j d es ”t h 弱c n p sm u m lp f 鲫麟 7 n s c s n c u 玩ls t 锄c e l l s p d g f p l a t c l c t d e r i v e dg 加f w t hf a d o r p l l p o l y l l y s i r ar a t i n o i ca c i d r m s螨t r a lm i g l a t o r y 吼 锄 s g z s u b g m 肌l 盯z o s n p s o d i u mi i i t r o p m s s i d e s v zs u b v 蛐t r i c l i l a r z 咖c t r l t c t c t m m c t h y lr h o d a m i n ej s o t h i o c y a n a t e 1 u j - 1 b i i l - t u b u l i n 弘 亲和素生物素复合物 脑源性神经营养因子 骨形态发生蛋白 5 溴2 脱氧尿嘧啶核苷 二氯基联苯胺 二乙烯三胺，一氧化氮聚合物 海马齿状回 表皮生长因子 内皮型一氧化氮 异硫氰酸荧光素 胶质细胞源性神经神经营养 胶质原纤维酸性蛋白 胰岛素样生长因子 白介素6 诱导型一氧化氮合酶 n 硝基l 精氨酸甲酯 巢蛋白 神经元特异性核蛋白 神经元型一氧化氮合酶 一氧化氮 一氧化氢舍酶 神经前体细胞 神经干细胞 血小板源性生长因子 多聚赖氨酸 维甲酸 吻侧迁移流7 颗粒下层 硝普钠 脑室下带 四甲基异硫氰酸罗丹明 8 i 型微管蛋白 苏州大学学位论文独创性声明及使用授权声明 学位论文独创性声明 本人郑重声明：所提交的学位论文是本人在导师的指导下，独立进 行研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不含 其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果，也不含为获得苏州大学 或其它教育机构的学位证书而使用过的材料。对本文的研究作出重要贡 献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人承担本声明的法律 责任 研究生签名寝垂选日期：汪业 学位论文使用授权声明 苏州大学、中国科学技术信息研究所、国家图书馆、清华大学论文 合作部、中国社科院文献信息情报中心有权保留本人所送交学位论文的 复印件和电子文档，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文。本 人电子文档的内容和纸质论文的内容相一致。除在保密期内的保密论文 外，允许论文被查阅和借阅，可以公布( 包括刊登) 论文的全部或部分 内容。论文的公布( 包括刊登) 授权苏州大学学位办办理 研究生签名：锫勉 日 期：丑! 主 导师签名：差觯日 期：乙韭 一氧化氮对神经干细胞，前体细胞分化的影响引言 引言 近年来有关神经干细胞的研究已成为神经科学领域关注的热点。因为长期以来， 人们一直认为神经元旦成熟就不可能再生，如果神经元受到损伤将不可逆转而永久 性缺失。1 9 9 2 年r e y n o l d s 等首次成功地从成年小鼠纹状体分离出神经干细胞( n e u f a l s t c mc e u s ，n s q ) 【，打破了成年哺乳动物的神经元不具备更新能力的传统观点，为 神经系统疾病的治疗带来了新的曙光。 神经干细胞是具有分化为神经元、星形胶质细胞、少突胶质细胞的能力，可自我 更新并提供大量脑组织细胞的干细胞。自我更新和多分化潜能是神经干细胞的两个基 本特性1 2 】。神经干细胞常常是与其产生的不同级别的神经前体细胞同时存在，且难以 仔细区分，因此统称为神经干细胞前体细胞( n 叫r a ls t c m l l s n c u 献p r e c u r s o 瑙， n s c s 哪s ) 。现在一般认为神经干细胞不仅存在于发育中的哺乳动物大脑中，而且 存在于所有哺乳动物成体中，主要分布在侧脑室的室下带( 蛐b v c n t f i c u l 缸z o n e ，s v z ) 和海马齿状回( d 蛐t a t cg y r i i s d g ) 的颗粒下层( 鲫b f 删l 缸瑚e ，s g z ) 1 3 j 。 由于神经干细胞能够不断更新自我复制，具有多向分化潜能，因此神经干细胞移 植治疗帕金森病等神经系统退行性疾病，已成为临床治疗的新策略。但是如何在体外 获得足够的神经元，是神经千细胞应用到临床的一个尚未解决的难点。 神经干细胞的增殖分化受到多种因素的调控，包括内在基因【4 】和外来信号b5 j 。 外部因素又包括生长因子、细胞因子、局部微环境等，如脑源性神经营养因子 ( b m i n d c r i v c dn e u 彤t r o p h i cf a d o r ，b d n f ) 、胰岛素样生长因子一1 ( i 咖l i n - l i k e 伊嘲他 f a c t o r 1 ，i g f 1 ) 、血小板源性生长因子( p l a t e l c t 一鲥v c d 伊叭hf a c i o r ，p d g f ) 、维甲 酸( 住t i i i o i ca d d ，r a ) 等可促进n s c s 向神经元表型方向分化睁1 1 】；白介素6 伽t c r l e l i l 【j i l 屯l l 广6 ) 、骨形态发生蛋白( b o n em o r p h o g c n i cp r o t e 虹b m p ) 、胶质细胞 源性神经营养因子( g l i a l d e r i v c dn c u r o t r o p h i cf a c t o i ，g d n f ) 可诱导n s c s 向胶质细胞 方向分化等【协1 4 1 。近年来有文献报道，一氧化氮( n i 翻co x i d e ，n 0 ) 也参与了神经干 细胞的增殖分化【1 5 l 。 n o 是一种以旁分泌或自分泌的方式作用于组织细胞的气体分予，它分子量小， 一氧化氮对神经干细胞席体细胞分化的影响 引 言 且为脂溶性，能够自由通过细胞膜而起传递信息的作用，因此在免疫、循环和神经系 统发挥着重要作用【蚓。在生物体内，n 0 是通过一氧化氯合酶( n i t r j co x i d es y n t h 弱c ， n o s ) 催化l 精氨酸和氧来合成的。n 0 s 有三种类型：神经元型n o s ( n 朋m n a ln i t r j c o x i d es y n t h 勰e ，n n o s 或n o s i ) 、诱导型n o s ( i n d u c i b l en i h 记o x i d cs ) l l t l l 髂c ，i n o s 或n o s 1 i ) 和内皮型n 0 s ( 仰d o t h c l i a l n i t r i c o x i d es y n 也a ，e n o s 或n o s i i i ) 【1 7 1 。 在脑内，n o s 的类型主要是n n o s ，主要在神经元表达。但有报道，神经前体细胞也 有n n o s 的表达【堋。 目前，有关n o 对神经干细胞前体细胞的作用的研究主要以在体实验为主， m o r c n 0 m p c z 等在成年小鼠在体实验中发现，内源性n o 的缺乏延缓了神经元的分 化成剿埘。而体外实验主要研究n o 对神经干细胞增殖的影响，如黼c h e n g 等在 新生小鼠s v z 离体实验中发现，n o 供体硝普钠( s o d i 啪l i i t i o p m s s i d c ，s n p ) 能抑 制神经干细胞有丝分裂增殖刚。但是，关于n o 对离体培养的新生大鼠神经干细胞 前体细胞分化的影响极少有报道。 本研究主要探讨n o 对新生大鼠体外培养的神经干细胞，前体细胞的分化作用。 首先，从新生大鼠s v z 分离培养扩增神经千细胞，前体细胞。随后用n 硝基l 精氨 酸甲酯( n n i t 胁i ，a r g i n j 肿m c m y l c s t e r ，i ，n a m e ) 作为n o s 的抑制剂，观察内源性 n o 对体外培养的神经干细胞前体细胞的分化作用。此外，用二乙烯三胺，一氧化氮 聚合物( d i e t l i y i 朗e t r i 锄i n 印q o ，d 髓a 绀o ) 作为n o 外源性供体，观察其对体外培 养的神经干细胞前体细胞的分化作用。同时，在实验中运用g r c i s s 还原法检测培养 液中n o 的释放量。用免疫细胞化学方法鉴别分化细胞的表型。 2 一氧化氮对神经干细胞廊体细胞分化的影响 实验材料及方法 一、实验材料 实验材料及方法 ( 一)实验对象 出生m 2d 的新生s p n g u c - d a w l e y ( s d ) 大鼠，清洁级，由苏州大学生命科学院 实验动物中心提供。许可证号：s y x k ( 苏) 2 0 0 2 - 0 0 3 7 。 ( 二)试剂 d m e m f 1 2 干粉s i g m ak 表皮生长因子( e g f ) s j g m ai b 2 7 g i b c o _ c 5 溴- 2 埘a 氧尿嘧啶核苷( b r d u ) r o c h cd i a 印t i cc o 多聚赖氨酸( p u ) s i g m al 虬 二乙烯三胺一氧化氮聚合物( d e 】r a n o ) s i g m ai 眦 n 硝基l 精氨酸甲酯( l m s i g m a l 鹅 小鼠抗b f d u 单抗b i 咖u 嗽e o 小鼠抗巢蛋白( n e s t i l l ) 单抗a l 啪i 咖h t e 阳a t i 彻i a ll n c 小鼠抗p i 型微管蛋白( t u j 一1 ) 单抗s i g m a i l l c 兔抗胶质原纤维酸性蛋白( g f a p ) 多抗n e 伽1 a 1 1 rh c 兔抗神经元型一氧化氮合酶( n n o s ) 多抗c l i 锄i c o nh i t e m a t i o n a lh c 生物素化的羊抗兔i g g 二抗v c c t o ri 劬咖l t o r i 鹳h l c 生物素化的羊抗小鼠i g g 二抗v e c 眈l a b o m t 唰e sh c a b c 试剂盒( p k 一6 1 0 2 ) v c c l o rl a b o 船t 鲥鹤k 二氨基联苯胺( d a b ) 、叠氮钠s i g m a l n c t r r r c 标记的驴抗小鼠i g g j a c k s 衄i m m u n o r e s e a r c h l a b o m t 硎鹳l n c f 1 1 标记的驴抗兔i g g j a c k s l 舢u r e s c a r c hl a b o r a t 耐e s i n c h 0 e c h s t3 3 3 4 2 s i g m al n c 总一氧化氮试剂盒南京建成生物工程研究所 3 一氧化氮对神经干细胞街体细胞分化的影响 实验材料及方法 h e p c s ( n ( 2 - 羟乙基) 哌嗪- n 一2 - 乙烷磺酸) 、谷氨酰胺( l ，g l u t 咖i n e ) 、磷酸 二氢钠、磷酸氢二钠、多聚甲醛、氯化钠、盐酸、双氧水、二甲苯、中性树脂、无水 乙醇、苏木精、硫酸铝钾、甘油 中国医药集团上海化学试剂公司 ( 三) 设备仪器 超净工作台 解剖显微镜 c 0 2 培养箱 离心沉淀机 倒置显微镜 倒置相差显微镜 直立显微镜 倒置荧光显微镜 数码相机 一2 0 低温冰箱 s w 二c 1 1 f d苏州净化设备有限公司 x s l r 1 b b 5 0 6 0 u ( j i i x s 乙d 2 d ( 5 1 c x i o t e 2 0 0 0 u c - 4 1 0 0 普通冰箱 b c d 1 8 3 d 纯水蒸馏器 电子天平 s 2 1 9 3 a l l 0 4 济南八一光学仪器厂 h c r a e u s 上海医用分析仪器厂 重庆光学仪器厂 0 l y m p 惦 o l y m p 惦 日本n i k o n 公司 o l y m p u s s a n y o s 锄s 岫g 上海亚荣生化仪器厂 m e l l l 量rt o l e d o 压力蒸汽消毒器s y q d s x 2 上海申安医疗器械修造厂 恒温培养箱 酶标仪 w m z k m l b e n c h m a r k 4 上海医用仪器厂 b i o r a d 一氧化氮对神经干细胞，前体细胞分化的影响 实验材料及方法 二、实验方法 ( 一) 实验分组 实验分三部分 第一部分：神经干细胞前体细胞的分离和培养 具体参照龚珊1 2 1 】等实验方法并加以改进。 ( 1 ) 取材新生s d 大鼠( m 2 d ) ，置于7 5 的乙醇中浸泡消毒1 2m i n ，断 头后迅速取脑放入无菌生理盐水中，漂洗3 次，入超净工作台，4 h e b s s 液( h a l i l 【s e a l l c ，sb a l 柚c c ds a l ts o l u t i 彻) 洗两次。在解剖显微镜下仔细剥离脑膜和血管，切取 前脑侧脑室周围组织包含脑室下带( 鲫b v t r i 叫l 缸z 衄c ，s v z ) ，见图1 。 图1 s v z 的解剖位置 虚线框内为实验切取的前脑室周围组织，包含s v z ( 2 ) 机械分散用一次性手术刀片将s v z 组织块机械剁碎，用巴斯德吸管反复 吹打，4 0 0 目筛网过滤，制成单细胞悬液。 入条件培养基( 基础培养基+ 2 b 2 7 ) 胞计数。 1 0 0 0r m i n 离心5 分钟，去除上清液，加 ，添加e g f 2 0 n 咖l ，重悬细胞，进行细 ( 3 ) 细胞计数0 4 台盼蓝按1 ：1 的比例与细胞悬液均匀混合，用血球计数 5 一氧化氮对神经干细胞前体细胞分化的影响 买验妨精及方法 板在显微镜下计数活细胞。 ( 4 ) 接种与培养调整细胞密度为1 1 旷m l ，接种于2 5c m 2 培养瓶内，入 3 7 、5 c 0 2 培养箱悬浮培养。以后每3 天半量换液一次，按2 0n g m l 的浓度 添加新鲜的e g f ( 5 ) 细胞传代原代细胞培养约5 - 7 天后形成原代神经球，将原代神经球移入 1 5m l 离心管，用巴斯德吸管反复吹打，尽量吹散成单个细胞，1 0 0 0 刀1 i n 离心5 分 钟，去除上清液，加入新鲜的条件培养基，添加2 0n g ，m l 的e g f ，重悬细胞，以1 1 0 5 ，m l 的细胞密度接种于2 5 锄2 培养瓶内，此后约培养7 天后再机械分离神经球 并传代一次，方法同前。 ( 6 ) b r d u 的标记b r d u 是胸腺嘧啶核苷的类似物，当细胞处于d n a 合成期时 可掺入新合成的d n a 中，在体或离体都能通过免疫组化的方法检测到，可用于标记 b r d u 暴露期间进行d 小l a 合成的细胞i 。在原代或次代培养的第4 天，加入1 0 ，m 的 b r d u 与细胞共同孵育铝小时 ( 7 ) 细胞分化将原代或次代培养5 7 天得到的悬浮生长的神经球移至1 5m l 离心管，1 0 0 0r m i l l 离心5 分钟，弃去上清，加入适量条件培养基重悬细胞，接种入 经多聚赖氨酸处理过的盖玻片上，加入条件培养基，不添加e g f ，继续培养5 天， 期间不换液。 第二部分：内源性一氧化氮对神经干细胞门；口体细胞分化的影响 实验采用l 广n a m e 作为n n o s 的抑制剂，抑制内源性n o 的合成。将传代培养5 天得到的悬浮生长的次代神经球移至1 5m l 离心管，1 0 0 0f 细i n 离心5 分钟，弃去上 清，加入适量条件培养基重悬细胞，接种子经多聚赖氨酸包被过的盖玻片上，每4 片一组，分为5 组：( 1 ) 对照组( 自然分化组) ，不添加b n a m e ；( 2 ) ( 5 ) 实验组，按添加l n m e 的不同浓度分为l n a m e5 0 肛m 组，【，n a m e1 0 0 p m 组， l n a m e 1 5 0 p m 组，i ，n a m e 2 0 0 m 组。在3 7 、5 c 0 2 培养箱中继续培养5 天，每组的培养基均为条件培养基，不含e g f ，期间不换液。实验重复3 次以上。 6 一氧化氮对神经干细胞脯体细胞分化的影响 实验材料及方法 第三部分：外源性一氧化氮对神经干细胞席体细胞分化的影响 实验采用d e t 悄。作为n 0 的外源性供体。将传代培养5 天得到的悬浮生长的 次代神经球移至1 5m l 离心管，1 0 0 0r 肺i l i 离心5 分钟，弃去上清，加入适量条件培 养基重悬细胞，接种于经多聚赖氨酸包被过的盖玻片上，每4 片为一组，分为7 组： ( 1 ) 对照组( 自然分化组) ，未添加d e t a n o ；( 2 ) ( 7 ) 实验组，按照添加 d e t a n o 的浓度不同分为d 翻r 纠n o1 0 m 组，d e i ! a 悄o2 0 m 组，d e t a 悄o3 0 p m 组，d 勘a n 0 4 0 p m 组，d 玎a n 0 5 0 p m 组，d e l a n 0 6 0 p m 组。在3 7 、 5 c 0 2 培养箱中继续培养5 天，每组的培养基均为条件培养基，不含e g f ，期间 不换液。实验重复3 次以上。 ( 二) 免疫细胞化学检测 1 n s c 洲p s 鉴定 1 1n 姻n 的检测用吸管吸取原代或传代培养得到的神经球悬浮液，移至预 先用多聚赖氨酸包被过的盖玻片上，继续培养4 小时，进行n 璐t i n 免疫细胞化学的鉴 定。具体方法是： ( 1 ) 将有细胞生长的盖玻片取出，吸去培养液，0 0 1m p b s ( p h 7 4 ) 洗3 次， 每次5m i n ，4 多聚甲醛固定2 0m i n ： ( 2 ) 0 0 1 mp b s 洗3 次，加入小鼠抗n 豁t i i l 的单克隆抗体( 1 ：1 0 0 0 ) ，放入湿 盒，4 孵育过夜； ( 3 ) o 0 1mp b s 洗3 次，加入相应的t r r r c 标记二抗( 1 ：1 ) ，3 7 避光 反应3 0 m i n ： ( 4 ) o 0 1 m p b s 洗3 次，加1 0 艇，m l h o e c h s t 3 3 3 4 2 标记细胞核，3 7 避光反 应3 0 m i n ： ( 5 ) 0 0 1mp b s 洗3 次，5 0 缓冲甘油封片，于n i k 衄倒置荧光显微镜下观 察阳性结果。 以0 0 1mp b s 代替一抗作为阴性对照组，每次实验重复3 次以上。 1 2b r d u 的检测在原代或次代培养第4 天加入b r d u ，与细胞共同孵育4 8 7 一氧化氮对神经干细胞，前体细胞分化的影响 实验材料及方法 小时后，用吸管吸取神经球悬浮液，移至多聚赖氨酸处理过的盖玻片上，弃去培养液， 4 多聚甲醛固定2 0 m i n ，经2 n h a 室温孵育3 0 m i n ，用o 0 1 m p b s 洗3 次后， 加入小鼠抗b r d u 单克隆抗体( 1 ：1 0 0 ) ，4 孵育过夜，其余步骤同前。 2 n n o s 的检测将原代或次代培养的神经球，以及l n a m e 处理5 天的细胞， 经4 多聚甲醛固定后，加入兔抗n n o s 多克隆抗体( 1 ：1 0 0 ) ，4 孵育过夜，其 余步骤同前。 3 t q 1 ，g f a p 的检测为了鉴定n s c s n p s 分化细胞的类型，作相应的特异 性标记物的观察。已知d i i i 型微管蛋白( b t u b u l i n ，1 u j - 1 ) 主要在神经细胞发育的 早期阶段表达，可以作为新生神经元的特异性标记物，而胶质纤维酸性蛋白( 醇i a l 劢r i l l a r ya c i d i cp r o t e i n ，g f a p ) 是星形胶质细胞的特异性标记物。简要步骤如下：细 胞经4 多聚甲醛固定2 0 m i i i 后，加一抗( 小鼠抗t u j - 1 单克隆抗体( 1 ：1 0 0 0 ) 或 兔抗g f a p 多克隆抗体( 1 ：1 0 ) ) 4 孵育过夜。加二抗3 7 孵育3 0m i l l ，亲 和素生物素试剂( a v i d i n b i o t i n 湖p l 懿，a b c ，1 ：2 ) 3 7 孵育3 0m i l l ，0 0 3 h 2 0 2 的o 0 5 二氨基联苯胺( d i 锄i b c 北i d i n e ，d a b ) 显色5m i n ，0 0 1mp b s 终止显色 苏木素复染细胞核。各步骤间用o 0 lmp b s 漂洗3 次，每次5 m i l l 。最后在7 0 、 8 0 、9 0 、1 0 0 乙醇中梯度脱水，二甲苯透明，中性树脂封片。光镜下观察记 录阳性反应细胞。 。 ( 三) n o 浓度的测定 正常培养的细胞能通过n n o s 合成内源性n 0 ，当n n o s 被抑制时，内源性n o 的产生就会减少，而添加不同浓度的d 】玎a 瓜o 时，细胞培养上清液中会释放出n o n 0 的代谢产物为亚硝酸根，可以通过g f e i s s 反应检测到。但部分亚硝酸根会进一 步代谢成更为稳定的硝酸根，不能被g 砖i s s 反应检测到。总n o 试剂盒利用n a d h 依赖的硝酸盐还原酶还原硝酸根为亚硝酸根，然后利用g r c i s s 反应检测亚硝酸根， 从而实现对总n o 的比较精确的检测。实验中，分别吸取1 、2 、5 天的细胞培养上清 液，按南京建成生物工程研究所提供的方法检测上清中总n o 的含量。具体方法是： 取上清1 0 0 l ，加入试剂一、试剂二各2 0 0 肛l 混匀，3 7 准确水浴6 0 分钟；再加 入试剂三2 0 0 肛l 、试剂四1 0 0 脚，漩涡振荡器振荡混匀3 0s ，静置1 0 分钟，4 0 0 0r m i n 8 一氧化氮对神经干细胞，前体细胞分化的影响 实验材料及方法 离心1 0 分钟，取上清5 l ，加入显色剂( 试剂五、试剂六、试剂七按2 5 ：1 ：1 配 制) 6 0 0 l 混匀，静置1 0 分钟，移入9 6 孔板，酶标仪5 5 0 砌检测o d 值。根据说 明书提供的公式：( 样本0 d 值一空白o d 值) ，( 标准品o d 值一空白o d 值) 标准品浓度( 1 0 0 “m ) ，计算出溶液中n o 浓度。 ( 四) 细胞计数和统计 用奥林巴斯c x4 0 直立显微镜或n i k 帆t e 2 0 0 m u 倒置荧光显微镜，于2 0 0 倍镜 下观察每孔阳性反应细胞，随机选取2 个不同视野下直径1 0 m 1 5 0 胂的神经球进行 拍照。通过图像分析软件h n a g c - p mp l u s6 o 计数阳性细胞细胞总数，得出阳性细胞 百分比。结果用均数标准差( m e a n s d ) 表示，实验组和对照组差异采用方差分 析( 伽c w a va n o v a ) 和f 检验判定，利用s p s s1 0 o 软件进行统计分析，以p o 月1 5 为有显著差异。 9 一氧化氮对神经干细胞脯体细胞分化的影响结粟 结果 、s v z 神经千细胞前体细胞的增殖与分化 1 原代培养 原代细胞在含有e g f 的条件培养基中培养第1 天，可看到多个单个悬浮的细胞 或数个细胞聚集成团，细胞呈规则圆形，胞膜完整，体积较大，胞浆，胞核比例大( 图 2 a ，a ，) 培养2 3 天后，多数细胞死亡，可见大量细胞碎片，少数细胞贴壁分化， 有突起伸出；存活的悬浮细胞不断分裂增殖，可见到哑铃状或多个细胞组成的小细胞 团。乒5 天后形成含有数十个细胞的大小不等的细胞团，悬浮在培养液中，称为神经 球( 玎e n f p h e f c s ) ( 图2 b ，b ) 。神经球边界清楚，无突起，折光性强。卵天神 经球明显增大，直径可达1 5 0 加l 左右 图2 原代培养的神经球 a a ，原代培养1 天的n s c 卵妤sb b 原代培养5 天的神经球 一氧化氖对神经干细胞廊体细胞分化的影响 结果 2 传代培养 神经球经机械吹打成单个细胞悬液，进行传代培养。传代培养第1 天，镜下见到 多数为数个细胞组