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基于金磁微粒的核酸纯化新方法 摘要 核酸( d n a 或r n a ) 纯化是分子生物学下游实验和核酸水平临床检测的重要 前提，纯化总体原则是高纯度核酸样品的获得和保证核酸结构的完整性。现有核 酸纯化方法包括酚一氯仿抽提，高盐沉淀，离子交换和选择性吸附等。但方法存 在不环保( 使用有毒试剂) ，操作繁琐( 多次离心) ，无法实现高通量( 难以大 规模自动化操作) 等缺点。纳微米超顺磁性复合微粒，在核酸纯化方面体现出较 大优势，与现有核酸纯化技术相比，无需离心，操作简便快速，能够实现高通量， 自动化。国外已有以磁性复合微粒为载体纯化核酸的相关试剂盒产品，国内在此 方面的研究与开发还较为落后。 本研究以我国自主知识产权的新型磁性复合微粒一金磁微粒为载体，建立了 从大鼠肝脏纯化总核酸( 即基因组d n a 和总i a ) 的方法。选择硫氰酸胍 ( g u a n i d i nt h i o c y a n a t e ，g t c ) 裂解体系，将裂解后的样本与金磁微粒混合，总 核酸将结合在金磁微粒表面，经过清洗后将吸附在金磁微粒表面的总核酸即可洗 脱下来。纯化得到的总核酸在2 6 0n n l 处有特征紫外吸收峰，凝胶电泳分析可见 基因组d n a 和2 8 sr n a 及1 8 sr n a 条带，其2 8 s 与1 8 sr n a 条带的比例约为 2 ：1 。建立的方法也适用于大鼠心、脾、肺、肾等组织的总核酸纯化。将该方法 初步用于其它生物样本如细胞、细菌、植物、全血总核酸的纯化，同样获得较为 理想的结果。 对建立的金磁微粒纯化总核酸的方法进行系统评价，结果表明：金磁微粒纯 化核酸回收率为8 0 ，方法的批内差从5 0 6 到1 6 2 9 ，批间差从4 2 2 到 2 0 5 ，可稳定用于肝脏组织总核酸纯化。纯化得到总核酸作为模板用于1 3 - a c t i o n 基因的r t - p c r 反应，能够扩增出目的片段，说明总核酸样品纯度高，不含抑制 r t - p c r 反应的抑制剂。 不经总核酸洗脱步骤，用d n a s e 消化金磁微粒总核酸复合物，可以得到总 r n a 。该方法能够从1 0m g 大鼠肝脏中纯化得到约4 0l x g 总r n a ，o d 2 6 0 o d 2 8 0 在2 0 左右。纯化得到总r n a 能够应用于r t - p c r 反应。同样，用r n a s e 消化 金磁微粒一总核酸复合物可以得到基因组d n a ，从1 0m g 大鼠肝脏中纯化得到约 5p g 的d n a ，o d 2 6 0 o d 2 8 0 为1 7 8 。此外，制备共价偶联o l i g o ( d t ) 2 0 功能化 磁性微粒，并以此为载体，从总核酸中纯化m r n a ，凝胶电泳结果可见清晰弥 散的m r n a ，没有r r n a 的污染，以纯化得到的m r n a 作r t - p c r 反应，能够 扩增出目的条带。 综上所述，本研究建立了以金磁微粒从动物组织中纯化总核酸( 包括基因组 d n a 和总砌姒) 的方法。在不洗脱总核酸的前提下，以d n a s e 处理金磁微粒 总核酸复合物，经过进一步纯化，可以得到总r n a ，以r n a s e 处理金磁微粒 总核酸复合物，经过进一步纯化，可以得到基因组d n a 。以得到的总核酸为样 品，可以用o l i g o ( d t ) 偶联的磁性微粒进行m r n a 的纯化。基于金磁微粒的核 酸纯化方法可重复，操作简单，选择性好，纯化得到的d n a 或r n a 纯度高， 收率高，是一种非常有前景的新方法。 关键词：金磁微粒总核酸总r n ad n am r n a i i an e wm e t h o do fn u c l e i ca c i dp u r i f i c a t i o nu s i n g g o l d m a g p a r t i c l e sa sa ca r r i e r a b s t r a c t n u c l e i ca c i dp u r i f i c a t i o ni st h em o s tt e c h n i c a l l yd e m a n d i n ga n dl a b o r - i n t e n s i v e p r o c e d u r e sp e r f o r m e d i nm o l e c u l a rb i o l o g yr e s e a r c ha n da s s o c i a t e dd i a g n o s t i c m e t h o d s t h ep r i n c i p l eo fn u c l e i ca c i dp u r i f i c a t i o ni st oo b t a i nh i g hp u r i t ya n de n s u r e t h ei n t e g r i t yo fn u c l e i ca c i d t h e r ea r es o m en u c l e i ca c i dp u r i f i c a t i o nm e t h o d ss u c ha s p h e n 0 1 c h l o r o f o r me x t r a c t i o n ，h i g hc o n c e n t r a t i o n so fs a l t ，a sw e l la si o ne x c h a n g e c h r o m a t o g r a p h ya n da d s o r p t i o nc h r o m a t o g r a p h y h o w e v e r , t h e s em e t h o d s h a v e d i s a d v a n t a g e si n c l u d i n gs a f e t yc o n ce n r n s ( n e e dh a z a r d o u sr e a g e n t ) ，t e d i o u sp r o c e s s e s ( m u l t i s t e pc e n t r i f u g a t i o n ) a 血c a nn o ta l w a y sg u a r a n t e et h ei s o l a t i o no fn u c l e i ca c i d w i t hh i 曲t h r o u g h p u ta n dl a r g e s c a l ea u t o m a t i o n s u p e r - p a r a m a g n e t i cp a r t i c l e sh a v e a l r e a d yb e e nu s e di np u r i f i c a t i o no fn u c l e i ca c i d ，i n s om u c ht h em e t h o dh a s a d v a n t a g e ss u c ha ss i m p l e ，r a p i d ，a n dc a nb ea c c o m p l i s h e dw i t h o u tc e n t r i f u g a t i o n ， a n dc a nb eu s e dt oi s o l a t en u c l e i ca c i d sw i t hh i 曲一t h r o u g h p u ta n da u t o m a t i o n t h e n u c l e i ca c i dp u r i f i c a t i o nk i t su s i n gm a g n e t i cp a r t i c l e sh a v eb e e nc o m m e r c i a l i z e di n u s a ，g e r m a n y , e t c s of a r , a s s o c i a t e dr e s e a r c hi nt h i sf i e l di ss t i l li ni t sp r e l i m i n a r y s t a g e sw i t h i nt h ed o m e s t i ce n v i r o n m e n t u s i n gg o l d m a g p a r t i c l e sa sac a r r i e r , an o v e lm e t h o do ft o t a ln u c l e i ca c i d ( i n c l u d i n gg e n o m i cd n a a n dt o t a lr n a ) p u r i f i c a t i o nf r o mr a tl i v e rw a se s t a b l i s h e d ： g t c ( g u a n i d i nt h i o c y a n a t e ) l y s i sb u f f e rw a sc h o s e nt ot r e a tt h el i v e r , h o m o g e n i z e d ， a n dt h e ng o l d m a g p a r t i c l e sw e r ea d d e d ；a f t e ri n c u b a t i o nf o r5m i nt h ec o m p l e x p a r t i c l e so fg o l d m a g p a r t i c l e sa n dn u c l e i ca c i d sw e r ew a s h e da n dt h e nt h en u c l e i c a c i d sw a se l u t e df r o mt h ep a r t i c l es u r f a c e t h et o t a ln u c l e i ca c i dh a sc h a r a c t e r i s t i c p e a ki nt h ew a v e l e n g t ho f2 6 0a m t h eb a n d sf o rg e n o m i cd n a ，2 8 sr r n a ，1 8 s r r n aw e r ec l e a r l ye v i d e n tb ya g a r o s ee l e c t r o p h o r e s i sd e t e c t i o na n dt h er a t i oo f2 8 s r r n aa n d18 sr r n aw a sa b o u t2 ：1 t h em e t h o da l s oc a nb eu s e di nt o t a ln u c l e i ca c i d p u r i f i c a t i o nf r o mr a th e a r t ，s p l e e n ，l u n ga n dk i d n e ya sw e l l a so t h e rb i o l o g i c a l 1 1 1 m a t e r i a l ss u c ha sc u l t u r e dc e l l s ，b a c t e r i a ，p l a n ta n dw h o l eb l o o d i no r d e rt oe v a l u a t et h em e t h o d t h er e c o v e r ya n dt h ec o e 伍c i e n t so fv a r i a t i o n ( c v s ) w i t h i n a n db e t w e e n - p u r i f i c a t i o nw e r et e s t e d ，t h er e s u l t si n d i c a t e dt h a tt h e c o e 伍c i e n t so fv a r i a t i o nw a sf r o m5 0 6 t o1 6 2 9 a n df r o m4 2 2 t o2 0 5 r e s p e c t i v e l y t h er e c o v e r yr a t i ow a sa b o u t8 0 t h et o t a ln u c l e i ca c i df r o mr a tl i v e r w a su s e d a s t e m p l a t e f o r a m p l i f i c a t i o n o f 1 3 - a c t i n g e n e v i ar e v e r s e t r a n s c r i p t i o n p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n ( r t - p c r ) a n dt h ea g a r o s ee l e c t r o p h o r e s i s r e s u l ts h o w e dt h a tt h e t a r g e td n am o l e c u l e w i t h2 4 0b pc a nb es y n t h e s i z e d ， i n d i c a t i n gt h a tn oe n z y m ei n h i b i t o re x i s ti nt h ew h o l ep u r i f i c a t i o np r o c e s s w i t h o u te l u t i n gs t e p ，t h et o t a lr n aw a so b t a i n e db yt r e a t m e n tt h ec o m p l e xo f g o l d m a g p a r t i c l ea n dn u c l e i ca c i d sw i t hd n a s e ，4 0l x gt o t a lr n aw a si s o l a t e df r o m 10m gr a tl i v e ra n dt h er a t i o no fo d 2 6 0 o d 2 8 0w a sa b o u t2 0 ，a n dt h ep u r i f i e dt o t a l r n ac a nb eu s e di nr t - p c r i nt h es a m em a n n e r , a f t e rt r e a t e dw i t hr n a s e t h e g e n o m i cd n aw a so b t a i n e d t h ey i e l do fp u r i f i e dd n af r o m10m gr a tl i v e rw a s a b o u t5 g ，a n dt h er a t i o no fo d 2 6 0 o d 2 8 0w a sa b o u t1 7 8 t h eo l i g o ( d t ) c o u p l e d w i t hf u n c t i o n a lm a g n e t i cp a r t i c l e sw a su s e dt oi s o l a t em r n af r o nt o t a ln u c l e i ca c i d s p u r i f i e db yt h ea b o v em e t h o d i nc o n c l u s i o n ，an o v e lt o t a ln u c l e i ca c i dp u r i f i c a t i o nm e t h o df r o ma n i m a lt i s s u e u s i n gg o l d m a g a sc a r r i e rw a se s t a b l i s h e d w i t h o u te l u t i n gt h et o t a ln u c l e i ca c i d ，b y t r e a t i n gt h ec o m p l e xo fm a g n e t i cp a r t i c l e sa n dn u c l e i ca c i dw i t hd n a s e ，a n da f t e r f u r t h e rp u r i f i c a t i o np r o c e s s e s ，t h et o t a lr n aw a so b t a i n e d ，w ec a na l s oo b t a i nd n ai n t h es a m em a n n e r u s i n gt h et o t a ln u c l e i ca c i da sm a t e r i a l ，m r n aw a si s o l a t e du s i n g f u n c t i o n a lm a g n e t i cp a r t i c l e sw h i c hw a sc o u p l e dw i t ho l i g o ( d t ) 2 0 t h ep u r i f i e dd n a a n dr n ad e m o n s t r a t e dh i g hp u r i t y , s ot h em e t h o di s p r o m i s i n gi nt e r m so fn u c l e i c a c i dp u r i f i c a t i o n k e yw o r d s ：g o l d m a g ，t o t a ln u c l e i ca c i d ，t o t a lr n a ，d n a ，m r n a i v 西北大学学位论文知识产权声明书 本人完全了解西北大学关于收集、保存、使用学位论文的规定。 学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版。 本人允许论文被查阅和借阅。本人授权西北大学可以将本学位论文的 全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫 描等复钶手段保存和汇编本学位论文。同时授权中国科学技术信息研 究所等机构将本学位论文收录到中国学位论文全文数据库或其它 相关数据库。 保密论文待解密后适用本声明。 学位论文作者签名：盘9 刍鏊： 指导教师签名： 略年月p 日 加口扩年石月，。日 西北大学学位论文独创性声明 本人声明：所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究 成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，本论文不包含其他人已经 发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得西北大学或其它教育机构的学位或证书而 使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确 的说明并表示谢意。 第一章前言 1 1 核酸纯化研究概况 1 1 1 核酸纯化的原则 在过去的几十年，分子生物学研究经历了突飞猛进的发展。随着技术的进步， 核酸纯化已经成为分子生物学研究准备阶段的必备工作。疾病诊断、克隆、测序、 扩增、杂交、e d n a 分析等实验操作的首要步骤就是纯化出完整，高质量的核酸。 核酸包括脱氧核糖核酸( d n a ) 和核糖核酸( i a ) 两种，在细胞中大多 以与蛋白质结合的状态存在。真核生物的染色体d n a 为双链线性分子，原核生 物染色质、质粒及真核细胞器d n a 为双链环状分子，d n a 病毒有时为单链环状 d n a 分子。9 5 的真核生物d n a 主要存在于细胞核内，其它5 为细胞器d n a ， 如线粒体、叶绿体等。r n a 分子在大多数均是单链线性分子，不同类型的r n a 分子可以具有不同的结构特点，如真核r n r n a 分子多数在3 端带有p o l y ( a ) 结构， 至于r n a 病毒粒子，其r n a 存在形式多种多样，有双链环状、单链环状、双 链线状及单链线状等。r n a 分子则主要存在于细胞质中，约占7 5 ，另有1 0 在细胞核内，1 5 在细胞器中，r n a 以r r n a 的数量最多( 8 0 8 5 ) ，t r n a 及核内小分子r n a 占1 0 1 5 ，而m r n a 分子大小不一，序列各异。 分离纯化核酸的总体原则： 1 ) 完整性：为了保证核酸结构与功能的研究，完整的一级结构是最基本的 要求，因为遗传信息全部贮存在一级结构之中，核酸的一级结构还决定其高级结 构的形式以及和其它生物大分子结合的方式 2 ) 纯度：对于核酸纯化应达到以下二点要求： ( 1 ) 核酸样品中不存在对酶有抑制作用的有机溶剂和过高浓度的金属离 子： ( 2 ) 其它生物大分子如蛋白质、多糖和脂类分子的污染应降到最低程度； 1 1 2 核酸纯化技术 核酸纯化方法主要包括两个步骤：一是裂解，将细胞破碎使核酸释放出来， 二是纯化，即将释放出来的核酸和细胞内的其他成分如蛋白质、盐和其他杂质分 离开。以下就基因组d n a ，总r n a 和m r n a 的纯化方法做一简要介绍。 1 1 2 1 基因组d n a 纯化 经典的d n a 的裂解方法有物理、化学或酶解法。常用的物理方法包括煮沸， 冻融、微波、超声、研磨等；化学方法包括高盐、表面活性剂等；酶解法有溶菌 酶、蛋白酶k 等。 裂解后纯化的方法有几下几种： 1 ) 酚氯仿抽提法 根据生物样本的不同，选取合适的裂解方法，对裂解后的样本使用苯酚氯仿 抽提和醇沉淀：利用酚氯仿对裂解体系进行反复抽提以去除蛋白质，实现核酸与 蛋白质的分离，再用醇将核酸沉淀下来，实现核酸与盐的分离。这种方法在使用 过程中涉及多次离心操作，非常浪费时间和耗材，复杂繁琐；不可避免使用挥发 性有毒化学试剂；沉淀烘干，溶解等步骤不易操作，对实验人员的技术要求较高； 易导致d n a 丢失，纯化d n a 质量不高。 2 ) 高盐沉淀法 这种方法和酚氯仿抽提方法的主要不同在于去除蛋白质的方式，基因组 d n a 的抽提中经常使用蛋白酶，将蛋白得以降解，从而将d n a 从与蛋白结合的 状态中游离出来。如从血液白细胞中纯化基因组d n a 的实验中，p a r z e rs 用蛋白 酶k 【1 1 、k e n d a l l 用蛋白酶e 【2 1 、r u d b e c kl 用蛋白酶k 和核糖核酸酶和强碱m a o h 或k o h ) 3 1 对蛋白质和r n a 进行充分消化分解，在高盐的条件下沉淀蛋白，用乙 醇直接沉淀分离纯化d n a 。避免了使用有毒有机溶剂，提取的d n a 的o d 2 6 0 o d 2 8 0 比值达到1 8 以上，d n a 提取量可达2 0 2 8 p g m l 。但蛋白酶对蛋白质消化需要 很长时间或需置高温条件下进行消化，给临床应用特别是常规应用带来了一定的 困难。 3 ) 硅介质吸附 早在2 0 世纪5 0 年代，人们就知道在有离液盐存在时d n a 能与硅胶可逆结 合，其原理被认为是由于d n a 分子中的磷酸二酯骨架在离液盐作用下脱水，使 得暴露的磷酸基团吸附硅胶。吸附的d n a 分子可以经水溶性缓冲液( 如t e 或 水) 重新水化后，洗脱下来【4 1 。双链d n a 与硅胶的相互作用依赖于d n a 的长 度，小于1 0 0b p 的d n a 片段很难吸附到树脂上。 2 这类载体以硅类介质为主，二氧化硅颗粒、硅藻土、玻璃粉等。介质有两类， 一类是颗粒状的如二氧化硅粒子，玻璃珠等；另一类是柱式的，即介质被预先装 填在离心柱中。 v o g e l s t e i n t 5 】直接使用玻璃粉从琼脂糖凝胶中提取得到d n a ，而m a r k o 6 1 使用 玻璃粉成功提纯质粒d n a 。b o o m 【7 1 对该方法加以改进，用二氧化硅和硅藻土为 固相吸附剂，用来提取纯化人血清或尿液中的微量病原体基因组d n a 。m e l z a k l 8 】 用二氧化硅介质结合质粒d n a 和基因组d n a ，并通过一系列条件的摸索探讨了 吸附的机理：分子及d n a 的静电作用，d n a 表面和硅介质表面脱水，及d n a 及硅介质表面的氢键形成。t i a n 【9 1 用纳克级的硅介质从白细胞和全血中纯化皮克 级的d n a ，通过p c r 和荧光检测建立了可用于芯片规格的d n a 纯化方法。 b r e a d m o r e t l o 】将硅珠包埋至芯片上，通过优化d n a 结合条件，将纯化时间减少， 结合p c r 扩增，此方法可以用于流行病监测。 一些商品化的试剂盒，将硅胶膜填充在离心柱中，采用吸附原理纯化核酸， 该方法与液相法相比，大大简化了实验步骤，但是仍需要多次离心。 4 ) 离子交换介质 利用阴离子交换技术【1 1 。3 1 ，将裂解液过柱，根据核酸大小不同，带电荷不同 吸附力不同，核酸被联结在离子交换介质上；洗涤去除残留的杂质后，用高盐缓 冲液将核酸从介质上洗脱下来。再经过标准的乙醇异丙醇沉淀、乙醇洗涤、干 燥等操作，获得纯的核酸，溶解于合适的缓冲液中。 阴离子交换技术能纯化得到纯度较高的核酸，其缺点是操作繁琐，操作时间 长，不太适合日常实验要求。 5 ) 磁性分离技术 磁性分离技术是利用超顺磁性材料在一定条件下可以在溶液中分散，而在外 磁场作用下可以定向运动和富集的特点进行分离纯化目的分子。目前基于超顺磁 性材料的磁分离提取技术已经成为生物提取分离中的主流技术之一。近年来，以 磁性分离技术纯化d n a 的研究越来越多，根据所采用的磁性材料的不同分离纯 化d n a 的原理也有所不同。目前许多公司如q i a g e n ，p r o m a g a ，d y n a l 等公司已 推出相应的d n a 纯化试剂盒。 1 1 2 2 总r n a 纯化 r n a 的纯化较d n a 纯化困难，因为r n a 分子核糖残基的2 和3 位有羟基， 化学性质活泼，在碱性条件下易被水解；同时r n a s e 分布广，结构稳定，且r n a s c 作用时不需要二价阳离子激活，缺乏e d t a 等金属螯合剂的保护。在纯化过程中， r n a 分子很容易被内源性或外源性r n a s e 降解。细胞破碎后内源性的r n a s e 会 立即释放，因此纯化r n a 的关键在于在裂解细胞的同时使用r n a s c 抑制剂将内 源性的r n a s e 迅速失活。 胍盐被证明是一种有效的r n a s e 抑制剂，能在裂解细胞的同时使r n a s e 失 活，最常用的是盐酸胍( g u h c l ) 或硫氰酸胍( g u s c n ) ，是一种高离液序列盐， 该种试剂能够破坏蛋白质三维结构，使多数蛋白质转换成为随机的卷曲状态【1 4 】。 由于它是核酸酶的强抑制剂，能够用来从富含r n a s e 的组织中分离完整的r n a ， r n a 分离过程中，首先作为蛋白变性剂的是g u h c l1 1 5 ，自此，异硫氰酸胍和盐 酸胍变成为r n a 提取的首选蛋白变性剂及r n a s e 抑制剂。 r n a 的纯化方法包括： 1 ) 氯化铯梯度超速离心 1 9 7 9 年c h i r g w i n $ 1 他的同事首先提出了用硫氰酸胍提取r n a 的方法【1 6 】：先将 组织在异硫氰酸胍性剂和d 一巯基乙醇一一种还原剂中混合均匀( 胍基裂解法) ， 然后通过乙醇抽提或者氯化铯梯度超速离心分离纯化细胞中的r n a 。这种技术 是第一种可以特异性分离r n a 的方法，但是存在耗时长，技术繁琐，纯化结果 不稳定等缺点。 2 ) 异硫氰酸胍和酚氯仿抽提 1 9 8 7 年c h o m c z y n s k i 对这一技术进行了改良，提出了“硫氰酸胍一酚氯仿抽提 法”( 简称“一步法”或a g p c 法) 【1 7 1 他们通过将异硫氰酸胍和酚氯仿结合起来，将 抽提的步骤缩短到了一步，这种方法带来了两个改进：第一，减少了r n a 分离 的时间，增加收集到的样品数，二来就是减少了r n a 的损失，增大了样品选择 范围，允许研究人员从更少量样品数中纯化r n a 。 g i b c o b r l 公司在此基础上研制了t r i z o l 试剂，已被大多数实验室广泛应 用。著名的a m b i o n 公司( 现r n a 试剂部分已被a b i 收购) ，开发的t o t a l l yr n a r m 总r n a 提取试剂盒也是基于这种方法，该试剂盒可以从来源广泛，样品量较低 的条件下纯化得到高质量r n a 。然而尽管优化了纯化步骤，但是这种方法仍然 4 有一些不足之处，比如说，超速离心不仅需要昂贵的设施，而且也经常导致r n a 凝集，难于重新悬浮。而且粗糙的有机溶剂也会引起样品中r n a 断裂，造成损 失。另外挥发有毒试剂的使用也是一个不可避免的问题。 3 ) 沉淀法 b o bw i l l i a m s o n 和其同事最早报道了利用氯化锂选择性沉淀高分子质量的 r n a 。用0 8 m 的l i c l 可以从含总砌叭分子的溶液中选择性沉淀大分子t r n a 和 m r n a i s 】，用2 5 m 的l i c l 可选择性沉淀1 0 0 个寡核苷酸长度的r n a t l 9 】。 g e ( 原a m e r s h a mb i o s c i e n c e s ) 公司采用异硫氰酸胍裂解细胞，使用氯化锂 和三氟醋酸铯( c e s i u mt r i f l u o r o a c e t a t e ，c s t f a ) 进行选择性沉淀和密度离心， 这样就不用依赖于有机溶剂，可以用普通的离心机在6 0 分钟内，从少至2 5m g 或 者1 0 6 1 0 8 细胞样品中分离得到i 必a ，而且c s t f a 离心对于避免r n a s e s 降解作用 也有更高的保护作用。 4 ) 硅介质吸附 利用硅介质吸附的方法纯化r n a 的原理和用此法纯化d n a 相似，一些公司 已经将胍基裂解法进行改进，利用r n a 吸附硅胶和玻璃质离心管代替了有机溶 剂提取步骤。这些系统的主要优点是：使用者可以避免有害的有机溶剂，例如酚、 三氯甲烷、异丙醇等。根据不同的设计方式，离心柱r n a 纯化流程可以通过离 心或者真空驱使细胞裂解物穿越滤膜。对于小量制备而言，生产商将滤膜安置在 小型离心管中，即可简化用户的使用步骤。 q i a g e n 的r n e a s y s t a b i l i z a t i o na n d t o t a lr n ai s o l a t i o ns y s t e m 就是一种 离心柱型r n a 提取试剂盒系统。r n e a s y 系列试剂盒能从动物细胞、组织，植物， 真菌细胞和组织中提取高质量的r n a 。使用r n e a s y 系统，研究人员们能在不使 用酚一氯仿抽提、氯化铯梯度离心、或者氯化锂或者乙醇沉淀的情况下3 0 分钟内 0 完成r n a 样品的收集。q i a g e n 公司同时也提供了为动物组织设计的r n e a s y p r o t e c tk i t s 、为革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌设计的r n e a s yp r o t e c t b a c t e r i ak i t s 。 这些试剂盒包含了r n a l a t e r ( 砌蛆稳定试剂) ，这些试剂能稳定细胞内的r n a 情 况，以便下游结果能准确地反映制备时样品r n a 表达状态。 q i a g e n 和b d 生物科学公司合资经营的品牌p r e a n a l y t i x 近几年也推出了 一款r n a 纯化试剂盒：p a x g e n e t mb l o o dr n as y s t e m f i t 液r n a 提取系统，临床 5 研究人员可以利用该系统收集、储存、稳定和从全血细胞中分离r n a 。抽血者 将血液注入特定的p a x g e n e b l o o dr n a 试管，这些试管内含有稳定r n a 的试剂， 能使血液样品在室温中稳定保存5 天。随后，研究者可以利用p a x g e n eb l o o dr n a k i t 试剂盒来分离r n a 。像q i a g e n 公司的r n e a s y 系列试剂盒一样，也是通过离 心柱纯化r n a 。 罗氏诊断公司应用科学部的高纯度r n a 分离试剂盒( h i g hp u r ep l a s m i d i s o l a t i o nk i t ) 币u 用玻璃纤维绒毛滤器安装在离心管内。该试剂盒利用单一的试剂 裂解细胞，并失活r n a s e s ，绒毛结合总r n a ，通过d n a s e 选择性的处理除去 d n a 污染。根据罗氏公司的介绍，该试剂盒能大范围用于全血和酵母细胞的r n a 提取。能使研究人员在数分钟的情况下纯化几种样品的总r n a 。 5 ) 磁性分离技术 以磁性分离技术纯化r n a 的研究相对于纯化d n a 的研究较少，目前已有 a m b i o n ，a g e n c o u r t 等公司推出相应的，总, r n a 纯化试剂盒，与其他的纯化方法相 比在r n a 纯化领域磁性分离技术有着较大优势：由于r n a 特别容易被r n a s e 所降 解，而其他方法不能避免的多步离心步骤很容易引入交叉污染，而以磁性分离技 术为基础的总r n a 纯化可以避免该问题。 1 1 2 3d n a 和r n a 共纯化 以上所述的d n a 和r n a 纯化方法大都只能提取出其中一种核酸而浪费另一 种核酸。当样品比较有限时，我们常常需要将同一种样品中的d n a 和r n a 提取 出来。从同一样品中同时提取d n a 和r n a 方法并不多。 k a r l i n s e yj ( 1 9 8 9 ) 首先采用酚抽提和l i c l 方法从真核细胞中同时抽提d n a 和 r n a 2 0 1 ，但是该方法操作繁琐还需要用到超速离心机，并没有得到广泛运用； c h o m c z y n s k i ( 1 9 9 3 ) 将一步法r n a 提取方法进行改剐2 1 1 ，使用一种溶液抽提即可 分别纯化d n a ，r n a 和蛋白质。但是使用该方法获得的d n a ，纯度比较低，难 溶解( 需要在8 m mn a o h 溶液中才能溶解) ，而且d n a 片段断裂比较严重，只有 1 0 k b 左右，因而很难满足下游的实验要求。 o m e g a 公司推出的d n a 和r n a 共提取系列试剂盒( e z n a t md n a r n a k i t ，e z n 。a p l a n td n ai ，i ：n ak i t ，e z 。n a t mf f p ed n a r n ak i t ) 采用了硅 胶膜纯化技术，可高效地从同一个样品中同时提取d n a 和r n a 。整个操作过程 6 中，不需要使用酚氯仿抽提和耗时的乙醇或异丙醇沉淀，完成数个样品的d n a 和r n a 抽提工作只需3 0 分钟。纯化的d n a 和r n a 可直接用于各种下游应用。 a m b i o n 公司最近推出了一种基于磁性分离技术的d n a r n a 共纯化试剂盒， m a g m a 删t o t a l n u c l e i ca c i di s o l a t i o nk i t ，纯化所得的核酸可直接用于r t p c r 或p c r 反应。 1 1 2 4m r n a 纯化 m r n a 占总r n a 的1 5 ，长短序列各异，用一般的r n a 分离方法很难分 离。大多数真核m r n a 具有3 p o l y ( a ) 尾，能够使用杂交互补的原理以0 1 i g o ( d t ) 为配基的亲和色谱法从总r n a 中选择性的分离出m r n a 。 传统的亲和色谱所采用的固相色谱填料有纤维素，葡聚糖及琼脂糖等高分子 聚合物。用此类填料进行m r n a 纯化均涉及离心过过柱等操作，不仅繁琐费时而 且过多的处理过程易引起r n a 的降解。 将磁性分离技术引入m r n a 的纯化是上述问题得到解决。用磁性复合微粒代 替非磁性填料，免除了离心，过柱等操作，使用非常方便，省时，从总对蛆分 离m r n a 的操作在不至l j l h 内完成目前，用磁性分离技术纯化m r n a 已经成为 m r n a 分离的主流技术。 1 1 2 5 核酸纯化技术的评价 综上所述，核酸纯化的方法主要有酚氯仿抽提，高盐沉淀，硅介质吸附和离 子交换和磁性分离技术，表1 1 对这几种方法的优缺点加以比较。 表1 1 核酸纯化方法比较 7 虽然硅介质住纯化的方法已经具备一定优势，但这种方法仍依赖于手工操 作，工作效率低、对操作者技术水平要求高并且容易带来人源污染，不能满足对 d n a 提取技术高纯度、高效率、自动化的要求。对于一些大规模的核酸分析试 验如d n a 数据库的建立，其工作量非常巨大。因此迫切需要一种能够用于高通 量自动化的核酸纯化方法。 1 2 磁性分离技术纯化核酸 1 2 1 磁性复合磁粒简介 1 2 1 1 磁性复合磁粒及其种类 磁性微粒( m a g n e t i cm i c r o s p h e r e s ) 是指带有磁性的尺寸在几十微米以下的 球形粒子( m i c r o s p h e r e s ) 、微粒( m i c r o p a r t i c l e s ) 微珠( m i c r o - b e a d s ) 等。以 此为基础形成的磁性材料应用极为广泛，涉及到电子信息、机电、汽车、冶金、 航天、航空、交通运输、等各部门。 磁性复合微粒是一种以磁性微粒为基础的新型磁性材料，由超顺纳米粒子与 无机或有机分子通过包覆或交联等方式而形成。二十世纪七十年代以来，将磁性 复合微粒应用于生物技术领域分离有活性的生物分子，引发了这个行业的热潮。 磁性复合微粒种类繁多，按照表面改性的不同，又可分为有机改性磁性复合 微粒和无机改性磁性复合微粒，按照其结构不同，可分为简单结构、核壳结构、 夹心结构。 1 ) 有机改性的磁性复合微粒 主要是以磁性纳米粒子( 铁、铁氧化物、钴、镍、正铁盐等) 为核心，有机 小分子、天然高分子、有机合成高分子等通过包覆或修饰而制备。见图1 1 。 有机小分子修饰的磁性复合微粒有天冬氨酸或谷氨酸、二巯基丁二酣2 2 】柠 檬酬2 3 1 磷酰维生素b 【2 4 1 、y 一环糊精等【2 5 1 。 利用具有生物相容性的高分子对粒子表面进行修饰，用于修饰的高分子有天 然高分子和合成高分子两大类，天然高分子主要包括有葡聚糖( d e x t r a n ) 2 6 】、 淀粉【2 7 , 2 8 1 多肽【2 9 】和蛋白【2 6 1 等，合成高分子主要有聚乙二醇( p e g ) 、聚乙烯醇 ( p v a ) 聚7 , - 醇一聚乳酸( p e g - p l a ) 1 3 0 、聚( n 异丙基丙烯酰胺) 及其共 聚物等( 3 l 】。 除了对粒子表面采用的修饰方法以外，另一种重要的方法是将磁性纳米粒子 复合到基体材料中来形成大尺寸的磁性微球，除了可以有效地避免磁性纳米粒子 之间聚集之外，还可以有效地提高磁性纳米粒子的化学稳定性。以有机高分子为 基体的磁性微球的制备方法主要有：包埋法【3 2 , 3 3 】、单体聚合法 3 4 - 3 6 、活化溶胀法 3 7 - 4 0 1 等。著名磁性复合微粒生产商d y n a l 公司( 现在为i n v i t r o g e n ) 生产的 d y n a b e a d s ，由活化溶胀即u g e l s t a d 法【4 l 】制得，该微球单分散性好，磁性粒子含 量均匀而且可以控制，批间差小于5 ，已被广泛应用于细胞分离，核酸纯化等 领域。 图1 1 表面有机改性的磁性复合微粒 2 ) 无机改性的磁性复合微粒 是铁、铁氧化物、钴、镍等与其它金属或无机物组成的微粒。 早期s t 6 b e r 小组用在性能优异的磁性纳米粒子表面直接水解有机硅氧烷的 方法制备s i 0 2 磁性复合粒子【4 2 1 。o h m o r i l m ，m am 开发了一种间接合成f e s i 0 2 复合粒子的方法 4 3 , 4 4 。t a a a j 小组用反相微乳液聚合法，制备了均一的s i 0 2 包覆 的磁性纳米粒子【4 5 4 8 1 。 对s i 0 2 磁性复合微粒进行表面功能化修饰，通过硅烷化试剂修饰活性官能 团，通过标记生物分子可以广泛应用于生物技术领域1 4 9 , 5 0 】。金磁微粒是一种新 型的无机改性的磁性复合微粒，由它将胶体金的生物相容性和磁性材料的可分离 性结合起来，c u i y l 小组率先开展了金磁微粒的制备研究【5 1 】，根据结构和组成 的不同，金磁微粒可分为核壳型和组装型见图1 2 。在磁性氧化物颗粒表面将金 离子还原成金单质，成功制备得到了核壳结构的金磁微粒，直径5 0 n m ，纳米磁 性微粒具有很高的抗体固定化容量，较好的单分散性和稳定性【5 2 】，同时该课题 组对微米级组装型金磁微粒也开展了一系列研究工作，合成了3 1 x m 的组装型金 磁微粒5 3 1 ，并将其成功用于抗体固定化和免疫学检测【5 4 5 5 1 。 9 图1 2f e 3 0 4 a u 核壳结构a 、