（分析化学专业论文）蛋白质的离心式微流控分析系统研究.pdf

东北大学硕士学位论文摘要 蛋白质的离心式微流控分析系统研究 摘要 本论文研究在离心式微流控分析系统中实现对牛血清白蛋白的定量分析。系 统利用芯片在伺服电机带动下做圆周运动时所产生的离心力作为液流的驱动力， 通过改变芯片旋转速度和设计不同的通道构型来调节和控制流体的速度，完成生 物试样在芯片上的混合、反应及检测。 为选择一种较好的牛血清白蛋白测定方法，对目前国内外普遍采用的b c g 法 进行重复性实验。实验结果表明b c g 法不但具有简便、快速、灵敏、试剂稳定等 优点，而且在b r i ! i 一3 5 存在的条件下，利用白蛋白与b c g 反应的特异性，可直接 对血清样品进行测定，反应过程中不产生任何沉淀。证明b c g 法非常适合于在离 心式微流控分析系统中进行蛋白质的测定。 将传统的蛋白质定量法b c g 法与离心式微流控分析系统相结合，在自行 设计和制备的微流控芯片上很好的完成了试样的混合和反应，并通过改装后的7 2 1 分光光度计对显色后的样品进行检测，绘制出符合线性规律的标准曲线，并成功 的完成了牛血清中自蛋白含量的测定。为了验证实验的准确性，与中国医科大学 附属第二医院对牛血清中自蛋白含量的测定结果进行比较，实验结果的相对标准 偏差为：一4 6 4 。 最后通过牛血清白蛋白标准溶液的回收率实验、检测仪器的精度实验和白蛋 白标准应用液在不同稀释倍数下的准确度实验，并结合上述工作，对蛋白质的离 心式微流控分析系统进行综合性评价。证明该系统是一种简便、高效、快速、准 确的蛋白质定量分析系统。相信随着微流控技术的不断发展，蛋白质的离心式微 流控分析系统必将以其突出的优越性在临床医学、环境检测、食品卫生等许多领 域发挥重要的作用。 关键词：离心式微流控分析系统生物试样蛋白质b c g 法分光光度计 东北太学硕士学位论史a b s t r a c t s t u d i e so n c e n t r i f u g a l m i c r o f l u i d i cs y s t e mo f a l b u m i n a b s t r a c t 孙ec e n t r i f u g a lm i e r o f l u i d i es y s t e mo f a l b u m i ni sak i n do f n e o t e r i ca b u m i n o i d q u a n t i t a t i v ea n a l y s i ss y s t e m 。t n t h i s s y s t e m , b i o l o g i c a lr e a g e n t s 勰p u m p e db y c e n t r i f u g a l f o r c e t h r o u g h d i f f e r e n t m i c r o c h i p c h a n n e l si n t ot h ec h e c k p o n d t o a c c o m p l i s h t h e s a m p l e sm i x i n g a n d r e a c t i o n + b yu s i n g t h e r e f i t t i n g 7 2 1 s p e c t r o p h o t o m e t e rt oc h e e kt h ea b s o r b e n c yo ft h e s o l u t i o na n dt h e nm a k es u r et h e q u a n t i t y & t h e a l b t m f i ni nb l o o ds e r u m ( b s a ) a t p r e s e n t ，b r o m o c r e s o lg r e e n ( b c o ) m e t h o d i si ne o n l m o r lu s ei nt h e q u a n t i t a t i v e t a s ko fb s a b e c a u s eb c gm e t h o di ss i m p l ea n dc o n v e n i e n t , t h ec h r o m o g e n i cr e a c t i o n w i l lc o m p l e t ei nh i g hs p e e d i na d d i t i o n ，t h e r ei sn od e p o s i t i o nd u r i n gt h er e a c t i o n p r o c e s s t h er e a g e n tw i l ln o tb l i n d # u g t h em i c r o c h i pc h a n n e ld u r i n gt h et r a n s m i s s i o n o f t h er e a g e n t s s ow ec h o s e nb c gm e t h o di nt h i sr e s e a r c hs u b j e c t c o m b i n i n gb c g m e t h o dw i 壕c e n t r i f u g a lm i c r o f l u i d i es y s t e m , u s i n gs e l f - d e s i g n a n d s e l f - m a k i n g 8 i l i c o n e c h i p ，t h es a m p l e s w e r em i x e d ，r e a c t e da n dd e t e c t e d s u c c e s s f u l l yo nt h ec h i p t h ee x p e r i m e n tr e s u l t sa r ec o r r e s p o n dw i t hs t a n d a r d i z a t i o n v a l u em a d eb yt h ea f f i l i a t e dh o s p i t a lo ft h ec h i n e s em e d i c a lc o l l e g e 。t h er e l a t i v e s t a n d a r dd e v i a t i o ni s - 4 6 4 t h ep e r c e n t r e c o v e r ya n d t h er e l a t i v es t a n d a r dd e v i a t i o no f t h es e r u ma l b u m i na r e1 0 2 5 a n d2 5 3 r e s p e c t i v e l y t h ep r e c i s i o no ft h ed e t e c t i n g i n s m m a e n tc a na l s or e a c ho u r e x p e r i m e n t a ld e m a n d s 。 b e s i d e s ，t h es y s t e mn o to n l ya d v a n c et h ea n a l y s i ss p e e d ，k e e pt h eg o o da c c u r a c y a n dp r e c i s i o no ft h ec o n v e n t i o n a lm 氍h o d ，b u ta l s oc u td o w nt h ec o n s u m p t i o no ft h e r e a g e n t sb y al a r g ea m o u n t a s s u r e d l y , t h ec e n t r i f u g a lm i c r o f l u i d i cs y s t e mo f a l b u m i n w i l lb eu s e di na l lw a l k s o f l i f eb e c a u s eo f i t s p r o m i n e n ta d v a n t a g e s 。 k e y w o r d s ：c e n t r i f u g a lm i c r o f l u i d i cs y s t e m b i o l o g i c a lr e a g e n t s s e r u ma l b u m i n b c gm e t h o d s p e c t r o p h o t o m e t e r - m 声明 本文声明所呈交的学位论文是在导师的指导之下完成的。论文中 取得的研究成果除加以标注和致谢的地方外，不包含其他人已经发表 或者撰写过的研究成果，也不包含本人为获得学位而使用过的材料。 与我一起工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中做了明确 的说明并表示谢意。 本人签名 史使焉 日期：2 0 0 廿l s 东北大学硕士学位论文第一章概述 第一章概述 1 1 微全分析系统概述 1 1 1 微全分析系统的介绍 面临2 1 世纪科技发展中提出的众多挑战，分析仪器和分析科学正经历着深刻 的变革，其中一个日益明显的发展趋势就是化学分析设备的微型化，集成化与便 携化。当前，分析仪器的发展正在出现一个以微型化为主要特征的、带有革命性 的重要转折时期。 微全分析系统( m i c r ot o t a l a n a l y s i ss y s t e m ，g - t a s ) 是一个跨学科的新领域， 它是为了适应时代的需要，由瑞士的m a n z 与w i d m e r 于1 9 9 0 年提出的，其最终 目的是通过化学分析设备的微型化与集成化，最大限度地把实验室的功能转移到 便携的分析设备中( 如各类芯片) ，实现实验室的“个人化”、“家用化”，为 此，微全分析系统也被通俗地称为“芯片实验室”( l a b c h i p ) 1 2 。它已成为目前 分析仪器发展的重要方向与前沿。微全分析系统具备独特的优越性，如：响应时 间短、试剂消耗量小，易于实现小型化和自动化，效率高，稳定性好及可在线操 作等 3 4 1 。 微流控分析技术从九十年代初研究兴起，到现在已有了多种名称，如：微流 控系统( m i c r o f l u i d i cs y s t e m ) 5 1 ， 微全分析系统( m i c r ot o t a la n a l y s i ss y s t e m ，即 g - t a s ) 6 1 ；芯片上的实验室( 1 a b o n - a c h i p ) 【7 8 】；微诊断系统( m i c r od i a g n o s t i c s y s t e m ) 9 1 ；平板芯片系统( p l a n a rc h i ps y s t e m ) 【10 ；微加工化学分析系- e ) ( m i c r o f a b r i c a t e dc h e m i c a la n a l y s i ss y s t e m ) “1 ；小型化学分析系统( m i n i a t u r i z e dc h e m i c a l a n a l y s i ss y s t e m ) 1 0 】等。尽管称谓各异，其最终目的都是把完成一项化学分析所需的 所有部件在微型化的基础上集成在一块芯片上，从而实现微型化的全分析系统。 此类装置的突出优越性在于通过芯片通道中的微流控操作，很容易在低于普通化 学分析体积几个数量级( 皮升到纳升) 的水平上，实现微机控制的自动化快速定 量操作。不仅分析速度大为提高，试样与试剂消耗也大为降低。这类芯片化实验 室将易于批量生产，因而使生产成本显著降低，这又会为分析技术的大规模普及 创造条件。 东北托学硕士学位论文第一章概述 在前述微型化分析系统的多种不同名称中，馓流控分析系统和h t a s 最能反 姨戴类系统均内含、操嚣愿理及本矮，数采耀此二名称款较多。 当前的微全分析系统可分为芯片式与非芯片式两大类，目前芯片斌是发媵重 点。在芯片式徽全分析系统中，依瓣芯片结梅及工作税遴又可分夤徽阵列芯片 ( m i c r o a r m yc h i p ) 和微漉控芯片( m i c r o f l u i d i cc 嫩p ) 。 微阵列芯片又称生物芯片，主要是以生物技术为基础，以索和结合技术为核 心，淤在芯片表甏露定一系列霹寻蛙豹识别分子簿刭为缨擒特缎。宅使用方便， 测定快速，但一般是一次性使用，并具有很强的专用性。理想中的生物芯片不但 可遥用予分子生物学的蘩础研究工作中，丽且可遴步寂用于晒床检验、法医学 检测耪巧境捡测等诸多领域中。近年来生物蕊片豹硬究工作集中于具肖核酸净到 分析功能的芯片的研究，故生物芯片又被称纂因芯片( g e n ec h i p 溅d n a 芯片( d n a c h i p f 竭。 微流控芯片，则主瑟以分析化学驷分析生物化学为纂础，以微机电加工技术 为依托，以微管道网络为结构特征。是当前微全分析系统发展的重点，它把整个 实黢室懿秘貔，畿据采耧、穆释、麴谈裁、爱应、分离、检测等集藏褒徽芯片上， 且可多次使用，因此具有更广泛的适用性。 微流掖芯片的构造一般为两片平祓材料，其中一片藏两片麴有细徽通遣，然 嚣嚣片平叛覆合程一起形成具有封鞠通道的芯片。用于制作微漉控分辑芯片的材 料有单晶礁、无定形硅、玻璃、石英、金属和有机聚合物，如：环氧树脂、聚甲 基辩浠酸擎糙( p m m a ) 、聚碳酸瑟( p c ) 耧聚二荦基磁氧浣淼( p d m s ) 等 1 9 。 硅与二氧化继具有良好化学惰性和热稳定性，在硅片上可使用光剿技术海精 度圭溆复制二维图形，并w 使用制各集成电路的成熟工艺进行加工及批艇生产。印 傻笺杂的三维缝梭，也珂後爱蕤体和表覆微热工投零进行裹糖发豹复镧。因此， 它荫先被用于制作微流控分析芯片。硅材料的缺点是易碎，价格贵，不透光，电 绝缘性能不够好，置表褥纯学行为较复杂。这些缺点限制了它在微流控芯片串靛 广泛应用。然两，由于醚具有趣好的光洁度和或熟的如工工艺，可用予加工微泵， 微阀等液流驱动和控制元器件。此外，在用热压法，模凝法制作高分子聚合物芯 片辩常籍窀割俸耀痊豹貘其。 玻璃和石英具有很好的电渗流性质和优良的光学性质，且鬯们的寝面性质， 如：润湿能力、表面吸附和表面反应性等，都有利于使用不同的化学方法对其进 彳亍表嚣改燧。健溺光刻秘亥l 毽技术可以搀擞通道鼹终亥褒玻璃帮五英上，因此玻 璃和石英村料已广泛地_ 陂用于制作微流控芯片。 - 2 东北大学硕士学位论文第一章概述 高分子聚合物具有种类多，可供选择的余地大，加工成型方便，价格便宜等 优点，非常适合于大批量制作一次性微流控芯片。用于制作微流控分析芯片的高 分子聚合物主要有三类：热塑型聚合物、固化型聚合物和溶剂挥发型聚合物。热 塑型聚合物有聚酰胺、聚甲基丙烯酸甲脂、聚碳酸脂、聚丙烯等：固化型聚合物 有聚二甲基硅氧烷、环氧树脂和聚胺脂等。将它们与固化剂混合，经升温固化便 可得到微流控芯片；溶剂挥发型聚合物有丙烯酸、橡胶和氟塑料等，将它们溶于 适当的溶剂后，通过缓慢地挥发去溶剂而得到芯片。 聚二甲基硅氧烷也称硅酮弹性体或硅橡胶，它具有：能可逆和重复变形而不 发生永久性破坏；能用模塑法高保真地复制微流控芯片；能透过3 0 0 n m 以上的紫 外和可见光；耐用且具有一定的化学惰性；无毒，廉价等特点，已广泛地应用于 制作微流控分析芯片。 从目前的发展水平看，微流控分析芯片已突破其发展初期在加工技术及基本 流控技术上的主要难关，正迸入一个开展更深入的基础研究，广泛扩大应用领域， 及深度产业化的转折时期。 微流控芯片分析系统在结构上的主要特征是各种构型的微通道网络，通过对 通道内流体的控制，完成芯片系统的分离分析功能。微流体的驱动方式是微流控 技术的基础，依据不同的要素，微流体的驱动系统可有多种分类方式。依据驱动 系统有无活动的机械部件，可分为机械和非机械驱动系统( 微泵) ；依据微泵中 流体控制部件的组成不同，可分为有阀和无阀微泵；依据微驱动系统所用驱动力 的不同，可分为液流驱动、流体动力、气压、重力、离心力、剪切力等多种驱动 手段。 基于离心力驱动流体很早就有人采用，但真正利用离心力来进行微流体驱动 和控制的则见于m a n d o u 和k e l l o g g 的工作中。在他们提出的“l a b c d ”系统中， m a n d o u 和k e l l o g g 采用光刻和模塑成型的方法在塑料圆盘上制作微管道网络，流 体被装载在靠近圆盘中心的供液池中，当圆盘由电机带动旋转时，流体就在离心 力的作用下沿着微管道网络向远离圆心的方向运动【l 4 】。 离心力驱动方式是微流控驱动技术中较为独特的一种技术，其系统利用芯片 在微电机带动下做圆周运动时所产生的离心力作为液流的驱动力。通过改变芯片 旋转速度和设计不同的通道构型可调节和控制流体的流速。一般情况下，离心式 微全分析系统的芯片为圆盘形，可在芯片上集成数十至数百个呈辐射状分布的结 构单元阵列，有利于实现微芯片的高通量分析。系统工作时，将被驱动试液放置 于靠近芯片圆心的储液池中，芯片旋转时在离心力的作用下试液通过微通道网络 一3 东北火学硕士学位论文第一章概述 流向芯片外周。其中，通道宽度范围：5 9 m 0 5 m m ，深度：1 6 t m 3 m m ，微电机旋 转速度：6 0 ，3 0 0 0 r m i n 。该系统在葱冀旋转过程中完成试裁靛混合、复斑、捡测等 过程。 1 9 9 9 年，d 嘣转等报道了一耱在芯片上条成热王有4 8 个酶努孝斤结秘擎元朗离 心式微流控芯片分橱系统，系统采用比色法毙成检测。 离心式微流控分析系统是在芯片实验室的基础上进一步研究的以离心力为试 棰驱凌力靛芯片系统。蘩予离，力送行徽滚镩驱动窍缀多优点，它在慕些方露熬 检测w 以替代电驱动装鼹，以弥补电驱动装髓的不足，如：装置简单、安全、对 样品的物璎化学住质不敏感；可用于驱动血液、尿液以及些有机溶嗣等生物流 薅，瞧可以驱动气体，羁恧适耀范围广；该驱动技术适用予驱动不网尺寸范豳的 管道中的流体；离心力驱动技术可获褥的流速范围大，调节方便。 聋前离心力驱动芯片系统存在静主要闰越是：旋转静蕊片不荔与外部酶试祥 引入系统、联用的检测系统等设备进行勰联。这一缺点在一定稷度上限制了离心 式微流控技术的戚用。 微滚羧分援系绞终冀徽型全分据系统戆主流形式，已发展或建分援辩学一个 重要的前沿领域。微流控分析芯片是微流控分析系统的核心部件，十多年来，人 们在微流撩分析芯片的研制中取得了穰大的进展，邮票大小、功能各异的微型纯、 集成位芯片不颧闷世。嬲比之下，与微流控分辑芯片配套妁高灵敏度微型检测器 的研制却相对落麟【”i 。微流控分析芯片的进样为皮、纳升级，反应通道般仪有 数卡微米竟，由于芯片裰夫港洚低了榉鑫秘试裁靛使用量，潋及耩传足发弱减夺， 发展与之相匹配的检测技术就成为芯片技术发展的关键问题。近年来国内外微流 控芯片在稔测系统方面的研究主要有；激光诱导荧光检测、光度法检测、质谱检 测( m s ) 、 乞学发毙捡测、电化学检测等陋 1 。 激光诱导荧光检测是一种旗于在暗背景下检测亮信号的检测方法，又因为激 光荧光的僚号强，所以激光诱等荧光法灵敏发商。因此，在徽全分析系统中研究 的较多。激光诱导荧光梭测器的微型他也在微机电加工( m e m s ) 技术豹支持下 迅速发展，虽然到现在为止，在大多数微流体芯片研究的实验擞中，仍然是传统 竞奄器锌檠梅的稔溺系统占主褰遣往，僵不鬻否谈，夔饕半导褡走电糨传在芯冀 上集成的逃一步发展，性能优越的微溅化、集成化的光学检测单元将会成为主流。 目前如光源、光纤、滤光部件、反射部件和光敏二极管都已实现了在微流体芯片 上戆集残。虽然激浅诱露荧光捡测爨楚嚣兹在微浚控分瓣系统斑翅较爻普遍瓣检 测器，但却远远没有达到微型化和集成化的腰求 18 1 。 。4 东北大学硕士学位论文第一章概述 由于使用激光诱导荧光检测常常需要进行荧光衍射，因此质谱( m s ) j 下在成 为微流体芯片研究中最受关注的检测器之一。通过为质谱提供良好的样品前处理 及分离途径，并通过进行的设计极大地提高处理通量，微流体芯片与m s 的联用 已经表现出了极大的应用前景和良好的技术可行性。 化学发光检测也是一种暗背景下的光检测，灵敏度高，选择性好，所以在微 流控分析中也得到应用。 电化学检测一向以其灵敏度高而著称，同时，加上超微电极的广泛使用，使 得微流体芯片与电化学检测器联用后，可望得到一个灵敏且真正集成化和微型化 的分析装置。由于微电子加工技术在电极、电路和微细结构制作上的优势，通过 对微流体电化学检测芯片系统的集成化和微型化，最有希望得到一个体积小，甚 至便携的装置。电化学检测作为一类常用的分析检测手段，在微型化、集成化方 面符合微流控分析系统的要求，这是因为：通过m e m s 技术在芯片上制作微电极 比在芯片上加工微光学器件容易的多；与光学检测法不同，电化学传感器的灵敏 度并不会因为通道几何尺寸的微型化而降低；电化学检测器只响应具有电活性的 化合物，具有较好的选择性。因此作为微流控分析系统的集成化检测方式，电化 学检测器具有独特的优势。目前在微流控分析系统中所采用的电化学检测器主要 有安培检测器和电导检测器。安培检测器在h p l c 和常规毛细管电泳用已得到较 为广泛的应用。自1 9 9 8 年w o o l l e y 等报道了第一例芯片毛细管电泳的安培检测器 以来，有关微流控芯片上的安培检测器报道逐渐增多。 由于芯片上的检测位通道尺寸过小，一般的在线光度检测难以达到需要的适 宜光路长度，因而难以应用。m a n z 等人利用硅具有良好的光反射性能，巧妙地在 硅片上设计了一种小体积光吸收检测池，仅4 n l 的体积，却有i m m 的光程，从而 获得了适宜的检测池长度体积比，解决了这一问题。它以二极管作光源，光电二 极管检测，所得吸光度与浓度的线性关系非常好，信号强度也很强，从而使紫外一 可见光分光光度检测法可用于微流控芯片上。 微流体芯片系统仍有许多问题有待解决，架构一个真正的“芯片实验室”无 疑还需要众多领域的科学工作者和工业界协同努力。而检测系统及其接口的研制 和微型化，在高处理通量中的使用无疑是此领域最为重要的一部分，如何提高其 灵敏度和处理通量将是我们都需要面临和投入大量工作的重点。 5 东北犬孝硕士学位论文第一章概遗 1 1 2 微全分攒系统发展历史及国内外发展状况 1 9 9 0 年瑞士m a n z 与w i d m e r 酋次提出微全分析系统的概念；1 9 9 4 年美国橡 树岭国家实验室r a m s e y 等改进了毛细管电泳的进样方法，提高了微全分析系统的 性能与实用性，引超了更广泛的关注；1 9 9 4 年首届g - t a s 会议在荷兰以工作室的 形式举行；1 9 9 5 年美国加州大学b e r k e l e y 分校的m a t h i e s 等人在微流控芯片上实 现了高速d n a 测序，其商业开发价值开始爨现；1 9 9 5 年9 月，酋家微流控芯片企 业，c a l i p e l t e c h n o l o g i e s 公司在美嗣成立；1 9 9 6 年m a t h i e s 等将p c r 扩增与毛细 管呶泳集成在一起，展示了微流控分析在试样前处理方面的潜力；1 9 9 7 年m a t h i e s 等又实现了微流控芯片上豹多通道毛细篱电泳d n a 测序，为微流控芯片在基因分 毒厅中的实际应用提供了踅要基础；1 9 9 9 年9 月a g i l e n t 与c a l i p e l 联合研制的首台 微滚控芯片商晶化仪器a g i l e n t 2 1 0 0b i o a n a l y z e r 开始在市场销售；2 0 0 1 年l o 月第 五羼x - t a s 会议在美国c a l i f o r n i a 举行。 在我国，2 0 0 1 零5 舅方肇 仑等圭持嬲开丁“微全分掇系统”香山科学会议；2 0 0 2 年卣方嫠捻主持的鼹家自然科学基金委重大项题“微流按生化分摄纂础磺究”开始 癌动；2 0 0 2 年8 月在j e 索举行了我强蓉届微流控分摄学术会议。 1 1 3 微全分析系统的主要应用领域及发展趋势 微芯片分祈系统的出现不仅可使珍贵的生物试样与试稍消耗大大降低弱微升 甚至纳升级，而且使分析逮度成十倍、百倍提高，费用大大下降，驭而为分析灞 试投术普及到千家万户创造了条件。 从微流控芯片的分析佳能看，其未来的应用领域将十分广泛，但目前的重点 显然在生物医药方面。除此之外，环境监测、食品卫生、刑事科学及酗防等方筒 也会成为重要的应用领域【l 辨。相信不久的将来，以微流控蕊片为核心的各种便携 式的诊断仪器瑚l 将取代当前化学分析实验蜜的很多设备，能监测自身生化指标及 基盼变异，食品卫嫩及环境状况的便携式“个人化实验寝”将可能成为现实。 微仝分析系统的主要发展趋势为1 1 3 i ： 继微阵列生物芯片之后，徽流控分析芯片已成为微全分析系统当前的发展前 沿，其会议论文数占总数的8 7 ，而前者仅占约4 ；微流控分析芯片正从基础 与应用基础研究阶段进入大规模产业化及市场开发阶段； 微流控分椭蕊片从以毛细管电泳分离为核心分析技术发展到液液萃取、过 滤、无膜扩散等多神分离手段； 6 东北大学硕士学位论文第一章概述 微全分析系统从以电渗流为主要液流驱动手段发展到以流体动力、气压、重 力、离心力、剪切力等为液流驱动的多种手段； 微流控分析芯片从单道检测发展到多重平行检测，芯片毛细管电泳分离最多 已达到9 6 条通道同时进行d n a 测序； 微全分析系统正从以激光诱导荧光及光度法为主要检测器发展到多种检测手 段，如：电化学、质谱、原子光谱、光声光谱、化学光谱等； 微全分析系统正从单纯分析检测发展为包括复杂试样前处理的高功能全分析 系统： 微全分析系统正从成分分析工具发展到包括在线检测的微化学反应合成手 段，在新药物筛选中显示出强大的生命力； 从一般成分分析发展为单分子、单细胞分析【2 ”。 1 2 蛋白质的定量分析概述 1 2 1 蛋白质定量测定的意义及进展 蛋白质的功能很多，它与营养、细胞结构、酶、激素、病毒、免疫、物质的 逆转、遗传、生命的起源和生物进化等有密切的联系，它是生命现象的物质基础。 蛋白质的分离与定性定量分析是生物化学和其它生物学科、食品检验、临床检验 诊断疾病、生物药物分离提纯和质量检验中最常用的手段，也是临床诊断疾病及 检验疾病治疗后的健康状况的重要指标。蛋白质的定量分析方法研究在国际上一 直非常活跃2 3 州。 测定蛋白质含量的方法很多，目前研究最多、应用最广、操作较为简便的分 子光谱分析法是吸光光度法、荧光光度法和新进展起来的共振光散射分析法等瞄 2 6 1 。其中因光度法具有简单、快速、重现性好等特点而倍受关注。 测定蛋白质含量常用的吸光光度法包括双缩脲法、l o w r y 法以及基于蛋白质与 染料结合的光度法等口7 1 2 8 f 2 9 1 。 双缩脲法是基于蛋白质的双缩脲反应的方法。在强碱性溶液中，蛋白质与 c u s o 。反应生成紫红色配合物，最大吸收峰位于5 4 0 n m 处，在一定范围内，吸光 度值与蛋白质浓度成正比。本法的缺点是灵敏度不高，检出限为0 2 1 7 m g m l ， 干扰也比较大口”。 l o w r y 法是测定蛋白质含量的经典方法【3 1 】。反应产物的最大吸收峰位于7 5 0 1 埘 处，在一定条件下，吸光度值与蛋白质浓度成正比。方法的线性范围较宽( 5 0 0 1 0 0 0 7 东北大学硕士学位论更第一章概进 m g m l ) ，检出限为0 1 m g m l ，操作较简便，但也存在灵敏度较低等不足之处释玉 3 3 1 。 生物大分子与小分予配体相互作用的研究，特剐是有机染料与蛋白质结合形 成有饿探针，用光度法勃需分离帮可遴霉亍蛋辩质的定量铡定，方法篱谨、侠遮、 准确，已在生物化学和i 瞒床分掇中得到广泛戍翊。在蛋白质的临床分耄旰中，基于 蛋白质与染料结合的反应是应用最为广泛的光度分析法。该法通常为测定白蛋白 懿方法，这跫霾兔裔蛋南含鸯碱性氨蕊酸残蘩，在羧牲条 牛下带正邀蕊，具鸯与 阴离子染料结合的能力，而白蛋白以外的其它蛋白质缺乏这种性璇。在对自蛋白， 尤其楚血清白蛋白和尿岛蛋白的测定中，染料结合法具有简便、侠速、经济、准 确豹特点，麸露褥刘广泛筑瘦用。 染料结合法兴起于6 0 年代，最早报道用于蛋白质定量的染料有溴酚蓝、溴甲 酚绿、阐溪黼蓝、亮绿等瑟4 】。蘸前，谯染释结合泫溺定蛋海厦静方法申使厨最多 的染料主要肖以下几类： 、酸性三苯甲烷类染料 溴荦酸绿( b r o m e r e s o lg r e e n ，b c g 法) ：在p h = 4 ，2 醛，b c g 与爨是质的结 合反成使溶液颜色由黄变绿，最大吸收峰由4 4 5 n m 移至6 2 8 n r n 处，吸光度值与蛋 白质浓度成正比。方法暴有简镁、侠遽、灵敏高、精密度好、试帮稳宠等蒋点。 不是之处在予b c g 与自骚自反应的j # 特异性，为了消除予扰，必须对反应时间进 行严格控制。有人利用这种非特异反应，将b c g 法用于总蛋白的测定1 2 卯。 漠甲酚紫( b r o m c r e s o l p u r p l e ，b o p 法) ：a n d r e w 涯疆tb c p 与蠹鬃鑫反寝兹 特异性。b c p 法测定白骚自具有特异性高，球蛋白干扰小，瞬间反应，星色稳定， 线性关系及重复性好，干扰因素少，受温度变化( 8 。3 0 ) 影响旗微等特点，艇其 灵敏凄低予b c g 浚。 考马斯亮蓝a 2 5 0 ( c o o m a s s i eb r i l l i a n tb l u eg - 2 5 0 ，c b b 法) ：c b b 在酸性溶 液中星红棕色，与蛋白餍结合衍变为簸色，最大吸收峰扶4 6 5 n m 移至5 9 5 n m ，在 一寇条终下，蛋囊质的浓度与i 嫒光度馑成正比。该法灵敏度高，操作简便，照色 稳定，反应5 m i n 内完成，重复性好，干扰少，近年来已被广泛应用。方法的不足 之凳在于染髓蔽嚣 e 较严重，线牲范溺较窄，爱褒特异搜不努。并且爨盘矮- c b b 的复合物罴不溶的，极大地影响了反应的准确度i 2 “”j 。 溴酚蓝( b r o m p h e n o l b l u e ，b p b 法) ：b p b 与自蛋白的结合反应导致溶液吸收 光落发生变纯，簸大吸收峰篷予6 1 0 r i m 处，在一是条 孛下，吸光度值与白蛋自的 浓度成正比。反戍速度快，稳定性好。在b p b 试剂中加入聚氧化乙烯月楗醚 - 8 东北大学硕士学位论文第一章概述 ( b 州3 5 ) 可提高反应的灵敏度，并抑制球蛋白与b p b 的作用。 邻苯二酚紫钼( v i ) ( p v - m o 法) ：在p h = 3 0 时，p v - m o 络合物与蛋白质发 生结合反应，溶液由棕黄色变为绿色，最大吸收峰位于6 8 0 n m 处，其强度与蛋白 质浓度成正比。方法简便快速，灵敏度比c b b 法高。 铬天青s a 1 ( h i ) ( c a s a 1 法) ：在p h = 3 7 的醋酸缓冲介质中，c a s 与a l ( i i i ) 及人血清白蛋白( h s a ) 形成三元络合物，最大吸收峰位于6 3 0 h m 处，并 与h s a 浓度成正比。方法简便快速，线性范围宽( 1 2 5 2 5 m g l ) ，灵敏度比b c g 法高8 倍。 二、酸性口占吨染料 邻苯三酚红一钼( ) ( p r m o 法) ：p r - m o 络合物在酸性条件下为红棕色，最 大吸收峰在4 6 7 n m 处，当其与蛋白质反应后变为蓝色，最大吸收峰移至5 9 4 m a a 处， 在6 0 0 n m 处的吸光度值与蛋白质的含量成正比。方法灵敏度高、样品用量少、线 性范围宽、操作简便、试剂不吸附比色池，但试剂对白蛋白和球蛋白的响应不一 致。在p r m o 络合物中加入适量的十二烷基硫酸钠( s d s ) ，使p r m 同球蛋白和 白蛋白的反应灵敏度有所改善f 3 6 1 。 藻红( e r y t h r o s i nb ，e b 法) ：在p h = 3 0 左右的柠檬酸柠檬酸钠缓冲溶液中， e b 与蛋白质反应导致溶液的最大吸收峰由4 9 8 n m 和5 3 0 n m 移至5 4 5 n m 处，吸光 度值与蛋白质含量成正比。方法简便、快速、准确、重复性好、干扰小，但对反 应酸度要求较为苛刻口”。 3 ，4 ，5 ，6 四氯茜素紫铝( v i ) ( t c 1 g a l l m o 法) ：在t r i t o nx 1 0 0 和p v a 存 在下，t c 1 g a l l m o 络合物与h s a 的反应导致溶液在6 4 0 n m 处有一最大吸收峰， 吸光度值与h s a 在0 - 1 5 m g l 范围内成正比。 4 ，5 - 二溴苯基荧光铜一钛( v i 法) ：在p h = 2 7 3 7 的柠檬酸钠一盐酸缓冲溶液 中，在t w e e n8 0 存在下，4 ，5 - 二溴苯基荧光铜钛( ) 络合物与蛋白质发生结 合反应，最大吸收峰位于6 0 5 n m 处，在一定条件下，溶液吸光度值与蛋白质浓度 成正比。线性范围为0 - 6 m g l ，干扰小，操作简便，稳定性好，可不经分离直接用 于尿液中自蛋白的测定。 三、羟基葸醌类化合物 在酸性条件下，茜素红与蛋白质的反应产物在5 4 0 n m 处有最大吸收，且吸光 度值与蛋白质浓度成正比。反应在5 m i n 内完成，颜色稳定1 h 以上，线性范围宽 ( o 一1 4 0 m g m l ) ，干扰小，操作简便，反应特异性强。在p h = 4 3 的b r i t t o n r o b i n s o n 缓冲溶液中，茜素红s 与h s a 结合生成红色复合物，吸光度与h s a 浓度呈正比， 9 东北走学硕士学位论文第一章概述 复合物的最大吸收峰比茜素红s 的最大吸收峰红移1 1 0 n m ，检出限为3m 以。 汹、变瞧酸双援氮类耽舍黪 文献报道了变色酸双偶氮类化合物，如偶氮月* i i i 、偶氮磺i i i 及溴偶氮磺i i i ， 戬及氯磺酚s 与蛋白质彳乍用的梳淫。灵敏度岛b c b 发褶邋f 3 墨涮。 近年来还发展了一些新的微量蛋融质定爨法。例如： 基于蛋白质和银相结合的能力来定量测定蛋白质。最大吸收峰位于4 2 0 h m 处。 方法院c b b 法灵敏1 0 0 结，蛋鑫霞锻复合物彩藏浚，显氛稳定。 利用蛋白质与胶体禽亲和，建立了用胶体金测定微量骺白质的方法，最大吸 收峰位于5 9 5 m n ，可以测定2 0 r i g 水平的蛋自质质爨。若对此方法加醣改进，袋敏 度可提裹8 ，l o 接。 在特定条件下，一种吡啶偶氮衍生物2 ( 5 溴吡啶偶氮) 5 ，( n 丙基n 磺丙 基氨蒺) 苯酚( 5 ，转r _ p a p s ) 与c o ( i i ) 及h s a 形成三元络台耪，萁畿大啜收峰 位于6 3 6 n m 处，搬此建立了用5 - b r - p a p s c o ( i i ) 试剂测定h s a 的离灵敏发、 高选择性的分析方法，其校正曲线范围为0 - 7 0 m g m l ，灵敏度比p r - m o 法高6 倍。 浆雳鑫符合残豹承溶性逐缎乡 试裁七次擎基纯饕，在逅红努送测盘滂蛋鑫矮。 染料的吸收光谱及荧光光谱均位于近红外区，而蛋白质在这个波段无吸收，因而 具有背景予扰小、灵敏度高等优点，梭出限为5 0 x1 0 g g m l 。 p h = 2 0 。3 。4 的缓 孛分藤中，在t r i t o nx 1 0 0 存在下，月二溴羟基苯基荧光锶一 钼( v i ) ( d i b r o m o h y d r o x y p h e n y lf l u o r i n e - m o l y b d e n u m ( ) ) ，d b h p f m o ( v i ) 络 台耘灏定蛋舀震，辩b s a 和h s a 的稔密陵分澍秀7 0 l o - 9 9 m l 帮8 0 1 0 - g g m l ， 方法不仅灵敏度离，而且几乎凭干扰，对培葬细菌、细胞匀浆及人体液中蛋囱质 的测定结果与c b b 法相符台。 1 2 2 蛋白质的离心式微流控分析系统 照然蛋白质的定量测定在临床医学、科学研究、食品分析、环境傈护等穰多 领域内褥到了充分弱发袋，毽怒疆蓍辩学技零懿飞速发袋，传统熬分掇方法葺【1 分 析仪器已不能满足高科技发展的需要。9 0 年代兴起的微流控分析技术，把整个化 学实验室的功能，包括采样、稀释、施试帮、反应、分离、检测等集成在一个几 乎方厘米到几十乎方厘米的微芯片上，裹效、快速的完成试样的分离、分辑及检 测，适应了化学分析设备的微型化、集成化与便携化这一发展趋势【4 0 l 。 遂年来，各秘各祥瀚样品簸淫与传输系统已经与离照经讫攀分丰斤仪器稻没备 相结合，微芯片的研究已突破其发展初期在加工技术及基本流控技术上的主要难 。l o 东北大学硕士学位论文第一章概述 关，正在进入一个深度产业化的转折时期，微流控芯片发展如此快速，直接取决 于它的商业化前景【4 l j 。 将传统的蛋白质定量方法与离心式微流控分析系统相结合，是一种新颖的蛋 白质定量分析系统。在此系统中，通过微流控芯片的高速旋转，使试样在微流控 芯片上完成不同的生物或化学反应过程，并对其产物进行分离和分析，最后在检 测系统中进行芯片上的在线检测，从而在微流控分析系统中完成蛋白质的定量分 析。这种结合既可以使试剂的消耗大大降低到微升甚至纳升级，并能够高效、快 速的完成试样的分离、分析及检测。该系统成本低，芯片加工技术简单，且易于 实现快速、大批量检测，相信随着对蛋白质的离心式微流控分析系统研究工作的 不断深入，该系统将以它突出的优越性在临床医学、环境检测、食品卫生等众多 领域发挥其重要的作用。 1 3 本课题的意义及目的 1 3 1 实验意义 血清蛋白是人体和生物体内的一种重要生命物质，它在体液中的含量 可作为人体营养健康、疾病诊断等的重要指标，因此蛋白质的定量测 定是生物化学、药学、食品及临床分析中常见的内容，也是临床诊断 疾病、及检验疾病治疗后的健康状况的重要指标 4 2 1 。 使用微流控分析系统进行蛋白质的定性分析，适应了化学分析设备微 型化、集成化与便携化的发展趋势。仪器的微型化所带来的优点是： 显著降低制造成本；易于运输与搬运；节省实验室空间、减少试剂的 消耗量；除此之外，集成化还将使得仪器操作简便，适宜于高通量实 验室的工作； 微流控技术所具备的独特优越性，将使蛋白质的离心式微流控分析系 统在科学研究、医疗保健、药物筛选、国防建设、环境保护等领域发 挥重要作用，具有很好的市场前景。 1 3 2 实验目的 酸性介质中，在有非离子去垢剂聚氧化乙烯月桂醚( b 坷3 5 ) 存在 的条件下，利用分光光度法检测牛血清中自蛋白的含量； 研究b c g 法缓冲体系稳定性对实验准确度的影响； 东北大学硕士学位论文第一章概述 三、将离心式微流控分析系统与分光光度法相结合，在微流控芯片上实 现试样的混合、反应及检测。并通过牛血清白蛋白回收率实验、检 测仪器精度实验，对蛋白质的离心式微流控分析系统进行综合评价。 1 2 东北大学硕士学位论文第二章t i c 6 法测定牛血清白蛋白含量 第二章b c g 法测定牛血清白蛋白含量 2 1 实验原理 血清白蛋白的测定是临床实验室最普通的检查项目之一。检测方法主要有电泳 法、盐析法和染料结合法等。电泳法操作繁琐，即使采用快速的醋酸纤维薄膜电 泳，也不能适应临床大批标本的检测需要。盐析法虽较电泳法简单，但仍需沉淀、 离心分离等步骤，手续麻烦，效果尚不十分满意。 染料结合法是近十余年来研究较多的一项新技术，所用染料主要有甲基橙、2 一 ( 4 羟偶氮苯) 苯甲酸( h a b a ) 、溴甲酚紫及澳甲酚绿等。但所得结果与盐析法 或电泳法相差较大，水杨酸盐、胆红素及血红蛋白对测定有显著干扰，常常需要 作空白校正，影响它在临床上的广泛应用。d o u m a s 报道一种用b c g 测定血清白 蛋白的新方法，他在试剂中加入种非离子去垢剂聚氧化乙烯月桂醚( b 两一3 5 ) ， 增进白蛋白b c g 复合物的溶解度，可用于直接测定血清白蛋白含量。 溴甲酚绿化学名称为：四溴间位甲酚磺酞，为细小微黄色结晶，玫瑰红或棕色 粉末，易溶于醇及稀碱液，微溶于水，是一种p h 指示剂，其变色域为3 8 ( 黄) 一5 4 ( 蓝) 。 依据溶液p h 值小于蛋白质等电点时，蛋白质质子转化为阳离子，可与一些酸 性染料阴离子相互作用改变染料吸光度，借以测定蛋白质含量【4 3 4 4 l 。b c g 在p h = 4 2 环境中，在有b d j 3 5 存在时，可与白蛋白形成蓝绿色复合物，最大吸收峰由4 4 5 n m 移至6 2 8 n m 处，吸光度值与白蛋白浓度成正比，可用于测定血清中自蛋白的含量 【2 5 - 4 5 ，4 6 - 4 7 1 2 2 实验试剂 一、 聚氧化乙烯月桂醚( b r i j 3 5 ) a r r t r e s c o ，高级纯】( ( c 2 h 4 0 ) 。c 1 2 h 2 6 0 ) 二、 柠檬酸 沈阳市诚晟试剂厂，分析纯】( c 6 h 8 0 7 h 2 0 ) ； 三、 柠檬酸钠【沈阳市新西试剂厂，分析纯】( c 6 h 5 n a 3 0 7 2 h z o ) ； 四、溴甲酚绿( b c g )