河豚鱼安全食用评价研究论文.pdf

山东大学硕士学位论文 河豚鱼安全食用评价研究 研究生:李泰然 导师:徐凌中 副教授 王茂起 研究员 摘要 河豚鱼是我国海域常见的一种有毒鱼类， 数量非常丰富。因其肉 味鲜 美而喜食者众多，河豚鱼是一种条件可食性鱼种，误食该鱼造成食物中毒 甚至死亡时有发生。 为了开发我国丰富的河豚鱼资源，掌握我国常见河豚鱼的带毒状况， 同时为遴选可供鲜食的河豚鱼品种和确定相应的捕捞海域，为安全食用鲜 河豚鱼提供科学依据， 我们对卫生部组织的河豚鱼毒性调查活动资料进行 了 系统的数据分析，该项调查是在 1 9 % 年 1 月1 2月采集的我国沿海的 1 6 个品种的 天然河豚鱼， 共3 5 4 尾及养殖红鳍东方豚和养殖假睛东方豚各 9 尾，通过i t x的直接e l i s a检测法对组织部位进行了t t x含量检测。 研究发现， 河豚鱼含毒 在组织部位间差异显著， 肝脏和性腺的含毒量很高， 组织部位别的毒力大小顺序为卵巢、肝脏、 皮、肌肉，肌肉一般为无毒或 弱毒。 河豚鱼毒力在品 种间 存在很大的差异，天然河豚鱼中 肝脏属于无毒 的品 种是红鳍东方豚， 黄鳍东 方豚、 铅点东方豚和紫色东方豚的 肝脏最大 毒力为弱毒， 肝脏属于强毒的品种是暗纹东方豚、 横纹东方豚、假睛东方 豚、菊黄东方豚、虫纹东方豚、墨绿东方豚和双斑东方豚。墨绿东方豚的 性腺为无毒，菊黄东方豚和虫纹东方豚的性腺含有剧毒，毒素含量最大值 分 别 是1 2 4 4 .7 m u / g 和2 0 7 7 .7 m u /g ， 其 它品 种为 弱 毒 或 强 毒。 皮 和 肌肉 中 ， 菊黄东方豚的 皮和虫纹东方豚的 肌肉为强毒，而且带毒率较高， 其它品 种 的河豚鱼皮和肌肉属于无毒或弱毒。腹刺豚属河豚鱼中除月腹刺豚肝脏和 性腺有强毒外， 其余均为无毒。头纹宽吻豚的肝脏性腺有强毒，皮和肌肉 无毒. 养殖红鳍东方豚 和假睛东 方豚的 各组织部位毒力均很低， 属于无毒。 对河豚鱼的鱼种、地域、 季节与毒力关系进行了分析研究表明河豚鱼 组织部位的毒力与鱼种、 地域、 季节均有非常密切的关系，鱼种间的毒力 山东大学硕士学位论文 差别有极显著性惫义 ( p 0 .0 0 0 1 ) ，河豚鱼在地域间的毒力差别也很显著 ( p 0 .0 1 ) ，除虫纹东 方豚的 地域间 毒力是长江以 北高于长江以南海域外， 其它均为长江以南高于长江以北的。季节间毒力差别有显著性意义 ( p 0 .0 1 ) ， 冬季河豚鱼的毒力较大， 显著高于其它季节 ( p 0 .0 5 ) ， 而秋季 河豚鱼的毒力在南北地区均比 较低. 通过本次调查分析结果，初步确定东方豚属的红鳍东方豚、墨绿东方 豚、黄鳍东方豚、假睛东方豚、暗纹东方豚、双斑东方豚和紫色东方豚及 腹刺豚属的棕斑腹刺豚、 暗鳍腹刺豚和淡鳍腹刺豚1 0 种天然河豚鱼属肌肉 无毒品种， 可以用于鲜食。 养殖河豚鱼的毒性很低，也可作为鲜食的鱼种。 本次调查发现，河豚鱼的毒力与生物学特征有一定的关系，尤其与肝 脏重量和性腺重量有密切关系， 提示可能随着肝脏和性腺的成熟，毒性有 增强的趋势。研究还发现， 河豚鱼的组织部位毒力间存在着相关性，说明 毒素在鱼体中可能有迁移转化的过程。 关键词:河豚鱼河豚毒素 ( ttx) 山东大学硕士学位论文 t he e v al ua t i on s t udy of s af e us e of p uf f e r f i s h i n chi na p os t gra du a t e: li t a i r a n s u p e r v i s o r : a / p r o f e s s o r x u l i n g z h o n g p rof e s s o r wa n g ma o g i abs tract p u ff e r f i s h i s a k i n d o f t o x i c f i s h t h a t i s c o m m o n l y s e e n i n t h e 呐a c e n t w a t e r s o f o u r c o u n t ry a n d r i c h i n r e s o u r c e . t h e p u ff e r f i s h c a n b e c o n s u m e d u n d e r c e r t a i n c o n d it i o n s , a n d i t i s w i d e l y c o n s u m e d a s a d e l i c a c y i n m a n y c o u n t r i e s d e s p i t e i t s l e t h a l p o i s o n - t e t r o d o t o x i n , b u t u n f o r tu n a t e ly p o i s o n i n g o r f a t a l i ty o f t h e d i n n e r s r e s u l t i n g fr o m e a t i n g t h e p o i s o n o u s p u ff e r f i s h o c c u r s e v e ry y e a r . t o e x p l o i t t h e v a s t r e s o u r c e o f p u ff e r f i s h i n o u r c o u n t r y a n d m a s t e r t h e t o x i c i ty o f t h e c o m m o n p u ff e r f i s h , t o s e l e c t t h e e d i b l e s p e c i e s a n d m a k e s u r e o f t h e fi s h i n g s e a s o n s a n d r e g i o n s , a n d t o p r o v i d e t h e s c i e n t i fi c b a s i s f o r t h e s a f e c o n s u m p t i o n o f t h e fr e s h p u ff e r f i s h , w e a n a ly z e d t h e d a t a o f t h e fi e l d s u r v e y o n t o x i c i ty o r g a n i z e d b y m i n s t ry o f h e a l t h . 3 5 4 s p e c i m e n s fr o m 1 6 w i l d s p e c i e s a n d 1 8 s p e c i m e n s fr o m 2 c u lt u r e d s p e c i e s w e r e c o l l e c t e d fr o m t h e c o a s t a l w a t e r s fr o m j a n u a ry t o d e c e m b e r i n 1 9 9 6 ,th e n a l l t h e p u ff e r f i s h w e r e as s a y e d f o r t h e a n a t o m i c a l d i s t r i b u t i o n o f t i x w it h t h e m e t h o d o f e l i s a ( e n z y m e - l i n k e d i m m u n o s o r b e n t a s s a y ) . t h e m a i n fi n d i n g s a r e t h a t t h e t o x i c ity i s o f s i g n ifi c a n t d i ff e r e n c e a m o n g o r g a n s , t h e l i v e r a n d o v a r i e s a re h i g h l y c o n c e n t r a t e d i n t o x i c i t y ,th e l e v e l s o f t o x i c it y i n d i ff e r e n t o r g a n s a r e r a n k e d a s f o l l o w i n g : t h e o v a r i e s , l i v e r s k i n ,a n d m u s c l e s ,t h e re i s u s u a l l y a s m a l l a m o u n t o f t o x i n in t h e m u s c l e s , s o m e t i m e s t h e re i s n o t o x i n a t a l l . a l s o ,t h e re a re m a r k e d d i ff e re n c e s a m o n g d i ff e re n t s p e c i e s ,t h e l i v e r o f t h e w il d s p e c i e s t x a n t h o p t e r u s i s n o n - t o x i c ;t h e s p e c i e s w h o s e l iv e r i s w e a k l y t o x i c a re t x a n t h o p t e r u s , t a l b a p l u m b e u s , t p o r p h y r e u s ; a n d t h e s p e c i e s w h o s e l i v e r i s h i g h l y t o x i c a re t o b s c u r u s , t o b l o n g u s , t p s e u d o m m u s , t b a s i l e v s k ia n n s , t b im a c u l t u s , t j l a v i d u s a n d t v e r m i c u l a r . a s f a r a s t h e o v a r i e s a re c o n c e rn e d , t h e t b a s i l e v s k i a n u s h a s n o t o x in , 不 j l a v id u s a n d t v e r m i c u l a r is a re e x t re m e l y t o x i c , a n d t h e m a x i m u n a m o u n t s o f t h e t o x in a re s e p a r a t e l y 1 2 4 4 .7 m u / g a n d 山东大学硕士学位论文 2 0 7 7 .7 m u l g , t h e o t h e r s p e c i e s a r e w e a k l y o r h i g h l y t o x i c . w h e n c o m in g t o t h e s k i n a n d m u s c l e s , t h e s k i n o f t ,j l a v id u s a n d t h e m u s c l e s o f t v e r m i c u l a r is a r e h i g h l y t o x i c , m o r e o v e r t h e f r e q u e n c y o f b e i n g t o x i c i s h i g h , b u t t h e s k i n o r m u s c l e s o f t h e o t h e r s p e c i e s a r e w e a k l y t o x i c o r n o n - t o x ic . t h e s p e c i e s o f l a g o c e p h a l u s a r e n o n - t o x i c e x c e p t t h a t t h e l i v e r a n d t h e o v a r i e s o f l . l u n a r i s a r e h i g h l y t o x i c . f o r a .h y p s e l o g e n i o n , t h e l i v e r a n d o v a r i e s a r e h i g h l y c o n c e n t r a t e d i n t h e t o x i c ity , w h i le t h e s k i n a n d m u s c l e s c o n t a i n s n o n - t o x i c . a l l t h e o r g a n s o f t h e c u l t u r e d t r u b r i s a n d i p s e u d o m m u s a r e n o n - t o x i c . w e a k l y t o x i c , b e l o n g i n g t o w e s t u d ie d t h e r e l a t i o n s h i p o f t h e t o x i c i ty t o s p e c i e s , r e g i o n s a n d s e a s o n s , a n d f o u n d t h a t t h e t o x i c i ty o f d i ff e r e n t o r g a n s h a s c l o s e re l a t i o n s h i p w i t h t h e s p e c i e s , r e g i o n s a n d s e a s o n s . t h e t o x i c i ty v a r i e s m o s t s i g n i fi c a n t l y a m o n g t h e s p e c i e s ( p 0 .0 0 0 1 ) , i t a l s o v a r i e s r e m a r k a b l y f r o m r e g i o n t o r e g i o n ( p 0 .0 1 ) , t h e t o x i c i ty o f t h e p u ff e r f i s h i n t h e o c e a n s t o t h e s o u t h o f t h e c h a n g j i a n g r iv e r i s h i g h e r t h a n t h a t t o t h e n o r t h o f t h e c h a n g j i n g r i v e r e x c e p t t v e r m i c u la r i s . i n a d d it io n , t h e r e a r e s i g n i fi c a n t d i ff e re n c e s a c c o r d i n g t o t h e s e a s o n s ( p 0 . 0 1 ) , t h e a m o u n t o f t o x i n i s l a r g e r i n w i n t e r t h a n t h a t i n t h e o t h e r s e a s o n s ( p 0 .0 5 ) a n d t h e t o x i c i ty i s l o we r i n b o t h t h e n o r t h e rn a n d s o u t h e rn a r e a s i n a u t u mn . o n t h e b a s i s o f t h e a n a l y s i s r e s u l t s w e c a n ma k e s u r e t h a t t h e m u s c l e s o f t h e f o l l o w i n g 1 0 w i l d s p e c i e s a r e n o n - t o x ic a n d c a n b e c o n s u m e d , t h e y a r e f u g u s t .b a s i l e v s k i a n u s ,t r u b r i p e s , t . b i m a c u l a t u s , t .x a n t h o p t e r u s , t .p s e u d o m m u s , t .o b s c u r u s , a n d t h e g e n u s l a g o c e p h a l u s s l .w h e e le r i , l .s p a d i c e u s a n d l _ g l o v e r i . t h e m u s c l e s o f t h e c u l t u r e d s p e c ie s t r u b r ip e s a n d t .p s e u d o m m u s a r e n o t u s u a l l y d a n g e ro u s l y t o x i c , s o t h e y a l s o c a n b e c o n s u m e d . t h r o u g h t h e s t u d y o f t h e s u r v e y w e c a n fi n d t h a t t h e t o x i c i ty i s i n c o r re l a t i o n w it h t h e b i o l o g i c a l c h a r a c t e r i s t i c s o f t h e p u ff e r fi s h , e s p e c ia l l y w i t h t h e w e ig h t o f t h e l i v e r a n d o v a r i e s , t h e m a t u r e r t h e l i v e r a n d o v a r i e s a re ,t h e l a r g e r a m o u n t s o f t o x i n t h e re t e n d t o b e l n a d d i t i o n t h e re i s r e l a t i o n s h i p a m o n g d i ff e re n t o r g a n s w h i c h d e m o n s tr a t e s t h a t th e re m a y b e a p r o c e d u re o f t r a n s f e re n c e a n d t r a n s f o r m a t i o n o f t h e t o x i n i n t h e b o d y . k e y w o r d s : p u ff e r fi s h t e ro d o t o x i n ( t t x ) 山东大学硕士学位论文 河豚鱼安全食用评价研究 研究生:李泰然 导 师，徐凌忠 副教授 王茂起 研究员 月 u舀 河豚鱼是指硬骨鱼纲豚形目豚科的各属鱼类，体型似 “ 豚”，常在河 口 捕到而得名 川 。产 于我国的 河豚 鱼种类有4 0 余种， 分隶于8 属，以东 方豚 ( f u g u ) 为 典 型 代 表e1 ， 我 国 的 河 豚 鱼 广 泛 分 布 于 各 江 河 下 游 和 近 海 区 ， 其 中 以 长江下游等地为主要产卵场所。 河豚鱼资源极其丰富，据估计，每年的 可捕量在1 0 万吨以上。国内养殖河豚鱼的面积已达5 万亩， 而且有不断发展 的趋势。 河 豚 鱼是 近 海 底 栖肉 食 性 有 毒 海 产 鱼 类 3 ， 其内 脏 有 剧 毒 ， 人 畜 误 食 后 均 能 致 死。 毒 性 物 质 主 要 是 河 豚 毒 素 4 ,5 ) ( t e t r o d o t o x in , t t x ) ， 它的 分 子 量为3 1 9 ，能溶于水， 不溶于乙 醇及普通有机溶剂， 理化性质比 较稳定， 耐 高温及日 光暴晒，一般的家庭烹饪过程几乎不破坏河豚毒素，也不能使毒 性减弱。 河豚毒素对人的 最小 致死量约为1 万单位洲u)，即 0 . 5 毫克 / 6 0 公斤 体重。河豚毒素的毒理作用主要是阻遏神经与肌肉的传导， 河豚毒素进入 机体后迅速使神经末梢及中枢麻痹。误食有毒河豚鱼后1 -2 小时有呕吐、 口 、唇、 舌尖、 指感觉发麻等初步中毒症状，随后舌端感觉迟钝， 步履言 语困难， 进而侵犯中枢神经而导致呼吸困难， 血压下降终至致死。 致死时 间 为1 . 5 - - 8 小时， 一般在 4 - 6 小时。 所以 长期以 来， 河豚一直是我国 食品 卫 生部门 禁止鲜食的鱼类之一， 1 9 9 0 年的 水产品卫生管理办法明 文规定: 河豚鱼有剧毒，不得流入市场，应剔出集中妥善处理，因特殊情况需进行 加工食用的 应在有条件的 地方集中 加工，在加工处理前必须先去除内 脏、 头、皮等含毒部位， 洗净 血污， 经盐腌晒干后安全无毒方可出 售， 其加工 废弃物应妥善销毁. 河豚虽含剧毒毒素， 但因其肉 味鲜美， 营养丰畜而久为 广大人民 群众 山东大学硕士学位论文 所喜好，国内 外沿海地区食用河豚 鱼的历史 可追溯到很早的年代，日 本在 明 治维新后取消了禁食河豚鱼的 规定而代之以 专职调理师掌勺的特许专 卖 制度，我国民间食用河豚鱼的历史也非常悠久，并在一些地区形成了 河豚 鱼特有的饮食文化。河豚鱼有很高的经济价值，它的综合利用率较大，因 而近几年在国外市场上售价倍增，日 本红鳍东方豚每公斤市场价为2 万日 元， 而且需求量很大，1 9 8 7 年日 本的河豚进口 量增到1 7 0 。 吨，我国是主要 的出口国 之一。长期以 来，我国虽有禁止鲜食河豚鱼的规定，实际的状况 却是屡禁难止，我国海域每年都有较大的河豚捕捞量，除按照外贸合同出 口 外， 大量的河豚鱼捕捞上岸后被非法贩卖，流入市场，每年因误食或加 工不当有毒河豚而引起的食物中毒甚至死亡己成为严重的食品卫生问题。 面对当前日 益繁荣的市场经济，开放河豚鱼市场的呼声日益高涨的形势， 卫生部门如何在加强河豚鱼管理、保障人民群众生命安全的同时，又要使 河豚鱼这一宝贵水产资源得到充分利用已成为当前紧迫的任务，因而全面 了 解河豚鱼的含毒状况和毒性变化规律以及影响因素，才能有针对地采取 措施以 化害为利。 从上世纪初发现河豚毒素以 来， 日 本在这方面做了 大量 研究【6 - 2 0 ， 调查 了日 本产豚科各属鱼种的毒性状况，台湾也对市场上采集的河豚鱼样品做 了毒性研究，我国在1 9 6 3 年前调查了长江下游及河口区几种东方豚的毒性 状况， 但资料不完整。我国未进行过河豚鱼毒性的分布状况的全面调查。 可以看出，进行河豚鱼带毒状况的调查研究可为进一步食用性研究奠 定基础，对于开发利用河豚鱼资源有深远的意义. 研究目的 该课题通过研究， 全面分析了 我国海域和养殖河豚鱼的主要鱼种、 含毒 状况、捕捞和可利用资源， 全面了解重点可食河豚鱼鱼种的含毒状况和毒 性变化规律，并相应开展加工去毒技术研究， 取得关 键技术和良 好操作规 程 ( g m p )， 从而为鲜河豚鱼的加工食用提供了 科学基础， 为河豚鱼的 安 全食用打下基础，更为发展养殖河豚鱼和发展沿海农业经济提供了广阔的 空间。 山东大学硕士学位论文 所喜好，国内 外沿海地区食用河豚 鱼的历史 可追溯到很早的年代，日 本在 明 治维新后取消了禁食河豚鱼的 规定而代之以 专职调理师掌勺的特许专 卖 制度，我国民间食用河豚鱼的历史也非常悠久，并在一些地区形成了 河豚 鱼特有的饮食文化。河豚鱼有很高的经济价值，它的综合利用率较大，因 而近几年在国外市场上售价倍增，日 本红鳍东方豚每公斤市场价为2 万日 元， 而且需求量很大，1 9 8 7 年日 本的河豚进口 量增到1 7 0 。 吨，我国是主要 的出口国 之一。长期以 来，我国虽有禁止鲜食河豚鱼的规定，实际的状况 却是屡禁难止，我国海域每年都有较大的河豚捕捞量，除按照外贸合同出 口 外， 大量的河豚鱼捕捞上岸后被非法贩卖，流入市场，每年因误食或加 工不当有毒河豚而引起的食物中毒甚至死亡己成为严重的食品卫生问题。 面对当前日 益繁荣的市场经济，开放河豚鱼市场的呼声日益高涨的形势， 卫生部门如何在加强河豚鱼管理、保障人民群众生命安全的同时，又要使 河豚鱼这一宝贵水产资源得到充分利用已成为当前紧迫的任务，因而全面 了 解河豚鱼的含毒状况和毒性变化规律以及影响因素，才能有针对地采取 措施以 化害为利。 从上世纪初发现河豚毒素以 来， 日 本在这方面做了 大量 研究【6 - 2 0 ， 调查 了日 本产豚科各属鱼种的毒性状况，台湾也对市场上采集的河豚鱼样品做 了毒性研究，我国在1 9 6 3 年前调查了长江下游及河口区几种东方豚的毒性 状况， 但资料不完整。我国未进行过河豚鱼毒性的分布状况的全面调查。 可以看出，进行河豚鱼带毒状况的调查研究可为进一步食用性研究奠 定基础，对于开发利用河豚鱼资源有深远的意义. 研究目的 该课题通过研究， 全面分析了 我国海域和养殖河豚鱼的主要鱼种、 含毒 状况、捕捞和可利用资源， 全面了解重点可食河豚鱼鱼种的含毒状况和毒 性变化规律，并相应开展加工去毒技术研究， 取得关 键技术和良 好操作规 程 ( g m p )， 从而为鲜河豚鱼的加工食用提供了 科学基础， 为河豚鱼的 安 全食用打下基础，更为发展养殖河豚鱼和发展沿海农业经济提供了广阔的 空间。 山东大学硕士学位论文 材料与方法 1 、材料 1 . 1研究对象 1 . 1 . 1天然河豚鱼 1 9 9 6 年1 月一 1 2 月 在我国黄、 渤、东、南海海域以 拖网或张网方式捕捞 的鲜活河豚鱼或冰鲜成鱼( 指分析时眼不凹、 鱼肚白的鲜鱼或活鱼或低温- 1 8 以下保存的符合上述条件的鱼)。 河豚鱼的种类及数量分别为:东方豚属的红鳍东方豚f u g u .r u b r i p e s ( t e m m i n c k e t s c h l e g e l ) 8 尾、 假睛东 方豚f .p s e u d o n u n u s ( c h u ) 2 0 尾、 紫色 东 方nf .p o r p h y r e u s ( t e m m i m c k e t s c h l e g e l) l 尾、 虫纹东方豚 f . v e r m ic u l a r i s ( t e m m i n c k e t s c h l e g e l ) 4 4 尾、黄鳍东方豚f .x a n t h o p t e r u s ( t e m m i n c k e t s c h l e g e l) 8 3 尾、 菊黄东 方 豚 f .fl a v i d u s ( l i , w a n g e t w a n g ) 2 1 尾、 双 斑东 方 豚 f .b i m a c u l a t u s ( r i c h a r d s o n ) 6 尾、 墨绿东方豚f .b a s i l e v s k i a n u s ( b a s i l e w s k y ) 4 尾、暗纹东方豚f .o b s c u r u s ( a b e ) 2 4 尾、铅点东方豚f .a l b o p l u m b e u s ( r i c h a r d s o n ) 2 尾、 横纹东方w r o b lo n g s ( b l o c h ) 2 2 尾。 腹刺豚属的棕腹刺豚 g a s t r o p h y s u s . s p a d i c e u s ( r i c h a r d s o n ) 5 5 尾、 月 腹刺豚l a g o c e p h a l u s l u n a r i s 旧 l o c h e t s c h n e i d e r ) 7 尾、 淡 鳍腹刺 豚 l .w h e e l e r 7 尾、 暗 鳍腹 刺豚 l .g l o v e r i 4 4 尾。 其他豚属河豚鱼头纹宽吻豚 a . h y p s e l o g e n io n 5 尾。 共1 6 个品 种， 3 5 4 尾。 1 . 1 .2养殖河豚鱼 1 9 9 6 年捕捞的，要求分析时眼不凹、鱼肚白的鲜鱼或活鱼或低温 ( 一 1 8 以下)保存的符合条件的成鱼。 种类及数量为:养殖红鳍东方豚9 尾和假睛东方豚9 尾。 1 .2器材及试剂 器材与试剂为常规e l i s a 试验所需的基本材料。 2 、研究方法 2 . 1 采样方法 采用随机抽样的方法，主要在渔汛期对当 地常见的河豚鱼进行采样， 选取符合调查要求的河豚鱼样本。 河豚鱼样本经各协作单位前处理后送达 卫生部食检所进行，ttx 的含量检测。 山东大学硕士学位论文 2 .2河豚鱼品 种的 鉴别 观察河豚鱼的颜色、花纹、皮刺分布、脚斑等形态特征，根据形态学 方法进行鱼种的鉴别.若在当地鉴别有困难，则将河豚鱼的照片或将鱼送 到卫生部食检所由专家进行鱼种鉴定。 2 .3河豚鱼毒素的测定 2 .3 . 1 河豚毒素的 提取方法 采 用乙 酸 提取法 2 p ， 将分 离后的 河豚组 织用 研钵或 匀浆 器磨 成 糊状， 称取5 g 加5 倍体积0 . 1 % 乙 酸( 2 5 m 1 ) ， 放入1 0 0 水浴中 不断 搅拌煮 沸i o m i n o 待冷却至室温后， 快速过滤于 1 2 5 m l 分液漏斗中， 滤纸残渣用2 0 m 0 . 1 %乙 酸反复洗净后，水浴加热3 m i n 。合并滤液，加入等体积乙醚振摇脱脂，静 置待分层后， 放出水层至另一分液漏斗中，再重复脱脂一次。然后将水层 放入5 0 m 1 容量瓶中， 用1 m o l/ l n a o h溶液调p h至6 .5 7 .0 ， 再用p b s 定 容至5 0 m 1 ，立即用于检测。 此提取液l m l 相当于o . l g 样品。 2 .3 .2河豚鱼毒素的直接e l i s a侧定方法 第 一步: 用t t x - h c h o - b s a ( 1 0 - 2 0 1i g ) 包被 酶 标微 孔 板， 每 孔1 0 0 a 1 , 3 7 c 2 小时或4 过夜。 第二步:酶标板用p b s 一洗3 次，每次3 分钟，加入样品提取液与 m c a b - h r p 的 混合液1 0 0 u l ( 各5 0 m 1 ， 实验前 配好， 3 7 1c 2 小时或4 过夜) 置于3 7 00 1 小时。 第三步:酶标板洗5 x 3 m i n ，加入底物溶液，每孔1 0 0 u l , 3 7 c 3 0 m i n 第四步:加入终止液，每孔5 0 u l ，于4 5 0 m n 处测o d 值。 第五步:结果计算。 t t x 含量( n g / g ) = 1 0 c x c为酶标板上测得的 t t x 浓度( n g ) ， 根据标准曲 线求得 x 为样品提取液的稀释倍数 山东大学硕士学位论文 3 , 资 料收 集 3 . 1 近海大陆 架不同 海域的 地理环境资料 3 .2国内外既往河豚鱼调查资料 ( 历史资料) 3 . 3研究指标定义及计算: 毒力:以m u / g ( m o u s e u n i t ) 表示，i m u / g 表示1 克河豚鱼组织3 0 分钟能杀 死2 0 克d d y 雄性 小鼠 的 毒 素 量。 据 文 献 报 道 u : 1 m u /g = 0 .2 2 u g t mg . 毒力结果均经以上折算而得。 毒 性大小 的 评 价: 1 0 m 吨 无毒、 1 0 .o m u j g 的 个 体占 总 数的 百 分 率 成熟系数:k 二性腺重/ 鱼体纯重x 1 0 0 0 4 、质量控制 4 . 1设计阶段 查阅文献，结合实际情况设计调查研究。 对既往资料的收集上要求资 料完整、 可靠、 符合标准，一般选择由专业出 版社出 版的专业图书和期刊。 对调查项目 筛选慎重，解释清楚，用统一的标准经专家论证其可行性。 4 .2调查员的培训 选择基层经质量认证的食品卫生监督检验单位责任心强，有一定工作 经验的人员为调查员，对他们进行集中培训，印发培训教材，邀请专家进 行培训。重点进行河豚鱼种类的形态学鉴定方法，要求培训后采样人员能 鉴别河豚鱼的种类， 进行河豚鱼免疫学检测的前处理方法培训，要求实验 操作人员熟练掌握操作方法，做到准确无误， 制定统一的河豚鱼毒素的直 接 e l i s a 法检验操作规程，完善质量控制。 4 .3实施阶段 严格按照随机法进行采样，现场采样时认真核对、记录样本的来源， 对样品编号、登记，迅速送往检验单位， 减少样本损伤和死亡， 检验人员 逐项检查记录鱼的生物学 特征， 严格按照检验操作规程进行实验操作， 记 录毒性检验结果，由 研究者统一部署协调各部门的工作，做到各单位从采 样到结果的统一，结果真实准确。 山东大学硕士学位论文 4 .4资 料分析 阶段 注重资料的完整性，认真核对，录入资料时认真核查， 检查异常值。 5 、 统计分析 5 . 1资料整理与录入 对所有资料进行核对整理， 采用s a s 6 .0 8软件包建立数据库并进行统 计分析。 5 . 2描述性分析 1 )描述我国各地常见河豚鱼品种分布及主要渔汛期; 2 )描述各种常见河豚鱼在不同季节的生物学特征 ( 体长、重量、成熟 系数等): 3 )根据种属的不同， 描述不同品种河豚鱼不同组织的带毒率、毒力平 均值、标准差等。 5 .3资料分析 1 )采用多因素方差分析方法分析品种、季节、 地域对河豚鱼毒力 ( 以 t t x 含量折算成 m u / g 表示)的 影响; 2 )采用多元回归模型分析河豚鱼的生物特征与毒力的关系; 3 )用相关性分析法分析河豚鱼不同组织毒力的相关性。 结果与分析 1 . 基本情况 我国位于欧亚大陆东部， 濒临太平洋，拥有辽阔的海陆疆域和漫长的 海岸线。海岸线北起辽宁的鸭绿江口，南至广西的北仑河口，长达1 6 1 2 4 . 8 公里。我国的黄海、东海、南海和中国内海渤海，四个海区总面积约 为4 7 0 x 1 0 0 la n 2 ，海 岸 呈“ s ” 形， 地理 纬 度 差 异巨 大， 跨 越2 3 个 纬 度， 包 括温带、亚热带和热带三个气候带， 形成了复杂的自 然环境和生物分布的 多样性。 1 . 1 我国 海域的 气象 基本 特征i- 3 1 我国是典型的季风国家， 沿海气候主要是受季风控制， 海洋性季节的 划分为:春季3 -5 月，夏季6 -8 月，秋季9 -1 1 月，冬季1 2 -2 月。 山东大学硕士学位论文 4 .4资 料分析 阶段 注重资料的完整性，认真核对，录入资料时认真核查， 检查异常值。 5 、 统计分析 5 . 1资料整理与录入 对所有资料进行核对整理， 采用s a s 6 .0 8软件包建立数据库并进行统 计分析。 5 . 2描述性分析 1 )描述我国各地常见河豚鱼品种分布及主要渔汛期; 2 )描述各种常见河豚鱼在不同季节的生物学特征 ( 体长、重量、成熟 系数等): 3 )根据种属的不同， 描述不同品种河豚鱼不同组织的带毒率、毒力平 均值、标准差等。 5 .3资料分析 1 )采用多因素方差分析方法分析品种、季节、 地域对河豚鱼毒力 ( 以 t t x 含量折算成 m u / g 表示)的 影响; 2 )采用多元回归模型分析河豚鱼的生物特征与毒力的关系; 3 )用相关性分析法分析河豚鱼不同组织毒力的相关性。 结果与分析 1 . 基本情况 我国位于欧亚大陆东部， 濒临太平洋，拥有辽阔的海陆疆域和漫长的 海岸线。海岸线北起辽宁的鸭绿江口，南至广西的北仑河口，长达1 6 1 2 4 . 8 公里。我国的黄海、东海、南海和中国内海渤海，四个海区总面积约 为4 7 0 x 1 0 0 la n 2 ，海 岸 呈“ s ” 形， 地理 纬 度 差 异巨 大， 跨 越2 3 个 纬 度， 包 括温带、亚热带和热带三个气候带， 形成了复杂的自 然环境和生物分布的 多样性。 1 . 1 我国 海域的 气象 基本 特征i- 3 1 我国是典型的季风国家， 沿海气候主要是受季风控制， 海洋性季节的 划分为:春季3 -5 月，夏季6 -8 月，秋季9 -1 1 月，冬季1 2 -2 月。 山东大学硕士学位论文 4 .4资 料分析 阶段 注重资料的完整性，认真核对，录入资料时认真核查， 检查异常值。 5 、 统计分析 5 . 1资料整理与录入 对所有资料进行核对整理， 采用s a s 6 .0 8软件包建立数据库并进行统 计分析。 5 . 2描述性分析 1 )描述我国各地常见河豚鱼品种分布及主要渔汛期; 2 )描述各种常见河豚鱼在不同季节的生物学特征 ( 体长、重量、成熟 系数等): 3 )根据种属的不同， 描述不同品种河豚鱼不同组织的带毒率、毒力平 均值、标准差等。 5 .3资料分析 1 )采用多因素方差分析方法分析品种、季节、 地域对河豚鱼毒力 ( 以 t t x 含量折算成 m u / g 表示)的 影响; 2 )采用多元回归模型分析河豚鱼的生物特征与毒力的关系; 3 )用相关性分析法分析河豚鱼不同组织毒力的相关性。 结果与分析 1 . 基本情况 我国位于欧亚大陆东部， 濒临太平洋，拥有辽阔的海陆疆域和漫长的 海岸线。海岸线北起辽宁的鸭绿江口，南至广西的北仑河口，长达1 6 1 2 4 . 8 公里。我国的黄海、东海、南海和中国内海渤海，四个海区总面积约 为4 7 0 x 1 0 0 la n 2 ，海 岸 呈“ s ” 形， 地理 纬 度 差 异巨 大， 跨 越2 3 个 纬 度， 包 括温带、亚热带和热带三个气候带， 形成了复杂的自 然环境和生物分布的 多样性。 1 . 1 我国 海域的 气象 基本 特征i- 3 1 我国是典型的季风国家， 沿海气候主要是受季风控制， 海洋性季节的 划分为:春季3 -5 月，夏季6 -8 月，秋季9 -1 1 月，冬季1 2 -2 月。 山东大学硕士学位论文 根据气候特点， 将各岸段分为几个气候带:1 ) 南 温带， 包括总菜以 北 的 江苏以 北岸段， 2 ) 亚热带， 总集以 南的江苏 至雷州半岛以 北的 岸段， 3 ) 热带， 包括霄州半岛、 海南及南沙群岛 等地。 沿岸海域的海洋生物组成受环境因素影响很大。我国海洋生物区系主 要由暖水性低盐种类组成。 1 .2我国常见河豚鱼自 然史 1 . 2 . 1 我国各种常见河豚鱼的种类及分布 中国沿海分布的河豚鱼品种d 1 主要有红鳍东方豚 f u g u .r u b r ip e s ( t e m m i n c k e t s c h l e g e l ) 、 假睛东方豚 f. p s e u d o m m u s ( c h u ) , 紫色东方豚 f .p o r p h y r e u s ( t e m m i m c k e t s c h l e g e l ) 、 虫纹东方豚f . v e n n i c u l a r i s ( t e m m i n c k e t s c h l e g e l ) 、 黄 鳍东 方 豚f .x a n t h o p t e r u s ( t e m m i n c k e t s c h l e g e l ) 、 菊 黄东 方豚 f .fl a v i d u s l i , w a n g e t w a n g 、 双斑东 方豚 f .b im a c u l a t u s ( r i c h a r d s o n ) , 墨绿东 方 豚f .b a s i l e v s k i a n u s ( b a s i l e w s k y ) 、网 纹东 方豚e r e t i c u l a r i s t i a n ,c h a n g e t w a n g 、暗纹东方豚 r o b s c u r u s ( a b e ) ,铅点东方豚 f .a l b o p l u m b e u s ( r i c h a r d s o n ) 、横纹东方豚 r o b l o n g s ( b l o c h ) ,棕腹刺豚 g a s t r o p h y s u s . s p a d i c e u s ( r i c h a r d s o n ) 、月腹刺豚l a g o c e p h a l u s l u n a r i s ( b l o c h e t s c h n e i d e r ) , m鳃兔头豚 l .i n e r m i s ( t e m m i n