（果树学专业论文）龙眼在酸雨胁迫下基因的差异表达及DHAR基因的克隆.pdf

福建农林大学硕士学位论文 缩写词 英文缩写 a m p 心 a s c 黼姆 b p d ) n a c t a b d d h 2 0 d e p c d d r r - p c r d h a r d t t m 们t e b e d l a p t g l b 。 m r n a n a a c o d p c r p v p p v p p r a c e r n a s e l q - p c r s d s t i l i s x - g a l 缩写词 英文全称 a m p i c i l i n a d a p t e rp r i m e r a s c o r b a t e a b r i d g e du n i v e r s a la m p l i f i c a t i o np r i m e r b a s e p a i r s c o m p l e m e n t a r yd n a c e t y lt r i e t h y la m m o n i u mb r o m i d e d i s t m e dd e i o n i z e dw a t e r d i e t h y lp y r o c a r b o n a t e 。 d i f f e r e n t i a ld i s p l a yr e v e r s et r a n s c r i p t i o n p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n d e h y d r o a s e o r b a t e r ed u c t a s e d i t h i o t h r e i t o l d i o x yn u c l e i o t i d et r i p h o s p h a t e s e 衄d i u mb r o m i d e e t h y l e n e d i a m i n et e t r a a c e t i ca c i d i s o p r o p y t h i o - p d g a l a e t o s i d e l u r i 瑚e r t a n im e d i a m e s s e n g e rr n a s o d i u ma c e t a t e o p t i c a ld e n s i t y p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n p o l y v i n y lp y r r o l i d o n e p o l y v i n y lp o l y p y r r o l i d o n e r a p i da m p l i f i c a t i o no fe d n ae n d s r i b o n u c l e a s e r e v e r s et r a n s c r i p t i o np c r s o d i u md o d e c y ls u l f a t e t f i - h y d r o x y m e t h y la m i n o m e t h a n e 5 - b r o m o - 4 - c h l o r o - 3 - i n d o l y l 1 3 - d - g a l a c t o s i d e 中文全称 氨苄青霉素 接头引物 还原型的抗坏血酸 缩短的通用扩增引物 碱基对 互补d 姒 十六烷基三乙基溴化铵 双蒸水 焦碳酸二乙脂 差异显示反转录聚合酶链式反 应 脱氢抗坏血酸还原酶 二硫苏糖醇 脱氧核苷三磷酸 溴化乙锭 乙二胺四乙酸 异丙基硫代一1 3 d - 半乳糖苷 l b 培养基 信使r n a 乙酸钠 光密度 多聚酶链式反应 聚乙烯吡咯烷酮 聚乙烯聚吡咯烷酮 e d n a 末端的快速扩增 r n a 酶 反转录- p c r 一 十二烷基磺酸钠 三羟甲基氨基甲烷 5 一溴一4 - 氯一3 一吲哚一1 3 一d _ 半乳 独创性声明 本人声明，所呈交的学位( 毕业) 论文，是本人在指导教师的指导下独立完 成的研究成果，并且是自己撰写的。尽我所知，除了文中作了标注和致谢中邑作 了答谢的地方外，论文中不包含其他人发表或撰写过的研究成果。与我一同对本 研究做出贡献的同志，都在论文中作了明确的说明并表示了谢意，如被查有侵犯 他人知识产权的行为，由本人承担应有的责任。 学位( 毕业) 论文作者亲笔签名： 论文使用授权的说明 日期： d 万，多、易 本人完全了解福建农林大学有关保留、使用学位( 毕业) 论文的规定，即学 校有权送交论文的复印件，允许论文被查阅和借阅；学校可以公布论文的全部或 部分内容，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文。 学位( 毕业) 论文作者亲笔 指导教师亲笔签名： 保密，在年后解密可适用本授权书。 不保密，本论文属于不保密。 日期：d 矽，多，莎 日期： 口0 ，多易 福建农林大学硕士学位论文摘要 龙眼在酸雨胁迫下基因的差异表达及 d h a r 基因的克隆 摘要 酸雨的污染是当代国际性的重大生态环境问题，以鸟龙岭龙眼成年树为材 料，研究p h2 5 、3 5 、5 6 ( 对照) 的模拟酸雨胁迫下龙眼叶片基因的差异表达。 对龙眼叶片r n a 的提取方法作出探索，以此为模板对影响d d r t - - p c r 扩增的重 要参数进行优化试验，并建立了适合龙眼叶片的差异显示分析体系，最佳体系为： 2 5pl 体系中r n a 投入量为3 0l ag ，锚定引物浓度0 8l am o l l ，随机引物浓度 0 8um o l l ，d n t p 浓度2 0 01 tm o l l ，t a q 酶浓度1 2 5u ，退火温度4 0 。找出 一个与酸雨胁迫有关的e s t 序列，登录到g e n b a n k 上，其登录号为f c 8 6 0 6 2 5 ； b l a s t n 核苷酸同源性比较结果显示此片段与己报道的杨树叶片受干旱胁迫的 e s t 有7 5 的同源性。另外，利用b l a s t x 蛋白质同源性查询，其可能的编码 产物与葡萄上的一个未命名的蛋白产物存在6 6 左右的相似性，与水稻上一个 假定的转录起始因子存在5 9 的相似性，与拟南芥a t p 结合因子r n a 聚合酶 转录因子存在3 9 的相似性。推测此差异片段可能是龙眼对酸雨信号感知后产生 的第二信使物质激活的转录因子，引起酸雨相应基因的表达；也可能与胁迫条件 下进行无氧呼吸、能量的加快消耗有关。 根据苹果、番茄、拟南芥、小麦上已克隆得到的d h a r 同源基因的保守区 序列，设计合成兼并引物，在龙眼叶片上克隆得到了长度为4 3 7 b p 龙眼中的 d h a r 保守区片段；利用r a c e 方法，根据本试验所得的d h a re d n a 保守 区序列，设计3 端特异引物，克隆得到了此基因3 端的序列。推测调控抗坏血 酸代谢是提高龙眼抗酸雨胁迫的一条可行途径。通过超量表达促进抗坏血酸再生 的酶如d h a r 的活性，可以提高龙眼体内抗坏血酸的含量，同时龙眼对酸雨的 抗性可能也有一定程度的提高。 关键词：龙眼；酸雨；差异表达；) h a r 基因；克隆； 2 福建农林大学硕士学位论文 摘要 m r n ad i f f e r e n t i a le x p r e s s i o no fl o n g a nu n d e rt h es t r e s s o ft h ea c i dr a i n c l o n i n go fd h a rf r o ml o n g a n a b s t r a c t a c i dr a i n p o l l u t i o n i s a 。m a j o re c o l o g i c a lp r o b l e mi n t e r n a t i o n a l l y a n d c o n t e m p o r a r i l y a d u l tw u l o n g ! i n gl o n g a nt r e e sw e r eu s e dt os t u d yd i f f e r e n t i a lg e n e e x p r e s s i o n so f l o n g a nl e a v e su n d e rt h es t r e s so f p h2 5 ，3 5 ，5 6 ( c o n t r 0 1 ) o fs i m u l a t e d a c i dr a i n 皿1 er n ae x t r a c t i o nm e t h o d so fl o n g a nl e a v e sw e r ee x p l o r e d a sat e m p l a t e o nt h eo p t i m i z i n go fi m p o r t a n tp a r a m e t e r sw h i c hi m p a c to fd d r t p c ra m p l i f i c a t i o n , a n de s t a b l i s h e dd i f f e r e n t i a ld i s p l a ya n a l y s i ss y s t e mo f1 0 n g a n1 e a v e s t h eb e s ts y s t e m ： 2 5p1s y s t e m 鼬蛆i n p u t3 0i xg ，a n c h o r e dp r i m e rc o n c e n t r a t i o no f0 8pm o l l ， r a n d o mp r i m e rc o n c e n t r a t i o no f0 8 “t o o l l ，d n t pc o n c e n t r a t i o no f2 0 0 “m ol l ， 1 2 5ut a qe n z y m ec o n c e n t r a t i o n , a n da n n e a l i n gt e m p e r a t u r eo f4 0 t h em r n a d i f f e r e n t i a ld i s p l a yc o n d i t i o l l sw e r eo p t i m i z e dt of m da ne s ts e q u e n c er e l a t e d 、衍t h a c i dr a i ns t r e s s b yl o g g i n go nt og e n b a n kw i t ht h ea c c o u n tn u m b e ro ff c 8 6 0 6 2 5 ，t h e r e s u l t so fb l a s 即nn u c l e o t i d es e q u e n c ec o m p a r i s o ns h o w e dt h a tt h et h i sf r a g m e n t h a d7 5 h o m o l o g yw i t ht h ee s to fp o l a rl e a v e su n d e rd r o u g h ts t r e s s i na d d i t i o n , b y u s i n gt h eb l a s t xp r o t e i nh o m o l o g y t h er e s u l t ss h o w e dt h a tt h ep o t e n t i a le n c o d i n g p r o d u c t sh a da b o u t6 6 s i m i l a r i t yw i t ha nu n n a m e dp r o t e i np r o d u c to fg r a p e s ，h a d 5 9 s i m i l a r i t yw i t hah y p o t h e t i c a lt r a n s c r i p t i o n i n i t i a t i o nf a c t o ro fr i c ea n d3 9 s i m i l a r i t yw i t ha t p b i n d i n gf a c t o r r n ap o l y m e r a s e ：，t r a n s c r i p t i 6 nf a c t o ro f a r a b i d o p s i s w ec a ns p e c u l a t et h i sd i f f e r e n c ef r a g m e n ti st h et r a n s c r i p t i o nf a c t o r w h i c ha c t i v a t e db yt h es e c o n dm e s s e n g e rs u b s t a n c e s l o n g a np e r c e p t e do fa c i dr a i n s i g n a l t h e nc a r r i e do u t 坊es e c o n dm e s s e n g e rs u b s t a n c e s 。功es e c o n dm e s s e n g e r s u b s t a n c e sa c t i v a t e dt r a n s c r i p t i o nf a c t o r , c a u s ea c i d r a i nc o r r e s p o n d i n gg e n e e x p r e s s i o n t h i sd i f f e r e n c ef r a g m e n tm a ya l s ob ec a r r i e do u tu n d e rt h ec o n d i t i o n so f a n a e r o b i cr e s p i r a t i o n , e n e r g yc o n s u m p t i o na c c e l e r a t e d b a s e do nt h ec o n s e r v a t i v es e q u e n c eo f 删rh o m o l o g o u sg e n ec l o n e di na p p l e s t o m a t o e s ，a r a b i d o p s i s ，w h e a t ，d e g e n e r a t ep r i m e r sw e r ed e s i g n e dt oo b t a i n 删r f r a g m e n tw i t ht h el e n g t ho f 4 37 b pf r o ml o n g a nt r e e sb yc l o n i n g ；b a s e do nt h e 删r c d n as e q u e n c eo b t a i n e df r o mt h ee x p e r i m e n t r a c em e t h o dw a sa d o p t e di n d e s i g n i n g3 - t e r m i n a ls p e c i f i cp r i m e r sa n do b t a i n i n g3 - t e r m i n a ls e q u e n c e so f t h i s g e n eb yc l o n i n g s p e c u l a t ea s c o r b i ca c i dm e t a b o l i s mi sav i a b l em e a n so fl o n g a nt o i m p r o v et h er e g u l a t i o na n dc o n t r o lo fa c i dr a i n t h r o u g ht h ep r o m o t i o no fe x c e s s i v e e x p r e s s i o ne n z y m ea c t i v i t ys u c ha sa s c o r b i ca c i dr e g e n e r a t i o ne n z y m ed h a r , c a n i m p r o v et h ec o n t e n to fa s c o r b i ca c i di nl o n g a n , l o n g a nr e s i s t a n c et oa c i dr a i nm a ya l s o b eac e r t a i nd e g r e eo fi n c r e a s e k e yw o r d s ：l o n g a n ；a c i dr a i n ；d i f f e r e n t i a le x p r e s s i o n ；d h a r ；g e n ec l o n i n g 3 福建农林大学硕士学位论文第一章文献综述 第一章文献综述 l 龙眼在酸雨胁迫下基因的差异表达 1 1 酸雨概况以及对植物影响的研究进展 在没有大气污染物存在的情况下，降水的酸度主要由大气中的二氧化碳所形 成的碳酸组成，其p h 值大约在5 6 6 0 之间，因此，一般地将p h 值小于5 6 的 降水称为酸雨。随着人类社会的发展与进步，人类社会赖以生存的地球环境却日 趋恶化。由各种污染所带来的生态问题急待解决。酸雨的污染是当代国际性的重 大生态环境问题，在国外被喻为“空中死神 。 近3 0 年来随着经济的迅速发展，中国南方已成为继欧美之后的第三大酸雨 沉降区，而且有不断发展的趋势【1 1 。福建沿海城市郊区降水p h 均值均低于5 6 0 ， 降水总体上偏酸，多数郊区降水p h 值比城区低，其中厦门市郊区的降水p h 均值最 低为4 3 3 ，1 1 个城市( 福鼎、宁德、福州、长乐、福清、莆田、泉州、石狮、厦 门、漳州、龙海) 的酸雨出现率介于2 0 1 0 0 之间厦门市的酸雨出现率超过9 5 ， 几乎逢雨必酸，为沿海1 1 个城市酸雨污染最为严重的城市【2 】。 酸雨对农作物的危害包括对作物叶片的损伤、叶片营养元素的淋洗、生理生 化过程的改变、生长发育的阻滞和产量的降低等等。酸雨对植物的损伤几乎都出 现在叶片和繁殖器官上，最明显的损伤出现在刚刚完全展开的叶片上1 3 4 j 。许建 新等【5 】研究了深山含笑幼苗在不同p h 值( 2 0 ，3 0 ，4 0 ，5 6 ( 对照) ) 的酸雨溶液胁迫 下的生长情况( 叶面积、苗高、根长等) 和叶片解剖结构变化。结果表明：p h 4 5 的酸雨淋溶缓冲了土壤 的酸化，土壤的酸度减弱。酸雨对不同植物种群个体地上部分生理生化的影 响。酸雨进入植物叶片，使细胞内环境p h 值降低，引起光合色素的分解、降低 生理代谢相关酶活性以及膜保护酶活性，使细胞膜系统损伤、生理代谢失调而伤 害植物，而不同的植物对酸雨的抗性是不同的。邱新棉等【8 】以5 个不同颜色棉花 品种为材料，通过不同p h 值的模拟酸雨处理棉花种子，测定了过氧化物酶p o d 和超氧化物歧化酶s o d 活性的变化。结果表明，p h 值从高到低，p o d 活性呈 现先降后升的趋势；s o d 活性变化呈现先升后降的趋势，表明模拟酸雨对棉花 幼苗的细胞发生了实质损伤，其酶活性不可逆下降。 1 2 研究基因差异的方法：m r n a 差异显示技术 高等真核生物基因约为3 5 万个，但在一定的发育阶段，在某一类型细胞 中仅有1 5 的基因得以表达，产生出大约4 5 0 0 7 5 0 0 种不同的m r n a 分子。这 种在生物个体发育的不同阶段，在不同的组织或细胞中发生的不同基因按时间、 空间进行有序的表达方式，叫做基因的差别表达( d i f f e r e n t i a le x p r e s s i o n ) 。它决定 着每一个生命个体的生长发育、分化、细胞周期调控、衰老及死亡等生命过程。 而比较不同细胞或不同基因型在基因表达上的差异，不仅是研究生命过程分子机 制的基础，也是分离克隆目的基因的前提。因此，可以通过比较不同类型细胞或 同一类型细胞在不同发育时期或不同生理状态下基因表达的差异，进一步克隆差 异表达的基因，可以为分析生命活动过程提供重要信息。 使用高效的实验技术手段来分离新基因，一直是分子生物学关注的热点。从 m r n a 水平分离基因的方法包括差减杂交( s u b t r a c t i v eh y b r i d i z a t i o n ，s h ) 、差异显 示反转录聚合酶链式反应( d i f f e r e n t i a ld i s p l a yr e v e r s et r a n s c t i o np o l y m e r a s e c h a i nr e a c t i o n ，d d r t - p c r ) 、代表性差异分析( r e p r e s e n t a t i o n a ld i f f e m c e a n a l y s i s , r d a ) 、抑制性差减杂交( s u p p r e s s i o ns u b t r a c t i v eh y b r i d i z a t i o n ，s s h ) 等。 从获得差异表达基因( 片段) 的角度来讲，除了上述从m r n a 水平分离基因的几种 方法外，还有r n a 指纹技术( r n aa r b i t r a r i l yp r i m e dp c r ，r a p p c r ) 、酵母双 杂交系统( y e a s tt w o h y b r i ds y s t e m ) 、互补d n a 捕捉法( e d n ac a p t u r a t i o n ) 等多 种。另还有基因表达系列分析( s e r i a la n a l y s i so fg e n ee x p r e s s i o n ，s a g e ) 、转座子 标签( t r a n s p o s o nt a g g i n g ) 、扩增差异基因表达( a m p l i f i e dd i f f e r e n t i a lg e n e e x p r e s s i o n , a d g e ) 、交互扣除差异r n a 显示( r e c i p r o c a ls u b t r a c t i o nd i f f e r e n t i a l r n ad i s p l a y , r s d d ) 、双链e d n a 末端限制片段扩增( a m p l i f i c a t i o no f d o u b l e - s t r a n d e dc d n ae n dr e s t r i c t i o nf r a g m e n t 加d e r ) 及鸟枪克隆法( s h o t g u n c l o n i n g ) 等。d d r t - p c r 的问世是基因分离方法上的一个突破，它是目前使用频 率最高的用于克隆未知基因的方法。 5 福建农林大学硕士学位论文 第一章文献综述 1 2 1m r n a 差别显示技术的基本原理 真核基因m r n a 分子的3 末端绝大多数都带有一段p o l y ( a ) 尾巴。在这段 p o l y ( a ) 序列起点碱基之前5 上游的两个碱基有1 2 种组合( c o 、g g 、a g 、t g 、 c t 、g t 、a t 、t t 、c c 、g c 、a c 、t c ) ，根据这种序列结构特征，按照碱基配 对原则，人工合成o l i g o d ( t ) 弓 物时，在其3 端加上两个碱基( 5 t 1 2 m n ，m 为a ，1 3 ic 中任一种，n 为a ，g c ，t 中任一种) 。因此引物可将1 1 2 的m r n a 反转 录成c d n a ，并用此引物锚定c d n a 第一条链的了3 端，用另一个随机寡核苷 酸引物组成的5 端引物与c d n a 第一条链互补进行p c r 扩增，由于57 端随机 引物结合在c d n a 的互补靶点上，来自不同r n r n a 的扩增片段大小有差异，对 p c r 产物进行电泳，即可显示差异表达的c d n a 片段。从理论上讲，用1 2 种 o l i g o d ( t ) 锚定引物，2 0 种5 端随机引物组成的全部2 4 0 组引物对p c r 扩增， 就能产生出2 00 0 0 条左右的c d n a 条带，其中每一条都代表着一种特定m i u n a 。 这个数字大体上涵盖了在一定的发育阶段某种类型细胞中所表达的全部m r n a 数，通过m r n a 差别显示技术，可以比较不同细胞群或器官基因表达类型，同 时比较调控表达基因的数量变化及在不同条件下差异调节的基因。 1 2 2m r n a 差别显示技术的操作步骤 高质量r n a 是开展m r n a 差别显示的基础。首先提取无污染的r n a 或 m r n a 在含有r n a ( m r n a ) 、5 t 1 1 1 2 m n 、r n a s e 抑制剂( r n a s i n ) 、反转录酶、 d n t p 、d e p c 处理水及反转录缓冲液体系内进行反转录反应，合成c d n a 第一 条链；然后以反转录产物为模板，在5 t1 1 1 2 m n 、3 引物、m g c l 2 、d n t p 、 t a q 酶、d d h 2 0 及p c r 缓冲液体系内进行p c r 扩增。产物通过琼脂糖凝胶电泳， 分离步并纯化不同的差异条带，取部分差异c d n a 片段放射性标记后做探针， 与总r n a 作n o r t h r c n 杂交，斑点杂交以排除假阳性片段，同时将获得的差异片 段进行克隆，并与基因序列数据库中的序列作同源比较，如获得新的基因片段可 申请登记入库。 1 2 3m r n a 差别显示技术的优缺点 对基因表达的研究，过去主要采用减法杂交和蛋白质双向电泳技术。蛋白质 双向电泳只能粗略地比较两种细胞内产生的蛋白质，不能直接从基因水平分析鉴 定，因而很难推广。减法杂交需建立c d n a 文库，通过两次杂交分离去除双链 分子，再将余下的单链分子同文库进行杂交，这种方法不仅复杂费时，且重复性 差。而m r n a 差别显示技术简单易行，r n a 用量少，灵敏度高，可同时比较不 同发育阶段、不同器官组织细胞内m r n a 样品的差异，且重复性好。该技术自 问世以来，已广泛应用于动物、植物及人类疾病研究的各个领域。但也有不足之 处，如克隆片段假阳性比例高；扩增片段短( 1 0 0b p 5 0 0b p ) ，大部分位于m r n a 的3 非翻译区；凝胶中单条c d n a 带成分不均一；检测稀有或低拷贝数m r n a 6 福建农林大学硕士学位论文第一章文献综述 困难；检测全部m r n a 工作量大；涉及技术环节多，技术不好掌握；基因克隆 受m r n a 表达的时效性影响等。许多学者对d d r t 技术进行了改进，如通过延 长引物长度，减少引物组合的数目和优化p c r 循环参数来提高d d r t - p c r 技术 的重复性、明显降低假阳性率【9 】；在从凝胶上切取差异条带时，选取相互对照组 的各组间信号强度对比明显的条带，当在切下的一条带中可能含有几条c d n a 片断时可用单链构象多态性( s s c p ) 方法区分开来【l o j 。 1 3 差异显示技术在植物逆境胁迫研究中的应用 植物生长、发育与环境条件密不可分，在长期的自然选择中，两者间形成了 一种动态平衡，而这种平衡是靠植物体内相关基因的选择性表达来调节的，如抗 病虫基因，盐胁迫、低温胁迫等抗性基因。因此，研究抗逆性机理对于提高植物 的抗逆性有重要的意义，而d d r t p c r 是抗逆性机理研究中的一种行之有效的 生物技术手段，现己被广泛应用于逆境胁迫研究中的各个方面。利用此技术筛选 抗逆新基因的基本程序是先将植株置于极端逆境中生长一段时间，然后将其与正 常条件下生长的对照植株作为一对平行材料进行m r n a 差异显示分析，由于极 端逆境诱导了植物的抗逆性基因的表达，因此所得差异表达基因片段往往与抗逆 性相关【1 1 1 。 1 3 i 在抗病性研究上的应用 病害是农业生产中影响农作物产量的重要因子。程志强等【1 2 】运用d d r t p c r 技术，分析水稻愈伤组织受白叶枯病菌诱导的m r n a 表达丰度差异，获得了3 个 差异片断，并对其中长度为6 8 0b p 的r b i 片段进行了测序和克隆。n o r t h e r m 杂 交结果证实该片段受白叶枯病菌诱导表达，且在抗性品种中的诱导表达明显高于 在感病品种中的诱导表达。指出r b i 片段可能参与水稻早期防卫反应，并且在植 物的信号诱导过程中起作用。牛吉山等【1 3 】研究表明，应用m r n a 差异显示技术 从小麦一族毛麦6 v s 6 a l 易位系分离到3 个叶绿体蛋白基因片段，它们是t a d 5 、 t a d 2 3 和t a d 3 3 ，3 个基因片段与小麦叶绿体基因r b c l ，拟斯卑尔脱山羊草叶 绿体r n a 聚合酶a 亚基基因r p o a 和大麦l ，5 二磷酸核酮糖羧化酶基因片段 ( r u b i s c oa c t i v er c a a 2 ) 的同源性分别为9 8 、9 7 和8 8 。n d 出皿分析表明， 这3 个叶绿体基因的表达在白粉菌诱导下得到增强，叶绿体基因组合有胸腺嘧啶 重复区是在m r n a 差异显示中克隆到叶绿体基因组基因的原因。谷守芹等【1 4 1 利 用d d r t - p c r 技术对接种玉米抗大斑病菌0 号小种菌株0 1 2 7 的玉米自交系 b 3 7 、b 3 7 h t l 、b 3 7 h t 2 抗病相关基因片段进行分离，得到6 5 条差异片段，经反 向n o r t h e r n 杂交检测，阳性片段为4 4 条；其中与b 3 7 亲和性互作相关的片段有 1 7 条，与b 3 7 h t l 、b 3 7 h t 2 非亲和性互作相关的片段分别为1 l 和8 。杨红等【l 副 采用d d r t - p c r 技术研究了棉花枯萎病菌异核体菌株及其2 个不同表型分离子 之间差异表达的基因，得到了1 9 个差异片段，片段大小在3 0 0 7 0 0b p ，经反向 7 福建农林大学硕士学位论文第一章文献综述 r n a 印迹，证实其中的2 条为阳性差异片段；对这2 条差异片段测序并在 g e n b a n k 中进行同源比较，首次在分子水平上证明了同一异核体菌株的不同表 型分离子在基因转录水平上有差异，为研究丝状真菌异核体形成的分子机制提 供了线索。v i n c e n z oc a r g i n a l e 等【1 6 - 1 使用d d r t - p c r 技术来鉴定和分离由于叶片 受到感染而导致转录改变的杏树叶片基因，得到了4 个受到感染后表达明显改 变的基因。结果显示，杏树叶片中有2 组基因受到植物原生质感染的影响，植物 原生质对第l 组基因产生正调节作用，而对第2 组基因产生负调节作用。他们的 研究证实了d d r t - p c r 技术能有效应用于研究被植物原生质感染所影响的植物 代谢途径。小麦叶锈病是一种世界性发生的小麦病害，利用抗病品种是防治该病 害最经济、安全、有效的方法。目前已经正式定名的5 6 个小麦抗叶锈基因中， 有许多表现出抗锈性的丧失。来自中间偃麦草的小麦抗叶锈基因三刀8 则表现出优 良的抗锈性。闰红飞等【1 7 j 利用d d r t - p c r 技术，分析了小麦抗叶锈近等基因系 材料t c l r 3 8 与感病对照t h a t c h e r 间的表达差异。通过对差异片段的克隆测序，获 得一条4 2 5b p 的差异表达序列，推测可能为一与抗病相关的基因片段。 1 3 2 在温度胁迫研究上的应用 温度是制约植物产量和品质的主要环境因子。低温是造成农作物减产的重要 原因之一，弄清作物抗冷机理有利于提高作物产量。z h a n g 等 埔j 以枸桔( p o n c i r u s t r i f o l i a t e ) 为试验材料，应用此技术和相对定量r t p c r ( q u a n t i t a t i v er e l a t i v e r t p c r ) 来研究冷胁迫下的基因表达差异，得到了8 个上游调控基因片段，对这 些片段的氨基酸序列分析表明，其同源性分别与水通道蛋白，甜菜碱脯氨酸转 运子，早期光诱导蛋白，趾d o k e t o 还原酶，硝酸盐转运子，三十四氨基酸重复 蛋白，f b o x 蛋白，核糖体蛋i 兰t l l 5 有较高的相似性。丁秀英等d g 选用抗性相 对较弱的水稻( o r y ms a t i v al ) 品种越富为实验材料，利用此技术研究了在4 6 c 的低温胁迫下i s o p r o t h i o l a n e ( i p t ) 诱导水稻幼苗抗性增强的部分分子机理。 经二次扩增及反向n o r t h e r n 杂交确定了5 个差异表达的基因片段。殷奎德等1 2 0 j 利用m r n a 差异显示技术从冷胁迫和甘露醇胁迫共同处理的冷敏感水稻根的总 r n a 中分离出冷胁迫诱导的c d n a 片段，经过测序和同源比较，发现它是一尚未 报道的新基因片段。程艳军等【2 l 】采用m r n a 差异显示技术对籼粳亚种间杂交稻 亚优2 号 幼穗发育基因在两种不同温度条件下的表达差异进行了研究。结果 发现，对照和低温处理的幼穗发育基因在转录水平上存在差异。梅菊芬等瞄】采用 m r n a 差别显示的方法对茶树冷驯化过程中基因差异表达进行了初步研究，从 5 8 条差异片段得到稳定扩增的差异片段2 3 条，用r t - p c r 的方法鉴定其假阳 性，得到5 个阳性片段，其中3 个片段在冷驯化过程中表达量增加，另p l - 2 个片 段的表达量降低。经过b l a s t 比对分析，其中一个片段序列与高粱反式玉米素 d 葡糖基转移酶同源性较高：一个与黄瓜叶绿体合成相关蛋白基因同源性较高； 8 福建农林大学硕士学位论文第一章文献综述 一个为茶树核酮糖1 ，5 双磷酸羧化酶力口氧酶小亚基基因片段；一个与细胞色素b 亚基有较高同源性；还有两个片段序列比对没有同源序列，可能为新基因。 近年来，在全球气候变暖的趋势下，我国很多地区夏季酷暑持续时间也逐渐 延长，夏季育苗遇到高温阻碍的现象也越来越严重，使生产和应用都受到了很大 的影响，于晓英等田j 应p 目m r n a 差异显示技术( d d r t - p c r ) ，对瓜叶菊( s e n e c i o h y b r i d u s ) 离体筛选获得的耐热变异p a k n l 2 1 及其母株n l 在热胁迫下的基因 差异表达进行分析。筛选到1 0 0 条在热胁迫下耐热变异体n 1 2 1 和母株n 1 间 差异明显的基因片段，其中有6 个片段( d f l - - d f 6 ) 经过n o r t h e r n 杂交验证只 在n 1 2 1 中表达而在母株n l 中不表达。进一步克隆测序和数据库比对分析表 明，d f 3 和d f 4 分别与马铃薯和水稻热胁迫时产生的应答反应有关，其中d f 4 与热休克蛋白h s p 7 0 部分序列高度同源，d f 3 与h s p 结合蛋白部分序列高度同 源；d f l 与花色素苷转酰基酶有关，另外3 个( d f 2 、d f 5 和d f 6 ) 未发现蛋白质 同源序列，推测为新的e d n a 片段。 1 3 3 在金属抗敏性研究上的应用 在酸性土壤中，铝的毒害是限制作物产量的主要因子之一，它影响到世界可 耕土地的4 0 左右。印莉萍等【2 4 】比较了正常供铁和缺铁胁迫下铁高效型小麦和铁 低效型小麦的基因表达差异，经n o r t h e r n 杂交后表明一些差异c d n a 的表达受 缺铁胁迫的抑制。测序和序列分析结果表明，受抑制的e d n a 片段分别与细胞 色素c 基因、a b c 转运子基因、和d d t p 4 ，6 葡萄糖脱水酶的基因有一定同源 性。 1 3 4 在盐分胁迫研究上的应用 土壤中盐分的积累给农作物的生长发育带来严重的影响。m r n a 差别显示技 术的建立为研究耐盐基因在不同组织、不同器官、不同环境条件及不同发育时期 的差异表达提供了可能，为植物耐盐分子机制研究提供了很多有价值的实验结 果。w e i 等【2 5 】以大麦近等基因系g o l d e np r o m i s e 和m a y t h o r p e 为试验材料，利用 d d r t p c r 技术分离得到b s 瑚p ( v a c u o l a ra t p a s es u b u n i tb ) 基因片段。在对 盐敏感品种m a y t h o r p e 中经过长时间盐胁迫，b s v a p 基因诱导表达且高水平表 达，而在g o l d e np r o m i s e 中表达量很低。王振英等1 2 6 】用此技术分析经n a c l 处理 3d 的的黑麦幼苗，得至t j l 4 个差异表达的c d n a 片段，包括8 个诱导表达片段， 2 个增强表达片段和4 个抑制表达片段。单雷等1 2 7 1 利用m r n a 差异显示技术分析 了小麦“济南1 7 7 和小麦与高冰草体细胞杂种耐盐品系“杂3 号 在盐胁迫前后 基因的差异表达情况。并通过反向n o r t h e m 杂交筛选，获得2 7 个阳性片段。从中选 出1 0 个候选片段进行序列分析，这些序列信息表明，其表达与盐胁迫应答有一定关 系。n o r t h e r n 杂交验证了差异片段w r s i l 在耐盐品系“杂3 号 的根中受盐诱导，推 9 福建农林大学硕士学位论文第一章文献综述 测可能为胁迫早期应答基因。陆海等【2 8 】通过使用优化的m r n a 差异显示技术分离 白刺盐碱胁迫相关基因，共得到4 1 个差异片断：通 过n o r t h e r n 杂交筛选，获得3 6 个 白刺盐碱胁迫相关基因。 1 3 5 在水分胁迫研究中的应用 水分胁迫下高等植物的分子响应主要表现在转录和转录后水平。郭宾会等 2 9 1 以小麦幼苗为材料，采用m r n a 差异显示方法和银染技术，对经过用1 6 ( - o 5 m p a ) p e g 6 0 0 0 溶液处理不同时间诱导表达的小麦基因进行分离，共得 到e d n a 差异片段5 2 条。经r e v e r s en o r t h e r m 验证，表达片段1 5 个，并对其 克隆、测序。经g e n b a n k 查询，有1 1 条与已知序列具高度的同源性，其余4 条 同源性较低，可能为新基因。郝岗平等【3 0 】在拟南芥中已克隆了1 个编码组氨酸 激酶a t h k l 的基因。应用d d r t p c r 技术分析含a t h k l 基因的野生型个 体和突变体之间的基因表达差异，得到9 个与渗透胁迫相关的c d n a 片段，其 中包括m a p k k k l 8 基因和丝氨酸苏氨酸蛋白激酶基因片段。郭新红等【3 1 】利用 此技术并结合抑制差减杂交方法分离了3 个e d n a 片段，并对这3 个片段进行 了克隆、测序。b l a s t 软件搜索g e n e b a n k 库结果表明，其中2 个片段均为在 梭梭( h a o x y l o na m m o d e n d r o n ) 中首次克隆，且与抗逆境胁迫有关。郭继虎等【3 2 】 以小麦旱选1 0 号为材料，利用d d r t - p c r 技术研究了种子芽期水分胁迫处理后 在m r n a 表达上的差异，找到一个与小麦叶片淹涝有关的e s t 序列，还有一个 与热胁迫有关的e s t 序列。m a l a t r a s 等【3 3 】应用此技术对大麦进行分析，得到了 几个在干旱、冷和脱落酸诱导的e d n a 段。对其中的1 个片段d d 6 首先通过 5 r a c e 技术延伸，之后对大麦的b a c 文库进行搜索，得到了其转录序列及 其旁侧序列。由此片段推测的氨基酸序列与人和鼠的d n a 结合蛋白有一定的同 源性，此基因被命名为s r 9 6 ( s t r e s s r e s p o n s i v eg e n e ) 。 1 3 6 在缺氧胁迫研究中的应用 k o n s t a n t i n o s 3 4 用d d r t - p c r 来分离柑桔在低氧胁迫下缺氧基因的表达。从 柑桔组织的差异凝胶看出，在0 , 0 5 ，3 ，2 1 氧气处理下2 4 小时，核酸杂交分析 2 5 个无性中发现1 1 个基因在缺氧条件下被诱导，几乎有一半的e d n a 的功能未 知或者在g e n b a n k e m b l 的数据库找不到明显的同源序列。六个基因具有类似 以下的职能：碳化合物和碳水化合物利用，植物生长发育，氨基酸代谢，生物合 成。 1 4 研究的意义 酸雨作为一种环境胁迫因子对植物的刺激而引起相关基因表达，关于这方面 的研究还未有报道。因此，以龙眼为材料研究酸雨胁迫下基因的差异显示将为龙 眼的抗酸机制和最终提高龙眼的酸适应性提供更深入可靠的理论