（生物化学与分子生物学专业论文）家蚕肌钙蛋白c基因的研究.pdf

浙江理工大学硕士学位论文 摘要 肌钙蛋白c ( t r o p o n i nc ，t h c ) 是一种e f 手图形超家族蛋白，可以结合c a 2 + 并发挥其生物学功能。它的c a 2 + 结合位点是由螺旋一环一螺旋( h l h ) 构成的e f 手 图像模体。肌钙蛋白c 主要存在于肌肉组织中，它在调节肌肉收缩方面具有重要 作用。目前，国内外对肌钙蛋白c 的研究多数集中在脊椎动物上，而对无脊椎动 物的研究较少。 我们通过r t - p c r 的方法从家蚕蛹中扩增到家蚕肌钙蛋白c 基因的完整的 o r f 序列，并将其命名为b m t n c ( b o m b y xm o r it r o p o n i nc ) ，g e n b a n k 登录号为 d q 6 7 5 0 2 0 。该基因序列长为4 8 0b p ，编码1 5 9 个氨基酸，预测分子量为1 8 1 8k d a 。 我们将扩增到的b m t n c 基因克隆到融合表达载体p e t - 2 8 a 相应的酶切位点上，得 到融合蛋白表达质粒p e t - 2 8 a - b m t n c ，经p c r 、酶切鉴定以及测序证明重组子是 正确的。将该重组子转化大肠杆菌b l 2 1 ( d e 3 ) ，用终浓度为lm m 的i p t g 诱导重 组菌后，裂解菌体作s d s p a g e 分析，在2 1k d a 左右的位置有一条特异性蛋白条 带，与预期值( 融合标签3 5 6k d a ，b m t n c1 8 1 8k d a ) 相符。融合蛋白以可溶 性形式存在，故用超声裂解菌体后1 2 0 0 0r p m 离心所得的上清以亲和层析的方法 纯化目的蛋白h i s t a g b m t n c 。经f p l c 反相柱层析进一步纯化后，再进行质谱分 析，得到该融合蛋白的分子量为2 1 6 0 0 9 d a ，证实了该蛋白表达的正确性。以纯 化所得蛋白为抗原免疫雄性新西兰兔，制各了该重组蛋白的多克隆抗体，e l i s a 检测该抗血清的效价可达到l ：2 5 6 0 0 以上。提取家蚕五龄幼虫的各组织蛋白，用 于w e s t e r n b l o t t i n g 实验。实验结果表明，b m t n c 蛋白在家蚕的表皮、肠道、头、 马氏管、睾丸等组织中都有表达，且表达量依次降低，而在丝腺和脂肪体中我们 并没有检测到该蛋白的存在。通过免疫组织化学实验，我们也发现该蛋白主要分 布在家蚕五龄幼虫的表皮、气门、肠道、马氏管、头部等组织中，以及蛹的头部、 肠道、体壁等组织中。亚细胞定位结果表明，该蛋白主要存在细胞质中。我们还 利用荧光定量p c r 的方法，对家蚕卵、五龄幼虫、蛹、蛾等发育时期，以及五龄 幼虫各组织中的靶m r n a 的量进行比较。用p r o t e i n a 凝胶柱纯化多克隆抗体，并 将纯化所得的抗体用于制作免疫亲和柱，从家蚕中纯化天然的b m t n c ，为研究 该天然蛋白的功能活性打下基础。 关键词家蚕；肌钙蛋白c ；原核表达；组织定位；亚细胞定位；荧光定量p c r ： 纯化 i 浙江理工大学硕士学位论文 a bs t r a c t t m p o n i nc ( t n c ) ，w h i c hi sk n o w n a sh a v i n ga b i l i t yo fb i n d i n gc a ”，i so n em e m b e ro ft h e e f - h a n ds u p e r f a m i l y i t sc a ”b i n d i n gs i t ei st h ee f - h a n dm o t i fc o n s t r u c t e db yh e l i x l o o p - h e l i x ( h l h ) t r o p o n i ncm a i n l ye x i s t si nm u s c u l a rt i s s u e ，a n dp l a y sa ni m p o r t a n tr o l eo f r e g u l a t i n gt h e m u s c u l a rc o n t r a c t i o nt h r o u g hb i n d i n go rr e l e a s i n gc a 2 + t od a t e ，m o s tr e s e a r c h e so ft r o p o n i nc w e r ef o c u s e do nm t h e rv e r t e b r a t et h a ni n v e a e b r a t e t h ef u l lo p e nr e a d i n gf l a m e ( o r do f b o m b y xm o r it r o p o n i ncw a so b t a i n e df r o ms i l k w o r m p u p ab yr t p c ra n dn a m e db m t n c ( b o m b y x m o r it r o p o n i nc ) ，o fw h i c ht h ea c c e s s i o nn u m b e r w a sd q 6 7 5 0 2 0 t h i so r fc o n t a i n e d4 8 0b p ，e n c o d i n gap o l y p e p t i d eo f1 5 9a m i n oa c i d sw i t ha p r e d i c t e d m o l e c u l a r w e i g h t o f l 81 8k d a a f t e r c l o n e d i n t o p e t - 2 8 aa n de x p r e s s e d i n e c o l i b l 2 1 ( d e 3 ) ，t h eb m t n cw a sf u s e dw i t hh i s - t a ga n dp u r i f i e do nc h e l a t i n gc o l u m n s t h em o l e c u l a r w e i g h to ft h i sf u s i o np r o t e i nw a s2 1 6 0 0 9d a ( h i st a gw a sw e i g h to f3 5 6k d a ，a n db m t n c w a s w e i g h to f1 8 1 8k d a ) c h a r a c t e r i z e db ym a s s - s p e c t r u ma f 【e rb e i n gf u r t h e rp u r i f i e do n1 0r if p l c t h i sr e s u l tp r o v e dt h a th i s - t a gb m t n cw a se x p r e s s e di nt h er i g h tf o r m t h ep u r i f i e df u s i o n p r o t e i nw a s u s e dt oi m m u n i z eam a l en e wz e a l a n dr a b b i t t h e n ，a n t i s e r u mw a sh a r v e s t e d ，a n d i g gw a sp r e p a r e db ya f f i n i t yc h r o m a t o g r a p h yu s i n gi m m o b i l i z e dp r o t e i na s o m et i s s u e so ft h e f i r t hi n s t a rl a r v a e ，s u c ha sh e a d ，m a l p i g h i a nt u b u l e ，e p i d e r m i s ，s i l kg l a n d s ，s e m i n a lg l a n d s ，g u t ， f a t t yb o d y ，w e r ee x t r a c t e da n da n a l y z e db yw e s t e r nb l o t t i n g t h er e s u l ts h o w e dt h a tb m t n c e x i s t e di nl a r v a se p i d e r m i s ，g u t ，h e a d ，m a l p i g h i a nt u b u l e ，s e m i n a lg l a n d so nt h ed e c r e a s e h o w e v e r ，n o n ew a sd e t e c t e di nl a r v a ss i l kg l a n d sa n df a t t yb o d y ：a n dw eg o tt h es i m i l a rr e s u l t s w h e nw ec a r r i e do u ti m m u n o h i s t o c h e m i s t r ya n a l y s i sw i t ht h ef i f t hi n s t a rl a r v aa n dp u p a a f t e r c a r r y i n go u ts u b c e l l u l a rl o c a l i z a t i o na b o u tb m t n c ，w e f o u n dt h a ti tm a i n l ye x i s t e di nc y t o p l a s m w ea l s oc o m p a r e dt h eq u a n t i t yo fb m t n cm r n ai nd i f f e r e n tt i s s u e so ft h ef i f t hi n s 扭rl a r v aa n d d i f f e r e n ts t a g e so fs i l k w o r m t h e s er e s u l t ss u g g e s t e dt h a tb m t n cs e l e c t i v e l ye x p r e s s e di n s i l k w o r m s h e a d ， g u t ，e p i d e r m i s ，s p i r a c l e a n d m a l p i g h i a n t u b u l e h t u n u n ea f f i n i t y c h r o m a t o g r a p h yw a sd o n et op u f f f yt h en a t i v eb m t n c f r o ms i l k w o r m i tl a i dag o o df o u n d a t i o n o f 缸r m e rs t u d i e so f b m t n c k e yw o r d sb o m b y xm o r i ；t o p o n i nc ：p r o k a r y o t i ce x p r e s s i o n ；t i s s u el o c a l i z a t i o n ；s u b c e l l u l a r l o c a l i z a t i o n ；r e a lt i m er t - p c r ；p u r i f i c a t i o n l i 浙江理工大学学位论文原创性声明 本人郑重声明：我恪守学术道德，崇尚严谨学风。所呈交的学位论文，是 本人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果。除文中已明确注明和 引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品及 成果的内容。论文为本人亲自撰写，我对所写的内容负责，并完全意识到本声 明的法律结果由本人承担。 组w 鞠7砂 戤少 一叩 僦肌学日 浙江理工大学学位论文版权使用授权书 学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留 并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅或借阅。 本人授权浙江理工大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进 行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。 本学位论文属于 学位论文作者签名： 保密口，在年解密后适用本版权书。 不保密日。 日期唧年岁月钐f 日 指导教师签名 日期：年月日 浙江理工大学硕士学位论文 a c n a p b m t r l c b s a d a p i e d l a e l i s a e s t f c a f c m n a h r p i p t g k a n n c b i o r f p c r p i p m s f s d s 队g e t e m e d 吼 缩略语 a c e t 0 1 1 1 “1 l e a l m c l l o l l l u i np e r s u l f a t e b o m b y xm o r it r o p o n i nc a l b u m i n ，b o v i n e ，f r a c t i o nv 2 “- a n u d i n o p h e n y l ) - 6 - i n d o l e c a r b a m i d m e d i h y d r o c h l o r i d e e t h y l e n ed i a m e n u n e t e t m a c e t l ca c i d e n z y m eh n k e di m m u n o s o r b e n ta s s a y e x p r e s s e ds e q u e n c et a g f r e u n d sc o m p l e t ea d j u v a n t f l o wc y t o m e t e r f r e u n d si n c o m p l e t ea d j u v a n t h o r s e r a d i s hp e r o x i d a s e i s o p r o p y l t h i o 一1 8 - d - g a l a c t o s i d e k a n a m y c i n n a t i o n a lc e n t e rf o rb i o t e e h n o l o g yi n f o r m a t i o n o p e nr e a d i n gf r a m e p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n 4 - 6 - d l a m i d i n o 一2 - p h e n y l i n d o l e p h e n y l m e t h a n e s u l f o n y lf l u o r i d e s o d m m d o d e e y ls u l f a l t ep o l ya c r y l a m l d e g e le l e c t r o p h o r e s i s n n n n - t e t r a m e t h y l e t h y l e n e d i a m i n e t r i f l o u r o a c e t i ca c i d 乙腈 过硫酸铵 家蚕肌钙蛋白c 牛血清白蛋白 4 6 联脒2 苯基吲哚 乙二胺四乙酸 酶联免疫吸附实验 表达序列标签 弗氏完全佐荆 流式细胞术 弗氏不完全佐剂 辣根过氧化物酶 异丙基硫代b - d 半乳糖苷 卡那霉素 美国国立生物技术信息中心 开放阅读框 聚合酶链式反戍 4 ，6 联咪_ 2 一苯基吲哚 苯甲基磺酰氟 十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺 凝胶电泳 n ，n n n 一四甲基乙二胺 三氟乙酸 浙江理工大学硕士学位论文 第一章肌钙蛋白c 的研究进展 引言 c a 2 + 信号传导是细胞中最广泛存在的信号传导机制中的一种，一般由e f 手图像( e f h a n d ) 蛋白参与执行n 肌钙蛋白c ( t r o p o n i n c ，t n c ) 作为e f 手 图像超家族的成员，也同样参与了细胞内的c a 2 + 信号传导。 肌钙蛋白c 是一种钙离子结合蛋白，它可以与肌钙蛋白i ( t r o p o n i n i ，t n i ) 、 肌钙蛋白t ( t r o p o n i nt ，t n t ) 形成复合物，并对横纹肌的收缩起到c a 2 + 依赖 的调节作用。肌钙蛋白c 在肌肉收缩过程中的作用主要体现在它与ca _ 2 + 结合 或解离之后，能够调节肌钙蛋白其它两个亚基t n t 、t n l 及收缩系统其它组分问 的相互作用。 肌钙蛋白c 除了可以调节肌肉收缩之外，它还具有其它方面的功能。随着 研究的不断深入，肌钙蛋白c 更多的功能将不断被发现。 1e f 手图像超家族 1 1e f 手图像的结构 e f 手图像是一种由螺旋区一泡区一螺旋区( h l h ) 构成的c a 2 + 结合模体 ( m o t i f ) ，通常成对出现( 图1 1 ) 。e f 手图像模体在结合c a 2 + 之后会发生较大 的构象改变。 鲫c co f p a l b u m i n l - 3 5a f a g v l n d a d 毛a a a l e a c k a a d 趼2 q i t k a f f a k v g l 3 6 - 7 0t s k s , 柚d m k k a f a i i d q d k s f g i e e d e l k l f l o n f 7 l d 0 8 k a 】阻钮u l l z d g e n “唯u ( a g d s d o d o o v d 黝m u 黼 e f h a 瑚l m o t i f o f u n d e r l i n em x p l e f , c e 图1 1 鲤鱼小清蛋白( p a r v a l b u m i n ) 的氨基酸序列及e f 手图像模体闭 f i 9 1 1s e q u e n c e a n d e f - h a n d m o t i f o f p a r v a l b u m i n f r o mc a r p m u s c l e 【2 】 2 浙江理工大学硕士学位论文 1 2e f 手图像蛋白的分类 e f 手图像超家族成员泛指所有的含有e f 手图像模体的蛋白。该超家族蛋白 按其功能可分为两种类型：信号蛋白与缓冲转运蛋白。信号蛋白是该家族中最 大的一类，它包括钙调蛋白、肌钙蛋白c 及s i o o b 等大家所熟知的家族成员。这 些蛋白都会发生典型的c a 2 + 依赖性的构象改变，进而暴露靶结合位点。而缓冲 转运蛋白不会发生c a 2 + 依赖性的构象改变，钙结合蛋白d 9 k 就属于这种类型。 1 3e f 手图像亚家族 在e f 手图像超家族中，有一个s 1 0 0 亚家族，它是一类跟疾病相关的蛋白。 s 1 0 0 蛋白只存在于脊椎动物中，具有胞内、胞外调节活性p 】。s 1 0 0 亚家族成员在 细胞内可形成反平行的二聚体结构，进而d a c a 2 + 依赖( 有时不依赖c a 2 + ) 的方式 将细胞内的两个同种或异种的靶蛋白功能性地桥联起来。s 1 0 0 蛋白的胞内活性主 要体现在蛋白的磷酸化、细胞增殖( 包括瘤性转化) 与分化、细胞骨架的形成、 膜的形成、胞c a 2 + 平衡及防止细胞氧化损伤等方面。而s 1 0 0 蛋白的胞外活性主 要体现在促进神经元存活或分化、星形胶质细胞增殖，通过凋亡引发神经元死亡 以及刺激或抑制炎症细胞的活性等方面。 在e f 手图像超家族中，还有另外一类含有e p s l 5 同源( e p s l 5h o m o l o g u c ，e h ) 结构域的蛋白，它在细胞内吞、膜泡运输及信号传导过程中发挥作用这类蛋白 同样也含有一对e f 手图像模体，其中一个结合c a 2 + ，而另一个可能并不结合。这 类蛋白中的e f 手图像模体上的残基可形成一个疏水结合口袋，进而与含有n p f 、 s w g 、h t s f 模体的蛋白结合。 此外，在l i n t 4 圾b l a n c h a r d 等人【5 1 的研究中发现，c a l p a i n 的n 端存在第五个e f 手图像模体，这类蛋白也因而被归类为p c n t a - e f 手图像( p e f ) 亚家族。它拥有 两类不同性质的e f 手图像模体：一种可结合c a 2 + ，另一种不结合c e + ，但可用于 形成二聚体。虽然p e f 亚家族成员的n 端的氨基酸序列及长度都不尽相同，但它 们同样都富含甘氨酸和疏水性氨基酸残基睁9 】。 2 肌钙蛋白c 2 1t n c 的进化分析 肌钙蛋白c 由四个e f 手图像模体构成，是e f 手图像超家族中的一员。它 作为肌钙蛋白复合体中的c a 2 + 结合亚基，是最早发现并明确其生理功能的一种 c a 2 + 调节蛋白。随着生物的进化，各物种中t n c 的氨基酸序列已不尽相同，即使 浙江理工大学硕士学位论文 在同一物种中也出现了t n c 的不同亚型。为了弄清该蛋白的进化情况，我们从 n c b i 数据库中调取了所有的t n c 的氨基酸序列，并就其中的1 1 6 个t n c 序列进 行了分析( 图1 2 ) 。分析结果发现，t n c 在其进化过程中保留了e f 手图像模体， 尤其是泡区的1 2 个氨基酸残基序列( d x d x d x 6 e ) 具有高度保守性。从图中不 难看出，该蛋白主要沿着脊椎动物与无脊椎动物两个分支进化，这也成为该蛋白 的分类依据之一。 图1 2t n c 的进化树 f i g1 2t h ep h y l o g e n yo f t n c 2 2 t n c 的分类 目自口研究认为，t n c 在脊椎动物中存在两种亚型，一种存在于快速骨骼肌中， 称为骨骼肌肌钙蛋白c ( f a s ts k e l e t o nm u s c u l a rt r o p o n i nc ，s t n c ) ，而另一种存 在于慢速骨骼肌或心肌中，称为心肌肌钙蛋白c ( s l o ws k e l e t o n c a r d i a cm u s c u l a r t r o p o n i nc ，c t n c ) 。而在无脊椎动物及昆虫中，肌钙蛋白c 也存在多种亚型， 但分类并不明确。目前，在果蝇、按蚊中己发现t n c 的多种亚型，其中果蝇中已 4 浙江理工大学硕士学位论文 鉴定的亚型有t n c 4 1 c 、t n c 4 7 d 及t n c 7 3 f 1 1 0 l 。 2 3 t n c 的结构 2 3 1 脊椎动物t n c 的结构 从脊椎动物的s t n c 的晶体结构j 可以看出，该分子是由一个中间螺旋连接 的两个球形区域构成。而两个球形区域又分别由两个e f 手图像模体构成，可以 结合金属离子。根据金属离子结合属性的差异，我们将这四个e f 手图像模体分 为两种类型：一种位于c 端，具有较高的亲和性，既可以跟c a 2 + 结合，又可以与 m ，+ 结合，称为c a 2 + 一m 孑+ 位点；另一种位于n 端，具有较低的亲和性，只能与 c a 2 + 结合，称为c a 2 + 特异位点。c a 2 + _ m 9 2 + 位点虽然在结合c a 2 + 或m 矿+ 之后会发 生较大的构象变化，但它并不具有明显的调节肌肉收缩的功能。然而，大量的证 据表明，仅仅c a 2 + 特异位点就可以传递c a 2 + 信号，与肌钙蛋白的其它亚基形成c a 2 + 依赖性的互作，调节肌肉收缩。因此，我们也可以将肌钙蛋白c 看作是一个c 端 为结构区域，n 端为调节区域的哑铃形结构【1 2 1 孔。 在脊椎动物的s t n c 中有四个c a 2 + 结合位点：c 端、n 端各有两个c a 2 + 结合位 点。而在脊椎动物的c t n c ( 如人的c t n c ，图1 3 ) 中，由于c a 2 + 结合位点i 的序列 发生改变，致使其失去c a 2 + 结合能力，从而使其n 端只含有一个低亲和性的c a 2 + 结合位点【1 4 l 。因此在心肌组织中，c a 2 + 只结合于位点i i 上，从而调节肌肉的收缩。 b 4 - 1 e l i xc h e l i x 图1 3 人的d t n c 与鸡的s t n c 中c a 2 + 结合位点的比较。左图：鸡的s t n c t l 5 1 ；右图：人i 举j c t n c ”6 1 f i g1 3c o m p a r i s o no ft h ec a 2 + b i n d i n gs i t eio fc h i c k e ns t n c ( 1 e f t ) 1 5 1t ot h a to fh u m a n c t n c ( r i g h t ) 1 ” 2 3 2 无脊椎动物t n c 的结构 无脊椎动物的t n c 氨基酸序列中通常存在四个潜在的可结合c a 2 + 的e f 手 图像模体。但是，由于这些t n c 中某些模体上的c a ：+ 结合所必需的氨基酸残基 发生突变，使得其失去两个甚至更多的c a 2 + 结合位点”0 1 。也就是说，虽然无脊 5 浙江理工大学硕士学位论文 椎动物的t n c 与脊椎动物的t n c 同样含有四个e f 手图像模体，但前者实际的 c a 2 + 结合位点通常只有两个，甚至更少。 东半球马蹄型蟹( t a c h y p l e u st r i d e n t a t u s ) 【 1 肌肉组织中的t n c 的c a 2 + 结合 位点i 上的某些氨基酸残基被取代，从而使其失去了c a 2 + 结合能力。蜊蛄( a s t a c u s l e p o d a c 钞l u s ) 1 1 8 1 9 1 和龙虾( h o m a r u s a m e r i c a n u s ) 1 2 0 1 肌肉组织中的t n c 都只在 位点i i 和位点上结合c a 2 + 。而软体动物的t n c 通常只在位点上结合c a 2 + ，而且这个位点属于c a 2 + 特异性结合位点。 2 4t n c 的生物学功能 2 4 1t n c 在肌肉组织中的作用 肌钙蛋白c 通过调节肌肉收缩发挥着重要而广泛的作用。由于肌钙蛋白c 分为两种亚型，这也决定了它们在调节肌肉收缩发挥功能时存在两种不同的生物 学功能。s t n c 即快速骨骼肌中的t n c 通过调节肌肉收缩调节着动物的一切行为 活动；而e t n c 即心肌的肌钙蛋白c 主要是通过调节心肌的收缩来调节心脏的收 缩，与生命的持续密切相关。正是因为它调节心肌的收缩，所以它和一些心肌疾 病密切相关。在早期的心肌疾病诊断中，心肌中t n c 的含量高低被作为评价心 肌受损程度的一种标志，这更加说明了心肌中的t n c 对心肌正常发挥功能的作 用。 肌钙蛋白c 作为肌钙蛋白复合物中的一个c a 2 + 结合亚基，需要与其它两个亚 基肌钙蛋白i ( t n i ) 、肌钙蛋白( t n t ) 共同作用，调节肌肉收缩。t n i 是肌 原纤维a t p 酶的抑制亚基，它可抑制肌球蛋白与肌动蛋白的偶联，松弛骨骼肌或 心肌。t n t 是原肌球蛋白的结合亚基，它将肌钙蛋白c 和肌钙蛋白i 连接到肌动蛋 白和原肌球蛋白上，从而在肌纤维收缩和舒张过程中发挥中介作用。 t n c 与t n t 、t n i 结合成肌钙蛋白复合物( t n ) ，然后再与原肌球蛋白( t m ) 一起构成t m t n 复合体，调节肌肉收缩与舒张的力量和速度。t m 。t n 复合体位于 横纹肌的细肌丝和心肌细胞的细肌丝上( 图1 4 ) 。从图中我们可以看出，肌原 纤维由肌小节构成，每个肌小节又由粗丝与细丝构成，而t m t n 复合体就位于细 丝e 。 6 浙江理工大学硕士学位论文 图1 4 肌原纤维的结构1 2 l j f i g1 4s t r u c t u r eo f t h em y o f i b r i l 2 1 】 t m 一 i n 复合体对肌肉收缩的调节作用需在c a 2 + 的诱导下进行。当肌浆中的 c a 2 + 浓度较低时，t n c 的n 端处于无c a 2 + 状态，使其与t n l 的结合能力减弱，无法 解除t n i 对肌动球蛋白a t p 酶的抑制，从而使肌肉处于舒张状态。当肌浆中的c a 2 + 浓度升高时，c a 2 + 结合到t n c 上，并使后者发生构象改变，从而使t n c 与t n l 、 t n t 的结合能力增强，t n i 与肌动蛋白的结合能力减弱并与其脱离，变成应力状 态( 图1 5 ) 。同时，t n t 使原肌球蛋白移动到肌动蛋白双螺旋沟的深处，消除肌 动蛋白与肌球蛋白结合的障碍，肌球蛋白头部结合到邻近的肌动蛋白上，这一结 合引起肌球蛋白头部a t p 酶的活化，释放a d p 、p i 和能量，从而使肌球蛋白头部 弯曲，导致了细丝和粗丝之间的滑动。弯曲后的肌球蛋白头部又结合a t p ，从而 与肌动蛋白分开恢复原来的构象，这就是肌肉收缩的一个循环。如果c a 2 + 仍存在， 肌球蛋白将进行下一个周期的循环。 图1 5 肌肉舒张( d i a s t o l e ) 、收缩( s y s t o l e ) 时肌丝蛋白构象的变化2 1 f i g1 5s t r u c t u r ec h a n g e si nt h i nf i l a m e n td u n n gd i a s t o l ea n ds y s t o l e 【2 2 l 7 浙江理工大学硕士学位论文 2 4 2t n c 在非肌肉组织中的作用 早在1 9 7 8 年，p o l l a r d 等人【2 3 】就发现，t n c 、t n i 等参与肌肉收缩功能的蛋白 不仅存在于肌肉组织中，而且还存在于非肌肉组织( 如软骨) 中。在非肌肉组织 中无需调节肌肉收缩，这也许暗示着t n c 、t n i 除了具有调节肌肉收缩功能外还 有其它功能。m o s e s 等人2 4 1 开创了这一领域的先河，他们的研究证实了t n l 也存 在于人的软骨中，并可抑制血管生成及肿瘤转移。另有研究发现，t n i 在抑制血 管内皮细胞增殖过程中需与受体结合发挥作用1 2 ”。 随着研究人员对t n i 在非肌肉组织中功能研究的深入，t n c 在非肌肉组织中 的功能也开始引起人们的重视。国内有研究报道称，重组人t n c 对人体静脉内 皮细胞增长成剂量依赖性关系，对小鼠异位抑制肿瘤也成剂量依赖性关系f 2 “。这 也就表明t n c 能够抑制血管内皮细胞的生长，并且具备一定的抗肿瘤作用。但 是，人们对t n c 发挥该功能的作用机制还不清楚，有待进一步研究。 2 5t n c 的研究现状及展望 近年来，国内对肌钙蛋白c 的研究主要集中在两个方面：一方面研究t n c 与 二价金属离子的结合属性，另一方面研究钙增敏剂对c t n c 的作用。张毅等人2 7 】 研究过羟苯氨酮对c t n c 与c a 2 + 亲和力的影响，认为羟苯氨酮作为钙增敏剂可直接 增加c t n c 与c a 2 + 的亲和力。除此之外，在国内最新的一篇文章中，刘先俊等人【2 哪 报道了重组入骨骼肌t n c 的抗肿瘤作用，这可能成为t n c 功能研究的新起点。 在国外，多数的研究都集中在对t n c 突变体【1 5 ，6 】及t n c 嵌合体 2 8 , 2 9 1 的研究， 进而了解t n c 与c a 2 + 的结合特性及其与其它蛋白之间的互作机制。b r e t 等人3 0 】的 研究认为，心肌肌钙蛋白c 在与心肌肌钙蛋白i 结合后会引发前者构象及结构灵活 性的改变。t h a r i n 等人【3 l 】的研究发现，在肌钙蛋白复合体中肌钙蛋白c 的调节区 域的灵活性具有c a 2 + 依赖性。y e 等人【3 2 】将单个e f 手图像模体上的c a 2 + 结合环嵌入 一种脚手架蛋白的不同位点，进而研究单个e f 手图像模体的c a 2 + 亲和性。 可见，到目前为止，国内外对t n c 的研究都只停留在对脊椎动物的研究。相 比之下，人们对无脊椎动物t n c 的研究相对较少。虽然在果蝇中已经鉴定出三种 t n c ，但我们还无法确定它的c a 2 + 结合位点3 3 1 。至今为止，人们已经克隆至i j t n c 基因的无脊椎动物有蜗牛、扇贝、乌贼、线虫、鲎、龙虾、蜊蛄、火蚁、果蝇等 3 4 1 。这些基因的克隆为今后研究无脊椎动物t n c 的功能打下坚实的基础。 然而，在另外一种模式生物家蚕中，关于t n c 的研究仍是一个空白。我 浙江理工大学硕士学位论文 们的研究就是要以家蚕为材料，克隆出家蚕t n c 基因的各种亚型，并确定各亚型 的组织分布情况，进而推测它们的不同功能。另外，由于家蚕在它一生中变态发 育较为迅速，我们通过分析t n c 基因在其发育过程中的表达情况，进而推测t r l c 与家蚕生长发育的关系。 此外，t n c 在肌肉组织中的作用已比较明确，而其在非肌肉组织中的作用却 鲜有研究。文中提到过t n c 能够抑制血管内皮细胞的生长，并具有抗肿瘤作用。 为此，找到t n c 在非肌肉组织( 特别是软骨组织) 中可能存在的受体并对其进行 研究将具有重大意义。我们也试图寻找家蚕非肌肉组织中的t n c ，希望能为抗肿 瘤研究做出一点贡献。 就目前的研究所知，肌钙蛋白c 主要具有调节肌肉收缩、抑制血管生成、抑 制肿瘤转移等功能，具有潜在的生物工程应用价值。由于t n c 在心肌收缩过程中 具有重要地位，而且还与某些心血管疾病相关，因此它在心血管疾病的诊断方面 有一定的应用前景。另外，人们发现动物软骨是恶性肿瘤的低发部位之一，还陆 续从软骨组织中分离出u - 9 9 5 、t n i 、s c a i f i 等多种血管生成抑制剂，并发现其 血管生成抑制活性明显高于内皮抑制素( e n d o s t a t i n ) 、血管抑制素( a n g i o s t a t i n ) 等 2 4 , 3 5 , 3 6 】。因而，动物软骨如鲨鱼软骨已成为人类抵抗恶性肿瘤的重要武器之一。 与t n i 相似，t n c 也同样存在于动物软骨中，并具有一定的抗肿瘤作用 2 6 , 3 7 l 。此 外，沈传陆3 8 1 的研究也表明，t n c 2 能特异的结合癌基因t r e l 7 ，从而抑制癌症 的发生。因此，如何从动物软骨中提取t n c 并将其作为抗肿瘤的天然药物，将是 t n c 在生物工程领域的重要应用。 9 浙江理工大学硕士学位论文 第二章实验方案设计 1 研究目的和意义 为了了解家蚕肌钙蛋白c 基因在家蚕中的转录、表达情况，弄清该蛋白在 其参与的蛋白复合体中的组合情况，探讨家蚕肌钙蛋白c 在家蚕生长、发育过 程中的功能，我们克隆了家蚕肌钙蛋白c 基因，并在大肠杆菌中表达该蛋白， 制备该蛋白的兔源多克隆抗体，用于组织定位、纯化家蚕中天然肌钙蛋白c 、 细胞定位等实验。该研究为今后深入研究家蚕肌钙蛋白c 在家蚕生长、发育过 程中的功能提供依据，也为研究家蚕肌钙蛋白c 在复合体中的作用打下坚实的 基础。 我们通过r t - p c r 获得家蚕肌钙蛋白c 基因的完整的o r f 序列，命名为 b m t n c ( b o m b y xm o r i 打o p o n i nc 1 基因。本实验构建了重组原核表达质粒 p e t - 2 8 a - b m t n c ，并在大肠杆菌中表达该重组融合蛋白r b m t n c ，将其纯化后 做为抗原制备多克隆抗体，为进一步研究家蚕肌钙蛋白c 奠定了良好的实验基 础。 2 研究内容 b m t n c 基因完整的o r f 序列的获得 该o r f 序列所编码的蛋白质的氨基酸序列特征的分析 重组表达质粒p e t - 2 8 a - b m t n c 的构建 重组表达质粒在大肠杆菌中的表达 表达产物的纯化 多克隆抗体的制备与效价测定 该蛋白在家蚕幼虫及蛹中的分布情况的研究 该基因在家蚕发育各时期及五龄幼虫各组织中的转录、表达情况的分析 该蛋白在家蚕细胞中分布的研究 家蚕中天然肌钙蛋白c 的纯化 1 0 浙江理工大学硕士学位论文 3 实验流程图 r t - p c r 扩增得到b m t n c 基冈完整的o r f 构建重组表达质粒p e t - 2 8 a - b m t n c 重组表达质粒在大肠杆菌中的表达与纯化 多克隆抗体的制备与效价测定 免疫组化 ii 细胞定位i l 制各亲和柱 纯化家蚕天然b m t n c 浙江理工大学硕士学位论文 第三章序列分析 利用生物信息学的方法发现新基因并对其进行功能预测研究是当前国际上 研究的热点之一，也是发现和研究新基因的一个重要手段。我们从本实验室构 建的家蚕e d n a 文库中获得了一个编码家蚕肌钙蛋白c 的e s t 序列，以该序列 为探针，从s i l k b a s e 数掘库中搜索到含有编码家蚕肌钙蛋白c 的完整o r f 的c d n a 序列，我们将该o r f 序列命名为b m t n c ( b o m b y xm o r it r o p o n i nc ) 。本 章主要介绍应用生物信息学的方法对b m t n c 基因进行序列分析与功能预测。 1 生物信息学工具 用s i l k b a s e 数掘库( h t t p ：p a p i l i o a b a u t o k y o a c j p s i l k b a s e i n d e x h t m l ) 搜 索家蚕基因：在n c b i 数据库中用b l a s t 在线软件( h t t p ：w w w n c b i n l m n i h g o v b l a s t ) 对获得的家蚕新基因所编码的氨基酸序列进行同源性比较；蛋白质的 疏水性由p r o t s c a l et o o l ( h t t p ：w w w e x p a s y o r g c g i - b i n p r o t s c a l e p 1 ) 预测：蛋白质 的高级结构由s w i s s m o d e l ( h t t p ：s w i s s m o d e l e x p a s y o r 9 0 预测；蛋白质在细 胞内的定位由在线软件t a r g e t p l 1 ( h t t p ：w w w c b s d t u d k s e r v i c e s t a r g e t p ) 分析； 蛋白质的功能区由p r o s i t et o o l s ( h t t p ：a u e x p a s y o r g p r o s i t e ) 预测；采用c l u s t a l x l 8 软件进行氨基酸多序列比对；用a l i b e e m u l t i p l ea l i g n m e n t ( h t t p ：w w w g e n e b e e m s u r u s e r v i e e s m a l i g n _ r e d u e e d h t m l ) 分析b m t n c 与其它无脊椎动物 t n c 的氨基酸序列相似性；蛋白质的等电点以及分子量由c o m p u t ep i m wt o o l ( h t t p ：u s e x p a s y o r g t o o l s p i t 0 0 1 h a n l ) 预测3 9 1 。 2 方法 2 1b m t n c 基因的获得 在本实验室的家蚕蛹e d n a 文库中，发现一个编码家蚕肌钙蛋白c 的e s t 序 列。以该序列为信息探针，从s i l k b a s e 数据库( h t t p ：p a p i l i o a b a u - t o k y o a c j p s i l k b a s e i n d e x h t m l ) 中搜索到一条c d n a 序列。该c d n a 序列含有编码家蚕肌钙蛋白 c 的完整的o r f ，并将其命名为b m t n c ( b o r n b y xm o r it r o p o n i nc ) 。 2 2b m t n c 基因的序列分析 将获得的b m t n c 基因序列用生物信息学软件d n a s t a r 进行分析；将推测的 1 2 浙江理工大学硕士学位论文 b m t n c 蛋白的氨基酸序列提交到s w i s s m o d e l ( h t t p ：s w i s s m o d e l e x p a s y o r g ) 以预测其高级结构，返回的数掘用s w i s sp d b v i e w e r 软件打开【4 皿4 2 1 ；利用生物软 件网中的序列处理在线工具包( s m s ) ( h t t p ：w w w b i o s o f t n e t s m s i n d e x h t m l ) 对b