（发酵工程专业论文）新型生物防腐剂纳他霉素发酵工艺的研究.pdf

摘要 纳他霉素( n a t a m y c i n ) 为多烯烃大环内酯类抗真菌抗生素。纳他霉素主要由恰塔努 加链霉菌( s t r e p t o m y c e sc h a t t a n o v g e n s i s ) ，纳塔尔链霉菌( s t r e p t o m y c e sn a t a l e n s i s ) 和 褐黄孢链霉菌( s t r e p t o m y c e sg i l v o s p o r e u s ) 发酵生产而来。由于它能够专性的抑制酵 母菌和霉菌，是一种高效、广谱的抗真菌抗生素，且对哺乳动物细胞的毒性极低，因 此被广泛应用于食品防腐和真菌引起的疾病的治疗。目前国内纳他霉素发酵的水平较 低，导致成本高、应用前景受到限制。因此，对纳他霉素发酵进行深入的研究和开发 具有重要意义。本文围绕如何提高褐黄孢链霉菌w z - 1 8 的纳他霉素的产量进行了研 究，获得结果如下： 首先建立了高效液相色谱法和紫外分光光度法来检测发酵液中的纳他霉素含量。 采用h p l c 法，将样品用甲醇萃取后，进行检测，检测条件为：色谱柱为d i k m a t e c h n o l o g i e sc 1 8 ( 5 u m ，2 5 0 r a m x 4 6 m m ) ，流动相为甲醇一水一甲酸( 5 0 ：5 0 ：0 0 5 ， 体积比) ，流速为1 0 0 m l m i n ，柱温3 5 ，紫外检测波长为3 0 3 r i m ：采用紫外分光光 度法，将样品用甲醇提取过滤后，稀释到适当浓度，在3 0 3 n m 处测定吸光值。前者 定量准确，精确度高，但耗时较长：后者简单快速，但有时会受到一些情况的干扰， 不能精确定量。故在试验中，将两种检测方法结合使用，达到既准确又快速的检测发 酵液中纳他霉素含量的目的。 通过对几种斜面培养基和种子培养基的比较，确定了斜面培养基成分为葡萄糖 1 0 9 l ，蛋白胨5 9 m ，酵母粉3 9 m ，麦芽浸粉3 9 l ，p h 7 0 7 1 ；种子培养基成分为 葡萄糖3 0 l ，酵母粉6 9 l ，大豆蛋白胨1 6 l ，p h 7 o ；种子的培养时间为4 4 , 4 8 h ； 发酵接种量为6 。 对发酵培养基进行优化，确定葡萄糖为适宜碳源，大豆蛋白胨和酵母粉的混和氮 源为适宜氮源，运用正交试验确定发酵培养基成分为葡萄糖4 0 l ，大豆蛋白胨2 0 l ， 酵母粉7 9 l ，初始p h 8 0 。 在培养基优化的基础上，对发酵工艺参数进行优化，考察了发酵温度、溶氧对发 酵的影响，并研究了添加铵离子捕捉剂磷酸镁和前体物质对纳他霉素产量的影响，最 终确定发酵温度为2 9 ，装液量为3 0 0 m l 三角瓶装液4 0 m l ，磷酸镁的添加量为0 2 ， 在发酵4 8 h 时添加0 2 的丙酸钠。在此工艺下，纳他霉素产量达到3 2 2 9 l ，与优化 前的产量1 7 1 9 t , 相比提高了8 8 3 。 进行了i o l 自动发酵罐的分批发酵试验和分批补料发酵试验。在不补料的情况 下，纳他霉素产量为2 9 1 9 l ：通过流加葡萄糖的方式进行补料，使菌体老化减缓， 纳他霉素的生产期延长，纳他霉素产量提高，最终纳他霉素的产量为3 4 3 l ，与分 批发酵相比提高了1 7 9 。 关键词：纳他霉素；褐黄孢链霉菌；发酵；间歇补料；检测 s t u d yo nf e r m e n t a t i o np r o c e s so fan e wb i o l o g yp r e s e r v a t i v en a t a m y c i n a u t h o r ：w 萌z h a o s u p e r v i s o r ：p r o z h a n gw e i m a j o r ：f e r m e n t a t i o ne n g i n e e r i n g a b s t r a c t n a t a m y c i n ( p i m a r i c i n ) i so n eo ft h ek i n d so fm a c r o l i d ea n t i b i o t i c s ，w h i c hi sp r o d u c e d b ys e v e r a lo fa c t i n o m y c e t e ss u c ha ss t r e p t o m y c e sc h a t t a n o v g e n s t s is t r e p t o m y c e sn a t a l e n s i s a n ds t r e p t o m y c e sg i l v o s p o r e u s b e c a u s ei ti so n ek i n dh i g h l ye f f e c t i v ea n t i - f u n g u s a n t i b i o t i cw h i c hc a ns p e c i a ls u p p r e s s e st h ey e a s ta n dt h em i l d e w , a n di ti sl o wt o x i ct ot h e m a m m a l i a nc e l l sw h i c hi sc o m p a r e dt oo t h e ra n t i f u n g a lc o m p o u n d s ，i ti sw i d e l yu s e di n f o o di n d u s t r i e sa n dm e d i c a lt r e a t m e n t h o w e v e r , t h ey i e l do fn a t a m y c i na tp r e s e n ti sv e r y l o w , s ot h ea p p l i c a t i o no fn a t a m y c i ni sl i m i t e ds e v e r e l yd u et ot h eh i g hc o s to fp r o d u c t i o n t h e r e f o r e ，i ti so fg r e a ti m p o r t a n c et oe n h a n c et h er e s e a r c ha n dd e v e l o p m e n to fn a t a m y c i n p r o d u c t i o np r o c e s s i nt h i ss t u d y , t h ew o r kw a sh o w t oi n c r e a s eo u t p u to fn a t a m y c i n 1 1 l e m a j o rr e s e a r c hc o n t e n t sa n dr e s u l t sa r ea sf o l l o w s ： ai 心一h p l cm e t h o da n da l lu l t r a v i o l e ts p e c t r o p h o t o m e t r i cm e t h o df o rt h ea n a l y s i so f n a t a m y c i ni nf e r m e n t a t i o nb r o t hw e r ed e v e l o p e d t h es a m p l ew a ss e p a r a t e da t3 5 co na d i k m at e c h n o l o g i e sc 18 ( 5 u r n 2 5 0 m m x 4 6 m m ) e l u t e da taf l o wr a t eo f1 0 0 m l m i nw i t ha m o b i l ep h a s eo fm e t h a n o l - w a t e r - p e r f o r m i ca c i d ( 5 0 ：5 0 ：0 0 5 ，v ) n a t a m y c i nw a sd e t e c t e d a n dq u a n t i f i e db yt h ea b s o r b a n c ea t3 0 3 n mi nt h er p - h p l c t h es a m p l ew a ss e p a r a t e db y m e t h y la l c o h o l ，a n dn a t a m y c i nw a sq u a n t i f i e db yt h ea b s o r b a n c ea t3 0 3 n mi nt h e u l t r a v i o l e ts p e c t r o p h o t o m e t r i cm e t h o d t h ef i r s to n ew a sa c c u r a t ea n dn e e d e dm o r et i m e t h es e c o n do n ew a ss i m p l ea n dr a p i d b u tw a si n f l u e n c e db ys o m e t h i n g sa tat i m e t h e r e f o r e i nt h ee x p e r i m e n t s ，t h et w om e t h o d sw e r eu s e di nc o m b i n a t i o nt oa c h i e v et h e p u r p o s et h a td e t e c t i n gn a t a m y c i ni nf e r m e n t a t i o nr a p i d l ya n da c c u r a t e l y t h es l o p ec u l t u r em e d i u ma n ds e e dc u l t u r em e d i u mw e r es t u d i e d t h eo p t i m u m m e d i u mo fs l o p ec u l t u r em e d i u mc o n s i s t e do f g l u c o s e10 9 l ，p e p t o n e5 9 l ，y e a s te x t r a c t p o w d e r3 9 l m a l te x t r a c tp o w d e r3 9 la n dp h7 0 7 1 t h eo p t i m u mm e d i u mo fs e e d c u l t u r em e d i u mc o n s i s t e do f ：g l u c o s e3 0 9 l ，y e a s te x t r a c tp o w d e r6 9 l ，s o y ap e p t o n e 16 9 la n dp h 7 0 t h es e e da g ew a s4 4 4 8 h n ei n o c u l u m sl e v e lw a s6 t h eo p t i m u mm e d i u mo ff e r m e n t a t i o nb r o t hw a ss t u d i e d t h ec a r b o ns o u r c ew a s g l u c o s e n i t r o g e ns o u r c e i sa d m i x t u r eo fs o y ap e p t o n ea n dy e a s te x t r a c tp o w d e r t h e o p t i m u mm e d i u mw a sd e m o n s t r a t e dt h r o u g ho r t h o g o n a ld e s i g nt e s t ，a n di t c o n s i s t e do f ： g l u c o s e4 0 9 l ，s o y ap e p t o n e2 0 9 l ，y e a s te x t r a c tp o w d e r7 # l a n dp h8 0 b a s e do no p t i m u mm e d i u mo ff e r m e n t a t i o nb r o t h ，t h eo p t i m i z a t i o no ft h e f e r m e n t a t i o nc o n d i t i o nw a ss t u d i e d 1 1 1 eo p t i m a lm e d i u mf o rd i s s o l v eo x y g e na n dt h e t e m p e r a t u r eo nt h ey i e l do fn a t a m y c i nf e r m e n t a t i o nw e r es t u d i e d t h er e s u l tw a st h a ta 3 0 0 m lf l a s kc o n t a i n i n g7 0 m lm e d i u mw a sc u l t i v a t e da t2 9 a n dt h ea g i t a t i o ns p e e dw a s 2 0 0 r m i n t h ei n f l u e n c eo fp r e c u r s o r sa n dm 9 3 ( p 0 4 ) 2o nn a t a m y c i np r o d u c t i o nw a s e x p l o r e d t h er e s u l ts h o w e d ：a d d i n g0 2 m 勘( p 0 4 ) 2a tt h eb e g i n n i n ga n d0 2 s o d i u m p r o p i o n a t ea t4 8 hc a ni m p r o v en a t a m y c i np r o d u c t i o no ff l a s kt o3 2 2 9 lf r o m1 71g l ， w h i c hw a s8 8 3 h i g h e rt h a nt h a to fi n i t i a lc o n d i t i o n s t h eb a t c hf e r m e n t a t i o na n df e d b a t c hf e r m e n t a t i o ni na10 lb i o r e a c t o rw e r es t u d i e d n a t a m y c i ny i e l do ft h eb a t c hf e r m e n t a t i o nw a s2 9 1g l i tm a d em y c e l i u ms t r o n g e rb y i n t e r m i t t e n c ef e e d i n gg l u c o s e ，a n dn a t a m y c i n y i e l dw a si m p r o v e dt o3 4 3 9 l t h e n a t a m y c i ny i e l do ff e d b a t c hf e r m e n t a t i o nw a s17 9 h i g h e rt h a nt h a to ft h eb a t c h f e r m e n t a t i o n k e y w o r d s ：n a t a m y c i n ；s t r e p t o m y c e sg i l v o s p o r e u s ；f e r m e n t a t i o n ；f e d - b a t c h ；d e t e r m i n a t i o n 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究 成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经 发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得塑兰堡盔些盘堂或其他教育机构的学 位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文 中作了明确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名：短口臣签字日期：础年月( ，。日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解塑兰垦壅些盘堂有关保留、使用学位论文的规定， 有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借 阅。本人授权塑兰垦壅些盘堂可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行 检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学位论文作者签名：力魄目己 签字同期：) 叻8 年6 月c , e i 学位论文作者毕业后去向： 工作单位： 通讯地址： 导师签名： 签字日期： 电话： 邮编： 窍bb 新型生物防腐剂纳他霉素发酵工艺的研究 1 引言 在乳制品、肉制品、果汁饮料等食品工业中，霉菌、酵母菌、丝状真菌的污染和 增殖给产品的生产和保藏带来危害，特别是当食品污染真菌后( 如黄曲霉a f l a v u s ； 寄生曲霉a p a r a s i t i c u s 等) 产生的真菌毒素具有强烈的致癌、致畸、致震颤、致出血、 致皮炎等致病性，真菌毒素给人类健康造成极大的伤害。因此食品原料的收获、存放、 以及食品的加工、保藏中真菌污染的防治，在上个世纪八十年代初即引起全世界的重 视1 1 1 。 人们在食品加工过程中添加防腐剂，来延长食品的保藏期和防止食品被真菌污 染。食品防腐剂根据其来源不同，可分为人工化学合成和天然生物防腐剂两类。经过 对一些纯化学防腐剂的研究发现，有些化学防腐剂有致病、引起中毒、致癌或潜在致 癌的可能性。如苯甲酸盐可能会引起积累性中毒现象，亚硝酸盐和硝酸盐可能生成致 癌变物质亚硝酸胺等。另外，化学防腐剂对生态环境也会造成不利的影响，必须严格 限制其在食品中的用量。近年来，随着经济的不断发展，人民生活水平的提高，健康 食品、绿色食品的概念越来越被大众提倡和接受，因此，开发天然高效、安全无毒、 性能稳定、广谱的天然防腐剂受到普遍关注。天然防腐剂主要来源于动植物( 或其分 泌物) 、微生物和矿物，其中，从微生物资源中开发天然食品防腐剂具有十分广阔的 应用前景【2 1 。 纳塔尔链霉菌( s t r e p t o m y c e sn a t a l e n s i s ) 、恰塔努加链霉菌( s t r e p t o m y c e s c 忍a 仃口，z d 9 缪瑚西) 和褐黄孢链霉菌( s t r e p t o m y c e sg i l v o s p o r e u s ) 等产生菌发酵生成的纳 他霉素( n a t a m y c i n ) 是一种高效、广谱的抗真菌剂，能有效的抑制和杀死霉菌、酵 母菌、丝状真菌，从而有效地降低强致病性真菌毒素对人类的侵害，同时可以延长食 品货架期，减少浪费【3 1 。我国现已批准使用的天然微生物防腐剂只有纳他霉素和乳酸 链球菌素( n i s i n ) 等少数几种。全世界已有三十多个国家将纳他霉素用于乳制品、肉制 品、果汁饮料、葡萄酒等的生产和保藏之q b l 4 , 5 j 。目前国内纳他霉素发酵的水平较低， 导致成本高、应用前景受到限制。因此，对纳他霉素发酵进行深入的研究和开发具有 重要意义。 1 1 纳他霉素的发现与命名 1 9 5 5 年，s t r u y k 等人从南非n a t a l 州p i e t e r m a r i t z b u r g 镇附近的土壤中分离到纳塔 尔链霉菌( s t r e p t o m y c e sn a t a l e n s i s ) ，并从中分离出了一种新的抗真菌物质。1 9 5 7 ， s t r u y k 等人称这种新的抗真菌药物为称为p i m a r i c i n ( 匹马菌素) 【6 】：1 9 5 9 年，b u m s 等人在美国田纳西州的c h a t t a n o o g a 的土壤中也分离到了一株恰塔努加链霉菌 ( s t r e p t o m y c e sc h a t t a n o o g e n s i s ) ，并从其培养物中分离到了t e n n e c e t i n ( 田纳西菌素) 。 此后的研究证明匹马菌素和田纳西菌素为同一物质，并被世界卫生组织w h o 统一命 名为n a t a m y c i n ( 纳他霉素) 【7 j 。我国早期曾译名为游霉素。 河北农业大学硕士学位( 毕业) 论文 1 2 纳他霉素的化学结构和理化性质 纳他霉素是一种多烯大环内酯类抗真菌抗生素，外观呈白色或奶油色，为无气味 无味道的结晶粉末，含有三分子以上的结晶水。分子式为c 3 3 h 4 7 n o l 3 ，分子量为 6 6 5 7 5 ，化学结构如图1 所示。纳他霉素是一种四烯大环内酯，四烯系统是全顺式， 内酯环上c 9 一1 3 部位是半缩醛结构，含有一个由糖苷键连接的碳水化合物基团，即 氨基二脱氧甘露糖( m y c o s a m i n e ) 。 图1 纳他霉素的分子结构 f i g im o l e c u l es t r u c t u r eo f n a t a m y e i n 纳他霉素是两性物质，分子当中含有一个碱性基团和一个酸性基团，其电离常数 p k a 值分别为8 3 5 和4 6 ，等电点为6 5 ，熔点为2 8 0 。其结构上存在两种典型构型： 烯醇式结构和酮式结构，这就决定了它在许多溶剂中的低溶解性。纳他霉素在水中或 低级醇中的溶解性随着p h 的降低或升高而增加，在中性p h 下溶解度最低，而在p h 低于3 或高于9 时溶解度增大。纳他霉素在各种典型溶剂中的溶解度见表1 。 纳他霉素的四烯发色团给分子一种高不饱和特性，可与溴和含活性氧的化合物如 高锰酸钾、高硫酸盐及过氧化物相互作用；另一方面，它以环氧族的形式保持弱氧化 性，当纳他霉素在冰醋酸中用热的碘化物处理后会析出碘。纳他霉素通过酸水解作用 可以释放出海藻糖胺，内酯可以通过碱水解作用皂化l o ，j 。 2 新型生物防腐剂纳他霉素发酵工艺的研究 表1 纳他霉素的溶解度 t a b l e1s o l u b i l i t yo f n a t a m y c i n 溶剂 溶解度( ) 水 乙醇 乙醇8 0 水2 0 甲醇+ 2 c a c l 2 甲醇 丙二醇 甘油 二甲基甲酰胺 冰醋酸 o 0 0 5 0 0 l o o l 0 0 7 1 5 3 3 1 4 - - 2 0 l 。5 5 o 1 8 5 纳他霉素的紫外吸收光谱如图2 显示，在2 9 0 、3 0 3 、3 1 8 n m 处有尖锐的吸收峰， 在2 8 0 n m 处有肩，2 2 0 n m 处有宽峰。由于纳他霉素含有四烯环，因此在2 8 0 3 2 0 n m 之间出现吸收峰，而在2 2 0 n m 的最大吸收是由于纳他霉素含有发色团。 客 s 燃 靛 警 图2 纳他霉素的紫外吸收光谱 f i g 2u v - s p e c t r u mo f n a t a m y e i n 1 3 纳他霉素的活性和稳定性研究 纳他霉素干粉在避光避潮下是稳定的化合物，室温下保存几年只有很小一部分 失去活性。三水化合物同样稳定，但其无水形态不稳定，在室温封闭的瓶子中保存 4 8 h 失去1 5 的活性。中性的纳他霉素水溶液几乎和干粉一样稳定。纳他霉素在含水 乙醇中结晶，形成细长强烈双折折射针形，有平行的消光性和正的延伸率。纳他霉素 河北农业大学硕士学位( 毕业) 论文 的稳定性受p h 值、温度、光照、氧化剂和重金属等条件的影响而变化【8 1 0 , 7 4 。 ( 1 ) p h 值 p h 值对于纳他霉素的稳定性有一定的影响，但对纳他霉素的抗真菌活性没有明 显的影响。纳他霉素在p h 4 5 , - - - 9 之间非常稳定，在p h 3 一9 内具有活性，在p h 5 7 范围内活性最强。据报道，纳他霉素于3 0 储存三个星期，在p h 5 7 的范围内保持 1 0 0 ，p h 3 6 时保持大约8 5 ，p h 9 0 时大约7 5 。在大部分食品的p h 范围内，纳 他霉素十分稳定。在极端p h 下纳他霉素迅速失活，形成各种各样的分解产物。在低 p h 值时其主要的裂解产物是海藻糖胺；在高p h 值时，如p i l l 2 ，由于内酯皂化可形 成纳他霉酸，用强碱处理导致进一步的分子破裂，产生一系列的后醛醇反应【l i 】。 ( 2 ) 温度 纳他霉素具有一定的抗热处理能力，温度对纳他霉素的活性几乎没有影响( 在中 性水溶液中) 。纳他霉素在室温条件下是稳定的，5 0 放置几天或1 0 0 。c 短时处理， 其活性几乎无损失。1 2 0 条件下加热不超过1 h 仍能保持纳他霉素的部分活性。 ( 3 ) 光照 纳他霉素在紫外光下分解，失去四烯结构。y 辐射也能使纳他霉素分解。 ( 4 ) 氧化剂 纳他霉素不宜与氧化剂如过氧化氢、漂白粉等接触，否则抑菌活性会明显f 、陴。 防止氧化的方法是使用抗氧化剂，如叶绿素、抗坏血酸、丁基羟基茴香醚、丁基甲苯 在占 寸o ( 5 ) 重金属 些金属离子可以促进纳他霉素的氧化失活，尤其是铁、镍、铅、汞等重金属。 因此，纳他霉素适宜存放在玻璃、塑料或不锈钢容器中，也可以添加e d t a 或聚磷酸 盐来防止失活。 ( 6 ) 鉴别用颜色反应 滴加一滴浓盐酸在纳他霉素晶体上，颜色马上变蓝；如果滴加一滴浓磷酸，颜色 马上变绿，几分钟后，都会变成浅红色。 1 4 纳他霉素的抑菌性质和安全性研究 1 4 1 抑菌性质 纳他霉素是一种广谱、高效的多烯大环内酯类抗真菌抗生素，能有效抑制和杀死 霉菌、酵母菌、某些原生动物和某些藻类剂，但是它没有抗细菌活性。多烯呈平面大 环内酷环状结构，能与甾醇化合物相互作用且具有高度的亲和性，对真菌有抑制活性， 其抗菌机理在于它能与细胞膜上的甾醇化合物反应，引发细胞膜结构改变而破裂，使 细胞内容物的渗漏，导致细胞死亡【1 2 , 5 7 , 7 5 】。但细菌的细胞壁和细胞膜不存在这些甾醇 化合物，所以，纳他霉素对细菌没有作用。 纳他霉素对于抑制正在繁殖的活细胞效果很好，而对于破坏休眠的细胞则需要较 4 新型生物防腐剂纳他霉素发酵工艺的研究 高的浓度【76 。纳他霉素对真菌孢子也有一定的抑制效果。1 9 5 6 年，t r e s n e r 曾测试过 纳他霉素对5 0 0 种霉菌的抗性，所有菌种都被1 1 0 p p m 的纳他霉素抑制。1 9 5 9 年， k 1 i s 比较了纳他霉素、山梨酸、放线菌酮、制霉菌素、龟裂霉素等的抑菌效果，发 现纳他霉素对1 6 种在肉汤和琼脂中培养的霉菌是最有效的抑制剂，绝大多数霉菌在 0 5 - - 一6 p p m 的纳他霉素浓度下被抑制，极个别的种在1 0 - - - 2 5 p p m 的纳他霉素浓度下被 抑制，多数酵母菌在1 o 5 0 p p m 的纳他霉素浓度下被抑制【l3 1 。 1 4 。2 安全性及毒性研究 纳他霉素对所有的霉菌和酵母菌几乎都具有极强的抗性，但对细菌、病毒等其他 的微生物则没有抗性。纳他霉素无毒，并且不致突变、不致癌、不致畸、不致敏。由 于其难溶于水和油脂，大部分摄入的纳他霉素会随粪便排出，很难被人和动物的消化 道吸收。据报道人体口服5 0 0 9 纳他霉素后，在血液中含量少于l m g m l ；给奶牛饲喂 高剂量的纳他霉素，结果表明，9 0 的纳他霉素及其分解产物经粪便排出【1 4 1 。 毒性试验确定经口服值为：小鼠1 5 2 5 9 k g 体重，大鼠2 7 4 7 9 k g 体重，家 兔1 4 9 k g 体重，狗1 0 9 k g 体重。对狗连续喂饲含o 1 2 5 9 k g 或0 2 5 0 9 k g 纳他霉素的 饲料没有发现不良反应【l 引。 经卫生学调查和皮肤斑点试验，表明纳他霉素无过敏性反映。1 9 6 6 年，l e v i n s k a s 等研究纳他霉素的急性毒性和慢性毒性，证明纳他霉素对人体器官没有明显影响，也 不产生伤害。1 9 7 3 年h a m i l t o nm i l l e 报道纳他霉素口服毒性最小，静脉注射毒性极大。 1 9 7 7 年，d eb o e r 和s t o l kh o r s t h u i s 研究了真菌对纳他霉素形成抗性的可能性，他们 在连续几年使用纳他霉素的食品仓库中，没有发现真菌形成抗性的证据，使用大于 m i c ( 最低有效抑制浓度) 的纳他霉素量，经过人为诱导也没有发现真菌形成抗性的证 据。1 9 8 2 年，r a y 和b u l l e r m a n 报道纳他霉素能减少黄曲霉产生的黄曲毒素、赭曲霉 产生的赭曲毒素、圆弧青霉产生的青霉酸、展开青霉产生的展开青霉素例。因此，纳 他霉素能减少真菌毒素给人类造成的危害，是一种高效、安全的新型生物防腐剂。 1 5 纳他霉素的特点及其应用情况 1 5 1 纳他霉素的特点 将纳他霉素和山梨酸盐在食品防腐方面的特点进行比较【1 5 , 1 2 。 ( 1 ) 无特殊感观形状 纳他霉素是白色或奶油色，无气味、无味道的结晶粉末。它对产品的口感特性无 任何影响，当应用于食品表面时，只停留在表面上，抑制容易生长在表面的霉菌和酵 母。而山梨酸盐具有强烈的苦味和一种柴油味，因受p h 值的制约其添加量一般大于 5 0 0 m g k g 从而影响制品的口感和风味。另外，山梨酸盐使用时会转移到食品内部， 这样就降低了其在表面的浓度，使己受到抑制的酵母菌和霉菌重新生长。 ( 2 ) 适用的p h 范围广 河北农业大学硕士学位( 毕业) 论文 纳他霉素在p h3 - 9 范围内具有活性，与常用的山梨酸钾等防腐剂相比，适用 p h 范围更宽。山梨酸钾属于酸性防腐剂，适宜在p h5 6 范围内使用，其防腐效果 随着p h 的升高而降低。 ( 2 ) 低剂量，高效率 纳他霉素对真菌有极强的抗性，使用微量即可起到作用。纳他霉素对付霉菌和酵 母菌的功效比山梨酸强5 0 倍以上。 1 5 2 纳他霉素的应用情况 19 8 5 年，w h o 和f a o 规定消费者每天纳他霉素最大摄入量( a d d 为0 3 m g k g 体重，奶酪和香肠的一般消费者每天摄入量为0 0 0 2 m g k g 体重【s 】。1 9 9 8 年g r a s 专 家组认定纳他霉素用于酸奶、奶油、干酪、酸性稀奶油和农家干酪非常安剑9 1 。目前， 荷兰、比利时、法国、西班牙、意大利、瑞典等国家都允许纳他霉素用于干酪和硬香 肠的防腐，荷兰还批准纳他霉素用于苹果和梨的防腐。在中国，纳他霉素被批准用于 干酪、肉制品、月饼、糕点、果汁原浆以及易发霉食品加工器皿的表面，一般采用 2 0 0 - - - 3 0 0 m g k g 悬浮液浸泡或喷洒，残留量不超过1 0 m g k g ；纳他霉素还可直接添加 到沙拉酱及发酵酒中，用量分别限定为o 0 2 9 k g 和1 0 m g k 9 1 3 l j 。 ( 1 ) 纳他霉素在食品中的应用 1 9 8 2 年6 月，美国f d a 正式批准纳他霉素可用作食品防腐剂。1 9 9 0 年1 月9 日， 我国卫生部食品监督厅签发了国内第一个生物食品防腐剂n i s i n ( 乳酸链球菌素或称 乳链球菌肽) 的使用合格证明，到1 9 9 6 年，中国食品添加剂标准化技术委员会正式批 准纳他霉素可作为食品防腐剂1 4 j 。乳链球菌肽对革兰氏阳性腐败细菌有抑制作用，对 酵母菌及霉菌等丝状真菌无效；而纳他霉素对酵母菌及霉菌等丝状真菌有极强的抑制 或杀灭作用，这一点正好与乳链球菌肽的抑菌谱互补【l 川。纳他霉素与乳链球菌肽是目 前国际上批准使用的仅有的两种生物食品防腐剂。 纳他霉素由于溶解度很低，被用作食品表面防腐剂以延长货架期，主要在奶酪、 肉制品、葡萄酒、茶饮料及果汁中添加，它不会干扰其它食品组分，也不会带来异味。 它在食品中的抗真菌作用是双效的：既可防止真菌引起的食品腐败，减少经济损失； 又可防止真菌毒素给人类造成的毒素型食物中毒。与传统的抗真菌剂比较，纳他霉素 有其独特的性质，它在很低的浓度下仍具有活性，例如：在奶酪中纳他霉素比山梨酸 钾活性高4 0 0 倍。在葡萄酒中，纳他霉素能取代山梨醇和其它抗真菌剂，它允许减少 所使用的s 0 2 量1 1 7 】。目前，全世界已有三十多个国家采用纳他霉素作为食品防腐剂。 ( 2 ) 纳他霉素在医疗中的应用 纳他霉素除了用作食品防腐剂，还可药用。近几年，报道纳他霉素用于医疗的文 献越来越多，它的临床应用范围也越来越广泛，因为它具有一些优良性质：非常低的 口服毒性；不会通过肠道吸收；没有发现过敏性及没有检测到交叉抗性。 纳他霉素口服不吸收，限于局部用药。纳他霉素以几种制剂形式( 悬浮剂、乳剂、 软膏和鞘状药片等) 被典型地用于抗皮肤和粘液膜的真菌感染，既可以单独使用又可 6 新型生物防腐剂纳他霉素发酵工艺的研究 以与新霉素、氢化可的松及其它类固醇共同使用。纳他霉素还可用于阴道和肺部真菌 感染的治疗【8 , 1 9 , 1 9 1 。 最近纳他霉素在眼角膜真菌感染方面的研究和报道层出不穷【2 5 , 2 6 , 7 列。j a n i 等报道 了用纳他霉素和崔西杆菌抗生素油膏治疗真菌性眼角膜溃疡的病例【l 引。d o r o c k a b o b k o w s k a 研究发现纳他霉素对口腔念球菌的感染有非常明显的治疗效果【2 0 。 t h o m a s 将纳他霉素溶液局部使用于眼角膜，发现纳他霉素对于由丝状真菌引起的角 膜炎也有明显的治疗效果，并且最佳的溶液浓度是5 2 1 j 。m o n i k a 等报道纳他霉素可 以治疗由短尾帚霉( s c o p u l a r i o p s i sb r e v i c a u l i s ) 引起的角膜炎1 2 2 j 。有人等用纳他霉素 和其它药物综合治疗由于白内障摘除引起的巩膜脓肿，效果明显 2 3 , 2 4 j 。 目前，纳他霉素已经广泛应用于食品、医疗、饲料、粮食储藏等领域中，特别是 在食品原料保鲜、成品防腐等方面的应用显示了良好的前景。 1 6 纳他霉素的生产和研究状况 1 6 1 纳他霉素生产菌菌株特征 纳他霉素产生菌为链霉菌，基内茵丝体通常发育良好，多分枝，无隔膜而连贯： 它的气生菌丝丰茂，气生菌丝通常较基内菌丝粗，颜色较深，当菌丝逐步成熟时，大 部分气生菌丝分化成孢子丝，产生呈长链的孢子，孢子为外鞘所包，鞘表面平滑或带 各种装饰物，在电子显微镜下表现为双短杆镶嵌图，有鳞片或形状和大小不同的突起、 刺或毛发等：孢子的分裂方式也有差异，有的沿横膈中央平切，有的两端浑圆，由残 余的鞘相连1 2 7 - 2 9 。 目前，报道的纳他霉素产生菌有三种： ( 1 ) 纳塔尔链霉菌( s t r e p t o m y c e sn a t a l e n s i s ) ，御5 3 5 7 孢子丝2 5 圈松敞螺旋形；孢子呈球形或卵圆形，表面带小刺。在琼脂培养基 上，气丝白色或黄灰色，浅褐灰色，浅灰红褐色。基丝反面无浅黄色或灰黄色、绿黄 色等鉴别色素。无可溶色素或迹量黄色，产生抗真菌的纳他霉素。 ( 2 ) 恰塔努加链霉菌( s t r e p t o m y c e sc h a t t a n o v g e n s i s ) ，a t c c1 3 3 5 8 孢子丝圈至螺旋形，有时柔曲；孢子呈球形或椭圆形，表面带细刺。在大部分培 养基内，基丝呈橙黄色至深黄橙色，可溶色素同基丝色，产生纳他霉素，抑制丝状真 菌和酵母。 ( 3 ) 褐黄孢链霉菌( s t r e p t o m y c e sg i l v o s p o r e u s ) ，a t c c1 3 3 2 6 孢子丝螺旋形；孢子呈球形或卵圆形，孢子表面带刺。在琼脂培养基上，气丝丰 茂、微褐，近于浅褐色，边缘白色，反面浅黄色。产生抑制真菌的纳他霉素。 1 6 2 多烯大环内酯抗生素的生物合成途径 多烯大环内酯抗生素的生物合成途径可以分解为活化前体的生成( 乙酰辅酶a 和丙二酰辅酶a ) 、内酯大环的生物合成( 多聚乙酰途径) 和氨基糖的形成1 3 0 1 。如图 7 河北农业大学硕士学位( 毕业) 论文 3 所示。次级代谢产物的化学结构比较复杂，合成所需要的前体物质也较多，合成代 谓 途径受到菌体的代谢环节也较多。 ，一- 一一一一一_ 一一- - - - 一一一_ _ t 聱聱簋 ：uil p i g - 鬻鞋赫麓 ： 1 l l l l i 6 确蕺果糖 t l ，j 一o l ，一一一一一一。一一。一弋。 n a d p hn d p 氰萋糖的芳香族化台钧 警硪u 徽l 勰 枷槲 皇 、- ， 器 值 磐 0 0 0 f i 0 1 0 1 50 2o 2 50 3 纳他霉素浓度( g l ) 图6 纳他霉素标准曲线 f i g 6t h es t a n d a r dc u r v go f n a t a m y c i n ( 7 ) 回收率与精密度试验 取发酵液1 2 份分成3 组，分别添加一定量的纳他霉素标准品，经过样品处理后， 分别进行检测，见表3 。三组的平均回收率和r s d 分别为1 0 0 5 ，1 0 1 0 ，1 0 0 1 和2 8 6 ，2 5 7 ，1 9 5 。由此可见，该方法灵敏度高，准确性好，可以作为纳他霉 素的检测方法。 表3 回收率与精密度试验 t a b l e3 r e c o v e r ya n dp r e c i s i o nt e s to fs a m p l e ( 8 ) 发酵液样品的检测 取5 批发酵液样品，分别取样经处理后，用h p l c 法检测，测得的纳他霉素的含 量分别为2 4 2 9 l ，2 5 5g l ，2 8 2g l ，2 3 7g l ，2 7 4g l 。根据以上结果分析，h p l c 法可以准确地测定发酵液中纳他霉素的含量。 2 0 0 鲫加的加地 新型生物防腐剂纳他霉素发酵工艺的研究 3 1 2 紫外分光光度法测定发酵液中的纳他霉素含量 ( 1 ) 发酵液样品溶液的处理 根据以上3 1 1 中的结果表明，甲醇作为提取试剂时，纳他霉素的保存时间最长， 提取效率最高，损失最小，且样品的最大吸收波长稳定在3 0 3 n m ( 如图7 ) ，因此确 定用甲醇作为发酵液样品的提取试剂。为了方便计算，采用1 ：9 的比例提取发酵液 中的纳他霉素。取l m l 的发酵液用甲醇定容到1 0 m l ，充分震荡，静置2 0 m i n ，便于 菌体上的纳他霉素全部溶于甲醇中。然后将溶液过滤除去菌体，取将滤液用甲醇适当 稀释，得到待测样品。 图7 祥品中纳他霉素紫外光谱扫描图谱 f i g 7u v - s p e c t r u mo f n a t a m y c i ni nt h es a m p l e ( 2 ) 标准曲线的建立 准确吸取不同浓度的标准溶液依次测定在3 0 3 n m 处的吸光值。以吸光值为纵坐 标，浓度为横坐标作标准曲线图，如图8 。线性回归方程为y = 1 4 5 蹦+ 0 0 0 7 8 ，r 2 = 0 9 9 9 6 。在浓度为0 0 0 1 - - 0 0 0 6 9 l 的范围内，吸光值与浓度成良好的线性关系。 j 四 米 餐 o0 0 0 10 0 0 20 0 0 30 0 0 40 0 0 50 0 0 60 0 0 7 浓度( g l ) 图8 纳他霉素标准曲线 f i g 8t h es t a n d a r dc u r y co f n a t a m y c i n 2 1 河北农业大学硕士学位( 毕业) 论文 ( 3 ) 回收率与精密度试验 取发酵液1 2 份分成3 组，分别添加一定量的纳他霉素标准品，经过样品处理后， 分别进行检测，见表4 。3 组的平均回收率和r s d 分别为9 9 4 ，1 0 0 7 ，1 0 0 3 和 3 7 7 ，3 1 0 ，2 6 5 。由此可见，该方法简单快速，准确度较高，可以作为纳他霉 素的检测方法。 表4 回收率与精密度试验 t a b l e4r e c o v e r ya n dp r e c i s i o nt e s to fs a m p l e ( 4 ) 发酵液样品的检测 取5 批发酵液样品，分别取样经处理后，用紫外分光光度法检测，测得的纳他霉 素的含量分别为2 2 8 e c l ，2 5 2 l ，2 3 6 l ，2 4 9g l ，2 6 1g l 。根据以上结果分析， 紫外分光光度法可以较为准确的测定发酵液中纳他霉素的含量。 通过对两种检测纳他霉素方法的分析，高效液相色谱法可以准确的测定发酵液样 品中的纳他霉素含量，但是不如紫外分光光度法更简便快速，而紫外分光光度法的精 密度低于高效液相色谱法，且考虑到紫外分光光度法有时会受到一些因素的干扰，难 以准确定量，故在检测中两种方法结合使用，达到既快速又准确的