（光学工程专业论文）用于海藻现场检测的荧光光谱仪的研究.pdf

用于海藻现场检测的荧光光谱仪的研究 摘要 近年来，赤潮的频繁发生给海洋生念环境带来了很大的影响，引起人们的广泛关注。 对海洋中海藻进行定性定量分析，可以估测海区内生态系统的群落结构和分布状态， 有效地监测和预报赤潮。荧光光谱法是海藻种类和浓度分析中常用的一种重要方法， 研制可用于海藻现场检测的荧光光谱仪对赤潮监测和预报具有一定的科研价值和现实 意义。 本论文针对海藻荧光的特点和实验测量的大量数据，根据海藻现场钡量的要求提出 了一种用于海藻现场检测的荧光光谱仪的设计方法，研制出原型机并进行了原型机的 小型化研究。该海藻荧光光谱仪采用上位机和下位机的结构。下位机由光路和以m c s s ! 单片机为核心的控制电路组成，主要实现激发光源选择控制、分光光栅扫描、光谱数 据采集、与上位机进行通信等功能，完成荧光光谱仪的底层控制。在光路设计上，根 据识别海藻激发波长的要求，结合现有l e d 管的采购状况，选用1 3 种发光二极管( l e d ) 作为激发光源，海藻产生的荧光采用切尔尼特纳( c z e m y t u r a 哪型光栅单色器分光，有 效地减小仪器的体积；使用光电倍增管作为光信号探测器，以提高系统的探测灵敏度。 在原型机中使用p c 机作为上位机，用v b 语言编写了控制软件，通过串行口控制下位 机的工作流程，实现光谱图线绘制、光谱数据存储等功能。实验结果表明，该仪器基 本达到了预期目的。 为了更适合现场检测和野外作业的要求，在原型机的基础上进行了使用a r m 嵌入 式系统替代p c 机的小型化研究。设计了基于i _ t c o s i i 实时操作系统和s 3 c 4 4 b o x 处 理器的嵌入式开发平台，实现了图形用户界面( g u i ) 、f a t 文件系统、u s b 通信等功 能。 在本设计中主要完成以下工作： 1 1 搭建了由高亮度l e d 为激发光源，切尔尼- 特纳( c z e m y - t u m e r ) 型光栅单色 器和光电倍增管组成的光学系统；建立了以m c s s i 单片机为核心的控制电路， 实现光谱数据采集。 2 ) 以p c 机作为上位机，使用v b 语言编写了上位机控制软件，完成样机制备并 进行了整机实验，验证了包括光路在内的总体设计的可行性。 3 ) 设计并实现嵌入式开发平台。引入嵌入式“c o s i i 实时操作系统和p c o u l 图 形用户界面，分析了p c g u t 图形用户界面的组织结构及其驱动程序的编写方 法，并将其移植到s 3 c 4 4 b o x 上。 4 ) 详细分析了f a t 文件系统，完成了嵌入式系统中对f a t l 6 文件系统的操作，实 现了现场测得的大量光谱数据的存储。 5 ) 基于u s b 设备控制芯片p d i u s b d l 2 实现了嵌入式系统与p c 机之间的u s b 通 信功能。与f a t l 6 文件系统相结合，将系统的数据存储器开发为u 盘，方便了 仪器与p c 机之间的数据传输。 关键词：海藻荧光；嵌入式系统；“c g u l ；f a t l 6 ；u s b i i i t h e s t u d y o ff l u o r e s c e n c es p e c t r o m e t e ru s e di n m e a s u r i n ga l g a eo n t h es p o t a b s t r a e t i nr e c e n ty e a r s ，t h ef r e q u e n to c c u r r e n c e so f t h er e dt i d eh a v ei n f l u e n c e dt h ee n v i r o n m e n t o f o c e a ng r e a t l y , a n da t t r a c t e dw i d e s p r e a da t t e n t i o n m a k i n gq u a l i t a t i v ea n dq u a n t i t a t i v e a n a l y s i sf o rt h ea l g a ei nt h eo c e a nc a ne s t i m a t ec o m m u n i t ys t r u c t u r ea n dd i s t r i b u t es t a t u so f e c o s y s t e mi ns o m es e aa r e a , a n dt h e nw e c a nm o n i t o ra n df o r e c a s tr e dt i d e f l u o r e s c e n c e m e t h o di sa ni m p o r t a n tm e t h o dt h a ti su s e dt oi d e n t i f ya l g a e sc l a s sa n dc o n s i s t e n c e a n a l y z i n g d e v e l o p m e n to f f l u o r e s c e n c es p e c t r o m e t e ru s e di nm e a s u r i n ga l g a e o nt h es p o t h a sar e s e a r c ha n dp r a c t i c a ls i g n i f i c a n c e f i nt h i sp a p e r , am e t h o do nh o wt od e s i g nak i n do f f l u o r e s c e n c es p e c t r o m e t e ru s e di n m e a s u r i n ga l g a eo ns p o ti si n t r o d u c e d a n da c c o r d i n gt ot h i sm e t h o d ，ap r o t o t y p ei n s t r u m e n t i sd e v e l o p e ds u c c c s s f u l l y t i i i si n s t r u m e n ti sd i v i d e di n t ou p p e rp a r ta n dl o w e rp a r tw h e n d e s i g n i n g 。n l cl o w e rp a r ti sm a d eu po f a c i r c u i tb a s e do nm c s 51a n do p t i c a ls y s t e m ，w h i c h a c h i e v e ss e v e r a lf u n c t i o n ss u c ha sc h o o s i n ge x c i t a t i o nl i g h t $ o u r c e ，c o n t r o l l i n gg r a t i n g ss c a n ， s p e c t r a ld a t ac o l l e c t i o n ，c o m m u n i c a t i n gw i t ht h eu p p e rp a r t w h e nd e s i g n i n gt h eo p t i c a l s y s t e m ，t h i r t e e nl e d sa r es e l e c t e da se x c i t a t i o nl i g h ts o b l c e ，a n dt h ec z e m y o t u r n e rt y p e m o n o c h r o m ei su s e dt om a k et h el i g h td i s p e r s i v e b o t ho f t h em e a s u r e sc a nh e l pr e d u c i n gt h e i n s t r u m e n t sv o l u m e a n du s i n gt h ep m ta sl i g h td e t e c t o rc a ne n h a n c et h es e n s i t i v i t yo f t h e i n s t r u m e n t t h eu p p e rp a r ti sap e r s o n a lc o m p u t e ri nt h i sp r o t o t y p ei n s t r u m e n t a n di th a s s 0 4 日t a , v a r ed e v e l o p e db yv bl a n g u a g e ，w i t ht h i ss o f t w a r ei ta c h i e v e sm a n yf u n c t i o n s ，s u c ha s c o n t r o l l i n gl o w e rp a r t sw o r kb ys e r i a lp o r t ，d i s p l a ya n ds a v et h es p e c t r u m e x p e r i m e n t s s h o wt h a tt h i si n s t r u m e n th a ss a t i s f i e da l ld e m a n d sr e q u i r e d i no r d e rt os a t i s f yt h ed e m a n d so fo u t e r - f l i e du s e ，a ne m b e d d e ds y s t e mu s i n ga r m p r o c e s s o ri sd e v e l o p e dt ot a k et h ep l a c eo f p e r s o n a lc o m p u t e r t l l i se m b e d d e ds y s t e mb a s i n g o nt t c o s i ir e a l - t i m eo p e r a t i o ns y s t e ma n ds 3 0 4 4 b o xp r o c e s s o rh a sr e a l i z e dt h eg r a p h i c u s e ri n t e r f a c e ( o u n ，r 盯f i l es y s t e ma n du s bc o m m u n i c a t i o nf u n c t i o n s t h ef o l l o w i n gw o r k sh a v e b e e nf i n i s h e di nt h i sp a p e r ： 1 ) f o u n da no p t i c a ls y s t e mi n c l u d e sh i g h - b r i g h t n e s sl e d sa sl i g h ts o u r c e ， c z e m y t u r n e rt y p em o n o c h r o m ei n s t r u m e n ta n dp m t a n df o u n d ac o n t r o lc i r c u i t b a s e do nm c s 5lt of i n i s hs p e c t r a ld a t ac o l l e c t i o n 2 ) d e v e l o ps o f i 7 a r ef o rc o m p u t e rw i t hv bl a n g u a g et oa c h i e v es p e c t r a ld i s p l a y , s p e c t r a ld a t as t o r a g ea n do t h e rf u n c t i o n s 3 、d e s i g n e da ne m b e d d e ds y s t e mi n c l u d i n gp c o s i ir t o sa n dp c g u i h a v e a n a l y z e dt h es t r u c t u r eo fu c g u ia n dh o w t op r o g r a mt h ed r i v e r , a n dp o r t e di tt o t h es 3 c 4 4 8 0 x sl c dc o n t r o l l e r 4 ) a c h i e v e dt h ef u n c t i o ni n t e r f a c et oa c c e s sf a t l 6f i l es y s t e m s oi tc a ns t o r et h em a s s d a t am e a s u r e di nt h es p o t 5 ) u s i n gt h eu s b c o n t r o l l e rc h i pp d i u s b d 12 c o m m u n i c a t i o nf u n c t i o nb e t w e e nt h e e m b e d d e ds y s t e ma n dp e r s o n a lc o m p u t e ri sa c h i e v e d t o g e t h e rw i t hf a t l6f i l e s y s t e m ，t h ed a t af l a s hm e m o r yi sd e v e l o p e dt ob eaud i s k w h i c hm a k e st h ed a t a t r a n s m i s s i o nb e t w e e nt h ei n s t r u m e n ta n dp e r s o n a lt o m p u t e rv e r yc o n v e n i e n t k e yw o r d s ：a l g a ef l u o r e s c e n c e ；e m b e d d e ds y s t e m ；p c g u l lf a t l 6 tu s b v 绪论 1 绪论 1 1 引言 浮游植物是海洋生念系统中最主要的初绂生产者和能量的主要转换者，其体内含有 叶绿素，可以通过光合作用将无机物( 如硝酸盐、磷酸盐) 转换成为新的有机化合物( 如 脂肪和蛋白质) ，由此启动了海洋中的食物链。浮游植物的生物量多少决定了海区内生 态系统的群落结构和能量分御状态，浮游植物生物量及群落结构的变化与海洋环境的变 化关系密切。通过对浮游植物生物量和群落结构的研究能了解海洋生态环境变化的趋 势，为人类开发和利用海洋资源提供依据。藻类在海洋浮游植物中占据了很大的比例。 目前，某些海域经常发生的赤潮现象就与藻类浮游植物有关。 赤潮又称有害海洋藻类水华，是海洋中某些微小的浮游藻类、原生动物或细菌在一 定条件下爆发性繁殖或聚集引起水体变色的一种有害的生态异常现象，表现为海洋藻类 在一定时期内浓度的突然变化。当藻类浓度超过一定数量，即认为发生了赤潮1 1 】。赤潮 属于一种海洋灾害，既是一种自然现象又与很多人为因素有很大关系。人类生活中大量 未经过处理的工业废水和生活污水流入大海，导致海水的富营养化，为海藻的大量繁殖 提供了物质基础。出于浮游植物大量繁殖，造成海水中溶解氧减少，海水中的动物会因 为缺氧而死亡，给海洋生态环境造成巨大破坏，也给人类带来巨额的经济损失。 因此，对海藻进行监测是很有意义的。从生态学角度说，它对人类分析和研究海洋 初级生产力提供了研究的数据基础；从预防自然灾害的角度说，有助于人类了解赤潮发 生的机理和危害，以便采取必要的措施，力争防止赤潮的发生和减轻赤潮灾害带来的损 失。监测海藻状态，辨别出海藻的类别和浓度，可以了解海区内生态系统的群落结构和 能量分布状态，有效地监测和预报赤潮【l 】。 1 2 海藻状态监测方法 藻类的检测一直是海洋监测的重要一环，在早期的方法中比较典型的褂2 】： ( 1 ) 计数法：将要测量的海水取出，用一定的色素使海水中的藻类呈现容易辨认 的颜色，然后从该海水随机提取一定微小体积的单元，将提取的海水放置于高倍数放大 镜下进行计数。数出一定体积内藻类细胞的个数，就能计算出提取的海水中藻类的浓度。 这种方法存在实时性差、从提取样品到计数所经历的时白j 较长、误差较大。 ( 2 ) 吸光法：将要测量的海水放置在透明的容器中，用一定波长的光照射容器， 测量通过海水后收集到的光强。该系统的原理是利用海水中的藻类对一定波长的光的吸 收特性，该种方法无法克服海水中其它物质对照射光的散射和吸收，所以存在较大误差。 此外还有其它监测海水中藻类的方法，如黑白瓶法，c ”法，叶绿素a 测量法，高效液 用十湘雒脱场 盘测的荧光光 竹仪的研究 相色谱等。这些取样分析测量方法存在取样困难、定位误差大、测试周期长、需实验室 做复杂的分离样品分析而不能进行现场连续监测等缺点【”。 1 9 6 6 年，l o z r e n z e n 提出了荧光法，它具有灵敏度高、快速、重现性好、取样容易、 试样需要量少、很容易实时得到有关藻类分前】自q 高灵敏度在线信息等优点。随着荧光技 术的成熟发展，目前已广泛地应用于海洋环境检测的许多领域。这是由于它能使那些需 要进行化学分析的问题，而用物理方法来处理。它具有极高的检测灵敏度，被测样品无 需制备，即可实时检测。荧光仪器的输出值与被测物质的浓度成比例关系，对物质具有 良好的鉴别性，在测量时不受其他微粒物质的影响聊。 1 3 用于海藻检测的荧光仪器的国内外发展现状 用于海藻检测的荧光仪器可以分为两类：一是通用的荧光分析仪器，如荧光分光 光度计；另一类是专门用于海藻种类识别和浓度测量的荧光仪器。 生产通用荧光分光光度计的国外厂家有r 立、岛津、p e 公司等，开立和岛津公司 的荧光分光光度计在国内市场中占有绝对优势。 国内荧光分光光度计的研制起步较晚，多为自彳亍装配，而商品化的仪器不多，已形 成商品化的仪器有：天津光学仪器厂生产的w f d 系列产品，厦门分析仪器厂生产的 g f y 系列以及与厦门大学合作研制的y f 型系列产品。另外上海第三分析仪器厂先后 生产几种型号荧光分光光度计，如9 7 0 m c 型荧光分光光度计，天津光学仪器厂，厦门 分析仪器厂，上海第三分析仪器厂等有商品化的荧光分光光度计。另外很多科研院所也 都根据自己的需求进行了荧光分光光度计的研制。 由于荧光分光光度计灵敏度高、特异性强，因此应用范围较为广泛。但由于它对 样品有一定要求，所以目前还不属于实验室的常规仪器，一般用于科研工作。 德国b b e - m o l d a e n k e 公司制造的藻类在线分析仪使用5 个发光二极管作为激发光 源，其峰值分别在4 5 0 n m ，5 2 5 n m ，5 7 0 n m ，5 9 0 n m 和6 1 0 r i m 处，用光电倍增光测量荧 光强度。该设备采用荧光技术，在线检测叶绿素荧光强度确定海藻的种类，同时分析出 各类不同的藻的浓度。设备能实时给出总的叶绿素荧光强度，以及各种海藻的浓度变化 曲线。仪器把藻类分为绿藻、蓝绿藻、硅藻和棕藻共四类分别检测。硅藻和甲藻光谱相 似，无法分开。通过直接测量海水可对四类浮游植物进行定性定量，用于浮游植物的粗 略分类。仪器检测范围：0 2 0 0 微克( 叶绿素) 升；综合分辨率：3 微克( 叶绿素) 升；叶绿素分辨率：0 1 微克( 叶绿素) 升h 。 国内对海水中浮游植物( 海藻) 浓度现场测量方面的研究始于8 0 年代未。 1 9 9 0 年，国家海洋局第一海洋研究所夏达英等人在国内首次研制成功了海水叶绿素 a 现场测量仪1 5 1 。该仪器采用高强度、窄脉冲宽度的脉冲氙灯为激发光源，用光电倍增 光测量荧光强度。为了有效分离叶绿素a 所产生的荧光和激发光的散射光，将荧光信号 绪论 的检测选择在粒子敝射最小的角度( 9 0 。) ，并采用高阻塞系数窄带干涉滤光片作为光 谱滤光。该仪器用于海上现场实时测量海洋中浮游植物体内叶绿素a 含量，测量浓度范 围为：l 1 矿一1 1 0 4 9 c m ) 。可在海表层至5 0 m 水深内任意r 光强度下工作。 燕山大学王玉田等人研制了一种光纤荧光海藻叶绿素a 浓度实时测量系统1 6 j 。采用 h e - n e 激光器作为激发光源，低损耗石英光纤束作为光信号传输通道。光电倍增管作为 荧光信号探测器。采用高阻塞系数的干涉滤光片作为光谱滤光，有效分离叶绿素a 所产 生的荧光和激发光的散射光。采用双光路、双通道测量方式消除激发光源波动对测量结 果影响，参考光路和信号光路分别经过光电倍增管得到电流信号，由i n 电路转换成电 压脉冲后，采用光子计数器进行测量并显示，并且通过r s 2 3 2 接口向p c 机传递数据文 件进行存储。其叶绿素a 最低检测浓度可达l l 旷g l 。 上述仪器各有利弊，有各自的适用场合，在赤潮浮游植物种类和数量测定中都是有 意义的。通用荧光分光光度计获得的光谱信息比较全面，但是其价格比较昂贵。德国 b b e 藻类在线分析仪使用方便，但只能检测四种藻类，但尚不能区分甲藻、硅藻。海水 叶绿素a 现场测量仪和光纤荧光海藻叶绿素a 浓度实时测量系统激发波长单一，只能测 定叶绿素a 浓度，不能辨别出海藻的类别。一般而言，不同种类的海藻中含有的色素成 分是不同的，所以其荧光光谱也不相同。实验室中通常使用荧光光谱仪测定海藻的荧光 光谱，根据荧光光谱中的特征峰值分析出海藻中含有哪些色素，对海藻色素的分析可用 于海藻的分类和生物量的测定。如果是一个未知成分的海藻样品，通过对海藻荧光光谱 的分析可以得知其中的主要色素成分，将分析结果与已知海藻的色素成分进行比较进而 判别海藻的种类；而如果是已知海藻种类的样品，则可以通过将样品的荧光光谱强度与 已知浓度海藻的荧光光谱强度进行比较，测定海藻的相对浓度。 1 4 课题研究的目的和意义 本课题源于“近海赤潮浮游植物荧光检测技术研究”的。8 6 3 ”科研项目。由于现 有的荧光光谱仪不能满足较低的海藻浓度检测限要求，针对海藻的特点研制一种可用于 现场检测、低检测限的荧光光谱仪。 由于需要检测的海藻的浓度检测限比较低，所以要求激发光的光强比较强。现今大 部分的荧光光谱仪的激发光源采用的是氤灯、氘灯等具有连续光谱的光源，因此激发光 还要经过一个单色仪进行分光，这样势必增大仪器体积。本设计中采用1 3 个高亮度发 光二极管作为激发光源，这1 3 种波长包含了海藻中主要色素的最佳激发波长。在进行 海藻检测时，可以根据实际需要选择其中一种或几种激发波长。光信号的探测方面采用 的是光电倍增管，从而保证了光信号探测的灵敏度。 用十渤 ； 脱场柠测的荧光光聃仪的研| c 1 5 本论文的主要研究内容 本文将荧光光谱仪在结构上划分为上位机和下位机两部分：下位机包括光路和仪器 的底层控制电路；上位机控制仪器的整个工作流程。在仪器整个设计过程中，将设计工 作分为两个阶段进行： 第一个阶段主要的研究内容是设计出仪器的原型样机，并进行海藻荧光测量实验， 验证总体设计方法的可行性。在该阶段中主要的工作有：通过文献调研，充分理解光路 的各种参数对荧光光谱仪性能的影响，根据仪器要达到的技术指标选择合适的光学元 件，搭建光路；设计下位机中的硬件电路和软件，完成激发光源选择控制、分光光栅扫 描、光谱数据采集、与上位机进行通信等功能；将p c 机作为上位机，设计上位机中的 控制软件，完成光谱数据绘图显示、数据保存等工作。 第二个阶段的工作内容是改善仪器的各种不足并主要进行仪器的小型化设计小型 化的主要手段是设计一个嵌入式系统取代p c 机作为上位机，并将该嵌入式上位机与下 位机集成为一个整体。在设计中以具有a r m 内核的s 3 c 4 4 b o x 处理器为核心，基于嵌 入式操作系统l j c o s i i 搭建了一个具有p c g u i 图形界面、f a t l 6 文件系统以及u s b 通信的等功能的嵌入式系统平台，并完成上位机的控制功能。 4 海凛，忡光测量蟓理 2 海藻荧光测量原理 荧光法监测海藻状态主要是测定海藻在激发光照射下的荧光激发光谱和荧光光谱， 根掘它们设度和形状的不同，对海洋中的藻类进行定性和定量分析，为了解海洋的生态 结构提供依据。 2 1 荧光测量原理 当激发光照射某些物质时，处在基态的分子吸收激发光后跃迁为激发态，这些激发念 分子在因转动、振动等损失一部分激发能量后，以无辐射跃迁下降到低振动能级，再从低 振动能级下降到基态，在此过程中激发态分子将以光的形式释放出它们所吸收的能量，这 种光称之为荧光，所得到的光谱称为荧光光谱1 7 】。可产生荧光的分子或原子在接收能量 后即刻引起发光，供能一旦停止，荧光现象随之消失。荧光光谱能够反映荧光物质的特 性。荧光光谱仪是基于物质的这种性质而对其进行定性及定量分析的一种分析仪器。 由化学反应引起的荧光称之为化学荧光，由光激发所引起的荧光称为分子荧光。按 产生荧光的基本微粒的不同，荧光可分为原子荧光、x 射线荧光和分子荧光。 2 1 1 分子荧光的产生机理 当光照射某一物质时，可能全部被吸收，或部分被吸收，也可能不被吸收。各种物 质的分子具有不同的结构，因而具有它们特殊的频率。当所照射的光线和被照射的物质 的分子具有相同频率时，则发生共振，即入射光被该物质的分子所吸收。在该物质的吸 收光谱中，分子所具有的特征频率处将出现吸收带。 在光的吸收过程中发生能量的转移。根据量子理论，分子从光线中所吸收的光子能 量由下式表示： 置一e = y = 了h e 式( 2 - 1 ) 式中e o - 吸光物质的基态能级；e 广吸光物质较高的能级；h - 普朗克( p l a i l k ) 常数； y 一光的频率；名一光的波长；c 一真空中的光速。 用分子结构理论来讨论荧光的产生机理。分子中电子的运动状态除了电子所处的能 级外，还包含有电子的多重念，用m = 2 s + i 表示，s 为各电子自旋量子数的代数和，其 数值为0 或l 。若分子中所有电子都是自旋配对的，则s = o ，m = i 该分子便处于单重态 ( 或叫单线念) ，用符号s 表示。基态分子吸收能量后，若电子在跃迁过程中，不发生自 旋方向的变化，分子处于激发的单重态；如果电子在跃迁过程中伴随着自旋方向的变化， 分子处于激发的三重态，即s = i ，m = 3 ，用符号t 表示。在同一激发态中，三重态能级 用十洳i j ；l 现场榆删的荧光光i 件仪的圳，彳c 总是比单重态能级略低，图2 - i 为能级及跃迁示意图嗍。 i f ， t 西5 毗 q ： jj f 3 仃7 l i 二 l li i j j j i酬i a 善ii 训r 铷 3 哪 j 屯 圈2 - 1 吸收光谱和荧光光谱能级跃迁豕意图 。母垃， 竹牲址 在光线照射下。一部分分子吸收光辐射后可能从基念跃迁至较高能级而成为激发分 子。这部分激发分子是不稳定的，它们首先因撞击而以热的形式损失掉一部分能量，从 所处的激发能级下降至第一电子激发念的最低振动能级，然后再由这一能级下降至基念 的任何振动能级。在后一过程中，激发分子以光的形式放出它们所吸收的能量，发出的 光称为荧光，如图2 1 所示。因分子碰撞发生一部分能量损失。所以荧光发射的能量比 分子吸收的能量要小，荧光发射的波长比分子吸收的波长要长。第一激发单重态最低振 动能级的平均寿命为l o l 9 1 0 4 s ，因此荧光寿命也在这一数量级。 激发分子在下降至第一激发态的最低振动能级后，经无辐射跃迁到达亚稳态的三重 线级，在这里逗留的时间较长( 有时常达l s 以上) ，然后再由这里降落到基态的任何振 动能级。从三重线级降落到基态所发出的光为磷光，磷光波长比荧光波长要长。因激发 分子在三重线级所逗留的时间稍长，有时在入射光光源关闭之后，还存在磷光。而荧光 因激发分子在很短暂的时间内便下降到基态，所以在入射光光源关闭之后立即消逝。处 于三重线级的激发分子还可能通过热激发而重新跃回第一激发态，然后再由第一激发态 经辐射跃迁回基态，发出荧光，这种荧光称为延迟荧光【9 】。 几乎所有物质分子都有吸收光谱，但不是所有物质都会发荧光。产生荧光必须具备 以下条件： 该物质分子必须具有与所照射的光线相同的频率，这与分子的结构密切相关。 吸收了与本身特征频率相同的能量之后的物质分子，必须具有高的荧光效率。许 多吸光物质并不产生荧光，主要是因为它们将所吸收能量消耗于与溶剂分子或其它分子 之问的相互碰撞中，还可能消耗于一次光化学反应中，因而无法发射荧光，即荧光效率 很低【1 0 1 。 荧光效率也称荧光量子产率，它表示所发出荧光的量子数和所吸收激发光的量子数 的比值，即 6 街艇荧光捌置蟓理 荧光效率= 薏燃式( 2 - 2 ) 它足衡量物质发射荧光能力的尺度，如果荧光物质将所吸收的能量以无辐射跃迁的 形式失去能量，荧光效率低，荧光就弱。反之如果荧光效率高，所产尘的荧光就强。 叶绿素( 苯溶液中) 的荧光效率约为0 3 2 。 由荧光的发光原理可知，分子荧光光谱与激发光源的波长无关，只与荧光物质本身 的能级结构有关。所以，可以根据荧光谱对荧光物质进行定性分析鉴别l l o 】。 2 1 2 影晌荧光强度的因素“1 1 溶剂的影响：同一种荧光物质在不同的溶剂中，其荧光光谱的位置和强度都会有 显著的差别。因此进行荧光分析实验时，需选择合适的溶剂，且要求溶剂达到足够的纯 度，以避免溶剂中杂质对被测试样荧光光谱的影响。 温度的影响：温度影响溶液的荧光强度。随着溶液温度的升高，介质粘度增大， 分子运动速度也变大，从而使荧光分子与溶剂分子或其它分子的碰撞机率增加，分子内 部能量损失变大，因此，荧光产率降低。 激发光照射的影响：某些荧光物质的溶液在激发光长时间的照射下不会发生显著 变化，但有些荧光物质的稀溶液在激发光照射下发生感光分解作用，从而引起荧光强度 的降低。某些物质受光线的照射后，将所吸收的光线的能量用于断裂分子内的一个键或 几个键，使该物质遭到分解。为了避免感光分解作用引起的误差，必须缩短溶液受激发 光照射的时间。 散射光和喇曼光的影响：散射光和喇曼光对荧光分析有显著影响，常成为限制荧 光分析法灵敏度的主要因素，常通过选择适当的测定波长，降低激发光强度的措施来降 低其影响。 2 2 荧光法分析海藻的可行性 根据物质分子吸收光谱和荧光光谱能级跃迁机理，在吸光过程中，荧光物质的分子 可以有几个不同的吸收带，但荧光只有一个峰带。吸收光谱和荧光光谱呈带状是由于基 态和激发态都各自有不同的能量分布。不同的荧光物质由于它们的分子结构和能量分布 的差异，各自显示出不同的吸收光谱和荧光光谱特性。叶绿索a 的两个明显的吸收谱带 的峰值分别在4 2 0 n m 和6 6 5 n m 附近，且在4 2 0 h m 附近的吸收带较宽。 海藻是由多种色素组成的海洋生物，其中叶绿素a 是负责光合作用的主要色素叶 绿素b 、叶绿素c 、类胡萝h 素，藻胆色素等都作为辅助色素。某类群的藻类含有某种 或某几种辅助色素，海藻种类不同，其所含的特征色素也不同。这些特征色素吸收不同 波长的光并发出荧光，激发光谱和荧光藻类色素经常作为鉴定不同藻类和估测浮游植物 群落组成的特征标示物。 用1 二潮j i i j j 巳场榆测的荧光光晰仪的圳兜 对海藻色素的分析可用于海藻的分类和生物量的测定。叶绿素a 存在于所有的光养 种群中，其浓度通常用于估测浮游植物的生物量和生产力，而其降解产物则用于研究浮 游植物的生理状况、碎屑含量和猎食过程。其他主要辅助叶绿素( 叶绿素b 和叶绿素c ) 、 一些类胡萝卜素、藻胆蛋白的存在与否是海藻分类的重要特征。 通过对各种提纯的特征色素和海藻活体荧光光谱分析，根据海藻产生特征荧光所需 的激发波长和市场上l e d 的采购状况。总结出用于海藻识别的1 3 个最佳激发波长。在 仪器设计时选用波长为3 9 2 n m ，4 2 8 n m 。4 4 8n m ，4 5 2 n m ，4 6 0 n m 。4 7 2 n m ，5 0 4 n m ，5 1 2 n m ， 5 2 4 n m 5 6 4 n m ，5 7 6 n m ，5 9 2 n m ，6 1 0 r i m 共1 3 种波长的高亮度l e d 作为激发光源。 在迸行海藻检测时，可以根据实际需要选择其中的一种或几种激发波长。 8 系统的艘件世汁 3 系统的硬件设计 荧光光蹭仪从整体j 二看，分为光路和电路两部分。 光路部分是系统的仪器的主体部分，由激发光源、会聚透镜，样品池、分光系统、 光电倍增管等部分组成。主要实现样品荧光的激发、探测等功能。其光学结构设计、器 件的选择都直接决定着系统的性能指标 光路部分的基本结构框图如图3 - l 所示 图3 - 1 光路基本结构框图 电路控制部分完成探测器输出信号的处理，包括光电信号的转换、信号放大、信号 a d 转换，光谱数据存储、光谱图线显示等功能。 电路部分的功能框图如图3 - 2 所示。 l 信号放大i _ 叫信号采集卜 i 扫描电机控制 _ 一 下位机 i 电机位置探测卜_ 呻 ，。、 上位机 m c u 、y i 光源控制 + 一 i 狭缝电机控制 一 图3 - 2 电路功能框图 将系统分为上位机和下位机两部分。上位机完成光谱数据存储、数据绘图显示等高 级功能，而电机控制、电机位置探测、光源选择等底层的控制交给下位机的单片机完成。 两者之问通过串行口通信，传输命令和数据。上位机发送控制命令给下位机，下位机执 行接收到的命令，两者配合完成光谱采集功能。 3 1 系统的光路设计 系统的光路部分的基本结构框图如图3 1 所示，包括激发光源、会聚透镜1 、样品 池、会聚透镜2 、分光系统等部分组成。 下面对以上几个组成部分进行逐一介绍。 9 用于海凝现场检测的荧光光讲仪的研究 3 1 1 光源 荧光光谱仪的激发光的单色性、强度等指标直接影响着仪器的可靠性和使用效果。 传统的激发光源有激光器、汞灯、氙灯等，必须使用滤光片或者单色仪产生单色光，并 且体积较大、安装不方便。因此，以传统光源研制的荧光光谱仪，不利于仪器的小型化、 便携式使用，限制了其应用的场所。 本系统选用发光二极管( l e d ) 作为激发光源。与传统的激发光源相比，l e d 具有以 下优点f 1 2 1 ： 1 ) 最显著的特点是不再需要单色器，使光路大大简化。 2 ) 发光响应时间极短，高频特性好，单色性好，有利于提高检测速度和检测质 量 3 ) 亮度高传统的激发光源经单色器分光之后，激发光的强度大大减弱。而l e d 不需要单色器分光，所以亮度高，有利于提高仪器的检测灵敏度。 4 ) 体积小、重量轻、抗冲击性能好，可将多只管子集成在一个圆端面上，从而可 以设置多个激发波长。 5 ) 价格低，性价比高，降低了整个系统的成本。 本系统选用波长为3 9 2 n m ，4 2 8 r i m ，4 4 8n m ，4 5 2 n m ，4 6 0 r i m ，4 7 2 n m ，5 0 4 r i m ，5 1 2 r i m ， 5 2 4 n m j5 6 4 n m ，5 7 6 n m ，。5 9 2 n m ，6 1 0 r i m 共1 3 种波长的高亮度l e d 。将这1 3 个l e d 集成 在一个圆形盘面上，示意图如图3 3 所示。该圆型盘面在步进电机的带动下转动到不同 的位置，将不同的l e d 对准光路的入口，从而选择不同的激发波长。 3 1 2 前置先路 圈3 - 3 光源盘面示意图 仪器中除分光系统之外的光路由光源、透镜、样品池等组成，其示意图如图3 - 4 所 示。将l e d 和样品池置于透镜b 的两侧两倍焦距处。这样a 、c 之阅的光程最短，并 且使照射到样品上的激发光强达到最大。同样的道理将透镜c 、分光系统的入射狭缝e 置于透镜d 的两侧且为两倍焦距处。 荧光辐射是从样品发生的，其在所有方向的辐射都相同。所以原则上可以从任何角 度进行观测，但是考虑到激发光的透射和散射，9 0 。角度是最方便且是目前使用较为广 i o 系统的韧! 件改汁 泛的方式。此时，激发光源的透射光和散射光对样品荧光的影响比较小。 3 1 3 分光系统 a l e d 激发光源 b 激发光源成像透镜 c 样品池 d 荧光成像透镜 e 分光系统的入射狭缝 图3 - - 4 前置光路示意圈 分光系统对样品的荧光进行分光，获得荧光光谱。其结构为切尔尼特纳 ( c z e m y - t u m e r ) 型结构，示意图如图3 5 所示。它主要由入射狭缝、准直球面镜、光栅、 成像球面镜、出射狭缝组成。入射狭缝起着限制杂散光入射的作用，一般将其置于准直 球面镜的焦点上；准直球面镜将从入射狭缝进入的复合光变为平行光入射到光栅上；系 统采用光栅作为分光器件；成像球面镜将从光栅出射的色散之后的光会聚到出射狭缝 上：出射狭缝置于成像球面镜的焦平面上，起限制光谱带宽的作用。在该系统中，出射 狭缝和入射狭缝对称分布在光栅的两侧，其最大的特点就是像差( 慧差) 比较小【l 引 推直球面镜成像球菌镜 入射狭缝出射狭缝 圈3 - 5 分光系统结构示 系统设计了多个宽度不同的入射狭缝，在步进电机的带动下可以根据荧光的强度选 择不同的狭缝。在荧光比较强的时候，可以选择窄的狭缝，这样可以提高系统的分辨率； 反之则选择宽的狭缝，增加荧光的光通量，以保证检测的灵敏度。 图3 5 中所示光栅在步进电机的带动下可绕垂直于平面的轴转动，在不同的角度下 l l 用f 海藻现场檎测的荧光光谭i 仪的研究 在出射狭缝处有不同波长的准单色光输出，从而实现分光的波长扫描。 3 2 系统的电路设计 下位机的电路设计主要分为以下几个部分：光电信号转换、信号放大电路、a d 转 换电路、步进电机控制、激发光源供电电路等。以下将系统硬件电路的各个组成部分进 行逐一介绍。 3 2 1 单片机简介 单片机选用5 1 内核的a t 8 9 c 5 5 w d 。a t 9 9 c 5 5 w d 是一个低电压，高性能c m o s8 位单片机，片内含2 0 k 字节可反复擦写的f l a s h 只读程序存储器和2 5 6 字节的随机存取 数据存储器( r a m ) ，器件采用a t m e l 公司的高密度、非易失性存储技术生产，兼容标 准m c s 5 1 指令系统，引脚兼容工业标准8 9 c 5 1 和8 9 0 5 2 芯片，采用通用编程方式， 片内置通用8 位中央处理器和f l a s h 存储单元，适用予低端嵌入式应用系统。特别是可 反复擦写的f l a s h 存储器可有效地降低开发成本t l ” 由于a t 8 9 c 5 5 w d 片内含程序存储器( r o m ) 和数据存储器( r a m ) ，因此它不用再扩 展r a m 或者r o m 。其最小系统比较简单，在此不作详细介绍。 3 2 2 光电转换电路 ， 系统采用光电倍增管作为光电转换的元件，光电倍增管具有极高的放大倍数、极高 的灵敏度，并且转换所需的时间极短。由于荧光的信号一般非常弱，所以通常选择光电 倍增管作为荧光检测的元件。本系统选用日本滨松公司生产的型号为r 9 2 8 波长检测范 围在1 8 5 9 0 0 r i m 的光电倍增管i t 5 l 。光电倍增管的供电原理图和放大电路原理图如图 3 _ 6 所示。 光电倍增管工作时需要上千伏的高压，并且由于光电倍增管是将光信号转换成电信 号的关键元件，光电倍增管的输出信号也特别地容易受到所加电压的波动的影响，所以 供电电压一定要有很好的稳定性、较小的纹波、漂移和温度系数，以保证良好的光度重 复性 选用天津市东文高压电源厂生产的d w - n 1 0 2 1 d 型电源作为光电倍增管的供电电 源。它可以提供可调的1 0 0 0 v 的输出电压，输入电压为1 5 v 。p m t 的阳极p 的输出电 流在采样电阻r 1 1 上产生电压，该电压经过u 2 和u 3 两级放大电路放大。放大后的 信号v o u t 接到a d 转换电路。r 9 2 8 的增益对供电电压非常敏感，而d w - n 1 0 2 一i d 型 高压电源的输出电压可以通过r 1 2 进行调节，所以在使用的过程中可以通过调节r 1 2 调节测量的灵敏度。 1 2 系统的龇件i 5 i t 。 暑 考 苦丢 善 誉暑。 粤辫一 豇。庹v 。碣瞩 3 2 36 d 转换电路 图3 - 6 光电转换原理图 放大电路的输出信号要经过a d 转换，才能成为可以被处理器处理的数字信号。 本文中选用的是t i 公司生产的a d s l l l o 芯片，这是一精密的连续自校准模数( a d ) 转 换器，带有差分输入和高达1 6 位的分辨率，片内2 0 4 8 v 的基准电压，提供范围为2 0 4 5 v 的输入差分电压。a d s i l l o 使用可兼容的i 2 c 串行接口，在2 7 v 至5 5 v 的单电源下 工作。a d s l l l o 可每秒采样1 5 、3 0 、6 0 或2 4 0 次以进行转换，片内可编程的增益放大 器p g a 提供高达8 倍的增益，并且允许以高分辨率对较小的信号进行测量【l7 1 。 a d s l “o 的接线图比较简单，使用5 l 单片机的两个管脚p 0 6 和p o 7 模拟1 2 c 总 线的s c l 和s d a 时序，实现对a d s l l l 0 的操作。其原理图如图3 7 所示。 3 2 4 步进电机控制电路 图3 - 7 a d s l l l 0 接线原理图 系统共包含三个步进电机。一个用于激发光源的选择，步迸电机带动装有l e