（发酵工程专业论文）洋葱布克氏菌burkholderia+cepacia酯酶酶法不对称拆分dl薄荷醇研究.pdf

摘要 摘要 天然薄荷醇由于受天气和地域等的影响，产量和质量波动很大，近年来，利用生物 法拆分讲薄荷醇制备厶薄荷醇己经成为厶薄荷醇生产的研究热点。本文利用透明圈平板 初筛与转化反应气相检测复筛相结合的方法，筛选出了一株具有高度不对称水解以乙酸 薄荷酯生成厶薄荷醇的菌株b u r k h o l d e r i ac e p a c i a ；以此菌株为材料，对其培养条件，整 细胞体系的转化条件进行了详细研究；并对该菌株细胞中立体选择性酯酶同工酶进行了 分离纯化，研究了其酶学性质，为其进一步克隆表达和相关应用提供实验依据。主要工 作包括： 1 ) 以提高单位发酵液中的酶活为目标，选择菌体生长和产酶为指标，利用响应面 法对丑c e p a c i a 的培养条件和营养条件进行了优化，确定摇瓶发酵产酶的最优培养基组 成为：葡萄糖2 2 7 ，牛肉膏1 5 8 ，蛋白胨1 8 3 ，k 2 h p 0 4o 4 2 ，m g s 0 4 7 h 2 00 0 2 ， c a c l 20 0 1 ，n a c l0 5 ；较优环境条件为：接种量6 ，培养温度3 0 c ，装液量1 5 ， 初始p h 值为7 肚7 5 ，培养时间为4 8h ；在此最优条件下进行摇瓶发酵产酶，产酶量比未 优化时提高了2 3 倍。 2 ) 采用硫铵盐析、疏水层析、离子交换层析和凝胶过滤对& c e p a c i a 的胞内酯酶进 行了分离纯化。同工酶e s t l 的比酶活提高了近3 倍，为0 7 7u m g ，分子量为6 6k d a ；同 工酶e s t 2 的比酶活提高了近2 3 倍，为5 9 1u m g ，分子量约为3 7k d a 。e s t l 和e s t 2 的最适 p h 都为7 0 ，最适反应温度为3 0 ，活性中心都存在丝氨酸残基，且都不属于金属酶类。 立体选择性受温度影响不明显，但受p h 影响严重，p h 过高或过低都会引起立体选择性 的明显下降，添加大部分表面活性剂或抑制剂均使酶的立体选择性下降。e s t l 没有明显 位置特异性，而e s t 2 具有2 位特异性，它们都优先水解短链脂肪酸酯。除甲酸薄荷酯外， 均优选短链，- 型脂肪酸薄荷酯进行水解。因此，两目的酶都属于短链酯酶。e s t l 的n 末 端氨基酸组成为：m h i t t t ，e s t 2 的n 末端氨基酸组成为：m g a r t d a ，与已知 b u r k h o l d e r i as p 水解酶( 酯酶脂肪酶) 均没有明显的同源性，说明e s t l 和e s t 2 都可能是 一种新酶，都属于羧酸酯酶大类( e c 3 1 1 1 ) 。 3 ) 对丑c e p a c i a 整细胞催化的讲乙酸薄荷酯不对称水解制备，薄荷醇的生物催化过程 进行了研究。发现添加助溶剂可改变底物与酶的接触面积和整细胞的通透性，从而对催 化反应转化率和产物e e 值( 对映体过剩量) 有一定的影响，添加15 的二甲亚砜对反应 速率和产物e e 值都有提高作用，最佳反应条件为：p h7 0 ，0 0 6 7m o l l 的n a 2 h p 0 4 k h 2 p 0 4 缓冲体系，温度3 0 ，1 5 - 甲亚砜，1 底物，1 5 以干细胞量，反应2 4h 。在此最优 条件下得到的，薄荷醇的光学纯度达9 5 以上。通过反应产物的分离纯化，纯化得率为 8 5 ，一薄荷醇单次循环总收率为6 6 ，说明了先对讲薄荷醇进行化学酯化再通过最 c e p a c i a 整细胞催化的不对称拆分制备，薄荷醇是完全可行的。 关键词：薄荷醇；乙酸薄荷酯；b u r k h o l d e r i ac e p a c i a ：酯酶；手性拆分；水解 a b s t r a c t 1 1 l ey i e l da n dq u a l i t yo fn a t u r a lm e n t h o la r ea f f e c t e ds e r i o u s l yb yw e a t h e ra n dr e g i o n ， e t c ，s y n t h e t i cm e n t h o lc a no v e r c o m ea l lt h e s ed r a w b a c k s t h e r e f o r e ，t l l e r ei sag r e a ti n t e r e s t i ns e p a r a t i o no fd l - m e n t h o lt op r e p a r el - m e n t h o lb ym i c r o b i a lm e t h o d s as t r a i nn a m e db u r k h o l d e r i ac e p a c i aa t c c2 5 416w i t hh i g he n a n t i o s e l e c t i v i t ya n d h y d r o l y s i sa c t i v i t yt o w a r dd l - m e n t h y la c e t a t ew a ss c r e e n e dt h r o u g hc o m b i n e ds c r e e n i n g s t r a t e g yo fh y d r o l y s i sa b i l i t yw i t hs t e r e o s e l e c t i v i t y t h ec u l t i v a t i o nc o n d i t i o n sa n dt h e e n a n t i o s e l e c t i v eh y d r o l y s i sc o n d i t i o n so f 丑c e p a c i aw h o l ec e l l sw e r es t u d i e di nt h i sw o r k i n o r d e rt oe x t e n dt h eu s a g ea n dc l o n et h ee n z y m ei nal a r g es c a l e ，t h ek e ye n z y m e sw e r ea l s o p u r i f i e da n dc h a r a c t e r i z e d t h em a i nr e s e a r c hc o n t e n t sw e r es h o w n a sf o l l o w s ： ( 1 ) t oi n c r e a s et h ee n z y m ea c t i v i t y ，t h ec u l t i v a t i o nc o n d i t i o n so fbc e p a c i aw e r e o p t i m i z e du s i n gr e s p o n s es u r f a c em e t h o d o l o g y ( r s l v o t h eo p t i m u mc u l t u r em e d i u m c o m p o n e n t sw e r e2 2 7 g l u c o s e ，1 5 8 b e e fe x t r a c t ，1 8 3 p e p t o n e ，0 4 2 k 2 h p 0 4 ，0 0 2 m g s 0 4 7 h 2 0 ，o o1 c a c l 2 ，0 5 n a c i t h eo p t i m u me n v i r o n m e n tc o n d i t i o n sw e r e6 i n o c u l a t i o ns i z e ，15 m e d i u mv o l u m e ，i n i t i a lp h7 肚7 5 ，3 0 0 ca n d4 8h u n d e rt h e s e c o n d i t i o n s ，t h ee n z y m ea c t i v i t yw a si n c r e a s e db y2 3t i m e s ( 2 ) 1 1 l ek e ye n z y m e sw e r ep u r i f i e df r o m 丑c e p a c i ab yaf o u r - s t e pp u r i f i c a t i o n ，i e ， a m m o n i u ms u l f a t ep r e c i p i t a t i o n ，b u t y l - s e p h a r o s e ，d e a e - s e p h a r o s e ，a n ds u p e r d e xg - 7 5 c o l u m nc h r o m a t o g r a p h y e s tlw a so b t a i n e dw i t l la c t i v i t yo f0 7 7u m ga n dm o l e c u l a rw e i g h t o f6 6k d a e s t 2w a so b t a i n e dw i t l la c t i v i t yo f5 9 1u m ga n dm o l e c u l a rw e i g h to f3 7k d a t h eo p t i m u mp ha n dt h eo p t i m u mt e m p e r a t u r eo fe s t la n de s t 2w e r ep h7 0a n d3 0 0 c ， r e s p e c t i v e l y t h e s et w oe n z y m e sb e l o n g e dt o t h ec l a s so fs e r i n eh y d r o l a s e s ，b u tn o t m e t a l l o e n z y m e 1 1 1 ee n a n t i o s e l e c t i v i t i e so ft h et w oe n z y m e sw e r en o tt e m p e r a t u r ed e p e n d e d ， b u tp hd e p e n d e d a n dd e c r e a s e ds h a r p l yu n d e rh a r s hp hc o n d i t i o n s 1 1 1 ee n a n t i o s e l e c t i v i t i e s w e r ea l s od r o p e dw h e nd i f f e r e n td e t e r g e n t so ri n h i b i t o r su s e di nt h er e a c t i o ns y s t e m s t h e r e w a sn o tp o s i t i o ns p e c i f i c i t ya b o u te s t l ，w h i l ee s t 2h a da2 - p o s i t i o ns p e c i f i c i t y t h et w o e n z y m e ss h o w e dh i g h e rh y d r o l y t i ca c t i v i t yt o w a r ds h o r ta c y lc h a i np - n i t r o p h e n o le s t e r sa n d s h o r ta c y lc h a i nm e n t h o le s t e r s e x c e p tm e n t h y lf o r m a t e ，t h e ya l lp r e f e r e n t i a l l yh y d r o l y z e d s h o r t - c h a i nf a t t ya c i de s t e r so fm e n t h o l 谢t l lh i g hs t e r e o s p e c i f i c i t y ，w h i c hi n d i c a t e dt h a tt h e t w op u r i f i e de n z y m e sw e r es h o r t c h a i nf a t t ya c i de s t e r sh y d r o l a s e n l en t e r m i n a la m i a n o a c i ds e q u e n c eo fe s t lh a db e e nd e t e r m i n e da sm h i t t t a n dt h en - t e r m i n a ls e q u e n c eo fe s t 2 w a sm g a r t d a t h e r ew e r en oh o m o l o g i e so ft h et w os e q u e n c e sw i t ho t h e rb u r k h o l d e r i as p h y d r o l a s e ( e s t e r a s e l i p a s e ) c o n s i d e r i n g t h en - t e r m i n a l s e q u e n c e s a n dt h e i r h i g h s t e r e o s p e c i f i c i t yf o rs h o r tc h a i nm e n t h y le s t e r s ，t h e s et w oe s t e r a s e sw e r ec o n c l u d e da sn e w e n z y m e sb e l o n g i n gt ot h ec a r b o x y l e s t e r a s eg r o u p ( e c3 。1 1 1 ) o fe s t e r a s ef a m i l y ( 3 ) t h ec a t a i y t i cr e a c t i o np r o c e s sa b o u te n z n t i o s e l e c t i v eh y d r o l y s i so fd l - m e n t h y l a c e t a t et ol - m e n t h o lc a t a l y z e db y 丑c e p a c i aw h o l ec e l l sw a ss t u d i e d t h er e s u l t ss h o w e dt h a t 血ep e r m e a b i l i t yo ft h ew h o l ec e l l sa n dt h ei n t e r f a c ea r e ab e t w e e ns u b s t r a t ea n de n z y m ew e r e c h a n g e da f t e ra d d i t i o no fc o - s o l v e n t s ，w h i c hi n f l u e n c e d t h eh y d r o l y s i sc o n v e r s i o na n d e e v a l u e ( e n a n t i o m e r i ce x c e s s ) o fp r o d u c t h i g hh y d r o l y s i sr a t ea n de e v a l u eo fp r o d u c tw e r e n a b s t r a c t a c h i e v e dw h e n15 ( v v ) d i m e t h y ls u l f o x i d e ( d m s o ) w a sa d d e d t h eo p t i m u mh y d r o l y s i s c o n d i t i o n s c a t a l y z e db y 丑c e p a c i aw h o l ec e l l sw e r e1m ln a 2 h p 0 4 - k h 2 p 0 4 ( p h7 0 ，0 0 6 7 m o l l ) ，15 d i m e t h y ls u l f o x i d e ( d m s o ) ，1 d l - m e n t h y la c e t a t e ，15g ld r yc e l l s ，3 0 0 ca n d 2 4h u n d e rt h e s ec o n d i t i o n s ，- m e n t h o lc o u l db eo b t a i n e d 埘mt h eo p t i c a lp u r i t yh i g h e rt h a n 9 5 t h ep r o d u c t - m e n t h o lw a ss e p a r a t e d 、i t l lar e c o v e r yo f8 5 ，a n dt h et o t a ly i e l do f - m e n t h o lw a s6 6 i ne a c hc y c l e t h e s er e s u l t sp r o v e dt h a ti ti sr e a s o n a b l et os p l i td l - m e n t h y l a c e t a t ei np r e p a r a t i o n - m e n t h o lu s i n gb c e p a c i aw h o l ec e l l sa sb i o c a t a l y s ta f t e rc h e m i c a l e s t e r i f i c a t i o no fa l l - m e n t h o l 、衍t l la c e t i ca n h y d r i d e k e y w o r d s ：m e n t h o l ；m e n t h y la c e t a t e ；b u r k h o l d e r i ac e p a c i a ；e s t e r a s e ；c h i r a lr e s o l u t i o n ； h y d r o l y s i s i i i 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工 作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地 方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含 本人为获得江南大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料 与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明 确的说明并表示谢意 签名： j 稚噎甬 日 期： 一 i j 关于论文使用授权的说明 沙0 8 9 b o ， 本学位论文作者完全了解江南大学有关保留、使用学位论文的规 定：江南大学有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和 磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以将学位论文的全部或部分内容编 入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、 汇编学位论文，并且本人电子文档的内容和纸质论文的内容相一致 保密的学位论文在解密后也遵守此规定。 签 名：j 丽吨蔫 导师签名： 日 期： 一逊军：垒 第一章绪论 1 1 生物拆分的意义与原理 第一章绪论 1 1 1 生物拆分的意义 手性是自然界化合物最重要的属性之一，分子手性识别在生命活动中起着极为重要 的作用。同一化合物的两个对映体之间不仅具有不同的光学性质和物理化学性质，而且 具有不同的生物活性。例如在药理上，药物作用包括酶的抑制、膜的传递和受体结合等 均与药物的立体化学有关。在外消旋体药物中，不同的对映体所起的作用也是不同的， 它们往往一种立体异构体有药效，而它的镜像分子则具有毒副作用，或具有相反的药效 或根本就没有药效。在许多杀虫剂、杀菌剂、昆虫激素及信息素中，只有特定的手性组 分才具有生物活性；在香料中，不同手性组分的香味完全不同；在功能性材料中，如液 晶、“靶”性化合物、半导体有机材料、导电有机材料等，不同的手性组分其物理性质完 全不同，材料性能也相差甚远。因此，各种手性产品成为医药、农药、香料、新材料和 精细化工产业追寻的目标，其产业迅速发展，形成巨大的手性产品市场。为此，发展手 性拆分技术成为当今有机化学家的挑战性课题。 获得手性化合物的方法很多，总的来说归结为两大类，即手性合成与手性拆分。其 中手性合成包括以手性物质为原料的手性源合成法和以化学催化剂或生物催化剂为载 体的不对称合成法。手性拆分法是在拆分剂的作用下，将外消旋体拆分成对映体。与手 性合成相比，手性拆分方法比较简单，成本较低，因而得到广泛应用。同时被拆分的外 消旋体可以通过化学反应得到，因而手性拆分使手性化合物的来源可以扩展到人工合成 领域，解决了提取原料不足带来的手性物质来源有限的问题。据统计，大约有6 5 的非 天然手性药物是由外消旋体或中间产物拆分得到的。 手性拆分方法包括物理拆分、化学拆分和生物拆分三大类。物理拆分法又包括机械 拆分、色谱拆分、萃取拆分、膜拆分等等。其中，机械分离和萃取拆分法适用的范围很 小而应用价值不大。化学拆分法中最常用的是形成非对映体分离法，即将对映体与一些 手性试剂反应，生成非对映体，利用非对映体物理性质( 如溶解度、熔点等) 的不同而将 其分开的方法。该方法不仅对外消旋混合物适用，也适用于外消旋化合物，因此范围比 机械拆分法要广。但是，该法仍未摆脱化学方法所带来的诸如需要消耗较多的手性拆分 试剂，特殊的设备，特殊的反应条件以及副产物对环境的污染等问题。 生物拆分法是利用微生物细胞所含的一个酶或一系列酶( 微生物法) ，或由细胞中分 离出的酶( 酶法) 作为催化剂，通过化学反应达到拆分外消旋体的目的。酶拆分的独特作 用是由于它们由l 氨基酸组成，其活性中心构成了个不对称环境有利于识别对映体。 在一定条件下，酶只能促使外消旋体中的一个对映体发生某一反应，而成为不同的化合 物，从而使两对映体彼此分开。与物理和化学法相比，生物拆分方法在手性拆分上具有 明显的优越性： 江南大学博士学位论文 ( 1 ) 生物催化反应通常具有高度的立体专一性，可得到高光学纯度的产物，适于 作各种生物活性和药理试验； ( 2 ) 催化效率高，转化步骤少，副产物少，使用溶剂少，产品分离提纯简单； ( 3 ) 生物催化反应大多在温和条件下进行，温度区间2 0 - - - 4 0 。c ，p h 值接近中性， 没有设备腐蚀问题，生产安全性高； ( 4 ) 生物催化剂无毒，易降解，不会造成环境污染。 随着酶的固定化、多相反应器以及整细胞反应体系等技术的不断成熟，酶拆分技术 更得到了极大的发展，酯酶、脂肪酶、蛋白酶、氧化还原酶、转氨酶等诸多酶类都可用 于外消旋体的拆分【1 1 。其中酯酶广泛地用于拆分外消旋醇和酸，拆分的主要途径为立体 选择性水解、酯化或转酯化。产生以上酶的微生物种类繁多，从细菌、霉菌、酵母菌到 放线菌均可以产生，其中尤以霉菌和细菌较多。酶拆分的例子很多，如萜类化合物的拆 分、1 , 2 - - 醇的拆分、硝基醇的拆分、氨基酸的拆分、内酯的拆分等。d s m 公司( o e l e e n ， 荷兰) 利用恶臭假单胞菌( p s e u d o m o n a s p u t i d a ) 的l 氨肽酶拆分d l 氨基酸酰胺，成功地获 得了d - 苯甘氨酸和d 对羟基苯甘氨酸这两种用于生产半合成青霉素和头孢菌类抗生素 的重要侧链1 2 l 。f u g a n t i l 3 1 等利用青霉素酰化酶对具有双手性中心的苯乙酸乙酯的衍生物 进行了水解，得至t j ( 4 r ，5 s ) 醇，其对映体过剩值( e n a n t i o m e r i ce x c e s s ，简称e e 值) 为9 0 。 m a r g o l i n 4 】以青霉素酰化酶对苯乙酸的衍生物进行了拆分，也体现了很好的选择性。以 上事实充分说明生物拆分法在制备单一对映体手性化合物中的活力和价值。 此外，由于遗传工程和细胞工程的发展，通过定位突变和重组d n a ，可以制备出有 特定氨基酸组成和序列的酶。基于蛋白质的三维结构，可以系统有效地调变酶的物理、 化学和生物性质，从而控制酶的催化特性，增加生物拆分在手性工业中的应用潜力。因 此，化学家和生物学家一致认为：生物拆分与合成是制备手性化合物的首选方法。 1 1 2 生物拆分的原理 生物催化手性拆分的原理是用某些特殊的微生物或酶对外消旋对映体中某一个异 构体具有高度的立体选择性，而对另一个异构体不起作用或作用很小，从而利用反应速 率的快慢实现对映体分离的技术。生物催化拆分过程实质是一个动力学拆分过程，反应 式如下所示，式中e 表示酶，s 表示底物，p 表示产物，下标a ，b 分别表示底物或产物的 两个不同构型。 快反应 e + s a 专e + 只 式1 1 慢反应 e + 品专e + b 式1 2 v ：型翌 k 。 式1 3 结合米氏方程，在【s 】远小于k m 时的简化式( 1 3 ) ，式中v 表示反应速度，比较反应 式1 1 和1 2 可知： 型幽：峰：e v b s bj 肛柏 式1 4 2 第一章绪论 式中吒为最大反应速度，k 一为米氏常数，陋】为底物浓度，在o t 范围内，对式 1 4 进行积分可得： ! 坐生! 墨q 2 ：垡! 鱼：e i n ( s b s b o ) k 朋丑 式1 5 在拆分反应中，将底物中一对异构体的匕k m 之比，即式1 4 、1 5 中等式右边部分， 定义为酶的光学选择性，即通常所说的对映体选择率( e n a n t i o m e r i cr a t i o ) ，简化为e 值。 e 值反映了某一特定拆分反应的效果，同时表征了酶选择性的大小，是生物法拆分中催 化剂的特征参数。 在通过拆分获得光学活性物质时，拆分的效果可以用光学纯度( o p t i c a lp u r i t y ，o p ) 或对映体过量值( e n a n t i o m e r i ce x c e s s ，e e 值) 来表示。式1 6 和1 7 分别计算了反应1 1 、1 2 中产物的光学纯度与产物的对映体过剩量( p 值) 。光学活性物质的光学纯度是指该物质 与其纯对映异构体的比旋光度的百分比，式1 6 中，口p 和口脚分别为实际所得产物和单一 a 构型产物的比旋光度。 o p ：型 k 脚j 式1 6 e e ：= o p a - - p b 。 【只】“岛】 式1 7 同样，产物的对映体过量值可按式1 7 计算，式中，【只】和【】分别为产物中a 构型 和b 构型的含量。 这样，对于式1 1 、1 2 的反应，我们就可以根据反应产物的o p 和p 吻来判断其拆分效 果。同样也可以计算残余底物的光学纯度o p 或底物的对映体过量值e e 。一般认为物质 的比旋光度与组成之间呈线性关系，因此，对同一样品，在实验无误差的前提下，o p 和e e 的数值应是相等的，即通过1 6 或1 7 计算得到的表征拆分效果的数值应是一样的。 拆分反应的转化率c 可按1 8 计算，若将1 8 与1 5 、1 7 结合，可推出式1 9 。 c ：卜坠址坠! ：【幺! 【垒! 【s 月o 】+ s 日o 】【s o 】+ 【s b o 】 式1 8 。l n 1 一c ( 1 + e e l p ) 】 ，巴= ：- 二一 l n 【l c ( 1 一g e | 口) 】 式1 9 式1 9 反映了e 值、p 吻和转化率c 之间的关系，同样可推出e 值、e e 。和转化率c 之间 的关系1 1 0 。 e ：i n 1 - c ( 1 - e e s ) l n 1 一c o + e e ，) 】 根据转化率的另一种表达式：c = p p ，( p p s + e e p ) r a k e l s 等人将式1 11 中的c 代换式1 9 中的c 得出e 的另一关系式： 式1 1 0 式1 1 1 江南大学博士学位论文 。i n ( 1 一e e ，) ( 1 + e e ，e e l p ) 】 i n ( 1 + e e , ) ( 1 + e e ，e e p ) 】背11 2 式1 1 2 反映了e 值、p 以和p 之间的关系，是目前较常用的计算e 值的方法，用此式 求出的e 值比用1 9 或1 1 0 式求出的e 值误差小，特别是在e e r 9 0 时。 对1 1 、1 2 的反应而言，若最终需要的是a 构型的产物，那么应该在反应的转化率低 于5 0 时结束，以使所得产物有较理想的光学纯度，而如果需要的是b 构型，那么就应 该使反应转化率大于5 0 ，以使反应剩余的底物有较好的纯度。 1 2b u r k h o l d e r i as p 酯水解酶研究背景 酯酶( e c3 1 ) 属于渐叠水解酶家族，是催化水解各种酯键的一类酶的总称，酯 + h 2 0 一酸+ o h 化合物。按照其作用底物的种类进行分类，包括( 1 ) 羧酸酯，例如脂酶， 胆碱酯酶；( 2 ) 硫酯；( 3 ) 磷酸单酯，磷酸单酯酶，例如酸性磷酸酯酶和碱性磷酸酶； ( 4 ) 磷酸二酯，磷酸二酯酶，例如核酸酶，磷脂酶；( 5 ) 硫磷酸酯：( 6 ) 硫酸酯， 硫酸酯酶。狭义的酯酶是指水解低级脂肪酸酯的脂肪酶。另外也有进行基团转移反应的。 1 2 1b u r k h o l d e r i as p 酯酶脂肪酶的应用研究 目前已经发现的布克氏菌( b u r k h o l d e r i as p ) 酯酶脂肪酶较多，主要为胞外酶，有 关胞内酶的研究较少，而且不同菌株来源的酯酶脂肪酶其催化特性和应用范围也不同， 不同b u r k h o l d e r i as p 商业化脂肪酶的来源及应用总结于表1 1 中。有报道证明 b u r k h o l d e r i as p 脂肪酶在有机相系统中可以保持较好的活力，对低分子醇具有良好的耐 受性，在生物柴油的制备中有所应用【5 一。也有许多报道发现占u r k h o l d e r i as p 。脂肪酶具有 优良的对映选择性( 尤其是手性一级或二级醇) 、较广的底物选择范围和较高的酯合成 能力，常用于催化非水相中酯、酸或醇外消旋混合物的不对称拆分反应【7 卅。目前己实 现了多种b u r k h o l d e r i as p 胞外酯酶月旨肪酶基因的克隆表达以及定向进化，为其工业化应 用打下了良好的基础。 表1 1再 b u r k h o l d e r i as p 商业化脂肪酶的来源及应用 t a b l e1 1c o m m e r c i a lb u r k h o l d e r i as p 1 i p a s e s ，s o u r c e s ，a p p l i c a t i o n sa n dt h e i ri n d u s t r i a ls u p p l i e r s 门s n o ts p e c i f i e d 酯酶在水相催化酯类水解和在有机相催化酯类合成的能力以及催化反应时的高度 立体选择性、位点选择性和区域选择性，使之在有机合成，特别是光学化合物的拆分中 具有广阔的应用前景。它们在有机溶剂中通过酯化或转酯化反应可以拆分外消旋的醇和 4 第一章绪论 酸，在水相中通过催化酯的水解反应可以拆分外消旋的酯，也可以达到拆分外消旋酸和 醇的目的。此外，具有区域和位点选择性的酯酶也可以催化糖类和胆固醇类化合物的特 定羟基的酯化，用于制备糖和胆固醇的衍生物。资料中报道的不同来源b u r k h o l d e r i as p 酯酶的性质及应用研究列于表1 2 e o ，主要集中于不对称拆分反应( 水解、酯化或转酯化) 。 酯酶在有机合成中得到广泛应用的另一个原因是酯酶的来源广，可选择范围宽。近几年 来，由于基因工程在酶学领域的应用，使不同来源的酯酶的产量获得了进一步的提高， 更进一步推动了它在此领域的应用。 表1 2 不同来b u r k h o l d e r i as p 酯水解酶应用比较 t a b l e1 2c o m p a r i s o no f t h ea p p l i c a t i o n so fd i f f e r e n tb u r k h o l d e r i as p e s t e r a s e n s n o ts p e c i f i e d 到目前为止，对于b u r k h o l d e r i as p 分泌的一类酯酶脂肪酶的相关报道在国内还非常 少见，国内各实验室内所应用的b u r k h o l d e r i as p 酯酶脂肪酶几乎全部依靠进口。 1 2 2b u r k h o l d e r i as p 酯酶催化酯水解反应机制 有关羧酸酯酶的水解机制已有较多报道【2 2 2 5 】，其确切的水解机制仍在争论中。通用 的水解机制包含了一个催化三连体，由丝氨酸( s e r ) 、组氨酸( h i s ) 、谷氨酸( g l u ) 或天冬氨酸( a s p ) 构成。羧酸酯酶通过两步过程完成水解酯，首先形成一个酰基化的 酶中间体，最终降解此中间体。图1 1 为酯酶催化羧基酯键的水解断裂过程。首先一个 质子从丝氨酸转移到组氨酸，使得丝氨酸羟基变得更具亲核性。接着组氨酸与谷氨酸或 是天冬氨酸间形成氢键而变得稳定。亲核性的丝氨酸攻击底物酯中缺电子的羰基部分， 诱导形成四面体中间体，此四面体中间体由于氧阴离子洞中的两个甘氨酸( g l y ) 而变 得稳定。接着此中间体解体形成酰基化酶复合物，在此过程中释放丝氨酸和底物中的醇 部分。随后被水分子激活的组氨酸攻击酰基酶复合物，重复上面的步骤且释放底物中酸 的部分。最终，被保留下来的丝氨酸残基为谷氨酸的空间位置的确定提供结构支持，从 而稳定了此催化三联体。 江南大学博士学位论文 咚- - 0 4 1 - 酝 胂。蜘 孓“丧善r - o h 卅 x h hi f - h 刭d 四面体中问体t t 酰基酶复合物 图l 1b u r k h o l d e r i as p 酯酶催化酯水解的机制 f i g 1 - 1e s t e r sh y d r o l y s i sm e c h a n i s mo f b u r k h o l d e r i as p e s t e r a s e 1 2 3b u r k h o l d e r i as p 酯酶的分离纯化 国际上报道的b u r k h o l d e r i as p 酯水解酶多为胞外酶，而有关b u r k h o l d e r i as p 胞内水 解酶的研究很少。其纯化策略都是交替采用离子交换柱、凝胶过滤、疏水柱等几种色谱 柱进行。用于分离和纯化酯酶脂肪酶的一个有效方法是疏水层析。自1 9 7 3 年t t j e r t e n l 2 6 1 提出疏水层析的概念以来，疏水层析在近年来发展很快，与离子交换层析一起成为两种 应用面广、价格相对较低的蛋白质层析技术。到目前为止，应用比较成功的介质是在天 然多糖凝胶上接疏水基团。疏水层析的原理是疏水载体和样品疏水基团之间相互作用而 结合，作用强度受中性盐的影响，在水相中提高中性盐浓度可增强疏水载体和样品疏水 基团之间相互作用，相反就会减弱二者之间相互作用。一般通过控制中性盐浓度调节疏 水作用强弱，以此达到分离目的。不同类型的酯酶脂肪酶具有非常相似的立体结构，酯 酶月旨肪酶的氨基酸顺序可能有较大的差别，但却具有相似的折叠方式和活性中心。一般 来说，酯酶j l 旨 肪酶的多肽链折叠成两个结构域，即n 末端和o 末端结构域。n 末端的 活性部位有一条可结合长链脂肪酸的疏水性的通道。该通道从催化部位的s e r 直到分子 的表面。这条通道有两种状态：“开放”和“闭合”，当遇到疏水介质时这条通道就会打开， 露出疏水部分，与靶分子结合。所以酯酶月旨肪酶n 端结构域可以和疏水层析中的疏水 介质相结合。另外，由于酯酶月旨肪酶疏水通道的“开放”与“闭合”，造成酯酶脂肪酶随 着外部环境疏水性强弱的改变，自身n 端结构域的疏水性也会发生细微改变，造成酯酶 , r i 旨肪酶这一水解酶类在疏水层析中与其他蛋白不同的洗脱特性。另外，疏水层析洗脱条 件较温和，载样量高，因此在酯酶月旨肪酶得分离纯化中被广泛应用。 6 研 蛳p r 麟 胁莲矗 叼 伽弋矿 一 2 l k 厶 雕j j 矗 申i 嘲 体 扣 i 彗 吨 四 伽文矿 第一章绪论 g u p t a 等 1 7 j 报道酯酶脂肪酶的活性位点周围都具有一大的疏水表面，采用疏水色谱 对酯酶脂肪酶进行纯化可以除去大部分的杂蛋白，达到较好的纯化效果。日本的y e osh 等1 1 2 】利用苯基疏水柱从b u r k h o l d e r i as p y y 6 2 菌株中纯化得到了一种辛酸叔丁酯水解 酶，其s d s p a g e 的分子量为4 0 k d a ，最适p h 7 0 ，最适温度2 8 ，n 末端的1 5 个氨基酸 残基为m e t a s p - p h e - t y r - a s p a l a - a s n - g l u t h r - a r g h i s - p r o g l u g i n a r g ，与已知蛋白无 同源性。 表1 3b u r k h o l d e r i as p 酯酶月旨肪酶的纯化策略 t a b l e1 3p u r i f i c a t i o ns t r a t e g i e sf o rb u r k h o l d e r i as p e s t e r a s e l i p a s e 尼s n o ts p e c i f i e d 目前在已发现的许多微生物酯酶中，分子量及性质差别很大，它们大多为多亚基蛋 白，且多数存在同工酶( i s o z y m e ) 现象。h o n g 等t 4 0 l p s e u d o m o n a sf l u o r e s c e n se s t e r a s e i i 为一羧酸酯酶( e c 3 1 1 1 ) ，以二聚体形式存在，含有两个同样的亚基，每个亚基的 分子量为2 3 ，0 0 0 ，酶分子活性位点的氨基酸序列为g x s x g ，属s e r 酯酶。s u g i h a r a 等t m 报道的b u r k h o l d e r i as p k w i 5 6 胞内羧酸酯酶含有两个2 8k d a 的亚基，等电点为5 9 ，为一 热不稳定酶，最适温度为2 2 ( p h7 5 ) ，最适水解底物为丙酸甲酯。因为酯酶分子的复 杂性，并且不同酯酶的性质及底物特异性差别很大，因而纯化较为困难，到目前为止， 已有不少有关b u r k h o l d e r i as p 胞外水解酶纯化的报道( 表1 3 ) ，但有关丑c e p a c i a 胞内酯 酶分离纯化的报道较少。上世纪九十年代末，k a n d z i ae ta l i 4 1 l 报道了酯酶活性染色的方 法，使酯酶的纯化变得容易。酯酶活力的染色的原理是，酯酶催化仅乙酸萘酯或p 乙酸 萘酯发生水解产生萘酚，利用萘酚与重氮染料f a s tb l u eb 反应生成蓝紫色物质，因而在 电泳后的凝胶上含有酯酶同工酶的地方可以染出蓝紫色的酶带。 江南大学博士学位论文 以上的纯化方法纯化蛋白量小，酶活回收率较低，不适于工业化应用，而只是用于 实验室的分析。重组会成为工业化大规模生产纯的ac e p a c i a 酯酶脂肪酶的最有潜力的 策略。目前报道的丑c e p a c i a 主要有4 种克隆酯酶脂肪酶，pc e p a c i aa t c c2 1 8 0 8 ， pc e p a c i ad s m3 9 5 9 ，pc e p a c i am 1 2 3 3 ，p s e u d o m o n a ss p k w i - 5 6 ，主要为胞外酶。 它们具有的共同点是都具有两个基因，s t r u c t u r eg e n e 和c h a p e r o n e ( a c t i v a t o r ，m o d u l a t o r ， h e l p e rp r o t e i n ，s p e c i f i cf o l d a s e ) g e n e ，且c h a p e r o n eg e n e 都位于e s t e r a s e l i p a s eg e n e 的下游， 主要功能是形成e s t e r a s e l i p a s e 的三级结构和e s t e m s e l i p a s e 的激活。 1 3 薄荷醇的性质及用途 薄荷醇又名六氢化百里酚，俗名薄荷脑，学名1 甲基4 异丙基环己3 醇，分子式 c l