（应用化学专业论文）超高效液相色谱质谱联用技术在药物分析中的应用研究.pdf

浙江工业大学0 7 届硕士学位论文 浙江工业大学 学位论文原创性声明 本人郑重声明：所提交的学位论文是本人在导师的知道下，独立进行研究工 作所取得的研究成果。除文中已经加以标注引用的内容外，本论文不包含其他个 人或集体已经发表或撰写过的研究成果，也不含为获得浙江工业大学或其它教育 机构的学位证书而使用过的材料。对本文的研究作出重要贡献的个人和集体，均 已在文中以明确方式标明。本人承担本声明的法律责任。 作者签名： 案脊，希 日期：伊归年厂月叩日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保 留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。 本人授权浙江工业大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行 检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。 本学位论文属于 l 、保密口，在 2 、不保密曰 年解密后适用本授权书。 ( 请在以上相应方框内打“4 ) 日期：伊尸年 日期：矽i 。年 y 月哆日 r 月i b 矿v淋坛 音0晨一 名名套堑者师怍导 浙江工业大学0 7 届硕士学位论文 超高效液相色谱一质谱联用技术在药物分析中的应用研究 摘要 超高效液相色谱质谱法( u p l c m s ) 是2 1 世纪初发展起来的一种 分析技术，它是结合了u p l c 的高效分离能力与m s 的高灵敏度和极强 的专属性的分离检测技术。它具有应用范围广、分离能力强、灵敏度 高、分析速度快和自动化程度高等特点，目前已成为有机物分析，特 别是药物分析的重要方法之一。 本论文开展了应用新型串联色谱柱分离头孢菌素类药物的研究； 超高效液相色谱多级质谱串联技术对仙鹤草提取物中仙鹤草酚的研 究；以及超高效液相色谱多级质谱串联柱后添加过渡金属在线区分黑 鳗藤提取物中c 2 。甾体糖苷同分异构体的研究。此外，论文详细综述了 色谱质谱联用技术的工作原理以及其在药物分析中的应用。 首先，对多孔壳层h a l o c 1 8 柱、z o r b a xe c l i p s ex d b - c 1 8 柱、z o r b a x s b c 1 8 柱、a c q u i tu p l cb e h c 1 8 柱以及多孔壳层h a l o c 1 8 与z o r b a x s b c ，8 的串联柱分离分析头孢菌素类药物进行了比较研究。结果表 明：h a l o c 1 8 柱的分离效果明显优于z o r b a xe c l i p s ex d b c 1 8 柱和z o r b a x s b c 1 8 柱。串联柱的柱效、分离度几乎达至o a c q u i tu p l cb e h c 1 8 柱的水平，而其柱压却只有u p l c 柱的一半。多孔壳层h a l o c 1 8 串联柱 在一定程度上可以取代超高压色谱柱在常规液相色谱仪上实现高通量 快速分离。 实验 最后，由于金属离子常常能诱导化合物的质谱裂解模式发生改变 这为鉴定化合物结构提供了新的契机。在以前研究的基础上，本实验 对在线的过渡金属离子诱导的c 2 ，甾体糖苷的质谱裂解机理进行了详 细系统的研究。并依据c 2 ，甾体糖苷过渡金属离子复合物的质谱裂解 机理成功区分了两对由非还原末端单糖异构引起的同分异构体。 关键词：超高效液相色谱，串联质谱，液质联用，头孢菌素，仙鹤草 酚，c 。甾体糖苷 n 0 d s u l t r ap e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h ya n dm a s ss p e c t r o m e t r y ( u p l c - m s ) h a sg r o w nt ob e c o m eam a t u r ea n dr o u t i n e l yu s e dt e c h n i q u ei n a n a l y t i c a lc h e m i s t r ys i n c e2 0 0 4 u p l c m si sa l lo n l i n ec o u p l i n gs y s t e mo f u p l c ，as e p a r a t i o nt e c h n i q u et h a tc a nb ea p p l i e dt ot h ee x t r e m e l yc o m p l e x m i x t u r e s ，a n dm s ，t h em o s ts e n s i t i v em e t h o do fm o l e c u l a ra n a l y s i st h a th a s t h ep o t e n t i a lt oy i e l di n f o r m a t i o no ft h em o l e c u l a rw e i g h ta sw e l la st h e s t r u c t u r eo ft h ea n a l y t e i tp r o v i d e sal o wl i m i to fd e t e c t i o na n da sa n i d e n t i f i e rf o rs t r u c t u r a li n f o r m a t i o n u p l c - m sh a sb e c o m eap o w e r f u la n d i m p o r t a n tt e c h n i q u ea n dm e t h o di na n a l y s i so fm e d i c i n e si nt h ec o m p l e x m i x t u r e s i nt h i s t h e s i s ，w ec o m p a r a t i v es t u d yo nt h es e p a r a t i o no f c e p h a l o s p o r i n sb yt h en e wr a p i dl i q u i dc h r o m a t o g r a p h yc o l u m n w e s u c c e s s f u l l yd e v e l o p e de l e c t r o s p r a yi o n i z a t i o nt a n d e mm a s ss p e c t r o m e t r y c o u p l e dw i t h u l t r a p e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h yt o s c r e e nf o r a g r i m o l s w i t h p o t e n ta c t i v i t ya g a i n s ts t a p h y l o c o c c u s a u r e u sf r o m r h i n a c a n t h u sn a s u t u s ( l ) k u r za n dc 2 1s t e r o i d a l g l y c o s i d e s w i t h i m m u n o l o g i c a l a c t i v i t i e sf r o m s t e p h a n o t i sm u c r o n a t a i no r d e r t o i i i 浙江工业大学0 7 届硕士学位论文 d i f f e r e n t i a t ei s o m e r si n e x t r a c t s ，w e a l s o i n v e s t i g a t e dc 2 1 s t e r o i d a l g l y c o s i d e sb yu l t r ap e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h yt a n d e mm a s s s p e c t r o m e t r yu s i n gf e r r o u sc h l o r i d ea sap o s t c o l u m nr e a g e n tb a s e do n p r e v i o u si n v e s t i g a t i o n so fo f f l i n e r e g i o i s o m e rc h a r a c t e r i z a t i o no fc 2 l s t e r o i d a lg l y c o s i d e s i na d d i t i o n ，t h ep r i n c i p l eo fl c m st e c h n i q u ea n di t s e x t e n s i v ea p p l i c a t i o ni np h a r m a c e u t i c a la n a l y s i sw e r er e v i e w e di nd e t a i l f i r s t ，t h e c h a r a c t e r i s t i c sa n dp e r f o r m a n c eo ff i v e d i f f e r e n t c js 。b o n d e ds i l i c ac o l u m n si n c l u d i n gh a l o c 8c o l u m n ，z o r b a xe c l i p s e x d b c sc o l u m n ，z o r b a xs b - c l sc o l u m n ，a c q u i tu p l cb e h c 1 8 c o l u m na n dt h ec o u p l e dc o l u m no fh a l o c l8c o l u m na n dz o r b a xs b c18 c o l u m nt os e p a r a t et h ec e p h a l o s p o r i n si nt h eg r a d i e n te l u t i o nm o d ew e r e i n v e s t i g a t e d t h er e s u l t si n d i c a t et h a tt h eh a l o - ci8c o l u m np r o v i d e sa h i g h e rp e r f o r m a n c et h a nt h a to fz o r b a xe c l i p s ex d b - c 1 8c o l u m na n d z o r b a xs b - c sc o l u m n f u r t h e r m o r e ，t h ee f f i c i e n c ya n dr e s o l u t i o no ft h e c o u p l e dc o l u m nw e r en e a r l ys a m ea st h a to fu p l cc o l u m n h o w e v e r , t h e b a c kp r e s s u r eo ft h ec o u p l e dc o l u m nw a s5 0 l o w e rt h a nt h a to ft h e u p l cc o l u m n i ti so b v i o u st h a tt h ec o u p l e dc o l u m nc a no f f e rr a p i d ，h i g h p e r f o r m a n c es e p a r a t i o no fc o m p o u n d si n s t e a do fu p l cc o l u m nw i t ha c o n v e n t i o n a lc h r o m a t o g r a p h yi n s t r u m e n t s e c o n d ，u l t r ap e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h yt a n d e mm a s s s p e c t r o m e t r y w a s d e v e l o p e d f o r s c r e e n i n g o fg r i m o l sw h i c hw e r e h o m o l o g o u s s e r i e si nt h er o o t so fr n a s u t u s b ym e a n so fo n l i n e i v 浙江工业大学0 7 届硕j ：学位论文 h i g h - r e s o l u t i o nh p l c t o f - m s f r a g m e n t a t i o np a t h w a y s a n dm a j o r f r a g m e n ti o n s w e r ed e t e r m i n e d a sar e s u l t ，n i n e t e e np h l o r o g l u c i n o l d e r i v a t i v e si n c l u d i n gf i v eg r o u p so fi s o m e r i cc o m p o u n d sa r er a p i d l y a n a l y z e da n di d e n t i f i e d ，a n dt w e l v eo f t h e s ea r eo b s e r v e dh e r ef o rt h ef i r s t t i m ei nt h i sp l a n t a tl a s t ，t h ef r a g m e n t a t i o np a t t e r n so fc o m p o u n di n d u c e db y m e t a li o nc a nb e s i g n i f i c a n t l ya l t e r e d ，a l l o w i n gn e wo p p o r t u n i t i e sf o r s t r u c t u r a ld e t e r m i n a t i o n w eh a v es y s t e m i c a l l yi n v e s t i g a t e df r a g m e n t a t i o n p a t t e r n so fc 2 1s t e r o i d a lg l y c o s i d e si n d u c e du s i n gt h ef e r r o u sc h l o r i d ea sa p o s t c o l u n mr e a g e n t ，t h en o n r e d u c i n ge n dg l y c o s i d es t e r e o i s o m e r sw e r e d i f f e r e n t i a t e d k e yw o r d s ：u l t r ap e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h y ，t a n d e mm a s s s p e c t r o m e t r y , l c m s ，c e p h a l o s p o r i n ，a g r i m o l ，c 21 s t e r o i d a lg l y c o s i d e s v 浙江工业大学0 7 届硕上学位论文 目录 摘要i a b s t r a c t i i i 第一章绪论。1 1 1 前言1 1 2 质谱技术简介1 1 2 1 串联质谱技术3 1 3 液相色谱技术简介3 1 3 1 高效液相色谱3 1 3 2 超高效液相色谱一：4 1 3 2 1 原理基础4 1 3 2 2 技术特点4 1 4 液质联用技术简介5 1 4 1 液质联用技术进展5 1 4 2 液质联用的接口技术：6 1 4 3 液质联用分析特点8 1 5 液质联用在药物分析中的应用8 1 5 1 中药成分分析一8 1 5 2 新药研发一9 1 5 3 药物中微量杂质、降解产物等分析1 0 1 5 4 药物代谢和药代动力学研究1 1 1 6 本课题的意义和主要内容1 1 参考文献1 4 第二章新型快速色谱柱分离头孢菌素类抗生素的比较研究1 9 2 1 引言。19 2 2 实验部分2 0 2 2 1 仪器和试剂2 0 2 2 3 色谱条件2 2 2 2 4 质谱条件2 2 v l 浙江工业大学0 7 届硕士学位论文 2 3 结果与讨论2 2 2 3 1 头孢菌素类药物的定性分析2 2 2 3 2 色谱柱分析时间的比较2 6 2 3 3 色谱柱分离度的比较2 7 2 3 4 色谱柱柱效的比较2 7 2 3 5 色谱柱柱压的比较2 8 2 3 6 色谱柱峰面积的重复性3 0 2 3 7 串联柱在常规h p l c 系统中的应用3 0 2 4 j 、结3 1 参考文献3 2 第三章液质联用技术快速筛选仙鹤草中活性物质仙鹤草酚3 4 3 1 引言3 4 3 2 实验部分3 6 3 2 1 样品和试剂3 6 3 2 2 样品配制3 6 3 2 3u p l c e s i i t - m s “实验。3 6 3 2 4h p l c e s i - t o f m s 实验3 7 3 3 结果与讨论3 7 3 3 1 色谱条件的优化3 7 3 3 2h p l c e s i t o f m s 实验4 1 3 3 3u p l c e s i - i t - m s “实验4 2 3 3 3 1c 3 、c 4 、c 1 2 和c 1 9 的结构确证4 3 3 3 3 2c 5 、c 7 和c 1 6 的结构确证5 3 3 - 3 3 3c i1 的结构确证5 8 3 3 3 4cl 和c 6 的结构确证5 8 3 3 3 5c 9 和c 1 5 的结构确证5 9 3 3 3 6c 8 、c 1 0 和c 1 4 的结构确证6 0 3 3 3 7c 1 3 和c 1 7 的结构确证6 0 3 3 3 8c 2 和c 18 的结构确证6 1 3 4 小结6 1 v i i 浙江工业大学0 7 届硕十学位论文 参考文献6 3 第四章柱后添加过渡金属离子在线区分鉴定黑鳗藤中的c 2 1 甾体苷异构体6 6 4 1 引言6 6 4 2 实验部分6 8 4 2 1 样品和试剂6 8 4 2 2 样品配制6 8 4 2 3 高效液相色谱6 9 4 2 4 超高效液相色谱6 9 4 2 5 质谱6 9 4 3 结果与讨论一7 0 4 3 1h p l c 与u p l c 的比较一7 0 4 3 2p g - 1 、3 、5 和6 的结构确证7 0 4 3 3 碱金属诱导的c 2 l 甾体糖苷的质谱裂解研究7 2 4 3 4p g 2 和4 的结构确证。7 7 4 3 5c 2 】甾体糖苷与过渡金属离子的作用方式一7 9 4 3 6 过渡金属诱导的c 2 l 甾体糖菅的质谱裂解研究8 1 4 4 小结8 5 参考文献8 7 第五章总结9 0 致1 射9 2 攻读学位期间发表的学术论文。9 3 v i i i 浙江工业大学0 7 届硕士学位论文 u p l c h p l c t o f 缩略词表 u l t r ap e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h y 超高效液相色谱 h i g hp e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h y 高效液相色谱 t i m e o f - f l i g h t a p i a t m o s p h e r i cp r e s s u r ei o n i z a t i o n a p c i 飞行时间 大气压电离 a t m o s p h e r i cp r e s s u r ec h e m i c a li o n i z a t i o n 大气压化学电离 f a bf a s ta t o mb o m b a r d m e n ti o n i z a t i o n c ic h e m i c a li o n i z a t i o n e ie l e c t r o ni m p a c ti o n i z a t i o n e s i e l e c t r o s p r a y i o n i z a t i o n m sm a s ss p e c t r o m e t r y rr e s o l u t i o n n t pn u m b e ro ft h e o r e t i c a lp l a t e s c i d c o l l i s i o ni n d u c ed i s s o c i a t i o n f t - i c rf o u r i e rt r a n s f o r m i o n c y c l o t r o nr e s o n a n c e s ds t a n d a r dd e v i a t i o n r s dr e l a t i v e s t a n d a r dd e v i a t i o n p d ap h o t o - d i o d ea r r a y x 快原子轰击电离 化学电离 电子轰击电离 电喷雾电离 质谱 分离度 理论塔板数 碰撞诱导解离 傅里叶变换离 回旋共振 标准偏差 相对标准偏差 光电二极管阵列 1 1 前言 随着生活水平的改善，人类对健康越来越重视。而药物在预防和治疗人类疾 病方面又有着举足轻重的作用。在现代新药开发过程中，随着化学技术的不断发 展，新化合物数量急剧增加，传统的分析方法己不能满足需要。不仅新药的开发 得到人们的重视，从资源丰富的天然药物中分离提取活性成分同样重新得到人们 的重视。然而天然药物的粗提物是一个十分复杂的体系，它可能包含了上百种不 同的成分，而且各成分的化学性质有很多相似性。如果采用传统的柱色谱对每个 化合物单体进行分离提取，进而依据各种谱学手段( 红外光谱、紫外光谱、质谱、 核磁共振谱) 来鉴定各自的分子结构，这个过程繁琐、复杂、费时费力、样品消耗 量大、而且往往只能得到主要成分，对微量活性成分的分析鉴定有一定的难度。 因此，药物分析工作者的一个重要任务是建立灵敏、可靠的分析方法来定性或定 量分析测定复杂样品中的微量成分，从而为进一步的科学研究提供有效的分析数 据。在药物分析领域，液质联用技术，结合了高效液相色谱强大的分离能力以及 质谱在定性、定量分析方面的优势，较好地适应了现代药物研究对自动化、高通 量分析方法的需求，在过去1 0 年中有利地推动了药物研究的发展【j 训。 1 2 质谱技术简介 质谱( m a s ss p e c t r o m e t r y ，m s ) 技术自1 9 1 2 年诞生以来已经经历了近百年的时 间。1 9 世纪末，g o l d s t e i n 在低压放电试验中观察到正电荷粒子，随后w w e i n 发现 正电荷粒子束在磁场中发生偏转，这为质谱的诞生提供了理论基础。到了二十世 纪初，英国学者j j t h o m s o n 对正电荷粒子束的物理学进行研究，从而发明了质谱p j 。 质谱是离子，如分子离子，碎片离子等按质荷比( m z ) 大小而依次排列的谱图，通 过对样品气相离子质荷比大小和丰度的测定进行化合物的组分分析和结构分析， 是化合物的“化学指纹图谱”之一。质谱仪主要由进样系统( s a m p l ei n t r o d u c t i o n ) ， 离子源( i o ns o u r c e ) ，质量分析器( m a s sa n a l y z e r ) ，检测器( d e t e c t e r ) ，数据处理系统 1 浙江工业大学0 7 届硕士学位论文 f d a t as y s t e m ) 和真空系统( v a c u u ms y s t e m ) 组成。其中，离子源和质量分析器是核心 组成部分，对质谱仪器的改进主要围绕这两个部分进行。 早期发明的电子轰击离子源( e l e c t r o ni m p a c t ，e 1 ) 1 4 】和化学离子源( c h e m i c a l i o n i z a t i o n , c i ) 【5 】需要在高真空条件下工作，样品在离子化之前，首先必须气化， 因而只能应用于易挥发、受热稳定不分解的有机小分子( k + c s + ) 。碱金属诱导裂解产生的碎片都保留碱金属离子，碎裂程度随着 离子半径的增大而减少( m + l i 】+ 【m + n a 】+ 【m + k 】+ 【m + c s n ，在【m + l i + 和 m + n a + 的多级质谱图中不仅有苷元c 1 2 、c 1 7 、及c 2 0 等位置上取代基中性丢 失产生的碎片，同时含有糖苷键断裂产生的碎片，这些碎片提供了表征苷元结构 及糖链序列的信息。【m + k r 碰撞裂解只产生c 1 2 或c 2 0 位置上酯基丢失的碎片。 由于c s + 的半径的较大，f m + c s + 碰撞裂解，c s + 和甾体糖苷分子解离，产生自身信 号。甾体苷元c 1 2 和c 2 0 位置上的取代基类型对甾体糖苷和碱金属结合离子的 质谱裂解模式有一定的影响。当取代基是酯基时，酯基上的氧原子易与碱金属配 位，酯基优先于糖苷键断裂。c 2 1 甾体糖苷与碱土金属c a c l 2 在甲醇