（分析化学专业论文）吩噻嗪类药物的分子印迹化学发光分析法的研究.pdf

吩噻嗪类药物的分子印迹一化学发光分析法的研究 牛卫芬 摘要化学发光( c l ) 分析法具有灵敏度高、线性范围宽、仪器设备简单、分析 速度快、操作方便等特点，广泛地应用于环境化学、临床检验、药物分析和工业 分析等领域。但是，由于选择性差，限制了该方法在复杂样品中的应用。因此， 提高化学发光分析的选择性是化学发光分析研究中一项迫切和十分有意义的工 作。已报道的化学发光免疫分析及酶联反应化学发光分析虽有很好的选择性，但 其涉及的分析对象范围有限，关于高效液相色谱及毛细管电泳与化学发光的联用 技术也有报道，但这些方法所需仪器昂贵，操作复杂，而且化学发光检测往往是 在柱后进行，当分离条件和化学发光条件不相容时，则很难应用化学发光分析法 来检测分析物。 分子印迹技术是近年来出现的一种制备对目标分子具有特异选择性识别能力 的聚合物的技术。由于分子印迹聚合物以目标分子为模板合成，其分子结构中含 有和目标分子高度互补的空腔结构，因而对目标分子表现出惊人的专一识别性。 将分子印迹技术应用于化学发光分析中，利用分子印迹聚合物对目标分子特异的 识别和捕获能力，将待测物质与复杂样品中的共存组分分离，而后进行化学发光 测定，从根本上解决化学发光选择性差的问题。 本论文分为两部分，第一部分为综述，第二部分为研究报告。 第一部分简要阐述了化学发光法的优缺点，分子印迹的基本原理，着重总结 了近十年来分子印迹技术的进展情况，主要包括聚合物的合成方法以及分子印迹 聚合物的应用，以及本实验室近几年来在分子印迹一化学发光方面所作的工作。 第二部分为具体研究工作。发现了吩噻嗪类药物分别在铁氰化钾一鲁米诺、高 锰酸钾- 鲁米诺体系中的后化学发光行为；合成了盐酸氯丙嗪、奋乃静的分子印迹 聚合物，以此聚合物为识别物质，建立了测定这些物质的分子印迹一化学发光分析 方法，并已将这些分析方法成功的应用于实际样品中盐酸氯丙嗪、奋乃静的测定 中；对吩噻嗪类药物在铁氰化钾一鲁米诺后化学发光体系中的反应机理进行了探讨。 研究报告由四部分组成： 1 、吩噻嗪类药物在铁氰化钾鲁米诺体系中后化学发光行为的研究分子印 迹一后化学发光法测定盐酸氯丙嗪 发现了吩噻嗪类药物在铁氰化钾一鲁米诺体系中的后化学发光行为，合成了盐 酸氯丙嗪分子印迹聚合物，并将此聚合物作为分子识别元件应用到化学发光分析 中，并对各试验条件进行了优化，建立了测定盐酸氯丙嗪的分子印迹一后化学发光 新方法。方法的线性范围为1 o 1 0 k 1 o 1 0 g m l ，线性相关系数为r = o 9 9 8 0 ，检 出限为3 x l o 。9g m l 。对1 o x l o 7g m l 的盐酸氯丙嗪溶液进行1 1 次平行的测定，相 对标准偏差为4 0 。此法己用于尿样及动物饮用水中盐酸氯丙嗪的直接测定，结 果令人满意。 2 、奋乃静分子印迹化学发光传感器的研究 本文合成了奋乃静印迹聚合物，评价了它在水溶液中对奋乃静的吸附选择性。 以此聚合物为传感器的识别元件，铁氰化钾鲁米诺一奋乃静化学发光反应为检测反 应，建立了分子印迹一化学发光传感器测定奋乃静的新方法。方法的线性范围为 5 o 1 0 - 8 _ 1 o x l 0 g m l ，线性相关系数为0 9 9 6 1 ，检出限为2 1 0 一g m l 。对1 o 1 0 4 g m l 的奋乃静溶液进行1 1 次平行的测定，相对标准偏差为3 7 。本法已成功应用 于尿样中奋乃静的直接测定。 3 、吩噻嗪类药物在铁氰化钾一鲁米诺体系中后化学发光反应机理的研究 以氯丙嗪为例，通过对有关化学发光反应的动力学性质、化学发光光谱、吸收 光谱、荧光光谱的研究以及对其它相关试验结果的分析，提出了此后化学发光反 应可能的机理。 4 、高锰酸钾一鲁米诺化学发光体系分子印迹一后化学发光法测定盐酸氯丙嗪 发现了盐酸氯丙嗪在高锰酸钾一鲁米诺体系中的后化学发光行为，结合分子印 迹技术，建立t n 定盐酸氯丙嗪的分子印迹后化学发光新方法。方法的线性范围 为1 0 1 0 1 o 1 0 g m l ，线性相关系数为r = o 9 9 9 1 ，检出限为3 1 0 g m l 。对 1 o x l 0 4g m l 的盐酸氯丙嗪进行9 次平行的测定，相对标准偏差为3 9 。此法已 成功用于尿样中盐酸氯丙嗪的直接测定。 5 、高锰酸钾一鲁米诺化学发光体系分子印迹一后化学发光法测定奋乃静 发现了奋乃静在高锰酸钾一鲁米诺体系中的后化学发光行为，建立了测定奋乃 静的分子印迹后化学发光法。方法的线性范围为1 ，0 1 0 - 7 _ 1 o 1 0 g m l ，线性相关 系数为r = o 9 9 8 4 ，检出限为3 x l o g m l 。对1 0 1 0 。6g m l 的奋乃静进行1 1 次平行 的测定，相对标准偏差为3 9 。此法己成功用于尿样中奋乃静的直接测定。 关键词： 后化学发光( p c l ) 分子印迹聚合物( m i p ) 分子印迹化学 ( m i c l ) 吩噻嗪 j i i n v e s t i g a t i o no nm o l e c u l a ri m p r i n t i n g - c h e m i l u m i n e s c e n c e m e t h o do fp h e n o t h i a z i n em e d i c a t i o n s n i uw e i f e n a b s t r a c t ：c h e m i l u m i n e s c e n c e ( c l ) m e t h o dh a sb e e nw i d e l yu s e di nm a n y f i e l d sd u e t oi t si n h e r e n th i g hs e n s i t i v i t y , w i d el i n e a rr a n g e ，s i m p l ei n s t r u m e n t a t i o n h o w e v e r , i ti s w e l lk n o w nt h a tas e r i o u sp r o b l e mi nc la n a l y s i si si t sp o o rs e l e c t i v i t y , w h i c hm a k e si t i m p o s s i b l et od e t e r m i n ea n a l y t e si nt h ec o m p l i c a t e ds a m p l e sd i r e c t l y g r e a te f f o r t sh a v e b e e nm a d et oo v e r c o m et h i ss h o r t c o m i n ga n dt h em o s tc o m m o ns o l u t i o nt ot h ep r o b l e m i st oc o m b i n et h ec lm e t h o dw i t l ls o m es e p a r a t i o nt e c h n i q u e ss u c ha sl i q u i d c h r o m a t o g r a p h ya n dc a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i s ，b u tt h e s em e t h o d sr e q u i r e dr e l a t i v e l y c o m p l i c a t e d a n de x p e n s i v ei n s t r u m e n t s t h e r e f o r eo n eo ft h em o s tu r g e n ta n d s i g n i f i c a n tw o r k si st oi m p r o v es e l e c t i v i t yo f t h ec l m e t h o d m o l e c u l a ri m p r i n t e dp o l y m e r ( m i p ) i sa ni m p o r t a n tm o l e c u l a rr e c o g n i t i o nm a t e r i a l a p p e a r e di nr e c e n ty e a r s m 1 ph a sap r e d e t e r m i n e ds e l e c t i v i t yf o rt h et a r g e tm o l e c u l e a n di t se x c e l l e n tr e c o g n i t i o na b i l i t yt ot h et a r g e tm o l e c u l ei sc o m p a r a b l et o a n t i b o d y a n t i g e na n de n z y m e s u b s t r a t en a t u r a lr e c o g n i t i o ns y s t e m i fm i pw a su s e da s t h er e c o g n i t i o nm a t e r i a li nc la n a l y s i s ，w h e nas a m p l es o l u t i o nf l o w st h r o u g ht h em i p , t h ea n a l y t ew o u l db es e p a r a t e df r o mc o e x i s t e ds u b s t a n c e sa n dp r e a d s o r b e do nt h em i p ， t h e nt h ec h e m i l u m i n e s c e n c er e a g e n t sf l o wt h r o u g ht h em i pf o rc ld e t e r m i n a t i o n ，t h e s e l e c t i v i t yo f c lm e t h o dw i l lb ei m p r o v e dg r e a t l y t h i st h e s i si n c l u d e sar e v i e wa n dar e s e a r c hs e c t i o n t h er e v i e wi n c l u d e st h eb a s i cp r i n c i p l e so fm o l e c u l a ri m p r i n t i n gp o l y m e r ( m i p ) ， h i g h l i g h t st h ed e v e l o p m e n tw i t hp r e p a r a t i o na n da p p l i c a t i o no fm i pi nt h er e c e n ty e a r s i nt h er e s e a r c hs e c t i o n ，t h e p o s t c h e m i l u m i n e s c e n c e ( p c l ) p h e n o m e n o n o f p h e n o t h i a z i n em e d i c a t i o n si np o t a s s i u mf e r r i c y a n i d e - h i m i n o ls y s t e ma n dp o t a s s i u m p e r m a n g a n a t e l u m i n o ls y s t e m w a sd i s c o v e r e d t h em i p so fc h l o r p r o m a z i n e h y d r o c h l o f i d ea n dp e r p h e n a z i n ew e r es y n t h e s i z e d u s i n gt h e s em i p sa sr e c o g n i t i o n m a t e r i a l ，m o l e c u l a ri m p r i n t i n g c h e m i l u m i n e s c e n c e ( m i c l ) m e t h o d sw e r ee s t a b l i s h e d ， a n dt h em e t h o d sh a db e e na p p l i e dt ot h ed e t e r m i n a t i o no fc h l o r p r o m a z i n eh y d r o c h l o r i d e a n dp e r p h e n a z i n ei nc o m p l e xs a m p l e sw i t hs a t i s f a c t o r yr e s u l t s t h ep o s s i b l er e a c t i o n m e c h a n i s mo f p h e n o t h i a z i n em e d i c a t i o n si np o t a s s i u mf e r r i c y a n i d e l u m i n o ls y s t e mw a s i i i d i s c u s s e d t h er e s e a r c hs e c t i o ni n c l u d e sf o u rp a r t s i n p a r to n e ，t h ep c lp h e n o m e n o no fp h e n o t h i a z i n em e d i c a t i o n si np o t a s s i u m f e r r i c y a n i d e l u m i n o ls y s t e mw a sd i s c o v e r e d t h em i po fc h l o r p r o m a z i n eh y d r o c h l o r i d e w a ss y n t h e s i z e d u s i n gt h em i pa s r e c o g n i t i o nm a t e r i a l ，an e wm o l e c u l a r i m p r i n t i n g c h e m i l u m i n e s c e n c e ( m i c l ) m e t h o df o rt h ed e t e r m i n a t i o n o f c h l o r p r o m a z i n eh y d r o c h l o r i d ew a se s t a b l i s h e d n em e t h o dd i s p l a y e dh i 曲s e l e c t i v i t y a n dh i g hs e n s i t i v i t y t h el i n e a rr a n g eo f t h em e t h o dw e r e1 o x l o 一1 o x l 0 4g m lw i t ha l i n e a rc o r r e l a t i o nc o e m c i e n to f0 9 9 8 0 t h ed e t e c t i o nl i m i tw a s3 x 1 0 4 g m l c h l o r p r o m a z i n eh y d r o c h l o r i d ea n dt h er e l a t i v es t a n d a r dd e v i a t i o nf o r1 o 10 7g m l c h l o r p r o m a z i n eh y d r o c h l o r i d es o l u t i o nw a s4 0 f n = 1 1 ) t h em e t h o dh a sb e e na p p l i e d t ot h ed e t e r m i n a t i o no fc h l o r p r o m a z i n eh y d r o c h l o r i d ei nu r i n ea n da n i m a l sd r i n k i n g w a t e rw i t hs a t i s f a c t o r yr e s u l t s i np a r tt w o ，t h ep e r p h e n a z i n em o l e c u l a ri m p r i n t e dp o l y m e r ( m i p ) w a ss y n t h e s i z e d a n di t sa d s o r p t i o ns e l e c t i v i t yt op e r p h e n a z i n ei na q u e o u ss o l u t i o nw a s e v a l u a t e d u s i n g t h e p e r p h e n a z i n e m 1 pa s r e c o g n i t i o nm a t e r i a l ， an o v e lm o l e c u l a r i m i p r i n t i n g c h e m i l u m i n e s c e n c e ( m i - c l ) s e n s o rf o rt h ed e t e r m i n a t i o no fp e r p h e n a z i n e w a sm a d eb a s e do nt h el u m i n o l p o t a s s i u mf e 玎i c y a n i d e p e r p h e n a z i n ec lr e a c t i o n n l e s e n s o rd i s p l a y e dg o o ds e l e c t i v i t ya n dh i g hs e n s i t i v i t y t h el i n e a rr e s p o n s er a n g eo ft h e s e n s o rw a s5 0 x 1 0 一1 0 x 1 0 g m lw i t hal i n e a rc o r r e l a t i o nc o c f f i c i e n to f0 9 9 6 1 t h e d e t e c t i o nl i m i tw a s2 xlo 一6g m lp e r p h e n a z i n ea n dt h er e l a t i v es t a n d a r dd e v i a t i o nf o r 1 o 1 0 。g m lp e r p h e n a z i n es o l u t i o nw a s3 7 ( n = 1 1 ) t h es e n s o rh a sb e e na p p l i e dt o t h ed e t e r m i n a t i o no f p e r p h e n a z i n ei nu r i n es a m p l e sw i t hs a t i s f a c t o r yr e s u l t s i np a r tt h r e e ，c h l o r p r o m a z i n eh y d r o c h l o r i d ew a ss e l e c t e da sar e p r e s e n t a t i v eo f p h e n o t h i a z i n em e d i c a t i o n s ，a n dap o s s i b l er e a c t i o nm e c h a n i s mw a sp r o p o s e db a s e do n t h es t u d i e so f t h ec lk i n e t i cc h a r a c t e r i s t i c s ，t h ec l s p e c t r a ，t h ef l u o r e s c e n c es p e c t r aa n d o t h e re x p e r i m e n t s i np a r tf o u r , t h ep c lp h e n o m e n o no fc h l o r p r o m a z i n eh y d r o c h l o r i d ei np o t a s s i u m p e r m a n g a n a t e l u m i n o ls y s t e mw a sd i s c o v e r e d an e wm i p c lm e t h o df o rt h e d e t e r m i n a t i o no fc h l o r p r o m a z i n eh y d r o c h i o r i d ew a se s t a b l i s h e d 1 1 1 el i n e a rr a n g eo f t h e m e t h o dw e r e1 o 1 0 1 o x l 0 。g n dw i t hal i n e a rc o r r e l a t i o nc o e f f i c i e n to f 0 9 9 9 1 t h e d e t e c t i o nl i m i tw a s3 x l o 一5g m lc h l o r p r o m a z i n eh y d r o c h l o r i d ea n dt h er e l a t i v es t a n d a r d d e v i a t i o nf o r l o x l o 。# m lc h l o r p r o m a z i n eh y d r o c h l o r i d es o l u t i o nw a s3 9 ( n = 9 ) t h e i v m e t h o dh a sb e e na p p l i e dt ot h ed e t e r m i n a t i o no fc h l o r p r o m a z i n eh y d r o c h l o f i d ei nu r i n e s a m p l ew i t hs a t i s f a c t o r yr e s u l t s i n p a r tf i v e ，i tw a sf o u n dt h ec lr e a c t i o no fp o t a s s i u mp e r m a n g a n a t e - l u m i n o l p e r p h e n a z i n ea n e wm i p c lm e t h o df o r t h ed e t e r m i n a t i o no fp e r p h e n a z i n ew a s e s t a b l i s h e d t h el i n e a rr a n g eo ft h em e t h o dw e r e1 0 x10 1 0 xl0 。e c r u lw i t hal i n e a r c o r r e l a t i o nc o e f f i c i e n to fo 9 9 8 4 t h ed e t e c t i o nl i m i tw a s3 x 1 0 。g m la n dt h er e l a t i v e s t a n d a r dd e v i a t i o nf o r1 0 1 0 七g m lp e r p h e n a z i n es o l u t i o nw a s3 9 ( n = 1 1 ) t h e m e t h o dh a sb e e na p p l i e dt ot h ed e t e r m i n a t i o no fp e r p h e n a z i n ei nu r i n es a m p l ew i t h s a t i s f a c t o r yr e s u l t s k e y w o r d s ：p o s t c h e m i l u m i n e s c e n c e ( p c l ) ；m o l e c u l a ri m p f i m i n gp o l y m e r ( m i p ) ； m o l e c u l a r i m p r i n t i n g c h e m i l u m i n e s c e n c e ( m i - c l ) ；p h e n o t h i a z i n e m e d i c a t i o n s v 学位论文独创性声明 v9 0 d 0 8 j 本人声明所呈交的学位论文是我在导师的指导下进行的研究工作及取得的研 究成果。尽我所知，除文中已经注明引用的内容外，论文中不包含其他个人已经 发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得陕西师范大学或其它教育机构的学位 或证书而使用过的材料。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均己在文中 作了明确说明并表示谢意。 作者签名：差至整日期：翌塑：丝 学位论文使用授权声明 本人同意研究生在校攻读学位期间论文工作的知识产权单位属陕西师范大 学。本人保证毕业离校后，发表本论文或使用本论文成果时署名单位仍为陕西师 范大学。学校有权保留学位论文并向国家主管部门或其它指定机构送交论文的电 子版和纸质版；有权将学位论文用于非赢利目的的少量复制并允许论文进入学校 图书馆、院系资料室被查阅；有权将学位论文的内容编入有关数据库进行检索 有权将学位论文的标题和摘要汇编出版。 作者签名：垄至蕴日期：塑型! ! ! 1 3 第一部分综述 第节化学发光法 化学发光( c l ) 分析法具有灵敏度高、线性范围宽、仪器设备简单、分析速度 快、操作方便等特点，广泛地应用于环境化学、临床检验、药物分析和工业分析 等领域。但是，由于选择性差，限制了该方法在复杂样品中的应用。因此，提高 化学发光分析的选择性是化学发光分析研究中一项迫切和十分有意义的工作。己 报道的化学发光免疫分析及酶联反应化学发光分析虽有很好的选择性，但其涉及 的分析对象范围有限，关于高效液相色谱及毛细管电泳与化学发光的联用技术也 有报道，但这些方法所需仪器昂贵，操作复杂，而且化学发光检测往往是在柱后 进行，当分离条件和化学发光条件不相容时，则很难应用化学发光分析法来检测 分析物。 第二节分子印迹技术及其应用 1 引言 分子e h 迹，又称分子烙印( m o l e c u l a ri m p r i n t i n g ) ，属超分子化学中主客体化学 范畴，是源于高分子化学、生物化学、材料科学等学科的一门交叉学科。分子印 迹技术( m o l e c u l a ri m p r i n t i n gt e c h n i q u e ，m i t ) 是指制备对某一特定的目标分子( 模 板分子、印迹分子或烙印分子) 具有特异选择性的聚合物的过程。它可以被形象 地描绘为制造识别“分子钥匙”的“人工匙”的技术。 分子e 迹技术的出现直接来源于免疫学的发展。早在2 0 世纪3 0 年代，b r e i n l 、 h a u r o w i t z 和m u d d 就相继提出了一种当抗体侵入时生物体产生抗体的理论。后来， 在2 0 世纪4 0 年代，由著名的诺贝尔奖得主p a u l i n g 对上述理沦做了进一步的阐述， 并提出以抗原为模板来合成抗体的理论。为分子印迹的发展奠定了一定的理论基 础。1 9 4 9 年，d i c k e y 首先提出了“专一性吸附”这一概念，实际上可视为“分子印 迹”的萌芽。但在很长一段时间内未引起人们足够的重视。直到1 9 7 2 年由德国w u l f f 研究小组首次报道了人工合成分子印迹聚合物之后，这项技术才逐步被人们所认 识i “。特别是1 9 9 3 年瑞典l u n d 大学的m o s b a c h 等在( ( n a t u r e ) ) 上发表有关茶碱分 子印迹聚合物( m o l e c u l a r l yi m p r i n t e dp o l y m e r s ，m i p s ) 的研究报道后口j ，分子印迹 技术得到了蓬勃发展。迄今，在分子印迹技术的作用机理、分子印迹聚合物制备 方法以及分子印迹技术和分子印迹聚合物在各个领域的应用研究都取得了很大的 进展，尤其是在分析化学方面的应用更是令人瞩目。分子印迹技术的应用研究所 涉及的领域非常宽泛，包括分离纯化、化学催化和模拟生物转化、分析传感等。 2 分子印迹技术的特点 分子印迹技术之所以发展如此迅速，主要是因为它有三大特点：构效预定性 f p r e d e t e r m i n a t i o n ) 、特异识别性( s p e c i f i cr e c o g n i t i o n ) 平1 广泛实用性( p r a c t i c a b i l i t y ) 。 基于该技术制备的分子印迹聚合物具有亲和性和选择性高、抗恶劣环境强、稳定 性好、使用寿命长、应用范围广等特点。因此，分子印迹技术在许多领域色谱分 析、固相萃取、仿生传感、模拟酶催化、临床药物分析、吸附、膜分离等得同益 广泛的研究和开发、有望在生物工程、临床医学、天然药物、食品关工业环境监 测等行业形成产业化规模的应用。同时，分子印迹技术对于研究酶的结构、认识 受体一抗体作用机理及在分析化学等方面具有重要的理论意义和使用价值。 3 分子印迹技术理论 3 1 分子印迹技术的基本理论和原理 在生物体内，分子复合物的形成通常需要借助非共价键( 氢键、范德华力、 离子键等) 相互作用。虽然单个非共价键比单个共价键键能低，但多重非共价键 的耦合和多个作用点的协同则会形成很强的相互作用，从而使复合物具有很高的 稳定性。由p a t d i n g 抗体形成理论出发，当模板分子与聚合物单体接触时会尽可能 地同单体形成多重作用点，如果通过聚合，把这些多重作用点固定或“冻结”下来， 当模板分子除去后，聚合物中就形成了与模板分子在空问和结合位点上相匹配的 具有多重作用点的空穴，这样的孔穴对模板分子具有选择性。分子印迹技术就是 指为获得在空间和结合位点上与某一分子( 模板分子、印迹分子) 完全匹配的聚 合物的制备技术。实现分子印迹通常要经过三个步骤。 ( 1 ) 在适当的介质中，具有适当功能基的功能单体通过与模板分子问的相互 作用聚集在模板分子周围，形成单体模板分子复合物。 ( 2 ) 功能单体与过量的交联剂在致孑l 剂的存在下形成聚合物，从而使功能单 体上的功能基在特定的空间取向上固定下来。 ( 3 ) 通过一定的物理或化学方法把模板分子脱除。这样在聚合物的骨架上留 下了一个对模板分子有“预定”选择性的空问和结合位点( b i n d i n gs i t e s ) 。 根据印迹分子和功能单体形成复合物时作用力的性质，分子印迹分共价型和 非共价型两种不同类型，其中非工价共价型的研究和应用更为普遍。 3 。2 分子印迹聚合物的识别机理 关于m i p 对印迹分子的识别机理研究报道相对较少。w u l l f f a l 用两位点结合理 论，阐述了印迹分子与m i p 之问的高度选择性结合作用。如图2 所示，首先印迹 分子与m i p 中的空穴发生单位点结合，如果单位点结合有正确的空问取向f 如图 2 c ) ，那么此中间产物会迸一步形成正确的两位点结合( 如图2 ：如果发生的单位 点结合空间取向不正确( 如图2b 、d ) ，那么只有将这种错误的结合键断裂后，才能 够形成正确的两位点结合。升高温度有利于加速两位点的结合，从而提高m i p 对 模板分子的选择性。 w u l l t 4 5 1 还研究了在分子印迹过程中是空穴形状还是空穴内印迹位点的种类与 空间取向对m i p 的选择性影响更大的问题。w u l l f 合成了一系列相似的印迹分子， 这些分子具有不同的印迹位点或者不同的分子形状，然后用这些物质制备m i p 。 结果表明，空穴中印迹位点的种类与空间取向比空穴的形状更加重要。当然，在空 穴内印迹位点的种类与空间取向相同时，模板分子的形状与大小就成为决定m i p 选择性的重要因素。 b )c ) ” d ) 3 3 分子印迹技术的分类 按照单体与模板分子结合方式的不同，分子印迹技术可分为预组织法( 共价 法) 和自组装法( 非共价法) 两种基本方法。如下图所示： bn d “g ) i )；| i 、 预组装法( p r e o r g a n i z a t i o n ) 又称共价法。由德国的w u l f f 及其同事在2 0 世纪 7 0 年代初期创立【6 ”。在此法中，模板分子( 印迹分子) 首先通过可逆共价键与单 体结合形成单体模板分子复合物，然后交联聚合，聚合后通过化学途径将共价键 断裂而去除印迹分子。共价键作用的优点是聚合物中能获得在空间精确固定排列 的结合基团。目前，该法已被应用制备具有特异识别功能的聚合物，糖类及其衍 生物、甘油酸及其衍生物、氨基酸及其衍生物、扁桃酸、芳香酮、二醛、三醛、 铁转移蛋白、联辅酶及甾醇类物质。由于共价键作用一般较强，在印迹分子预组 装或识别过程中结合和解离速度慢，难以达到热力学平衡，不适于快速识别，而 且识别能力与生物识别差别甚远，因此这种方法发展缓慢。 自组装法( s e l f - a s s e m b l i n g ) 又称非共价法。由瑞典的m o s b a c h 及其同事在2 0 世纪8 0 年代后期创立 8 。在此法中，模板分子( 印迹分子) 与功能单体之间自组 织排列，以非共价键自发形成具有多重作用位点的单体一模板分子复合物，经交联 聚合后这种作用保存下来。常用的非共价作用有：静电力、疏水作用力、氢键及 金属配位健电荷转移以及范德华力等，以氢键作用应用最多。需要注意的是，如果在 印迹和后续分离过程中只有氢键一种作用时，其拆分外消旋体的效果不佳；而如果 在印迹过程中既有氢键，又有其他物理或化学作用时，其拆分外消旋体的分离系数0 【 值很高。s e l l e r g r e n 就静电作用对选择性的影响做了详细的研究1 9 ，当只有一种静 电作用时，获得的m i p 的选择性降低【lo 】。而将静电作用和共价作用结合起来，其 选择性比单个共价作用的选择性好得多。也有人使用强度小且无方向性的范德华 力来形成复合物【1 1 】，其分子识别过程接近天然的分子识别系统。f u j i i 等【12 j 首次使 用金属配基结合作用制得金属配位m i p ，其拆分外消旋体的分离系数。值很高。 a r n o l d 掣1 3 1 详细研究了含咪哗的化合物与c u 2 + 的结合作用。k e m p e 等【1 4 】在用非共 价或离子作用的m 1 p 研究手性分离时，着重考察了水对分子识别的影响，并同时 研究了氢键和疏水性在手性分离中所起的作用。而d a u w e 等【l 卅在研究三嗪类农药 的m i p 时，发现在水含量较少的流动相中，m i p 的选择性随印迹分子的碱性增加 而增加，与印迹分子的疏水性无关。而在水含量较多的流动相中，其选择性与印 迹分子的疏水性有关。总之，非共价作用的种类较多，在制各m i p 及其后续过程 中，使用一种作用制得的m i p 的选择性较低，而使用多种作用相互结合制得的m 1 p 则具有较高的选择性和分离能力。 非共价结合型m i p 的优点较多：( 1 ) 非共价作用具有多样性和普遍性，故对 印迹分子的类型没有太多限制；( 2 ) 可使用多种功能单体；( 3 ) 印迹分子易除去； f 4 1m i p 形成和识别机理类似抗体等生物大分子配体，专一性好等。因此，非共价 结合型m i p 已成为近年来分子印迹研究的主要方向。 除了以上两类基本类型外，另外还有一种技术综合了这两者，即聚合时单体与 印迹分子问作用力是共价键，而在对分子印迹分子的识别过程中，二者作用是非共 价的。w h i t c o m b e 等 1 6 1 用印迹分子胆固醇与单体4 一乙烯基苯基碳酸酯共价结合后， 通过水解使共价结合部断裂形成酚羟基，在分子识别中通过氢键结合胆固醇。最 近，用功能单体与金属离子配位制备m i p 也得到了发展，主要用于金属离子和蛋白 质的分离。由于金属配位作用较强，m i p 可以在极性溶剂中制备和识别。另外， 这种方法最大的优点是可以通过简单地变换金属种类实现对m i p 亲合能力的灵活 调节。 4 4 分子印迹聚合物的制备 分子印迹聚合物制备方法的研究主要围绕着两个问题展开，一是对m i p 的性 能加以改善( 如提高交换容量和提高材料韧性) ，以适应大规模生产和应用的需要；另 一方面是实现在水相中制备分子印迹聚合物，以解决对水溶性分子、特别是生物 大分子的印迹问题，扩大分子印迹聚合物的应用范围。目前，分子印迹聚合物主 要有以下几种制各方法： 4 1 本体聚合 这是一种最常用的方法。该方法是将模板分子、功能单体、交联剂和引发剂 按一定比例溶解在惰性溶剂( 通常是氯仿或甲苯) 中，然后移入一玻璃安培瓶中，超 声脱气，通氮除氧，真空下密封安培瓶，经热( 6 0 1 2 0 。c ) 或紫外光照引发聚合一定 时间( 通常2 4 小时) 得到块状聚合物，经粉碎、研磨、筛选等过程获得适度大小的 粒子，洗脱除去模板分子，经真空干燥后即成。这种方法所制备的m i p 作为固定 相已用于高效液相色谱( h p l c ) t ”，18 1 、薄层液相色谱( t l c ) 和毛细管电泳( c e ) 【2 0 i 等的研究中。本体聚合的方法简单，优化印迹条件比较直接，但此方法也存在很 多缺点，主要是研磨过程中会不可避免地产生一些不规则粒子和相当大量的超细 粒子，粒子的不规则性影响m i p 的选择性和柱效，超细粒子使色谱柱柱压明显升 高甚至堵塞色谱柱，因此装柱前须经反复沉降倾析除去超细粒子，手续繁琐费时， 加之后面的洗脱过程，使得此方法的制各的m i p 产率很低( 通常小于5 0 1 。尽管 如此 但由于它制备方法简单，易于掌握，加之其固有的高选择性，甚至对映异构体 在用这种方法所制备的固定相上也获得了完全的分离，因而目前还广泛使用。 4 2 原位聚合 原位聚合法是在色谱柱上或管内直接合成m i p 固定相的方法，由于其直接、 简便的特点，具有很强的实用性。m a t s u i 等人 1 0 , 2 1 1 采用原位聚合法在液相色谱柱 中直接制得了连续棒状m i p 分离介质，使用前只需进行洗涤，手性分离的选择性 可达1 - 7 ，对位置异构体也有较好的分离效果，但柱效和分辨率仍不够高。 s e l l e r g r e n l 2 2 1 采用改进的分散聚合技术，在玻璃管( 1 5 c m x 3 m m ) 中原位制备了多孔 m i p 。分散原位聚合技术也成功用于熔融石英毛细管中固定相的制备【2 3 j 。邹汉法等 但4 l 对原位聚合法制备高效液相色谱分子印迹手性柱己作了较为详尽的综述，并采 用此法制备了辛可宁印迹聚合物，分离了非对映异构体抗疟药物辛可宁和辛可尼 丁，柱效远高于一般高效液相色谱分离的柱效。最近，吴文镶等采用原位聚合合 成了杀菌剂腈菌唑印迹聚合物并研究了它的识别性能【2 5 】。虽然原位分子印迹技术 处于刚刚起步阶段，但已展现了用于手性物质分离的潜力，是一种很有发展前途 的印迹技术。 4 3 分散聚合 分散聚合是一种新的聚合方法，于7 0 年代初由英国i c i 公司的研究者最先提出 【2 6 】。该方法是反应开始前，单体、引发剂、交联剂等溶于分散剂中，分散剂的大 分子舒展在溶剂中，由引发剂引发聚合。当反应进行到一定程度后，高分子链生 长到一定长度就相互缠结在一起，在搅拌作用下逐渐形成完整的微球从聚合相中 析出。该方法的特点是可得到形状规则的微球，并可通过调节乳化剂的用量控制 粒径，粒径介于沉淀聚合和悬浮聚合方法之间。整个制备过程都是在非极性体系 中进行的，因此产物较适合应用于非极性环境中。其制备的关键是表面活性剂和 惰性分散体系的选择。y e l 2 等人首先采用分散聚合法制得了天冬氨酰基苯丙氨酸 甲脂微球形分子印迹聚合物。他们制备了一系列全氟代高聚物表面活瞄u ( p f p s ) ， 并在具有化学惰性的全氟代碳化物分散体系中聚合得到粒径在1 2 5 岫的m i p 微 球，并把该聚合物微球用于旺一天( 门) 冬氨酰苯丙氨酸甲酯( 小a s p a r t a m e ) 鬲o 产物的分 离中。s a y 2 8 j 等用分散聚合法制备了c u ( i i ) 印迹聚合物微球( p o l y ( e g d m a - m a h c u ( i i ) ) ) ，这种粒径在1 5 0 也0 0 岬的微球被用于金属离子溶液中铜离子的吸附 解吸附，显示出了很好的选择性。 4 4 沉