（食品科学专业论文）固定化红曲霉发酵水溶性色素的研究.pdf

沈阳农业大学硕士学位论文 摘要 本课题通过紫外诱变筛选出一株高产水溶性色素的红曲霉菌株，将其固定化并对 固定化与发酵方法进行优化，在最优条件下液态培养红曲霉固定化细胞，从而提高红 曲水溶性色素的产量，以适应现代化食品加工业的发展趋势。 首先平板分离实验室保留的红曲霉菌株s 和风城老窖酒厂提供的红曲霉菌株f ， 各获得5 株菌株，比较它们的产色素水平，选择风城老窖菌株f 4 为出发菌株，紫外 诱变2 m i n ，获得的f 4 0 1 8 菌株水溶性色素产量最高，达到2 4 2 5 u m l ，比出发菌株f 4 产色素能力提高了6 7 。然后对红曲霉菌株f 4 0 1 8 进行性能指标的测定，确定其最适 生长温度为3 0 3 5 ，最适p h 值为4 6 。 在上述研究结果的基础上对红曲霉菌株f 4 0 1 8 液态培养基配方进行研究，根据正 交试验结果和方差分析，确定了红曲霉菌株f 4 0 1 8 液态发酵的最佳培养基配方：大米 粉8 ，n f l n 0 30 4 ，k h ：e o , 0 2 ，g g s o , 0 1 ，z n s o , 0 0 2 ，m n s o , 0 0 4 ，调p h 为5 5 。在最优条件下对红曲霉菌株f 4 0 1 8 进行液态培养，确定其对数生长期是第三 天。 分别选用海藻酸钠、聚乙烯醇、卡拉胶和壳聚糖为固定化载体，对红曲霉菌株 f 4 0 1 8 进行包埋，分析比较这四种固定化颗粒的特性，最后选择海藻酸钙包埋法作为 红曲霉菌株f 4 0 1 8 的固定化方法。并对其固定化与发酵条件进行单因素研究。通过 正交试验确定制备与发酵固定化红曲霉f 4 0 1 8 细胞的最优条件为：采用5 0 海藻酸 钠与红曲霉f 4 0 1 8 菌株( 1 1 0 9 个i n l ) 等体积混合，将5 m l 海藻酸钠孢子悬液滴 入到4 c a c l ：溶液中，制成红曲霉f 4 0 1 8 海藻酸钙胶珠。用5 0 0 m l 的三角瓶装l o o m l 培养基，接入8 m l 的海藻酸钠凝胶固定化细胞，摇瓶转速为1 8 0 r m i n ，3 0 c 下避光 培养。 在优化条件下液态培养红曲霉f 4 0 1 8 的固定化细胞和游离细胞，比较两者的发酵 特性，发现固定化红曲霉f 4 0 1 8 细胞不仅具有与游离细胞相似的前期发酵过程和色价 最值，而且还表现出比游离细胞更长的平衡期，这将非常有利于色素产量的提高，为 实现工业化大规模生产提供了依据。 最后，对本文研究作了总结，并对存在问题作了探讨。 英文摘要 关键词：红曲霉；诱变；色价；固定化；水溶性 2 沈阳农业大学硕士学位论文 a b s t r a c t i nt h i sd i s s e r t a t i o ni m m o b i l i z e das t r a i nt h a th i g h - y i e l dw a t e r - s o l u b l ep i g m e n tw a s s c r e e n e do u t t h r o n gm o n u s c u sw h i c hw a sm u t a t e db yu l t r a v i o l e tl a s e r , a n df u r t h e l o p t i m i z e di t si m m o b i l i z a t i o na n df e r m e n t a t i o nm e t h o d s ，a n du n d e rt h e m o s ts u p e r i m c o n d i t i o nf e r m e n t e dt h ei m m o b i l i z e dm o n u s c u sc e l l si nt h el i q u i d - s t a t ec u l t i v a t i o n a tf i r s t s c r e e n i n go u tt h es t r a i nsr e t a i n e di i lt h el a b o r a t o r ya n dt h es t r a i nfp r o v i d e d b yf e n g c h e no l d - c e l l a rc o m p a n y , o b t a i n e dr e s p e c t i v e l yf i v e s t r a i n sa n dc o m p a r e dt h e m w i t hl e v e lo fp r o d u c e d - p i g m e n t t h es t r a i nf 4w h i c hw a sc h o s ea sb e g i n n i n gs t r a i nh a s b e e nm u t a t e df o r2 m i nb yu l t r a v i o l e tl a s e r , a n do b t a i n e ds t r a i nf 4 0 1 8w h i c hh a st h el i i g h e s t o u t p u to fw a t e r - s o l u b l ep i g m e n tr e a c h e d2 4 2 5 u m l c o m p a r e dt ot h eb e g i n n i n gs t r a i n f 4 ，w h o s ea b i l i t yo fp r o d u c e d - p i g m e n th a se n h a n c e d6 7 t h e nt h r o u g hc a r r y i n go nt h e c a p a b i l i t yi n d e xt ot h es t r a i nf 4 0 1 8 ，d e t e r m i n e di t sm o s ts u i t a b l eg r o w t ht e m p e r a t u r ef o r 3 0 3 5 ca n di t sm o s ts u i t a b l ep hv a l u ef o r4 6 b a s e do ht h ea b o v ef i n d i n g s ，c o n d u c t e dt h es i n g i ef a c t o rr e s e a r c ht ot h el i q u i d - s t a t e c u l t i v a t i o no ft h es t r a i nf 4 0 1 8 ，a n da c c o r d i n gt oo r t h o g o n a lt e s tr e s u l ta n dv a r i a n c ea n a l y s i s ， d e t e r m i n e dt h eb e s to p t i m i z e dp r o p o r t i o no ft h el i q u i d s t a t em e d i u mf o rt h es t r a i nf 4 0 1 8 ： r i c e p o w d e r 8 ，n h 4 n 0 3 0 4 ，k h z p 0 4 0 2 ，m g s 0 4 0 1 ，z n s 0 4 0 0 2 ，m r l s 0 4 0 0 4 ， p h 5 5 u n d e rt h em o s ts u p e r i o rc o n d i t i o n , t h es t r a i no ff 4 0 1 8 w a sr a i s e di nt h el i q u i d - s t a t e m e d i u m ，a n dd e t e r m i n e di t sl o g a r i t h mv e g e t a lp e r i o df o r t h et h i r dd a y s r e s p e c t i v e l ys e l e c t e dt h es o d i u ma l g i n a t e ，t h ep o l y v i n y la l c o h o l ，t h ec a r r a g r e e n a n a n dt h ec h i n t i na st h ei m m o b i l i z e d - c a r r i e r , t h e ne m b e d d e dt h es t r a i nf 4 0 1 8 a n dt h o u g h a n a l y z i n ga n dc o m p a r i n gt h ec h a r a c t e r so ft h e s ef o u rk i n d so fi m m o b i l i z a t i o nc e l l s ，f i n a l l y d e t e r m i n e dt h es o d i u ma l g i n a t ee m b e d d i n g - m e t h o da si m m o b i l i z e d - m e t h o do ft h es t r a i n f 4 0 1 8 a n dc o n d u c t e dt h es i n g l ef a c t o rr e s e a r c ht oi t si m m o b i l i z a t i o na n df e r m e n t a t i o n c o n d i t i o n ，t h e nt h r o u g ht h eo r t h o g o n a le x p e r i m e n td e t e r m i n e dt h eb e s tc o n d i t i o nf o r i m m o b i l i z i n gs t r a i nf 4 0 1 8c e l l ：5 o a l g i n a t es o d i u mm i x e dw i t ht h es a m ev o l u m e s t r a i nf 4 0 1 8 ( 1 x 1 0 9 个m l ) ，w h i c ha r ed r i p p e di n t o4 c a c l zs o l u t i o n ，t h e nm a k e si n t o t h ea l g i n a t es o d i u mi m m o b i l i z e dc e l l so ft h es t r a i nf 4 0 1 8 t a k e1 0 0 m ll i q u i d - s t a t e 3 基奎塑茎 一一 m e d i u mw h o s eo u t s e tp hv a l u ei s5 5 hi n t o5 0 0 m lt r i a n g l eb o t t l e ，a n dv a c c i n a t e st h e8 m l s o d i u ma l g i n a t ei m m o b i l i z e dc e l l s ，a n dr a i s et h e mw i t h o u tl i g h tu n d e r1 8 0 r r a i nr o t a t e d s p e e do ft h er o c k e r u n d e rt h eo p t i m i z e dc o n d i t i o nr a i s e di m m o b i l i z e d - s t r a i nf 4 0 1 8c e l l sa n df r e ec e l l s ， a n dt h o u g hc o m p a r i n gt h e mw i t hf e r m e n t a t i o nc h a r a c t e r s ，n o to n l y d i s c o v e r e dt h e i m m o b i l i z e d - s t r a i nf 4 0 1 8c e l l s1h a dt h es a m ee a r l i e rp e r i o df e r m e n t a t i v ep r o c e s sa n dt h e h i g h e s tp i g m e n tv a l u ea st h ef r e ec e l l s ，b u ta l s od i s p l a y e dl o n g e rb a l a n c e dt i m e t h a nf r e e c e l l s ，t h u st h i sw i l lb ee x t r e m e l ya d v a n t a g e o u st oe n h a n c e m e n to ft h ep i g m e n to u t p u t ，a n d w i l lp r o v i d e dt h eb a s i sf o rr e a l i z i n gi n d u s t r i a l i z e dl a r g es c a l ep r o d u c t i o n f i n a l l y , s u m m a r i z e ds t u d i e dr e s u l t sa n dd i s c u s s e dr e m a i n e dp r o b l e m k e yw o r d ：m o n u s e u s ；m u t a t i n g ；p i g m e n tv a l u e ；i m m o b i l i z a t i o n ；w a t e r - s o l u b 4 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我 所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他入已经发表或撰写过的研 究成果，也不包含为获得沈阳农业大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我 一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。 研究生签名： 参互朱 时1 - j ：二7 牵z 月g 日 导师签名： 一关于论文知识产权和使用授权的说明 本论文的知识产权为沈阳农业大学所有。本人完全了解沈阳农业大学有关保留、使用学 位论文的规定，即：学校有权保留送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以 采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意沈阳农业大学可以用不同方式 在不同媒体上发表、传播学位论文的内容。 学位论文中的所有内容不经沈阳农业大学授权不得以任何方式擅自对外发表。 5 ( 保密的学位论文在解密后应遵守此协议) 研究生签名：乏瓠 导师签名 时间： 历；7 年莎月f 日 沈阳农业大学预士学位论文 1 1 红曲的历史 第一章文献综述 追源溯流，在人类历史发展的长河中，中国及其周边国家的制曲技术源远流长，东 方的先人运用自己的聪明才智，创造了独特的“霉”文化，堪称世界文明史中的巨擎。 对于红曲霉在欧洲曾一度被视为腐败菌，而在东亚地区却是传统食品加工的神奇微生 物，我们的祖先早在1 0 0 0 多年前就将其特殊功效和在食品上的应用记载下来，流传至 今。北宋初年，陶古在其清异录中提到“用红曲煮肉”的较早记载：元朝吴瑞在日 用本草中撰写到：“红曲酿酒，破血行药势”；以及李时珍在本朝纲目中写到：“红 曲主治消食活血，健脾燥胃。治赤自痢，下水谷，治打补伤损，治女人血气痛及产后恶 血不尽”( 周立平，5 0 0 4 ) 。这些都证明了由我们祖先发现的红曲在食品染色，食品防腐 及医疗上的卓著功效。 1 8 8 4 年，法国学者v a nt i e g h e n 分离在马铃薯培养基上的两株真菌建立了红曲霉属， 此后世界各国的学者才陆续加入到红曲霉的研究工作中，使其在食品、医药等颁域大放 光彩，为世人瞩目( 路秀玲，2 0 0 1 ) 。随着人们对红曲的菌物学与生物化学、遗传学与分 类学以及生物工艺与应用等诸多方面研究的深入，科学地证明了其初级与次级代谢产物 不仅可以用于酿酒，用作天然食品着色剂，还可以用来调节血脂、降低血压等。这一系 列的生理保健功能，使得红曲终将蔚成大业。 与此同时，海内外学者在红曲霉研究、应用领域的交流也十分活跃。1 9 9 8 年7 月及 2 0 0 0 年l o 月，在法国图卢兹大学和中国浙江工业大学相继举办了红曲国际学术研讨会， 东西方人士共同探讨“红曲”这一热门话题( 周立平，2 0 0 4 ) ，神奇的红曲将成为生物 科技的明日之星，发挥其宝贵的价值1 1 2 红曲霉 1 2 1 红曲霉属的分类 红曲霉( m o n a s c u s ) 属于真菌界( f u n g i ) 予囊菌门( h s c o m y c e t e s ) 不整囊菌纲 文献综述 ( p l e c t o m y c e t e s ) 散囊菌目( e u r o t i a l e s ) 红曲科( m o n a s c a c e a e ) 红曲霉属( m o n a s u s ) ， 主要种类有红曲霉( m a n k a ) 、烟色红曲霉( m f u l i g i n o s u s ) 、紫红曲霉( m p u r p u r e u s ) 和红色红曲霉( m r u b e r ) 等。中科院微生物菌种保藏管理委员会正式收集编目的重要红 曲霉有8 种4 8 个菌株，国内实际报道的红曲霉有1 7 种，日本有4 0 多种，纵观红曲霉 种类尚且不多，仍值得深入探讨( 陈义光等，2 0 0 0 ) 。 1 2 2 红曲霉的生理特性 红曲霉为腐生真菌，嗜酸，特喜乳酸( 能在p h 3 5 6 0 范围生长，最低能耐p h 2 5 ) ， 耐高温，耐乙醇，能以糖类、有机酸、醇类为碳源，能利用硝态氮、氨态氮和有机氮， 一般多采用麦芽汁琼脂培养基培养。 红曲霉的形态为不规则的分支菌丝，菌丝具有大型液泡，菌丝具横隔，多核，分支 多而不规则。幼时含有颗粒，老后含空泡及油滴，菌丝体不产生与营养菌丝有区别的分 生孢子梗，分生孢子着生在菌丝及其分枝顶端，单生或以基式生出，2 6 个成链，闭囊 壳成球形，有柄，柄长短不一，壳内多散生十多个子囊，子囊成球形，含有8 个子囊孢 子，成熟后予囊壁解体，孢子留在薄壁的壁囊壳内。菌落初为白色，老熟后变成淡红色， 紫红色，橙红色等。菌落呈绒状或皮膜状，呈皮膜状的菌落多为褶纹辐射状( 远腾章， 1 9 8 5 ) 。 1 2 3 红曲霉高产色素菌株的诱变筛选 菌种诱变的方法很多，包括物理诱变和化学诱变。其中红曲霉菌株的诱变采用有紫 外诱变、原生质体融合、亚硝基肌和激光诱变等方法。 赖建军等以a s 3 7 8 2 作出发菌，用p u l s e m a s l e r6 0 0 l e 型激光器经不同强度和不 同时间照射平板菌落，筛选出一株色素高产菌株，确定最佳碳源、氮源成份和发酵培养 基成份的最佳配比，并摸索温度、p h 、摇床转速对菌体生长和产色素的影响。最后测定 其生长曲线和各项参数规律，为以后大规模生产提供相关数据( 赖建军，2 0 0 0 ) 。 顾玉梅等采用所在实验室保藏的部分红曲霉菌种，通过测定发酵液的色价，筛选出 m o n a s c u s s p p9 9 0 3 菌株，色素产量较高，而桔霉素产量不高。在1 0 l 自动发酵罐实验中， 以玉米淀粉和谷氨酸单钠盐为主要成分的发酵液色价达1 8 4 u l i l l ，桔霉素质量浓度低于 2 沈阳农业大学硕士学位论文 l m g l ( 顾玉梅等，2 0 0 2 ) 。 谌斌通过对紫红曲的原生质体紫外线诱变育种，红曲色素产量提高到出发菌株的 2 2 7 倍( 谌斌，1 9 9 9 ) 。 连喜军等设计了一种双层培养基选育耐高浓度赖氨酸红曲霉菌株的实验，其培养基 上层为红曲霉生长培养基，下层为水溶性红曲色素合成培养基，红曲霉分泌的红曲色素 可沿琼脂从表面向深层扩展，扩展过程中脂溶性红曲色素与赖氨酸反应，生成水溶性红 曲色素，通过观察下层水溶性红曲色素的生成情况，就可筛选到耐高浓度赖氨酸菌株。 经过多次紫外诱变，获得1 株新菌株，其在菌落形态和菌丝形态上都与出发菌株不同， 赖氨酸耐受程度提高了1 0 倍以上，可见其效果非常显著。 1 3 红曲色素的概述 1 3 1 红曲色素的种类 红曲霉的代谢产物极其复杂，在不同的培养条件下，代谢途径也不尽相同，其产生 的红曲色素是多种色素成分的混合物。1 9 3 2 年n i s h i k a w a 首次从m p u r p u r e u s 等培养物 中分离出黄色色素晶体y o n a s c i n ( 红曲素) ( s h o j i s h i b a t a ，1 9 6 4 ) ，随后许多学者相继进 行了一系列的研究。目前已测出结构式有6 种( 见表1 1 ) ( 远藤章，1 9 8 5 ) 。除此之外，1 9 9 3 年，我国郭东川分离出两种新的红曲色素纯品( 郭东川，1 9 9 3 ) ，日本学者认为可能还有 4 6 种色素成分存在红蓝培养物中( 广井忠夫，1 9 8 8 ：曦部明彦等，1 9 7 5 ) 。 寰1 1 红曲色素的种类及分子结构 t a b l e1 1k i n d s 、c o l o r 、m o l e c u l ea n ds t r u c t u r eo f m o n s c n l $ p i g m c n g t 文献综述 1 3 2 红曲霉产色素的代谢途径 根据目前的研究，首先合成橙色色素m o n a s c o r u b i n 和r u b r o p u n c t a t i n ，随后合 成红色色素m o n a s c o r u b r a m i n e 、r u b r o p u n c t a m i n e 和黄色色素a n k a f l a v i n 、m o n a s c i n ( h a s s a nh a j j a j ，1 9 9 9 ) 。红曲色素的合成途径如下图( 图1 1 ，1 2 ) 。 4 6 c 蛳。蛳 l 。早y l 秘 仁一 图1 1 橙色色素产生的途径 f i g 1 1 t h e p r o d u c e dc o u r s c o f o r a n g e p i g m e n t 一 率 沈阳农业大学硕士学位论文 淞 r 曲m 州t - 如：r 衄- c m m 舛哪洲b 曲：r 叫晒1 4 ” 8 ”焱稆0 o m o 聃埘毗殳。哟h ”珀妇印曲噍l * ：r | 幛h l 妇m v l n ：r 吣h i sm w ：r n c t h 围1 2 红色素和黄色素产生的途径 f 毡1 ，2t h ep r o d u c e d u r o f r e x la n dy c u o wp i g m e n t 红曲霉生物合成橙色色素的过程涉及到6 分子的乙酸缩合成环状结构( 傅亮，1 9 9 8 ) 以及己酸和辛酸分别作为b o z o l a c t o n e 环上的两个不同的脂肪族侧链并入结构中，s 腺苷甲硫氨酸的甲基基团接合于c 一7 处。该基本途径属于一种多聚乙酰的生物合成，目 前对红曲霉调控该途径的方式一无所知。c a r e l s 和s h e p h e r d 认为，橙色色素首先生成， 黄色色素和红色色素属于衍生物。 橙色色素m o n a s c o r u b r i n 、r u b r o p u c t a t i n 转变成红色色素m o n a s c o r u b r a m i n e 、 r u b r o p u n c t a m i n e 的条件是培养基中存在过量的游离氨基酸和较高的p h 值。 有人认为，红曲色素是红曲霉的一种能量贮存物质，黄色色素组分在富含氮源的培 养基中可与含氮物质( 如氨基酸) 进行化学转化( 而非生理性转化) 成红色色素，可视为一 种氮源捕获剂，当营养缺乏时，红曲霉可同化色素，延缓细胞衰老、自溶过程。红色色 素组分( 胺类色素) 富含氮源，比黄色色素组分更容易被菌体同化( c u b r o d e r ，1 9 8 0 ) 红曲色素有胞内色素和细胞结合型色素两种形式( 张名光，1 9 8 2 ) ，在深层发酵过程 中，其色素大量地分泌至胞外( 陈家文，1 9 9 5 ) 。 5 张 蝴 弘 埘 。 邺卜 文献综述 i 3 3 红曲色素的特性 1 3 3 1 溶解性 红曲色素一般为菲承溶性，将非水溶性盼红越色素转化为水溶性红曲色素，主要是 通过红曲色素与水溶性蛋白质、水溶性肽或胨和氨基酸反应而变为水溶性。国内有的单 位采用大豆蛋白与红曲色素先结合，再酶解达到水溶，也有的单位采用红曲霉在含糖类、 水溶性蛋白质、水溶性肽或胨类和氨基酸的液体培养基中直接发酵生产水溶性红曲色素 的，但发酵水平不高，且为实验室技术。以大米和黄豆为主要原料生产水溶性红曲色素， 产量、色价、光热稳定性均较好( 王银善，1 9 8 7 ) 。 1 3 3 2 稳定性 红曲色素所含的黄色和橙色物质不稳定，易褪色；而它所含的红色物质则较稳定， 其鲜亮的颜色可保持较长时期( 谢珍珍，1 9 9 3 ) 。 p h 值对红益色素稳定性影响：在不同p h 值中，黄色组分和红色组分的含量会发生变 化，酸性条件下，黄色素的含量大增，对色调的影响较大( 方元祥，1 9 9 0 ) 。 光照对红曲色素稳定性影响：色素的酒精溶液在自然光照射条件下和避光保存时稳 定性最好( 方元祥，1 9 9 0 ) 。 加热对红曲色素稳定性影响：温度越高，加热时间越长，色素的保存率越低( 方元 祥，1 9 9 0 ) 。 1 3 3 3 红曲色素吸收光谱 使用分光光度计测定红曲色素，光密度最高峰值在9 0 一9 6 ( 体积比) 酒精中获得， 最大吸收波长分别为4 1 0 n m 和5 0 5 5 1 0 5 1 5 n m ( 偏于5 1 0 h m ) ；在蒸馏水中最大吸收波长为 4 1 0 h m 和4 8 5 4 o n m ( 偏于4 9 0 r ”n ) 。 1 4 红曲色素的生产 1 4 ，1 生产现状 红曲色素的生产有固态培养和液态深层发酵两种方式。目前，液态深层发酵进行稳 定而大规模的工业化生产较少。其重要原因之一是发酵色价偏低，生产成本较高。对于 同样组分的基质，深层发酵产生的红曲色素色价只有固态发酵的1 0 左右，其原因是固 6 沈阳农业大学硕士学位论文 态培养体系中，胞内产生的色素能不断地扩散到周围的介质中，不存在色素合成受阻遏 的现象：而在深层发酵过程中，色素在通常的酸性基质中可溶性较低，故大都保留在菌 丝体内，致使色素合成受抑制。另外，通气搅拌罐中的机械搅拌装置对菌丝体有一定的 剪切力，不利于色素的形成。 当然固态培养也有其缺点，如：劳动强度大，产品质量不稳定等。深层发酵的优点 在于可以调节发酵参数从而较大幅度提高某一特定产物的产量。 目前在工业上的液体培养以使用传统的通气搅拌发酵罐为主，但在实验室里已进行 了采用气升式反应器以及多段连续培养方式的研究，也有用细胞固定化发酵来提高色素 产量的研究，但资料尚少( 傅亮，1 9 9 7 ) 。 1 4 2 培养条件 1 4 2 1 碳源 对于大多数生产菌株来说，大米是用来生产色素的较佳的原料。大米的优越性在于 其复杂的成分有利于色素的合成；固态培养时，其微观结构更有利于菌丝的穿透和色素 的扩散。还有一些研究表明饴糖、甘油等也适于液体发酵产生红曲色素。 1 4 2 2 氮源 氮源的种类和浓度对所产红曲色素的类型和组成成分具有显著影响。当培养基含氮 量高，水溶性色素色价增高；含氮量低，则醇溶性色素色价较高，而水溶性色素色价偏 低( 傅亮，1 9 9 7 ) 。 添加非蛋白氨基酸可以增加红曲色素的产量( m ic h a e lr j o h n s ，1 9 9 1 ) ，有机氮源 含量高，产生的菌丝体量就多，但菌体生物量与色素产量并不呈正相关。无机氮源( 如 n a n 0 3 ) 也有利于色素的生产，但较高的氮源对提取不利，也不太经济( 吴大康，1 9 9 1 ) 。 1 4 2 3 氧气 红曲色素的形成需要氧，而且细胞内色素的稳定也要靠氧来保持。在无氧条件下， 色素迅速分解。深层发酵时，一些影响溶氧系数的因素如：搅拌和通气速率，以及碳源 的性质、细胞浓度和菌丝形状等，显著影响色素的产生( 毛宁等，1 9 9 4 ) 。 1 4 2 4p h 值 红曲霉产生红曲色素的最佳初始p h 值为中性偏酸( p h 值在5 5 - - 6 5 范围内) ，但为了 抑制杂菌，一般用酸调p h 值为3 5 - - 4 5 。醋酸的抑菌效果较好，而乳酸对产生调味品的 7 文献综述 香气有利；硫酸、盐酸等因成本低，一般工厂都愿意使用( 杜贵安等，1 9 8 8 ) 。 有研究表明，以大米为基质进行固体发酵，大米初始p h 值影响色素产量( 何佳等， 1 9 9 8 ) ，虽然培养中期，所有培养物的p h 值都变为3 4 ，但当初始p h 值为大米样品的自然 p h 值约6 o 时，各种色素组分的产量都最高。初始p h 值也影响各色素组分的产生比例。 培养前期，米粒的颜色取决于初始p h 值，初始p h 值依次为3 4 、6 o 和7 0 ，米粒呈现黄 色、橙色、红色。但在培养后期，红黄比( a s o o r m a 4 0 0 n m ) 随着初始p h 值的降低而升高。红 色色素与橙色色素的含量比相对恒定。 深层发酵与固态培养一样，初始p h 值对色素产量有影响( 何佳等，1 9 9 8 ) 。起始p h 值 偏低时( p h 3 o 3 5 ) ，发酵滤液颜色浊黄，随着p h 值逐渐趋近中性，呈鲜亮的深红色， 最适的起始p h 值为5 6 6 0 之间。p h 值为中性或略酸性，产色素效果好，因为低p h 值不 利于黄色素向红色素的转变。无论后期的p h 值如何变化，培养的初始p h 值决定色素产量 和色泽，其原因可能是p h 值影响营养物质的吸收。初始p h 值为4 5 时，醇溶性色素的色 价最高，p h 值为5 5 时水溶性色素的色价最高。 1 4 2 5 初始含水量 固体发酵，初始含水量对菌体生长和产生色素影响甚大。初始含水量较低，菌丝不 生长或生长限于米粒的外层；当初始含水量最大时，菌体长入米粒内部，产生橙红色色 素。但初始含水量对红曲色素中三类组分的比例没有影响( i m a n a k a ，t ，1 9 7 3 ) 。 1 4 2 6 温度 发酵温度应控制在3 0 3 2 左右。有报道指出试验菌株在液体摇瓶发酵的前期( 3 6 h 内) ，培养温度降低( 2 5 以下) ，中后期再提高温度至正常( 3 0 3 2 。c ) ，菌株产色素能力 很弱，甚至不产生色素，延长培养( 1 0 d ) 仍然不产生色素( 傅亮等，1 9 9 6 ) 。 1 4 2 7 培养时间 培养一定时问后应及时终止发酵，否则色素含量达到最高后会较快下降，可能是由 于营养底物含量很低时，色素被作为底物消耗所致。 从色素的组成看，随着发酵期的延长，则黄色素增加而红色素减少，原因是随着菌 体的老熟，部分红色素转变为黄色素，因而降低了红色素的色价。 1 4 3 色素的提取 1 4 3 1 固体发酵产品红曲米提取红曲色素 沈阳农业大学硕士学位论文 滤渣综合利用 下 滤液一过滤一二次浸提 l下 红曲米一一次浸提一过滤一滤渣 上 滤液一减压浓缩一膏状体红曲色素( 或喷雾干燥成红曲色素粉剂) 通常用酒精从红曲米中提取红曲色素，提取条件为：固液比l ：1 0 ，酒精浓度7 5 ， 浸提温度5 0 ，浸提时间l h ，得率达9 0 o 。提取后的滤渣仍可作着色产品( y u a n k u n l e e ，1 9 9 7 ：曹俊生，1 9 9 0 ) 。 1 4 3 2 深层发酵滤液提取红曲色素 1 4 3 2 1 水溶性色素提取工艺 发酵液一过滤一清液一真空浓缩一升华或喷雾干燥一水溶性色素干粉 l 菌丝体 1 4 3 2 2 醇溶性色素提取工艺 清液一提取水溶性色素 t 发酵液一过滤一菌丝体一加2 倍发酵液体积的8 0 乙醇浸泡4 h 一过滤一菌丝体 一加4 倍体积9 5 乙醇浸泡4 h 一过滤一第二次滤液一真空浓缩一醇溶性色素 浓缩液一升华干燥一醇溶性色素干粉 上 菌丝体 如需制结晶则需利用等电点法使红色素和黄色素分开。提取过的菌丝体，菌丝体间 的色素可以全部提取掉，而菌丝体壁内的色素也可提掉一部分。但用乙醇不能充分提取 菌丝体内的色素，菌丝体内一般会残留6 0 左右的色素而不能被乙醇提取出来( y u a n - k u n l e e ，1 9 9 7 ) 。 深层发酵产生的菌渣可以综合利用，其蛋白质含量高，氨基酸分布合理，利用菌渣 水解可以制造多种氨基酸( 曹俊生，1 9 9 0 ) 。 1 5 红曲色素在食品中的应用 自古以来，我国就已用红曲色素着色各种食品，我国食品添加剂使用卫生标准 ( g b 2 7 6 0 1 9 9 6 ) 规定：红曲色素可在各种肉制品、水产品、配制酒、冰棍、饼干、果冻、 9 文献综述 膨化食品、调味类罐头、奶制品、植物蛋白、果品中按生产需要适量使用。现着重介绍 红曲色素在肉制品、红腐乳、酒、醋、水产品中的应用。 1 5 1 红曲色素在肉制品中的应用 肉的呈色物质主要是肌红蛋白，在鲜肉中肌红蛋白同空气中的氧气结合形成鲜色， 但氧合肌红蛋白受热就会变成灰褐色的高铁肌红蛋白。在高温长时间加热时，发生的完 全褐变，还有诸如糖焦化作用和羰氨反应等。通常肉制品生产中加入亚硝酸盐，使肉制 品在加热后形成较稳定的红色，以刺激人们的食欲；同时还能起到防腐和增加风味的作 用。但现已证明亚硝酸盐是强烈致癌物亚硝胺的前提物质。因此，我国食品卫生法对它 的使用有严格的限制。 多年来人们力图寻找适当的代替品，最后通过多次研究，证明红曲是非常理想的替 代物。在发酵香肠、午餐肉、通脊烤肉、圆火腿等西式肉制品中添加适量红曲色素替代 亚硝酸盐作着色剂，其产品色泽红润均匀一致；而且口感细腻、风味独特、安全耐藏， 耐日光性高于亚硝基色素；同时由于红曲色素对脂肪代谢有促进作用，故将它用于肉制 品更具有积极意义。所以红曲色素在肉制品的加工中的应用越来越广泛。 1 5 2 红曲色素在豆腐乳中的应用 豆腐乳是我国的民族发酵食品，被欧美各国称为“中国乳酪”。因为豆腐干经过有 益微生物发酵后，蛋白质水解成多种氨基酸以及醇类、酯类、有机酸、芳香呈味物质， 形成豆腐乳特有的色香味风格，且营养十分丰富，易被人体消化吸收。而红腐乳是腐乳 中最受消费者喜爱的品种，是腐乳类中的上品，更是一种保健食品。因为红腐乳中选用 的天然色素一红曲色素不仅提供了色素和各种酶类，使产品表面形成诱人食欲的红 色，内部形成多种香气和香味成分，而且具有降血压、降胆固醇和血糖的功能。 1 5 3 红曲色素在酒中的应用 我国福建的红老酒( 老红酒) 和台湾的红露酒的生产都有悠久的历史。它们是先将糯 米先蒸煮，然后接种糖化菌和酵母，添加原料酒、红曲和水，发酵后经压榨、澄清、贮 存、调配而成的。其酒精含量一般在1 8 左右，且具有爽快的香味和香气，长时间贮藏 l o 沈阳农业大学硕士学位论文 也不变质，反而风味更佳。 在国外，日本新泻县生产的红酒以鲜红的色泽为特征，该产品色泽和功能性兼顾。 但存在着调香时不能使用活性炭、红曲特有香味的保持和酿造过程中哪个阶段添加红 曲、红曲色素的褪色等问题。其中最困难的是如何防止产品中天然红色素的褪色。日本 清酒与红露酒、老红酒相比，酒度和酸度要低些。 1 5 4 红曲色素在醋中的应用 福建红曲老醋是选用糯米、芝麻、红曲为原料，将糯米蒸熟( 米饭熟透、均匀、疏 松不结团) ，拌入米量2 5 的古田红曲( 内含糖化酶、洒化酶等多种酶系) ，经液体发酵酿 制而成。产品色泽棕黑、酸而不涩、香中带甜，风味独特，畅销3 0 多个国家。 1 5 5 红曲色素在水产品中的应用 红曲色素应用在腌制的鱼、虾上的作用和原理与在肉制品中是一致的：既作着色齐j ， 又作为抑菌剂，同对可以产生鲜美的味感。在我国，红曲色素被应用于水产品的加工上， 食品添加剂使用卫生标准( g b 2 7 6 0 - - - 1 9 9 6 ) 规定其用量为0 5 1 0 。在日本，它 被广泛应用于水产熟制品( 蟹、虾的仿制品等) 、煮章鱼、咸桂子鱼等的着色。 除应用上述几类食用物质之外，红曲色素还可用于各种调味品、禽类、果酒、辣椒 酱、甜酱、糕点等食品，具体不赘述。但它不宜用于新鲜蔬菜、水果、鲜鱼、海带。 在使用红曲色素时应注意：因为它在使用中会逐渐变成红棕色，溶解度、色价也会 下降，在p h 值4 o 以下或盐溶液中可能产生沉淀，p h 值9 o 以上可能会出现絮状物，所以 有它参与加工的某些产品应尽快食用。 1 6 红曲霉发酵过程中的毒性物质桔霉素 红曲霉还能产生一些有毒物质，如秸霉素。桔霉素首先是在1 9 3 1 年被作为抗生素从 青霉中分离并加以研究的，它能抑制蜡状芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、金色链球菌等。后 来研究表明，桔霉素是一种具有神经毒性的次级代谢产物，它是一种肾毒素物质。1 9 9 5 年，法国的b l a n c 教授证明红曲霉中的某些菌株能产生桔霉素。桔霉素的存在给红曲色 素及红曲霉制品的食用安全性提出了巨大的挑战，我国红曲制品的出口也因为桔霉素的 文献综述 存在受到严重影响。 如何使红曲霉在产生红曲色素的同时抑制桔霉素的形成已经成为一项重要的课题， 目前的解决方法主要集中在两方面：抑制桔霉素的合成和降解桔霉素。红曲霉合成红曲 色素和桔霉素的代谢途径己经研究清楚，它们具有共同的前体一丁酮，只要找到合适的 抑制剂，来抑制从丁酮到桔霉素的过程中关键酶的活性，就可以有针对性的抑制桔霉素 的合成，而不影响红曲色素的合成，目前已经找到一些抑制剂，并证明有效，但却影响 了色素的形成，因此，这方面还需要进一步研究，以期获得专一性的桔霉素合成抑制剂。 另外，研究人员试着采用化学法降解桔霉素，在加入0 5 n a o h ，同时加热到t 0 0 - 1 1 0 。c ， 可完全除去桔霉素的毒性：在室温下，将桔霉素和0 0 5 的过氧化氢接触3 0 分钟即可彻底 使桔霉素失去毒性，可是遗憾的是，采用上述两种方法去除桔霉素毒性的同时都会不同 程度地影响红曲色素的品质，我国的郝常明等提出了采用微生物混合发酵法来解决桔霉 素问题的策略，就是采用生长条件与红曲霉接近，但能分解桔霉素或能抑制其形成的真 菌与红曲霉一起培养，从而根本上抑制桔霉素的合成。 1 7 固定化细胞的研究现状 目前各国都把固定化细胞研究的部分成果很快地应用于工业生产过程中，而且其应 用范围远远超出食品加工、轻化工业和制药工业，现己扩展到化学分析、环境保护、能 源开发等领域。可以预见，不久的将来，由固定化细胞所构成的，具有高效、低耗、无 公害、长寿命、安全、自动和连续化等优点的生物反应器将逐渐代替与传统的发酵工艺 和有机合成工艺相关的设备。但固定化细胞基础研究工作还有待进一步深入。 以海藻酸盐、琼脂等为代表的天然高分子凝胶材料虽然具有成本低廉、操作简单、 对生物无毒、传质性能好的特点，但强度低、特别是在某些产气的发酵过程中，凝胶因 强度低而受力破裂，在遇到某些离子时还会使凝胶颗粒软化、脱落。为了克服这些不足， 海洪、顾缪等用聚乙烯亚胺溶液来处理海藻酸钙凝胶( 海洪，1 9 9 0 ) ；中野用硫酸铝置换 的海藻酸钙胶珠中的钙离子( 中野，1 9 9 0 ) ；段俊英等通过加入不饱和脂肪酸及改变c a c l 2 浓度等均有效地提高了凝胶颗粒的强度，改善了固定化细胞稳定性( 段俊英，1 9 9 0 ) 。张 书祥、李宁等人提出在海藻酸钠中加入0 6 的a 1 ：0 。或加入1 6 的s i0 2 ( 张书祥，李宁等， 1 9 9 9 ) ，翁庆北、纪黔生等人提出在海藻酸钠中添加麸皮来改善海藻酸钙凝胶的强度皆 起到一定的效果( 翁庆北，纪黔生等，2 0 0 0 ) 。对于琼脂，它化学性质稳定，但强度低、 1 2 沈阳农业大学硕士学位论文 通透性差，需添加聚丙烯酞胺一类聚合物可加强琼脂强度。王叔亭报道了两相成珠法制 备琼脂珠，对其通透性有很好改善( 王叔亭，1 9 9 2 ) 。 以聚乙烯醇( p v a ) 为代表的合成高分子凝胶材料一般比天然高分子载体材料的强度 好，但其凝胶网格结构较紧密，传质性能较差，在对细胞包埋时会影响其活性。在多数 情况下，凝胶成型较慢且只能形成块状或膜状。为此，围绕p v a 的改性有很多报道，p v a 凝胶常用硼酸等化学交联法及冷冻法来制各，其抗压强度高、弹性、韧性好、价格低廉、 易得，对生物的毒性较小，是通用的固定化载体之一。邓元修、袁明雄等人提出使用p v a 包埋酵母细胞( 邓元修，袁明雄等，1 9 9 3 ) ；梁金钟、王建华等人用p v a 包埋酵母制备固定 化细胞膜都收到了良好的生产效果( 梁金钟，王建华，1 9 9 3 ) 。 也有很多文献提出将p v a 和其他载体材料混合使用来提高凝胶的强度、成型速度及 传质效果。吴思方、陈九武将海藻酸钠和p v a 混合使用制备小球状的水凝胶颗粒，提高 了凝胶的强度( 吴思方，陈九武，1 9 9 6 ) 。童群义、陈坚等人将p v a 与卡拉胶混合使用制备 粒状、强度大、性能稳定的固定化细胞颗粒( 童群义，陈坚等，2 0 0 0 ) 。 也有人正研究使用新型的合成高分子载体材