（生态学专业论文）环境因子对好氧反硝化菌活性及其功能基因表达的影响.pdf

m l l l l l j i l l l l l l l l 1 1 1 1 l 1 1 1 1 l i 17 6 8 2 7 4 ad i s s e r t a t i o ns u b m i t t e df o rm a s t e rd e g r e ei ns o u t hc h i n an o r m a l u n i v e r s i 够 t h ee f f e c to fa m b i e n tf a c t o r so nt h e a c t i v i t yo f a e r o b i cd e n i t r i f i e ra n dt h ee x p r e s s i o n o ft h ef u n c t i o n a lg e n e s c a n d i d a t e ：y a n gl i x i a n g s p e c i a l t y ：e c o l o g y c o ll e g e ：c o ll e g eo fl i f es c i e n c e s u p e r v i s o r ：p r o f w a n ga n l i s u b m it t e dd a t e ： m a y ，2 0 1 0 摘要 环境因子对好氧反硝化菌活性及其功能基因表达的影响 摘要 专业：生态学 申请人：阳丽香 导师：王安利 自好氧反硝化菌在2 0 世纪8 0 年代被发现后，好氧反硝化作用一直是国外 的研究热点，近年来在国内也颇受关注。虽然好氧反硝化作用的生理机理目前 还不是很清楚，但已有的研究表明好氧反硝化细菌在污水脱氮中有很强的应用 潜力，可为突破传统脱氮工艺的限制提供一种有效的解决方法。因此，本试验 在对好氧反硝化细菌鉴定的基础上，对细菌的好氧反硝化特性展开研究，以丰 富和发展对好氧反硝化细菌的认识，并为将来脱氮应用提供依据。 本试验从实验室现有的4 4 株反硝化菌中筛选出两株可以在好氧条件下高效 进行反硝化作用的细菌l z 3 0 和l z 4 2 ( 至) 。通过对这两株细菌的生理生化特征研 究，以及1 6 s r d n a 序列测定认为菌株r z 3 0 0 和l z 4 2 ( 篁) 分别与施氏假单胞菌 ( p s e u d o m o n a s s t u t z e r i ) 和水氏黄杆菌( 砌v o b a c t e r i u mm i z u t a i i ) 亲缘关系最近。 好氧培养条件下，在初始氮源约为2 8 0 m g l 。1 的反应体系中，3 2 时，两株细菌 在2 7 h 内均引起体系中氨氮显著下降，削减率均达8 0 以上。反应过程中没有 检测到亚硝态氮的积累。 摘要 好氧条件下，对细菌l z 3 0 进行了纯培养，研究了培养介质在不同碳源、 起始p h 、盐度和c n 比条件下，菌株l z 3 0 的好氧反硝化活性。分别从生理 生化水平、细胞水平和分子水平检测了好氧反硝化作用。研究表明，葡萄糖是 菌株l z 3 0 ( 至) 生长和进行反硝化作用最理想的碳源。在p h 为7 8 5 范围内，最 适合细菌l z 3 0 生长和进行反硝化代谢。低盐度有利于细菌l z 3 0 生长和进行 反硝化代谢。碳源过低( c n 比1 ) ，菌株不进行好氧反硝化作用；当c n 比是5 时，碳源不足，细菌的好氧反硝化作用进行不完全。当c n 比在1 0 一1 5 时细菌 的好氧反硝化率最高；当c n 比为2 0 时，碳源过量，细菌对氮源的利用不完全， 反硝化效率反而有所下降。 关键词：好氧反硝化细菌n i r s 反硝化特性碳源c n 比 a b s t r a c t a b s t r a c t t h ee f f e c to fa m bie n tf a c t o r so nt h e a c tivit y 0 fa e r o bicd e nit rifie ra n d t h ee x p r e s slo no ft h ef u n c tio n a lg e n e s m a j o r ：e c o l o g y n a m e ：y a n gl i x i a n g s u p e r v i s o r ：w a n ga n l i a e r o b i cd e n i t r i f i c a t i o nh a sb e e np a i dm o r ea n dm o r ea t t e n t i o ni nr e c e n ty e a r s ， h o w e v e r , t h e r ei sl i m i t e di n f o r m a t i o no nt h em e c h a n i s mo fa e r o b i cd e n i t r i f i c a t i o n r e c e n t l y , a e r o b i cd e n i t r i f i c a t i o nb a c t e r i as u c h a s t h i o s p h a e r ap a n t o t r o p h aa n d a l c a l i g e n e sf a e c a l i sh a v eb e e ni n t e n s i v e l ys t u d i e da sp o t e n t i a lm i c r o o r g a n i s m st h a t m a yb eu s e dt oo v e r c o m ep r o b l e m si n h e r e n ti n t h ec o n v e n t i o n a lm e t h o d f o r o b t a i n i n gm o r ea e r o b i cd e n i t r i f e r s ，t h ei s o l a t i o na n dc h a r a c t e r i s t i co fn e ws t r a i n s c a p a b l eo fh i g ha e r o b i cd e n i t r i f i c a t i o nw e r ec o n d u c t e di nt h es t u d y t w os t r a i n so ff a c u l t a t i v ea n dg r a mn e g a t i v ea e r o b i cd e n i t r i f i e r s ，c o d e da s l z 3 0 ( 堇) a n dl z 4 2 ( 墓) w e r ei s o l a t e df r o m4 4a v a i l a b l es t r a i n s i nt h el i g h to ft h e i r m o r p h o l o g i c a la n dp h y s i o l o g i c a lf e a t u r e sa sw e l la st h e1 6 s r d n as e q u e n c e ，t h e y w e r ei d e n t i f i e da sp s e u d o m o n a s s t u t z e r ia n df l a v o b a c t e r i u mm i z u t a i i u n d e rt h e a e r o b i ci n c u b a t i o nc o n d i t i o na t3 2 。c ，a m m o n i a nl o s st h r o u g hd e n i t r i f i c a t i o ni nt h e l i q u i dc u l t u r em e d i u mi n o c u l a t e dw i t hl z 3 0 ( 互) a n dl z 4 2 ) b o t hr e a c h e dt o8 0 w i t h i n2 7h o u r s ，r e s p e c t i v e l y n i t r i t ew a s n to b s e r v e dd u r i n gt h ei n c u b a t i o n f o ra e r o b i cd e n i t r i f i c a t i o n ，w es t u d yt h er a t eo fd e n i t r i f i c a t i o nb yu s i n gd i f f e r e n t i i i a b s t r a c t c a r b o ns o u r c e ，p h ，s a l i n i t ya n dc nr a t i oc l u t u r em e d i u m s w cd e t e c t e dt h e d e n i t r i f i c a t i o na tt h r e el e v e l s ：p h y s i o l o g i c a l ，c e l l u l a ra n dm o l e c u l a r t h er e s e a r c h e s h a v es u g g e s t e do p t i m u mc a r b o ns o u r c eo fs t r a i nl z 3 0 0 3w a sg l u c o s e w h e ni n i t i a l p ho ft h em e d i u m sw a s7 - 8 5 ，p hc a na f f e c tt h eg r o w t ha n dt h ee f f i c i e n c yo fa e r o b i c d e n i t r i f i c a i o no fl z 3 0 0 c a r b o ns o u r c ec o u l da f f e c ta e r o b i cd e n i t r i f i c a t i o ns e r i o u s l y , a n dt h eo p t i m u mc nr a t i of o ra e r o b i cd e n i t r i f i c a i o nw a sb e t w e e n1 0 1 5 k e yw o r d s ：a e r o b i cd e n i t r i f i e rn i r s c h a r a c t e r i s t i c sc a r b o ns o u r c ec nr a t i o i v 目录 目录 摘要l a b s t r a c t ii l 第一章绪论1 1 1 弓l 言1 1 2 反硝化菌2 1 2 1 反硝化代谢2 1 2 2 反硝化细菌的多样性3 1 3 重要环境因子如何影响反硝化代谢3 1 3 1 环境中的底物因素3 1 3 2 影响反硝化细菌生长和其他正常代谢的环境因素4 1 4 好氧反硝化菌4 1 4 1 好氧反硝化菌的种类4 1 4 2 好氧反硝化菌反硝化作用机制4 1 4 3 好氧反硝化菌的反硝化作用酶类5 1 4 4 影响好氧反硝化菌反硝化作用的因素6 1 4 5 好氧反硝化菌的分离筛选8 1 5 分子生物学技术在反硝化菌研究中的应用一8 1 6 本论文的立题依据与研究内容及意义1 2 1 6 1 立题依据1 2 1 6 2 研究内容1 2 1 6 3 研究意义1 3 第二章好氧反硝化菌的筛选及活性的评级归类1 4 2 1 材料与方法1 5 2 1 1 筛选材料1 5 2 1 2 培养基1 5 2 1 3 好氧反硝化细菌脱氮能力的评级归类。1 5 2 1 4 好氧反硝化细菌的验证1 5 v 目录 2 1 5 细菌好氧反硝化性能的测定1 6 2 1 6 分析方法1 6 2 1 7 计算方法。1 6 2 1 8 菌体的生理生化特征1 7 2 1 9 菌体1 6 s r d n a 与亚硝酸盐还原酶的鉴定1 7 2 2 结果与讨论1 9 2 2 1 细菌的好氧反硝化作用的初步验证1 9 2 2 2 细菌好氧反硝化性能的测定1 9 2 2 3 好氧反硝化菌l z 3 0 和l z 4 2 t 窑) 的鉴定2 1 2 3小结。2 5 第三章不同碳源、p h 、盐度以及c n 比对好氧反硝化特性的影响研究2 6 3 1 材料与方法2 7 3 1 1 细菌2 7 3 1 2 实验方法2 7 3 1 3 分析方法2 8 3 1 4 计算方法3 7 3 2 结果与分析3 7 3 2 1 不同碳源对菌株l z 3 0 好氧反硝化特性的影响3 7 3 2 2 不同起始p h 对菌株l z 3 0 好氧反硝化特性的影响3 9 3 2 3 不同盐度对菌株l z 3 0 好氧反硝化特性的影响4 3 3 2 4 不同c n 比对菌株l z 3 0 ( 王) 好氧反硝化特性的影响4 6 3 3小结5 0 全文结论与展望5 2 参考文献5 4 致谢6 1 v i 第一章绪论 第一章绪论 1 1引言 俗话说，“养鱼先养水 ，水质是养殖成败的先决条件。但当前我国水产养 殖以高密度或超高密度为主，造成水体氮素含量严重超标。如以虾体收获的n 占投饵n 总量的5 8 - - , 4 0 ( 多集中于1 8 - - - 2 3 范围内) ，鱼体收获的n 占投饵n 总量1 9 - - - , 2 8 ( 赵清，等，2 0 0 4 ) ，剩余的大部分氮则进入养殖环境中。有机氮矿化 为氨氮后，相继转化为亚硝酸盐、硝酸盐。氨氮和亚硝酸盐对水产动物有很强 的毒害作用( j e n s e n ，2 0 0 3 ) ，养殖水体中亚硝酸盐积累对水产养殖动物的毒害主要 体现在：降低水产动物机体内的供氧能力；干扰细胞内外的c l 、k + 浓度使 之失衡，破坏神经系统传输、骨骼肌收缩等功能，使水产动物活力下降；抑 制免疫系统功能，减弱水产动物对病原生物的抵抗力。亚硝酸盐浓度超标严重 影响了水产品的质量和产量。尤其在养殖的中后期或是夏季高温季节，鱼虾等 水生生物时时处于应激状态，浮头、厌食等现象常常发生，严重时还会出现大 批死亡( 魏泰莉，等，2 0 0 1 ；胡家文，等，2 0 0 5 ) 。而且过多的氮存在会导致养殖环境 中细菌特别是病原菌过度繁殖，致使水产动物易病易死亡。氮污染的结果是迫 使养殖者换水，继而造成周边水体的污染加剧，引发赤潮等危害( 崔毅，等，2 0 0 5 ) 。 水产养殖中的氮污染已经严重阻碍了我国水产养殖的健康发展，同时对周边水 域造成了严重危害。时至今日，水产养殖者已清醒认识到氮污染控制的重要性， 对水产养殖中氮污染控制技术有迫切需求( 曾国锋，等，2 0 0 4 ) 。 目前国内外许多学者都在研究从环境中分离获取高效的好氧反硝化细菌。 廖绍安等( 2 0 0 7 ) 对从对虾养殖池中通过反硝化条件选择性富集培养得到的具 有去除硝酸盐及亚硝酸赫能力的细菌进行筛选，结果分离到2 7 株能够还原硝酸 盐的异养细菌，其中2 4 株在7 天内能有效地降低硝酸盐和亚硝酸盐浓度；特别 是l z 2 2 、l z 2 7 、l z 2 3 、l z 2 1 等4 株使硝酸盐氮由起始的4 2 2 2 5 m g l 降至 4 0 0 m g l 以下，亚硝酸盐浓度也降至0 4 0 m g l 以下。马放等( 2 0 0 5 ) 从活性污 泥中筛选得到1 株高效好氧反硝化菌，在间歇培养条件下，其脱氮率能达到9 0 以上。l o n e 等( 1 9 9 7 ) 从间歇厌氧好氧运行污水处理池活性污泥中分离出1 6 株反硝化细菌，它们在好氧和厌氧条件下都具有反硝化作用。 传统上水产养殖水体的脱氮是在循环水养殖模式下进行，通过脱氮处理系 华南师范大学硕士学位论文 统与养殖系统串联而实现，国外在这方面的研究较多( v a nr i i n ，1 9 9 6 ：g r e i n e re t a 1 ，1 9 9 8 ：s u z u k ie ta 1 ，2 0 0 3 ) ，国内近些年也陆续开展了相关研究，该方法秉承 和移植了工业和生活废水生物脱氮技术。这类技术难以应用于非循环水的室外 池塘养殖或开放水体养殖系统，而非循环水养殖是我国水产养殖的主要模式， 对这类养殖水体脱氮又非常必要，在既无脱氮处理系统又须保证溶解氧不得低 于3 5 m g l 的要求等条件的限制下，只能依靠溶解氧水平低的上覆水和沉积物一 水界面脱氮( h a r g r e a v e s ，1 9 9 8 ；史春龙，2 0 0 3 ) ，在中上层溶解氧水平较高的大空 间水体中脱氮尤为不足，但目前还无有效的解决办法。好氧反硝化细菌的发现 为这个问题的解决提供了一种可能性。自认识到存在好氧反硝化细菌以来，有 氧条件可进行反硝化脱氮功能的细菌相继被报道( s c h o l t e ne ta 1 ，1 9 9 9 ；o k a d ae t a 1 ，2 0 0 5 ；w a n ge t 口正，2 0 0 7 ) ，寻找在有氧条件下能进行高效脱氮的细菌是当前该 领域的一个热点。但是，目前对海水养殖生态系统脱氮还缺乏深入的理论基础 研究，加之该系统的复杂性和特殊性，还没有有效的成熟技术。因此，本论文 拟通过海水养殖环境中反硝化重要功能基因( n i r s ) 的多样性，含量及相应m r n a 水平对重要环境因子的应答，以求了解环境因子调控对反硝化细菌的群落结构、 数量水平和代谢活性的影响，从而为海水养殖环境中生物脱氮技术的研究和发 展提供理论依据。同时，本研究的结果对提高海水养殖环境管理水平、促进水 产健康养殖模式的发展，达到少换水、少用药、保护环境、降低能耗、降低养 殖风险及保障水产品质量安全等目的，具有重要的经济、社会意义。 1 2 反硝化菌 1 2 1 反硝化代谢 能将硝酸盐或亚硝酸盐异化还原为含氮气体的细菌，全程反硝化经过4 个 连续的步骤：n 0 3 。n 型堡丝巴n 0 i n 丝型屿n o n 2 0 _ - n 2 ，n 0 3 。一n ( 硝酸盐，n i t r a t e ) 、n 0 2 - - n ( 亚硝酸盐，n i t r i t e ) 、n o ( 氧 化氮，n i t r i co x i d e ) 、n 2 0 ( 氧化亚氮，n i t r o u so x i d e ) 、n 2 ( 氮气，d i n i t r o g e n ) d p 氮元 素的化合价分别为+ 5 、+ 3 、+ 2 、+ 1 、0 ，在反硝化代谢过程中以氮氧化物作 为氧化剂氧化有机物，而n 被逐渐还原，其化合价逐级下降；正如细菌的有氧 呼吸过程中0 2 氧化有机物一样，氧的化合价由o 变为一2 。事实上，在有机物被 氧化的过程中，氮氧化物和氧是类似物，都是作为氧化剂，只是前者通常是厌 2 第一章绪论 氧呼吸中的氧化剂，而后者是有氧呼吸中的氧化剂。但二者并非绝对相斥，某 些细菌能同时利用氧和氮氧化物作为氧化剂，即共呼吸作用( c o r e s p i r a t i o n ) ， 具有这个特征的细菌被认为是好氧反硝化细菌( a e r o b i cd e n i t r i f y i n gb a c t e r i a , o r a e r o b i cd e n i t r i f i e r ) 。有相当部分的反硝化细菌不能完全完成这4 个连续的反应， 而只能进行部分步骤的代谢过程，即不完全反硝化( i m c o m p l e t ed e n i t r i f i c a t i o n ) 。 不完全反硝化的发生，有内外两个可能的原因：细菌本身缺少催化某些步骤 的还原酶及其基因；环境因子抑制了某些还原酶基因的表达或者该酶的活性。 尽管如此，但反硝化细菌必须具备亚硝酸盐还原酶( n i r ) ，否则不是反硝化细菌。 在水产养殖环境脱氮中，氮的去除通常主要考虑的是硝酸盐还原和亚硝酸 盐还原。因为这两步由不同的还原酶催化完成，所以特定细菌中2 种还原酶基 因是否存在、影响它们表达及还原酶活性的因素都会影响到这2 步代谢速率。 1 2 2 反硝化细菌的多样性 已知反硝化细菌有1 3 0 多种，分属于5 0 多个属，包括真细菌中的p r o t o b a c t e r i a 多个亚群，如a 、b 、丫等，及古细菌( a r c h a e ) r 9 的一些属。1 6 s r d n a 作为真细菌 及古细菌多样性分析及系统发育分析中最重要的分子标记，在研究中有重要应 用，不仅因为所有细菌中都存在1 6 s r d n a ( h e n r ye ta 1 ，2 0 0 6 ) ，而且它在不长的 序列( 约1 5 0 0 b p ) 中具有高度保守序列及可变序列，能够较好地区分细菌间亲 缘关系；另外大部分细菌细胞中的1 6 s r d n a 拷贝数不只1 个，也便于分析。 但是反硝化还原酶基因作为有功能特征的d n a 片段，似乎比较容易在不同 的菌株之间迁移。正因为如此，反硝化细菌的1 6 s r d n a 系统发育树与反硝化还 原酶基因的系统发育树之间不存在严格的对应关系。这为反硝化功能确定带来 了难度，利用分子生物学手段只有研究其反硝化还原酶基因是否存在才能确定 是否具有反硝化功能。 1 3 重要环境因子如何影响反硝化代谢 1 3 1 环境中的底物因素 反硝化代谢本质上是氧化还原反应，有机物作为电子供体，氮氧化物作为 电子受体。因而，有机物的种类和浓度对反硝化代谢的进行有重要作用，而氧 作为氮氧化物的类似物也对反硝化有重要影响，氧对反硝化代谢起到抑制或竞 3 华南师范大学硕士学位论文 争性抑制的作用。 1 3 2 影响反硝化细菌生长和其他正常代谢的环境因素 由于反硝化细菌大部分是兼性厌氧微生物，有机物在其生长和代谢中作为 细胞结构成分和能量来源具有特殊的重要地位，而且进行有氧呼吸时能获得较 高的生长速率。在相同的时间段内，生长速率较高可获得较高的细菌数量，因 而其反硝化还原酶基因总量也会较高。因而，氧对反硝化细菌的生长和反硝化 代谢分别表现出促进和抑制2 种相反的作用。氮源在细菌生长中具有重要作用， 通常细菌对氨氮的利用能力强于硝酸盐。 另外，反硝化细菌作为完整的生命体，对环境有一定的适应能力。如盐度、 p h 值等。 1 4 好氧反硝化菌 人们发现在废水处理反应器中存在好氧反硝化现象。一种解释为：由于d o 扩散的限制，活性污泥絮凝颗粒中产生d o 梯度，外层d o 浓度较高，内部则 是缺氧区，形成好氧一缺氧微环境，反硝化菌在这种环境条件下的反硝化作用被 认为是好氧反硝化。也有人认为环境中确实存在可进行好氧反硝化代谢的细菌， 并认为好氧反硝化作用由好氧反硝化细菌执行，其后诸多研究人员从环境中分 离获得了好氧反硝化细菌。 好氧反硝化菌是利用好氧反硝化酶的作用，在有氧条件下进行反硝化作用 的一类反硝化菌。 1 4 1 好氧反硝化菌的种类 好氧反硝化现象仅发现在细菌中存在，在放线菌、真菌中尚没有报道好 氧反硝化菌主要存在于假单胞菌属( p s e u d o m o n a s ) 、产碱杆菌属( a l c a l i g e n e s ) 、副 球菌属( p a r a c o c c u s ) 矛 芽孢杆菌属( b a c i l l u s ) 等，是一类好氧或兼性好氧、以有机 碳作为能源的异养硝化菌。 1 4 2 好氧反硝化菌反硝化作用机制 好氧反硝化菌的反硝化作用过程包括4 个步骤，分别由硝酸盐还原酶、亚 硝酸盐还原酶、一氧化氮还原酶、一氧化二氮还原酶催化完成。目前提出好氧 4 第一章绪论 反硝化菌的假想呼吸途径中，n 0 3 。、0 2 均可作为电子最终受体t 即电子可从被 还原的有机物基质传递给0 2 ，可传递给n 0 3 、n 0 2 - 和n 2 0 ，并将它们分别还 原( 王薇，等，2 0 0 7 ) 。 好氧反硝化菌与厌氧反硝化菌的反硝化相比，它们的反硝化的特征为：1 ) 好氧反硝化菌的反硝化主要产物是n 2 0 ，而厌氧反硝化菌的反硝化则主要产生 n 2 以及少量的n 2 0 和n o ；2 ) f l 皂在好氧条件下进行反硝化，使其与硝化能够同 时进行；3 ) 在铵态氮被氧化为亚硝酸盐后，有氧条件下直接转化成气态产物，即 可实现短程硝化好氧反硝化脱氮；4 ) 好氧反硝化菌的反硝化中，n o ；、0 2 均可 作为电子最终受体：5 ) 受0 2 的竞争性抑制，好氧反硝化速率可能会慢一些；6 ) 催化好氧反硝化代谢的硝酸盐还原酶是周质酶而不是膜结合酶( 殷士学，陈丽 敏，2 0 0 2 ) ；7 ) 特殊的好氧反硝化假单胞菌t r 2 和k 5 0 主要产生n 2 ( t a k a y a ，e t a 1 ，2 0 0 3 ) ，这类特殊菌株可能有助于构建一种不产生n 2 0 的好氧反硝化模式。 1 4 3 好氧反硝化菌的反硝化作用酶类 硝酸盐还原酶( n i t r a t er e d u c t a s e ，n a r ) 。目前已发现2 种硝酸盐还原酶，1 种 是与膜结合的蛋白酶( n a r ) ，1 种是周质蛋白酶( n a p ) 。n a r 还原酶不仅存在于反 硝化细菌中，在非反硝化细菌中也广泛存在。研究结果显示它主要有三个亚基 组成，分别由n a r g 、n a r h 和n a r l 基因编码，此外基因簇中还有其他一些基因 如n a r l 、n a r j 、n a r k 等( t h r o b i i c k i n e ta 1 ，2 0 0 4 ) ，这些基因在基因簇中的排列 位置因菌株的不同而有些差异。n a r 基因在一些蛋白细菌、g + 细菌甚至古细菌中 都有存在，根据n a r g 基因及所对应反硝化细菌的1 6 s r d n a 构建系统发育树， 比较发现二者互相吻合。n a p 基因只存在于蛋白细菌中，n a p 还原酶是一种主要 由n a p a 和n a p b 基因编码的异源二聚体，除了这两个基因外，其基因簇中还包 含了其他一些基因n a p e 、n a p f 、n a p d 、n a p c 、n a p k 、n a p h 等，在某些反硝 化细菌中n a p 基因簇至少包含了n a p f 、d 、a 、及c 等5 个基因，排列次序一 般亦为上述顺序。 亚硝酸盐还原酶( n i t r i t er e d u c t a s e ，n i r ) 。由亚硝酸盐还原为氧化氮是反硝化 作用中最关键的一步反应，目前已知有两种亚硝酸盐还原酶，这两种酶在进化 上完全不相关并且结构亦不相同，分别为含铜型和细胞色素c d l 型亚硝酸盐还原 酶( h a r t i ge e ta 1 ，1 9 9 7 ) ，由n i r s 和n i r k 基因所编码。到目前为止，还未曾发现 n i r s 和n i r k 还原酶能同时存在于同一株反硝化细菌中，但它们可以在同属或同 5 华南师范大学硕士学位论文 种的反硝化细菌中同时出现，如产碱杆菌a l a c l i g e n e s f a e c a l i s 。编码n i r s 还原酶 的基因簇中除了n i r s 基因，与之伴随的还有n i r c 、n i r f 、n i r d 、n i r l 、n i r g 、n i r h 、 n i r j 、n i r e 、n i r n 、n i r t , n i r b 、n i r m 、以卯、n i r o 、n i r q 等，但这些基因并非都 会同时出现在同一株细菌中，在某些反硝化细菌中可能只有其中的一个，如古 细菌中的p y r o b a c u l u ma e r o p h i l u m 中除了n i r s 基因外只多了一个n i r e 基因。与 n i r s 还原酶的基因簇相比，对n i r k 还原酶的基因所知甚少，已知大部分n i r k 还 原酶的基因簇中n i r k 与n i r v 相邻，目前尚未发现其他基因的存在。n i r s 和n i r k 基因在蛋白细菌中的0 c 、b 、y 亚群及古细菌中均有分布。 一氧化氮还原酶( n i t r i co x i d er e d u c t a s e ，n o r ) 。n o 还原酶是主要由n o r c 和 n o r b 基因编码的两个亚基组成的复合物。比较各反硝化细菌的n o 还原酶基因簇 结构，在多数已知的其他反硝化细菌中n o r c 、及q 、d 基因都同时存在，并且 按照n o r c 、n o r b 、n o r q 、n o r d 的顺序紧密排列；而在r h o d o b a c t e rs p h a e r o i d e s f s p d e n i t r i f i c a n s l l 1 0 6 中只有n o r c 和b ，p s e u d o m o n a ss p 的菌株中没有n o r o 基 因，a l a c l i g e n e s f a e c a l i s 中则有n o r q 基因没有n o r d 基因；除此外，某些反硝化 细菌的n o 还原酶基因簇中还有n o r e 和n o r f 基因。 一氧化二氮还原酶( n i t r o u so x i d er e d u c t a s en o s ) 。n 2 0 还原酶( n o s ) 是由两 个亚基组成并包含了8 个铜离子的酶。n o s 基因簇通常包括三部分，分别是n o s z 、 n o s r 和n o s d f y l ，在不同的菌株中，三者仅在前后排列次序上稍有不同。但有 一个例外， n e i s s e i r i am e n i n g i t i d i s 不仅缺少n o s z 基因，而且n o s r 、n o s d 基因 也比其他反硝化细菌的小。根据n o s z 基因构建的系统发育树主要由三大类群所 组成，大致与基于1 6 s r d n a 发育树所区分的蛋白细菌0 【、b 、y 类群相对应，只 是b 亚群中的a c h r o m o b a c t e rc y c l o c l a s t e s 和n e i s s e r i ag o n o r r h o e a e 的n o s z 与仅亚 群中的关系更近些。目前还未发现g + 细菌和古细菌中有n o s z 基因的存在，尽管 g + 细菌中也有些具有n 2 0 还原酶活性，但是对其相应的基因还不了解。 1 4 4 影响好氧反硝化菌反硝化作用的因素 溶解氧( d o )早期研究认为0 2 的得电子能力阻止了电子传递给n 0 3 。或 n 0 2 。，从而抑制了反硝化的进行( 王薇，等，2 0 0 7 ) 。w i l s o n 等( 1 9 9 7 ) 提出了好 氧反硝化菌反硝化过程中的电子传递模型，指出好氧反硝化茵可将电子从被还 原物质传递给0 2 ，同时也可通过硝酸盐还原酶将电子传递给n 0 3 。最近研究表 明，在好氧反硝化细菌中，n 0 3 和0 2 同时被还原，缺少n 0 3 或0 2 都会降低细 6 第一章绪论 菌的生长率和反硝化率( r o b e t r s o ne ta 1 ，1 9 8 8 ；p a t u r e a u e t a 1 ，2 0 0 0 ；j o oe t a 1 ，2 0 0 5 ) ，反硝化作用则可能以电子受体的角色与有氧呼吸形成辅助或竞争关系 ( c h e n ，2 0 0 3 ) 。 所以对好氧反硝化菌来说，d o 是重要的环境指标。p a t u r e a u 等( 2 0 0 0 ) 在研 究好氧反硝化菌株m i c r o v i r g u l aa e r o d e n i t r i f i c a n s 时发现：当d o 浓度高于4 5 m g l - 1 时，对该菌株的反硝化效率没有影响；当d o 浓度低于4 5m g - l - 1 时，反 硝化酶系的活性急剧上升，反硝化率也较大幅度地升高，这时的d o 值就是所 谓的阀值( t h r e s h o l d ) ( 李平，2 0 0 5 ) 。但是s u 等( 2 0 0 1 ) 分离到1 株施氏假单胞菌 s u 2 ，当气体中0 2 饱和度为9 2 时，反硝化率在9 0h 内达到9 9 2 4 ，这难以 用阀值理论来解释。 碳源和c n 比值最近几年来，人们对好氧反硝化菌需要的碳源进行了研 究。甲醇为硝酸盐的还原提供了充足的还原态碳，是一种廉价的加速反硝化的 碳源物质，因而被广泛地作为好氧反硝化菌的典型碳源( b a n g e ta 1 ，1 9 9 5 ；n e e f 赫 a 1 ，1 9 9 6 ；张丹等，2 0 0 3 ) 。不同的好氧反硝化菌的最适碳源不同。j o o 等( 2 0 0 5 ) 对1 株粪产碱菌n o 4 的研究表明，当以柠檬酸盐或醋酸盐作为碳源时， 4 4 0 m g l - 1 的氨氮在3 9 h 或4 5 h 后被完全消耗；其他的碳源如葡萄糖、蔗糖、果 j 糖并没有被利用。l u k o w 等( 1 9 9 7 ) 研究的动胶菌t l l 是以醋酸盐、丙酸盐、 丁酸盐和乙醇作为碳源的。早在2 0 世纪8 0 年代，r o b e r t s o n 等( 1 9 8 3 ) 就指出， 在某一范围内，作为能源的有机碳浓度越高，好氧反硝化菌的反硝化速率就越 。， 快。 在c n 比值对好氧反硝化菌反硝化作用的影响的研究中表明( j o oe t a 1 ，2 0 0 5 ) ，在初始含有3 6 0m g l 1 氨氮的基本培养基中，当c n 为1 0 和2 0 时， 氨氮能被完全消耗；当c n 为5 时，氨氮的消耗在1 2 0m g l 1 时停滞。氮源被 用来进行细胞物质( 细胞内合成和反硝化作用，而在c n 为1 0 和2 0 时用来进 行细胞物质合成的氮源的消耗比c n 为5 时要多，这样反硝化作用就似乎会优 先在低的c m ( 如c n 为5 ) 的条件下进行，不过在高的c n 下，能够保证充足 的碳源，好氧反硝化菌的反硝化作用就会更为彻底。s t o u t h a m e r 等( 1 9 9 7 ) 发现周 质n a t 的基因调控蛋i 兰t ( f n r ) 对氧化还原反应敏感。他们认为在高c n 比的情 况下，氧化还原反应可能比较强，f n r 类蛋白活性高，激活好氧反硝化菌的反 硝化相关基因表达。所以，当碳源受到限制时，好氧反硝化现象消失。 7 华南师范大学硕士学位论文 1 4 5 好氧反硝化菌的分离筛选 间歇曝气法好氧反硝化菌能同时利用0 2 和n 0 3 ，好氧、缺氧的频繁转 换有利于其在竞争中占优势地位( 王薇等，2 0 0 7 ) 。如：r o b e r t s o n 等( 1 9 8 3 ) 根据脱氮 副球菌既能自养又能异养，缺氧条件下和好氧条件下都能生长，通过间歇曝气 分离筛选出好氧反硝化细菌脱氮副球菌l m d 8 2 5 。l o n e 等( 1 9 9 7 ) 从间歇厌氧 好氧运行污水处理池活性污泥中分离出1 6 株反硝化细菌，它们在好氧和厌氧条 件下都具有反硝化作用。李丛娜等( 2 0 0 1 ) 采用间歇曝气对污水处理中的活性污泥 进行驯化并分离出好氧反硝化细菌。 使用选择性培养基或呼吸抑制剂可用选择性培养基来分离筛选对培养条 件有特殊要求的好氧反硝化菌。如m e i b e r g 等( 1 9 8 0 ) 根据生丝微菌x 以三甲胺 或二甲胺为唯一碳源和氮源，在好氧条件下利用n 0 3 - 作为电子受体这一性质对 其进行分离。g u p t a 等( 2 0 0 0 ) 在选择性培养基中将m g s 0 4 的浓度从o 1g l 1 调 整为0 3g l 1 时可以富集培养脱氮副球菌，而像假单胞菌等其他好氧反硝化菌 的生长则被抑制。 孔庆鑫等( 2 0 0 5 ) 利用氰化钾( 1 ；聊选择培养基来筛选好氧反硝化细菌。k c n 是呼吸抑制剂，可终止呼吸链中电子向氧的传递，从而抑制氧作为电子受体的 呼吸反应，同时曝气状态下，氧分子又抑制了厌氧条件下起作用的酶( 如周质硝 酸盐还原酶) 的表达与活性，在这种环境中好氧反硝化菌更易被筛选出来。 使用酸碱指示剂用该指示剂对好氧反硝化菌进行初步筛选( n a o k ie t a 1 ，2 0 0 3 ) 。在硝酸盐或亚硝酸盐培养基中加入溴百里酚蓝( b t b ) ，酸性条件下 b t b 指示剂显黄绿色，当好氧反硝化菌的反硝化作用消耗了硝酸盐或亚硝酸盐 后，p h 上升，指示剂显蓝色，在筛选培养基上会出现蓝色克隆或晕环。 1 5分子生物学技术在反硝化菌研究中的应用 应用分子生物学方法对环境中细菌样品的分析，根据分析目的和所采用的 分析技术，环境样品在分析前的准备工作可分为三类，通过分离培养获得纯培 养菌株，对样品中的遗传物质进行抽提，或者在抽提的基础上进一步做p c r 扩 增。而有些则在分析前无需要对样品进行特别处理，如荧光原位杂交和原位 p c r 。 多样性分析用分子技术对反硝化细菌群落进行多样性分析，通常第一步 8 第一章绪论 为确定所研究的样品是否具有反硝化功能，方法之一为在纯培养条件下检测细 菌是否还原硝酸盐( 亚硝酸盐) 为n o 、n 2 0 或者是n 2 等气体，然后对筛选到 的反硝化菌进行1 6 s r d n a 分析；之二则是直接分析样品中关键的还原酶基因， 如n i r s 、n i r k 、n o s z 等。 复杂环境样品中，特别是土壤中( s t r e se ta 1 ，2 0 0 4 ) ，同样为反硝化细菌的同 一功能基因亦会有很多不同之处( p h i l i p p o te t a l ，2 0 0 6 ) 。对这些区系中的功能基因 进行p c r 扩增会形成一条包含多个大小相同但序列不完全相同的产物的条带， 这就需要采用构建克隆文库或者指纹技术作进一步的分析，如d g g e ( m u y z e re t a 1 ，1 9 9 3 ；m u y z e re ta 1 ，1 9 9 8 ) 、t - r f l p ( m a r s he ta 1 ，1 9 9 9 ；o s b o me ta 1 ，2 0 0 0 ) 等，以 分辩出单一产物条带中存在的多态性。 克隆文库如通过t - a 克隆系统构建亚克隆文库，通过蓝白斑筛选克隆， 被克隆的片断可以通过测序，进一步分析其多态性。克隆文库的分辨率比指纹 图谱方法要高，可以提供更丰富的信息，但是克隆文库耗时耗力，分析土壤中 特定区系多样性时构建文库通常不会筛选超过1 0 0 个克隆，因此不一定能完全 真实地反映实际存在的多样性( s c a l a e ta 1 ，2 0 0 0 ；p r i e m ee ta 1 ，2 0 0 2 ) 。不过，克隆文 库的一个突出优点是如果它覆盖面足够广，则可以用统计学方法估计和比较样 品间的多样性( p h i l i p p o te ta 1 2 0 0 5 ) 。 t - r f l p ( 末端限制性片段长度多态性分析) t - r f l p 是在r f l p 的基础 上发展起来，区别是其一端引物被荧光标记，扩增后产物进行限制性酶切，不 同的扩增产物在酶切位点和数量上不同，荧光标记引物末端的限制性片段长度 亦会不同，随后在自动d n a 测序仪上检测，仅有荧光标记的末端限制片段能被 检测到。影响t - r f l p 最重要的因素是限制酶的选择，可变区应该优先被酶切， 避免产生太多小片断。t - r f l p 与d g g e 相比，有三个优点：分辨率更高、图像 分析更简单、可以分析多样性更高的样品。它克服了r f l p 方法工作量大、分析