（环境科学专业论文）稀土配合物荧光探针用于细胞内小分子物种的成像分析.pdf

山东师范大学硕士学位论文 针的中间体。实验以2 氨基6 甲基吡啶为原料，通过重氮化、乌尔曼偶联、氧化、 硝化、溴化、脱氧及n b s 溴化等步骤合成了4 溴6 ，6 二溴甲基2 ，2 联吡啶，然后 通过4 溴6 ，6 二溴甲基2 ，2 联吡啶与亚氨基二乙酸二乙酯的反应，成功制备了4 溴6 ，6 二( n ，n 二乙酸乙酯- n 亚甲基) 2 , 2 联吡啶，再进一步通过类似二芳基 醚的制备反应合成4 对叔丁氧基甲酰氨基苯氧基6 ，6 二( n ，n 二乙酸乙酯n 亚 甲基) 2 , 2 联吡啶。在实验中对各步的反应条件进行了简单的摸索，并通过熔 点测定、核磁共振、红外光谱和质谱等实验手段对各步所得产品进行表征，证明 了产物的结构以及合成方法的可靠性。 关键词：稀土配合物荧光探针荧光成像分析活性小分子物种合成 中图分类号：0 6 5 7 3 2 山东师范大学硕士学位论文 a b s t r a c t a c c o m p a n i e dw i t ht h ed e v e l o p m e n to fl i f es c i e n c e ，p e o p l er e a l i z e sm a n ys m a l l a n db i o a c t i v em o l e c u l e rs p e c i e sp l a y v e r yi m p o r t a n tr o l ei nl i v i n gc e l l s ，f o re x a m p l e ， a c t i v eo x y g e ns p e c i e s ( 10 2 ，h 2 0 2 ，o - 2 ) a n ds o m em e t a li o n s ( m 9 2 + ，c a 2 + ，z n 2 + ，c u 2 + ) t h e ya r ei m p o r t a n tm e d i a t o r sf o rt h ep a t h o l o g i c a lc o n d i t i o n so fv a r i o u sd i s e a s e s a r a p i dr i s ei ni n t r a c e l l u l a ro x i d a n tl e v e l su n d e ro x i d a t i v es t r e s sc o u l dc a u s ed a m a g et o b i o l o g i c a l m o l e c u l e sa n dr e s u l ti nv a r i o u sd i s e a s e s ，s u c ha s c a r c i n o g e n e s i s ， i n f l a m m a t i o n ，i s c h e m i a - r e p e r f u s i o ni n j u r y , a n ds i g n a lt r a n s d u c t i o n t h e r e f o r ei ti so f g r e a ti m p o r t a n c et oa c h i e v ed e t e c t i o no ft h ea c t i v es m a l lm o l e c u l e rs p e c i e si nl i v i n g c e l l s i ti sh e l p f u lt os t u d y i n gt h er e l a t i o nb e t w e e nt h e i rp h y s i o l o g i c a lf u n c t i o na n d d i s e a s e s a tp r e s e n t ，f l u o r e s c e n c ei m a g i n gm e t h o d sa r ew i d e l yu s e di nl i v i n gc e l l s f l u o r e s c e n tp r o b e st h a ta r eu s e di ni m a g i n ga p p l i c a t i o n sa r em o s t l yb a s e do no r g a n i c f l u o r e s c e n td y e s ，s u c ha sf l u o r e s c e i no rr h o d a m i n e b u tt h e s ed y e sh a v es o m e l i m i t a t i o n s ，f o re x a m p l e ，t h e ya r ep r o n et oi n t e r f e r e n c ef r o ml i g h ts c a t t e r i n gi n b i o l o g i c a lm e d i aa n dt h e yh a v el o wp h o t o s t a b i l i t yw h i c hl e a dt op h o t o b l e a c h i n g s o i ti so fg r e a ti m p o r t a n c et oa c h i e v ef l u o r e s c e n c el i f e t i m ei m a g i n ga n dt os o l v et h e p r o b l e mo fp h o t o b l e a c h i n g ，w h i c hi no r d e rt oi m p r o v et h es e l e c t i v i t ya n ds e n s i t i v i t y i nt h er e a lt i m e ，d y n a m i ca n dc o n t i n u o u sd e t e c t i o n t h ea p p l i c a t i o n so fl a n t h a n i d e c o m p l e x e sa sf l u o r e s c e n tp r o b e sh a sc a u s e dm u c ha t t e n t i o ni nb i o l o g yb e c a u s eo f t h e i rl o n gf l u o r e s c e n tl i f e t i m e ，s h a r pe m i s s i o nb a n d sa n dl a r g es t o k e ss h i f t a tp r e s e n t ，t h e r ea r es o m er e p o r t sa b o u tl a n t h a n i d ec o m p l e x e sa sf l u o r e s c e n t p r o b e ss p e c i f i cf o rs o m es m a l la n db i o a c t i v em o l e c u l e rs p e c i e si nl i v i n gc e l l sm a i n l y a b o u tt h ed e t e c t i o no fs i n g l e to x y g e na n dz i n ci o n ，b u tt h e r ea r eaf e wr e p o r t sa b o u t f l u o r e s c e n c ei m a g i n gb a s e do nl a n t h a n i d ec o m p l e x e s a sf l u o r e s c e n tp r o b et h e ym u s t s a t i s f yt h ef o l l o w i n gr e q u i r e m e n t s ：f i r s t ，g o o dw a t e r - s o l u b i l i t y ；s e c o n d ，g o o dt h e r m a l s t a b i l i t yi np h y s i o l o g i c a lc o n d i t i o n s ；t h i r d ，g o o dm e m b r a n ep e n e t r a t i v i t ya n dh a v en o t o x i c i t yt oc e l l s ；f o r t h ，l o n ge x c i t a r e dw a v e l e n g t ha n dh i g hq u a n t u my i e l d w h e nw e d e s i g nt h ep r o b ew em u s tc o n s i d e ra l lt h ef a c t o r si no r d e rt om a k ei t sa p p l i c a t i o ni n f l u o r e s c e n c ei m a g i n gb e t t e r r e c e n t l y ，n e ww a t e r s o l u b l el a n t h a n i d ec o m p l e x e sh a v e b e e nd e v e l o p e dg i v i n go p p o r t u n i t i e st on o v e la p p l i c a t i o n s ，i nh e t e r o g e n e o u sa n d h o m o g e n e o u si m m u n o a s s a y s ，d n ah y b r i d i z a t i o na s s a y s ，d e t e r m i n a t i o no fe n z y m e a c t i v i t i e sa n di o n s t h e r ei sa n e x i g e n t n e e df o rr e s e a r c h e r st o d e v e l o p 3 山东师范大学硕士学位论文 l a n t h a n i d e - b a s e df l u o r e s c e n tp r o b e sw i t hh i 曲q u a n t u my i e l d , l o n gf l u o r e s c e n t l i f e t i m ea n dg o o dw a t e r - s o l u b i l i t y i nt h i s p a p e r ，w ed e s i g n e d a n dp r e p a r e dt h ei n t e r m e d i a t e so fl a n t h a n i d e c o m p l e x e sa c c o r d i n gt os o m ec o r r e l a t i v el i t e r a t u r e t h ei n t e r m e d i a t e4 - b r o m o - 6 ， 6 - b i s ( b r o m o m e t h y l ) - 2 ，27 - b i p y r i d i n e w a s p r e p a r e d f r o m 2 - a m i n o 一6 - p i c o l i n eb y d i a z o t i z a t i o n ，u l l m a n nc o u p l i n gr e a c t i o n ，o x i d a t i o n , n i t r a t i o n ，b r o m i n a t i o n ， d e o x y g e n a t i o n , n b sb r o m i n a t i o na n ds oo n w eu s e d 4 - b r o m o - 6 ， 6 - b i s ( b r o m o m e t h y l ) 一2 ，27 - b i p y r i d i n er e a c t i n gw i t hd i e t h y li m i n o d i a c e t a t et op r e p a r e t e t r a e t h y l2 , 2 ，2 ，2 - o - b r o m o 2 ，2 - b i p y r i d i n e - 6 ，6 - d i y l ) b i s ( m e t h y l e n e n i t r i l o ) t e t r a k i s ( a c e t a t e ) t h e n w e p r e p a r e d t h ei n t e r m e d i a t e t e t r a e t h y l 2 , 2 ，2 ，2 ” ( 4 - p t e r t - b u t y l o x y c a r b o n y l a m i n o b e n z y l o x y 2 ，2 一b i p y r i d i n e 一6 ，67 一d i y l ) b i s ( m e t h y l e n e n i t r i l o ) t e t r a k i s ( a c e t a t e ) s i m i l a r t ot h e s y n t h e s i s o f d i a r y le t h e r s d u r i n g t h e e x p e r i m e n t a t i o n ，t h ec o n d i t i o no f t h es y n t h e s i sw a sr e s e a r c h e da n dt h es t r u c t u r eo ft h e p r o d u c t sw e r ed e t e r m i n e db yt h ed e t e c t i o no fm e l t i n gp o i n t ，1h n m r ，i r ，m sa n ds o o nt op r o v et h er e l i a b i l i t yo ft h e s e ss t r u c t u r e sa n ds y n t h e t i cm e t h o d s k e y w o r d s ：l a n t h a n i d ec o m p l e x e s f l u o r e s c e n tp r o b e 。f l u o r e s c e n c ei m a g i n g m e t h o d s s m a l la n db i o a c t i v em o l e c u l e rs p e c i e s s y n t h e s i s c a t e g o r yn u m b e r ：0 6 5 7 3 4 独创声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得 的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包 含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得 ( 注：如没有其他需要特别声明的，本栏可空) 或其他教育机构的学位或证书 使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作 了明确的说明并表示谢意。 学位敝作者躲呷 和虱 导师签字 学位论文版权使用授权书 弋桫堤 本学位论文作者完全了解堂撞有关保留、使用学位论文的规定，有权保 留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。 本人授权堂撞匦可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检 索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。( 保密的学位 论文在解密后适用本授权书) 学位论文作者躲研碌币 导师签字：弋 m 次 签字日期：2 0 咿年，上月，产日 签字日期：2 0 0 m 胗月，严日 山东师范大学硕士学位论文 第一章绪论 1 1 引言 近年来，随着生命科学的不断发展，人们对细胞内的活性物种、细胞信号转 导及细胞凋亡等方面的研究越来越深入。人们逐渐认识到细胞内的多种活性小分 子物种，例如活性氧物种( 包括单线态氧1 0 2 、过氧化氢h 2 0 2 、超氧负离子自由 基o 2 等) 以及镁离子( m 矿+ ) ，钙离子( c a 2 + ) ，锌离子( z n 2 + ) ，铜离子( c u 2 + ) 等金属 离子，它们在细胞内起着非常重要的作用，在各种致病过程中都是重要的介导因 素，与癌症、机体炎症、组织过氧化、蛋白质交联变性、d n a 损伤和细胞信号 转导等都有着直接的关系，因此实现细胞内各种活性小分子物种的实时、原位、 动态测定分析，对于研究它们的生理功能与人类疾病的关系有着重要的价值和意 义。 荧光成像分析是目前广泛应用于活细胞分析的一种有效的可视化分析技术。 目前用于活细胞成像分析的荧光探针多为有机荧光染料分子【1 。1 5 】，它们为活细胞 分析提供了有效的荧光探针。但是利用有机荧光染料分子作为荧光探针，也存在 局限性，一方面细胞内的背景荧光会对测定产生干扰，从而影响分析测定的灵敏 度；另一方面作为荧光探针的有机荧光染料分子的光稳定性相对较差，在测定过 程中容易发生光漂白而使测定的信号减弱。因此利用探针的时间分辨荧光成像与 有效解决探针的光漂白问题，实现长时间的实时动态连续测定与提高可视化分析 的选择性和精度是目前迫切需要解决的问题。稀土配合物荧光探针由于具有荧光 寿命长、发射峰窄和s t o k e s 位移大等发光性质，引起了人们的重视与关注。 目前稀土配合物荧光探针由于其优越的光学特性已被应用到生命科学研究 的各个领域，包括荧光免疫分析【1 6 棚】、酶活性测定2 0 剀、核酸测定【2 5 枷】、阴阳离 子识别【3 卜3 6 】等。许多关于稀土配合物荧光探针在上述各方面应用的综述性文章 3 7 - 3 9 】都对此进行了评述和讨论。近年来，随着新型的水溶性稀土配合物不断的被 合成出来，稀土配合物荧光探针得到了更广泛的应用，尤其在荧光成像方面，越 来越显示出它的优越性。本绪论主要就近年来稀土铕、铽的配合物在活细胞成像 研究中的进展进行评述，并展望了其发展趋势和应用前景。 1 2 稀土配合物的发光机理及其在荧光成像领域的应用 5 山东师范大学硕士学位论文 1 2 1 稀土配合物的发光机理 在溶液中，稀土离子s m ”、e u s + 、t b 3 + 、d y 3 + 等的络合物在高能射线的激发 下会发出荧光，但是这些三价稀土离子本身所发出的荧光还是非常微弱的，当它 们与一些常见的有机配位体如1 3 一二酮类、芳香羧酸衍生物类络合形成配合物时， 其荧光强度就会明显地增强。1 9 4 2 年w e i s s m a n 首先发现了1 3 一二酮- e u 配合物 4 0 】 在吸收紫外光后，发射出了线性的稀土铕离子的特征光谱，自此人们开始对稀土 配合物进行广泛深入的研究，这使得稀土配合物荧光性质的理论研究及其在相关 领域内的应用研究得到了飞速的发展。 经过大量的研究，目前已经证明稀土配合物的发光是由于配位体向稀土离子 的能量转移所导致的【4 1 4 5 1 ，其发光是由稀土离子本身所决定的。其荧光产生的物 理过程【4 6 】如下所述：当稀土配合物受到光激发时，首先由有机配体分子吸收辐射 能，从单重态的基态s o 跃迁至激发态s l ，其激发能可以辐射方式回到基态s o ， 也可以非辐射方式传递给三重态的激发态t l 或t 2 * 三重态的激发能也可以辐射 方式失去能量回到基态，从而发出磷光，或者以非辐射方式将能量传递给稀土离 子；处于激发态的稀土离子的能量跃迁也有两种方式，以非辐射方式或者辐射方 式跃迁到较低的能态，再到基态。当以辐射方式从高能态跃迁到较低能态时就产 生了荧光。下图所示为稀土配合物发光机理示意副4 6 ，4 7 1 。 6 e x c 攀n l i g h t e n e r v yt r a n s t e rl o 垮。1 i v e d 1 u m i n e s c e n c e 、e c s e h n r o s “m 讫。高p h g o r e 卜弋l n 3 + i c o v a l e n t l y b o u - f i 图1 1 稀土配合物发光原理示意图 山东师范大学硕士学位论文 能量 辐射跃迁非辐射跃迁 图1 2 稀土配合物发光机理图 由其发光机理示意图我们可以看出，稀土离子荧光的发射取决于两方面的因 素，一是配位体的三重激发态t 1 能级的位置，二是它与稀土离子激发态的能量 匹配程度。 1 2 2 稀土配合物的发光特点 由于稀土配合物具有特殊的发光机理，因此其所发出的荧光与罗丹明荧光素 等常见的有机染料分子 4 8 , 4 9 相比，具有以下不同的特点： ( 1 ) 稀土配合物的荧光发射峰的波长与中心的稀土离子有关，而与配位体的 具体结构关系不大。配位体的作用是吸收激发光的能量然后将能量转移给稀土离 子，因此同一种稀土离子与不同的配体络合形成配合物时荧光发射峰的形状和发 射波长是基本不变的。 ( 2 ) 稀土配合物的荧光寿命比较长，约lm s 是通常生物背景荧光的1 0 5 1 0 6 倍。原因是稀土配合物所产生的荧光是延迟荧光。利用这种长寿命的荧光，就可 进行时间分辨荧光显微成像测定和荧光寿命成像，从而有效的避免了背景荧光的 干扰，提高了测定的灵敏度。 ( 3 ) 稀土配合物的荧光的s t o k e s 位移( 最大发射峰与晟大吸收峰之间的位移 差) 比较大，一般在2 0 0n t n 以上，利用该特点易于进行波长的分辨，同时也有 7 山东师范大学硕士学位论文 利的避免了因激发光而导致的散射光对荧光测定的干扰。 ( 4 ) 稀土配合物的荧光发射峰较窄，半峰宽一般在l o 1 5n m 左右，这一特点 有利于提高分析测定的选择性和灵敏度。 ( 5 ) 稀土配合物的激发光谱带较宽，可以有效地增加激发能，从而提高灵敏 度。 1 2 3 时间分辨荧光分析技术 时间分辨荧光分析技术5 0 l ( t i m e - r e s o l v e df l u o r e s c e n c ea s s a y , t r f a ) 是稀土 元素配合物作为标记物，同时利用波长分辨和时间分辨两种测量技术，对待测物 质进行定量分析的一种技术方法。由于背景荧光的寿命相对标记物而言很短，因 此利用时间分辨在测定过程中，通过在样品激发后引入一定的延迟时间来实现对 稀土元素发出的特异荧光进行检测，可以有效地排除背景荧光的干扰，从而提高 了检测的灵敏度。 由于时间分辨荧光分析技术具有诸多优点，例如标记物的制备简单，且稳定 性好，分析的动态范围宽等，因此该技术得到了广泛的应用和发展。目前时间分 辨荧光分析技术主要应用5 0 1 在蛋白质的定量分析、蛋白质之间的相互作用、酶的 活性测定以及基因筛选等研究领域。随着生命科学的发展和人们对检测要求的提 高，时间分辨荧光分析技术的分析系统将会得到不断的完善和发展，时间分辨荧 光分析技术将会在更多的领域得到应用。 1 2 4 细胞标记成像 作为细胞内的成像探针，必须满足以下要求：( 1 ) 良好的水溶性；( 2 ) 在生 理条件下具有良好的热稳定性和动力学惰性；( 3 ) 良好的膜穿透性，并且对细胞 是无毒的；( 4 ) 有较长的激发波长和较高的荧光量子产率。在进行探针设计时必 须综合考虑以上各个因素，不断地完善探针的结构，才能使其更好地用于活细胞 的成像分析。 最早将稀土配合物用于细胞成像的是1 9 6 9 年s c a f r 等人用噻吩甲酰三氟丙 酮的铕配合物对大肠杆菌细胞壁制成的细菌涂片进行染色成俐5 1 1 。后来s a a v e d r a 等人设计合成了一种具有磷酸乙醇胺基团的铽配合物( d o p e y a s t b ) ，并将其成 功应用于小鼠胚胎成纤维细胞的膜标记【5 2 】。除了用于膜标记，稀壬配合物还被用 于细胞核和细胞质的定位研究中【5 3 6 1 。英国的d a v i dp a r k e r 课题组设计了一种以 卜氮杂硫代咕吨酮为发色团的稀土铕配合物选择性地标记细胞核，成功地对 8 山东师范大学硕士学位论文 n m 3 t 3 ( 小鼠成纤维细胞) 的活细胞和固定后的细胞进行了荧光显微成像，并 通过细胞存活实验、共定位实验分别对探针的毒性和标记细胞核的选择性进行了 证呀5 7 1 。在此探针基础上，该课题组又通过改变配体上的取代基设计了一种p h 荧光比率探针【5 8 】，并将其应用到n i h 3 t 3 细胞中进行成像。最近该课题组又设 计了一种以氮杂咕吨酮为发色团的铽配合物【5 9 】，并通过引入吡唑基来增加激发波 长，用于对c h o 细胞( 中国仓鼠卵巢细胞) 的成像，结果表明该探针没有定位细 胞核的趋势。进一步的研究表吲鲫，上述所合成的用于细胞标记的探针是适合于 细胞成像的，在细胞内不会被内在的抗氧化剂( 如尿酸盐、抗坏血酸盐等) 所猝 灭。 除了具有单一稀土元素的配合物探针在活细胞内成像的应用，具有双稀土元 素的配合物探针也在逐步应用到细胞的成像分析中【6 1 】。瑞士的j e a n c l a u d e g ；b i i n z l i 课题组设计合成了具有两个铕元素的三链螺旋状配合物( e u ：l 。) 6 2 删，其 中l 为具有苯并咪唑和吡啶羧酸基团的配体，由于增溶基团聚乙烯基乙二醇链在 苯并咪唑和吡啶两个不同的位置引入而使配体有所区别。该探针成功应用到 h e l a 细胞( 人宫颈癌细胞) 中进行成像，实验表明该探针定位在细胞质中，并在 细胞内保持完整的螺旋状态。通过对聚乙烯基乙二醇链长度对发光的影响进行研 究【6 5 】，结果表明链的长短对探针在活细胞内的发光成像并没有影响。 在稀土配合物探针的活细胞成像研究中，人们多采用单光子共聚焦荧光显微 成像技术，由于双光子【6 6 】荧光显微成像所具有的近红外激发、暗场成像、避免光 漂白及降低组织自发荧光等诸多特点而明显地优于单光子荧光显微成像，人们的 目光也在逐渐向双光子及多光子荧光显微成像转移。 法国的o l i v i e rm a u r y 等人合成了双光子激发的水溶性铕配合物 n a a e u ( l ) 3 吲，其中配体l 为带有聚乙烯基乙二醇链的烷氧基苯乙炔修饰的吡 啶二羧酸。用该探针在人膀胱癌t 2 4 细胞中进行双光子激发显微成像，从细胞图 片可明显看出配合物分布在细胞核的周围，其分布同内质网的分布相似。d a v i d p a r k e r 等人研究了一种以氮杂咕吨酮为发色团的铽配合物 ( t b l ) c 1 3 】与不同物质 ( 如低聚精氨酸、低聚胍盐、甲基酯和氨基化合物等) 结合后在n 珊3 t 3 细胞 内的成像情况【6 8 】：结果表明，低聚胍盐的配合物分布在n i h 3 t 3 细胞的线粒体 内，会引起细胞的凋亡；与含有1 2 个碳的氨基化合物结合后发现其使细胞坏死； 与氨基酸和甲基酯结合后发现其在细胞液中间断式分布。这一研究为设计能够实 9 山东师范大学硕士学位论文 时动态检测细胞内不同物质的探针提供了强有力的支持。最近p a u lk w a n s i n g l a m 等人合成了可用于三光子显微成像的铽配合物探针 t b l 删0 3 ) 3 】【6 9 】，其中l 为带有甲氧基苯胺的配体，并将其成功用于h o n e l 细胞( 人鼻咽癌细胞) 、a 5 4 9 细胞( 人肺癌细胞) 及h e l a 细胞中进行成像分析。 1 2 5 细胞内小分子物种的成像分析 细胞内的小分子物种包括各种活性氧物种( 单线态氧1 0 2 、过氧化氢h 2 0 2 、 超氧负离子自由基o 2 等) ，镁离子( m 矿+ ) ，钙离子( c a 2 + ) ，锌离- 子( z n 2 + ) ，铜离子 ( c u 2 + ) 等也是人们研究关注的焦点，因为它们调控着细胞的诸多功能与性质，在 细胞内起着非常重要的作用，因此实现活体细胞内各种生理活性小分子物种的实 时在线动态检测对生命科学研究与发展具有重要的价值。 单线态氧是一种处于激发态的氧分子的存在形式，它可以导致生物细胞的凋 亡和生物体的氧化老化，因此备受人们的关注。目前单线态氧的检测方法很多， 例如磷光光度法、吸收光度法及有机荧光探针法等，但用稀土配合物探针进行检 测的方法还鲜有报道。袁景利等人以三吡啶的羧酸衍生物为配体、分别以葸环和 甲基葸作为单线态氧的特异性识别基团，设计了两种铕的配合物探针( a t t a e u 3 + 和m t t a e u 3 + ) 7 0 , 7 1 】，另外又将原来的三吡啶配体改为一个吡啶连接两个吡唑， 同样利用葸环来识别单线态氧设计了铽的探针( p a t a t b 3 + ) 【7 2 1 ，并将探针m t t a e u ”成功用于h e l a 细胞内单线态氧的检测成像。 锌离子是生物体内必不可少的一种过渡金属，它的新陈代谢紊乱会引起诸多 疾病，因此细胞内锌离子的检测也是人们研究的热点。目前关于稀土配合物探针 检测锌离子的相关报道已有不少【7 3 。7 6 1 ，但真正能够应用到活细胞内成像的却不 多。日本的t e t s u on a g a n o 课题组设计了一种以双( 2 一吡啶甲基) 胺为z n 2 + 螯合基 团、二乙基三胺五乙酸( d t p a ) 为配体的稀土铕探针( e u 7 ) 【7 7 】，并将其用于h e l a 细胞内z n 2 + 的成像分析。为了利用稀土铕荧光寿命长的特点，更好的实现成像， 该课题组又设计了一种新型的时间分辨长寿命荧光成像系统【7 8 】，有效的消除了细 胞内背景荧光的干扰，提高了检测的灵敏度：利用此成像系统成功实现了探针 e u 7 在h e l a 细胞内检测z n 2 + 的时间分辨荧光成像；该成像系统的另一大优点就 是可以实现稀土铕铽两种配合物在同一激发光下的双色成像；这一成像系统的设 计利用将为实现细胞内稀土配合物探针的时间分辨荧光成像提供新技术，为实现 细胞内小分子物种的实时原位动态测定提供新的途径。 1 0 山东师范大学硕士学位论文 1 2 6 细胞内生物大分子物种的成像分析 稀土配合物荧光探针除了用于细胞内小分子物种的成像分析，在生物大分子 的测定分析方面应用也是非常广泛的。目前关于稀土配合物探针用于酶活性测定 2 0 - 2 4 】、核酸测定 2 5 - 3 0 】、蛋白质标记【7 9 8 5 1 及癌症标记物测定【8 6 】等方面的报道已有不 少，但是应用到细胞内进行成像分析的报道很少。 外周型苯二氮卓受体( p b r ) 是一种位于线粒体外膜的疏水蛋白，它会在胶质 母细胞瘤、乳腺癌和阿尔茨海默氏症等多种疾病中过度表达。美国的d a r r y j b o m h o p 等人设计合成了一种环状配体的铕配合物( e u p k l l l 9 5 ) 作为分子显影 剂【8 7 , 8 8 1 ，对c 6 胶质瘤细胞中的外周型苯二氮卓受体进行了成像分析。这一研究 结果将对肿瘤的早期诊断和治疗及其病理学研究提供新的思路。 1 3 结论与展望 稀土配合物独特的发光特点与先进的光学成像技术相结合，为实时在线动态 监测细胞内的分子提供了有力的实验手段，为揭示细胞内小分子物种与生物大分 子的生理功能与人类疾病的关系提供了新技术与新方法，结果将有力的促进生命 科学的发展。但稀土配合物探针在细胞成像领域的应用中还存在着激发波长相对 较短等有待解决的问题。预计今后相关研究将会在以下方面开展： ( 1 ) 设计新型的稀土配合物荧光探针，提高其水溶性、膜穿透性、选择性以 及激发波长； ( 2 ) 设计更多双光子或多光子激发的探针以及可用于细胞内活性小分子物 种检测的探针： ( 3 ) 深入研究探针穿膜机理及在细胞内的分布情况，为探针的设计提供理论 支持； ( 4 ) 利用时间分辨等荧光显微成像技术实现细胞内分子事件的实时观测和 动态研究。 总之，随着新型荧光探针的开发与应用，稀土配合物荧光探针将会对细胞生 物学、组织学以及光子学成像研究产生重要的影响。 山东师范大学硕士学位论文 参考文献： 1x uk h ，t a n gb ，h u a n gh ，y a n ggw jc h e nzz ，l ip a nlqs t r o n gr e d f l u o r e s c e n tp r o b e ss u i t a b l ef o rd e t e c t i n gh y d r o g e np e r o x i d eg e n e r a t e db ym i c e p e r i t o n e a lm a c r o p h a g e s j c h e mc o m m u n ，2 0 0 5 ，4 8 ：5 9 7 4 - 5 9 7 6 2 t a n gb ，h u a n gh ，x ukh ，t o n gll ，y a n ggw jl i ux ，a nlgh i g h l y s e n s i t i v ea n ds e l e c t i v en e a r - i n f r a r e df l u o r e s c e n tp r o b ef o rz i n ca n di t s a p p l i c a t i o nt om a c r o p h a g ec e l l s j c h e mc o m m u n ，2 0 0 6 ，3 4 ：3 6 0 9 3 6 1 1 3g a ojj ，x uk h ，h ujx ，h u a n gh ，t a n gb d e t e r m i n a t i o no ft r a c eh y d r o x y l r a d i c a l sb yf l o w 埘e c t i o ns p e c t r o f l u o r o m e t r ya n di t sa n a l y t i c a la p p l i c a t i o n j j a g r f o o dc h e m ，2 0 0 6 ，5 4 ( 21 ) ：7 9 6 8 7 9 7 2 4 t a n gb ，z h a n gl ，x uk h f i a - n e a r - i n f r a r e ds p e c t r o f l u o r i m e t r i ct r a c e d e t e r m i n a t i o no fh y d r o g e np e r o x i d eu s i n gt r i c a r c h l o r o b o c y a n i n ed y e ( c y 7 c 1 ) a n dh o r s e r a d i s hp e r o x i d a s e ( h r p ) 叨t a l a n t a ，2 0 0 6 ，6 8 ( 3 ) ：8 7 6 8 8 2 5x ukh ，l i ux ，t a n gb ，y a n ggw ：y a n gya nlgd e s i g no fa p h o s p h i n a t e b a s e d f l u o r e s c e n tp r o b ef o r s u p e r o x i d ed e t e c t i o n i nm o u s e p e r i t o n e a lm a c r o p h a g e s j c h e m e u rz ，2 0 0 7 ，1 3 ( 5 ) ：1 4 1 1 1 4 1 6 6g a ojj ，x uk h ，t a n gb y mll ，y a n ggw ，a nlgs e l e c t i v ed e t e c t i o no f s u p e r o x i d ea n i o nr a d i c a l sg e n e r a t e df r o mm a c r o p h a g e sb yu s i n gan o v e l f l u o r e s c e n tp r o b e j f e b s j o u r n a l ，2 0 0 7 ，2 7 4 ( 7 ) ：1 7 2 5 - 1 7 3 3 7 t a n gb ，l i ux ，x ukh ，h u a n gh ，y a n ggw a nlq a d u a ln e a r i n f r a r e dp h f l u o r e s c e n tp r o b ea n di t sa p p l i c a t i o ni ni m a g i n go fh e p g 2c e l l s j c h e m c o m m u n ，2 0 0 7 ，3 6 ：3 7 2 6 - 3 7 2 8 8 t a n gb ，x i n gy l ，l ip ，z h a n gn ，y ufb ，y a n ggw ：ar h o d a m i n e b a s e d f l u o r e s c e n tp r o b ec o n t a i n i n gas e - nb o n df o rd e t e c t i n gt h i o l sa n di t s a p p l i c a t i o ni nl i v i n gc e l l s j za m c h e m s o c ，2 0 0 7 ，1 2 9 ( 3 8 ) ：1 1 6 6 6 - 1 1 6 6 7 9 p e n gxj ，d ujj ，f a njl ，w a n gjy w uykz h a ojz ，s u ns1 3 lx ut a s e l e c t i v ef l u o r e s c e n ts e n s o rf o ri m a g i n gc d ? i nl i v i n gc e l l s j za m c h e m s o c ，2 0 0 7 ，1 2 9 ( 6 ) ：1 5 0 0 1 5 0 1 10x ukh ，l i ux ，t a n gb ap h o s p h i n a t e - b a s e dr e df l u o r e s c e n tp r o b ef o r i m a g i n g t h e s u p e r o x i d e r a d i c a la l l i o ng e n e r a t e d b y r a w 2 6 4 7 m a c r o p h a g e s j c h e m b i o c h e m ，2 0 0 7 ，8 ( 4 ) ：4 5 3 - 4 5 8 11k e n m o k us ，u r a n o 巧k o j i m ah 。n a g a n ofd e v e l o p m e n to fah i g h l ys p e c i f i c 1 2 山东师范大学硕士学位论文 r h o d a m i n e b a s e df l u o r e s c e n c ep r o b ef o r h y p o c h l o r o u s a c i da n di t s a p p l i c a t i o n t or e a l - t i m ei m a g i n go f p h a g o c y t o s i s j 】za m c h e m s o c ，2 0 0 7 ， 1 2 9 ( 2 3 ) ：7 3 1 3 - 7 3 1 8 12 k o i d e 髟u r a n ozk e n m o k us ，x o j i m ah 。n a g a n ozd e s i g na n ds y n t h e s i so f f l u o r e s c e n tp r o b e sf o rs e l e c t i v ed e t e c t i o no fh i g h l yr e a c t i v eo x y g e ns p e c i e s i nm i t o c h o n d r i ao f l i v i n gc e l l s j za m c h e m s o c ，2 0 0 7 ，12 9 ( 3 4 ) ： 1 0 3 2 4 - 1 0 3 2 5 13d i c k i n s o nbc ，c h a n gcj at a r g e t a b l ef l u o r e s c e n tp r o b ef o ri m a g i n g h y d r o g e np e r o x i d ei nt h em i t o c h o n d r i ao fl i v i n gc e l l s j j a m c h e m s