（生物化学与分子生物学专业论文）海洋蟹类的分子系统发育学研究.pdf

摘要 摘要 蟹类是十足目甲壳动物中最大的一支，广泛分布在海洋环境中，在维持海洋 生态系统的正常运作上有举足轻重的地位。蟹类的物种繁多，但由于其形态分类 特征相对集中，给传统分类学带来了许多困惑，对其分类系统研究尚存在不少争 议。本研究应用分予系统发育学方法，以1 8 sr r n a 基因、线粒体1 6 sr r n a 基因和 线粒体细胞色素c 氧化酶亚单位i ( c oi ) 基因序列片段为分子标记，结合形态学 特征对台湾海峡1 3 个蟹类样品以及印度洋中脊海区2 个蟹类样品的分类地位做出 了评价，并对初级蟹类的分类地位进行了探讨。主要研究结果如下： 1 依据蟹类的形态分类特征以及相关图谱对样品进行了形态学鉴定，结果 为1 5 个样燕分别为锈斑螭、疾进婿、变态媾、锐齿蠕、蛊额婿、红星梭子蟹、中 华近方蟹、日本大眼蟹、强壮菱蟹、酋妇蟹、特异大权蟹、火红皱蟹、锯额拟蛙 蟹和绵蟹。1 4 个种分别属于? 个科，l o 个属。并构建了样品系统树。 2 检索基因库，收集各种分子标记信息，摸索p c r 反应条件，对蟹类的1 8 s r r n a 、1 6 sr r n a 和i 基因扩增体系进行了优化，顺利扩增了9 种台湾海峡的蟹 类以及2 种大洋蟹类的1 8 sr r n a 和c oi 基因序列片段，4 种台湾海峡的蟹类以及2 种大洋蟹类的1 6 sr r n a 基因序列片段。其中1 8 条序列已在g e n e b a n k 等国际三大基 因库公布，序列号为e u 2 8 4 1 3 9 - e u 2 8 4 1 5 6 。 3 通过分析蟹类1 8 sr r n a 和线粒体1 6 sr r n a 以及c oi 基因序列片段，发 现1 8 sr r n a 仅含有一个约5 0 b p 的高可变区，最为保守，适合科以及科以上系统 ， 发育研究；c oi 基因序列变异性最高，适合属种之间的研究，线粒体1 6 sr r n a 既有保守区又有可变区，相对l 基因保守性很高，但相对1 8 sr r n a 变界性强， 最适合做蟹类的物种鉴定以及系统发育研究。 4 利用本实验扩增的序列结合g e n e b a n k 检索的相关序列，构建系统发育 树，并结合形态系统树，对样品作比较明确的系统发育定位，探讨了蟹类起源问 题。1 8 sr r n a 系统发育树由方蟹总科、沙蟹总科、溪餐总科和梭子蟹总科四个 科组成，它们和蛙鳃科距离相当，应起源于同一共同祖先。在1 8 sr r n a 系统发 摘要 育树中，样品中的5 种蛹首先聚合在一起，遗传距离小，亲缘关系近，与传统分 类相符合；中华近方蟹首先和平背蜞聚合，与传统分类一致；在1 8 sr r n a 系统 发育树中，高等蟹类和蛙蟹首先聚合，显示蛙蟹和高等蟹类的关系更加亲密，绵 蟹则处于较低等的地位。c 0i 基因系统发育树展现疾进蝽和直额蝠亲缘关系紧 密，锐齿蛹和变态蝎关系较近，而锈斑蛹则与前4 种蝠亲缘关系相对较远。1 6 s r r n a 系统发育树显示出大洋样品先和扇蟹科的大权蟹属以及皱蟹属聚合，与形 态分类结果相一致，可以判定两个大洋样品属于扇蟹科。在1 6 sr r n a 系统发育 树中，高等蟹类首先和蛙蟹科聚合，再与绵蟹聚合。综合1 6 sr r n a 和1 8 sr r n a 基因系统发育树，在蟹类起源问题上，本研究支持将蛙蟹归为高等蟹类的论点。 关键词：蟹类；1 8 sr r n a 基因；1 6 sr r n a 基因 a b s t r a c t a b s t r a c t b r a c h y u r ac r a b s ，t h el a r g e s tc l a d eo f t h ed e c a p o dc r u s t a c e a ，h a v eu n d e r g o n ea n e x t e n s i v er a d i a t i o na n dt o d a ya 诧e x t r e m e l yd i v e r s eb o t hm o r p h o l o g i c a l l ya n d e c o l o g i c a l l y t h e yp l a y av e r yi m p o r t a n tr o l ei nt h ee c o l o g yo fm a r i n e e n v i r o n m e n t ，a n do c c u p ya l li m p o r t a n tp o s i t i o ni na q u a c u l t u r e 。b u tt h ee x t r e m e m o r p h o l o g i c a ld i v e r s i t ya n dp r o b a b l el a r g es c a l ec o n v e r g e n c eo f a d u l tf e a t u r e si nt h e b r a c h y u r ah a sc o n f o u n d e d c o n s e n s u so np h y l o g e n e t i c r e l a t i o n s h i p s m o l e c u l a r a p p r o a c hw a su s e dt ot e s th y p o t h e s e sa b o u tt h ep h y l o g e n yo fs e l e c t e db r a c h y u r a n c r a b sw h i c hw e r ec o l l e c t e df r o mt h et a i w a ns t r a i ta n di n d i a no c e a n 。c o m b i n i n gt h e m o r p h o l o g i c a lc h a r a c t e r s ，b r a c h y u r aw e r ea s s e s s e df o rt h e i rp h y l o g e n e t i cp o s i t i o nb y u s i n g18 sr i b o s o m a lr n a 、1 6 sm i t o c h o n d r i a lr n aa n dc oi s e q u e n c e s ( d n a s e q u e n c eo ft h em i t o c h o n d r i a lc y t o c h r o m eo x i d a s ei ) a n dd i s c u s s e dt h eo r i g i no ft h e b r a c h y u r ac r a b s t h er e s u l t sa sf o l l o w s ： 1 c h a r y b d i sf e r i a t u s 、p o r t u n u ss a n g u i n o l e n t u s 、c h a r y b d i sv a d o r u m 、c h a r y b d i s v a r i e g a t a ，c h a r y b d i sa c u t a ，c h a r y b d i s 护u n c a t a ，h e m i g r a p s u ss i n e n s i s ，p a r t h e n o p e v a l i d u s ，m a c r o p h t h a l m u sj a p o n i c u s ，e r i p h i i d a es p 。，m a c r o m e d a e u sd i s t i n g u e n d u s ， l e p t o d i u se x a r a t u s ，r a n i n o i d e ss e r r a t i f r o n sa n dd r o m h 2d e h a a n i w e r ei d e n t i f i e df r o m t h es p e c i m e n sb a s i so nt h em o r p h o l o g i c a lc h a r a c t e r s 。 2 e s t a b l i s h e dt h e18 sr r n a 、16 sr r n aa n dc oig e n ep c rr e a c t i o ns y s t e m a m p l i f y i n ga n ds e q u e n c i n g18 sr r n a 、1 6 s r r n aa n dc ois e q u e n c e so ft h ec r a b s a m p l e s a n ds u b m i t t e d18s e q u e n c e s t ot h ei n t e r n a t i o n a lg e n eb a n k , t h es u b m i s s i o n s a r ee u 2 8 4 l3 9 e u 2 8 4l5 6 3 t h r o u g ha n a l y s i n gt h e18 sr r n a 、16 sr r n aa n dc ois e q u e n c e so ft h e s p e c i e s ，w ef i n dt h a t 18 sr r n ai s17 8 5b pa n dc o n s t a n t e s t , i ti se f f i c t i v ea tt h e i n f r a o r d e rl e v e lo fb r a c h y u r a n d n as e q u e n c eo ft h em i t o c h o n d r i a lc y t o c h r o m e o x i d a s eii s7 0 9 b p ，a n dh a st h eh i g h e s tv a r i a b i l i 填i ti sv e r yu s e f u li np h y l o g e n e t i c i n f e r e n c ei nt h eg e n u s m i t o c h o n d r i a l16 sr r n ai s5 3 0 b pa n da l s ov e r yc o n s e r v a t i v e ， b u tm o r ev a r i a b l et h a n18 sr r n a , i ti st h em o s te f f e c t i v ee v o l u t i o n a r ym a r k e ri nt h e a b s t r a c t b r a c h y u r a n 4 u s i n gt h o s es e q u e n c e so ft h es a m p l e sa n dc o m b i n i n gt h e r e l a t e dd n a s e q u e n c e so fb r a c h y u r a ni n ( e n b a n k , w eb u i l tt h em o l e c u l a rp h y l o g e n t i ct r e eo f b r a c h y u r a n s c o m b i n i n gt h em o r p h o l o g i c a lc h a r a c t e r s ，a l lt h es p e c i e sg a i n e dt h e i r p h y l o g e n e t i cp o s i t i o n w ea l s od i s c u s s e dt h eo r i g i no fb r a c h y u r ac r a b t h e18 sr r n a m o l e c u ep h y l o g e n e t i ct r e ei sc o m p o s e db yf o u rf a m i l i e s ：g r a p s i o i d e a 、o c y p o d i o i d e a 、 p o t a m o i d e aa n dp o r t u n o i d e a t h i ss u g g e s t e dt h a tt h ef o u rf a m i l i e sa s ef r o mac o m m o nm a r i n e a n c e s t o r ，a n dt h ee s t i m a t e dd i v e g e n c et i m ea l es i m i l a r i nt h e18 sr r n am o l e c u ep h y l o g e n e t i e t r e ef i v ec h a r y b d i sg r o u p e dt o g a t h e rf i r s t t h eg e n e t i cd i s t a n c eo ft h e mi ss m a l l ，t h i s a c c o r d s 、析mt h et r a d i t i o n a lc l a s s i f i c a t i o n t h r o u g ha n a l y s i n gt h e18 sd n am o l e c u e p h y l o g e n e t i ct r e ew ec a nf m d t h a tt h es oc a l l e dh i g h e rc r a b sg r o u p e dw i t hr a n i n i d a e f i r 瓯t h e ng r o u p e dw i t ht h ed r o m i i d a e t h i ss u g g e s t st h a tt h es oc a l l e dh i g h e rc r a b s h a v eam o r ec l o s e p h y l o g e n e t i cr e l a t i o n s h i p 、i t hr a n i n i d a e t h ec oig e n e p h y l o g e n e t i ct r e es h o w s t h ep h y l o g e n e t i cr e l a t i o n s h i po ft h ef i v ec h i a r y b d i s t h r o u g h a n a l y s i n gt h em i t o e h o n d r i a l16 sr r n a m o l e c u ep h y l o g e n e t i ct r e ew ec a nf i n dt h a tt h e s a m p l e sf r o mt h ei n d i a no c e a ng r o u p e dt h ex a n t h i d a e a n dt h i sa c c o r d s 、析t ht h e m o r p h o l o g i c a la n a l y s i s s ot h es a m p l e so ft h ei n d i a no c e a ns h o u l db e l o n gt ot h e x a n t h i d a e i nt h e1 6 sr r n am o l e c u ep h y l o g e n e t i ct r e e ，t h eh i g h e rc r a b sa l s og r o u p e d 谢t 1 1r a n i n i d a cf i r s t , t h e ng r o u p e d 而t l lt h ed r o m i i d a e c o m b i n 谢t l lt h e18 sd n a m o l e c u ep h y l o g e n e t i ct r e e ，t h i se x p e r i m e n ts u p p o r t st h a tt h er a n i n i d a ed e m a r c a t et h e l o w e rl i m i to ft h eb r a c h y u r aa n df o r mad i s t i n c tl i n e a g et h a td i v e r g e de a r l yf r o mt h e l i n e a g el e a d i n gt oo t h e rm e m b e r so ft h i si n f i a o r d e r k e yw o r d s ：m o l e c u l a rp h y l o g e n yo fb r a c h y u r a n ：1 8 sr r n a ；1 6 sr r n a 厦门大学学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独 立进行研究工作所取得的成果。除文中已注明引用的内容外，本论文 不含其他个人或集体已经发表或者撰写过的作品成果。对本文的研究 做出重要贡献的个人和集体，均己在文中以明确的方式表明。本人完 全意识到本声明的法律结果将由本人独立承担。 邢炳鹏 日期：2 0 0 8 年6 月1 日 厦门大学学位论文著作权使用声明 本人完全了解厦门大学有关保留、使用学位论文的规定。厦门大 学有权保留并淘国家主管部门或萁指定枧构送交论文的纸质版和电 子舨，有权将学位论文照于j 赢刹目的的少量复制并允许论文进入学 校图书馆被查阅，有权将学位论文的内容编入有关数据库进行检索， 有权将学位论文的标题和摘要汇编出版。保密的学位论文在解密后适 羯本规定牵 本学位论文属于 1 、保密() ，在年解密后适用本授权书。 2 、不保密( ) ( 请在以上相应括号内打“4 ) 作者签名 导师签名： 日期：力簿月印日 日期：跏扩年占月中日 第一章前言 第一章前言 蟹类是指甲壳纲( c r u s t a c e a ) ，十足目( d e c a p o d a ) ，爬行亚目( r e p t a n t i a ) 中的短尾派( b r a c h y u r a ) 。种类繁多，达6 5 0 0 多种，体型高度特化，是甲壳类最 为高等的一个类群，并且是十足目甲壳动物中最大的一支【l 】。蟹类起源于侏罗纪， 经过长时间的进化和扩散，不仅在形态上具有多样性并且在生态上也具有多样 性。蟹类主要生活在海水中，也有一些生活在淡水和陆地上，分布广泛，从热带 山脉溪流到深海热液喷口都有它们的踪迹【2 l 。 蟹类中约9 0 的种类生活在海洋里，由于类别不同，它们所处的生境也迥然 各异。 绝大多数类别的蟹类集中分布在大陆架浅海区，也有相当多的蟹类生活 在潮间带，也有不少蟹类生活在次深海及深海区。许多较为原始的蟹类如绵蟹类， 裸胸类，尖口类和尖额类中的一部分均生活在浅海至深海区。它们对盐度适应性 较为狭窄，均要求典型的海水浓度3 5 。而另一些庞大的类群，大体集中在浅 海和潮间带，如相当多的梭子蟹，生活在浅海，其中有许多种类对盐分的适应性 较宽，也有部分种类生活在较深处。扇蟹( x a n t h i d a e ) 大都在沿岸带或者低潮线 的浅水中生活，体型比较坚实，对风浪和水流波动的适应性较强；相当一部分在 繁殖习性上是半陆生。另外相当多的种类，如方蟹总科( g r a n s i o i d e a ) 和沙蟹科 ( o c y p o d i d a e ) 生活在广阔的潮间带，成为半陆生的代表。它们生活在红树林的泥 沼中或岩石滩、泥沙滩上或其他泥沼区，对盐度的适应性广泛，大都营穴居生活， 但在上述大的生态区域内也有许多不同的小生境，如广阔的潮间带，仍有岩岸， 沙滩和泥涂，粗沙和细沙，粘土和淤泥等的区别。这么复杂的生境，与亚种的形 成，种类的进化都有密切的关系【3 】。仅有一小部分种类进入陆地淡水水域，成为 非海洋习性的蟹类。按其成体栖息地的不同，以及它们对非海洋性生活的适应程 度不同，可将非海洋性蟹类分成3 种类型，即成体湖沼型( a d u h l i m n i c f o r m ) ，成体 陆生型( a d u l t t e r r e s t r i a l f o r m ) 和完全内陆型( e n t i r e l y i n - - a n d f o r m ) 。中国特有的淡水 蟹类一华溪蟹( s i n o p o t a m o n ) 是典型的完全内陆型蟹类，完全脱离了海洋栖息地。 中华绒螯蟹( ei n e n s i s ) 属成体湖沼型，其生活史的大部分时间在江河和湖泊的泥 岸、泥滩的洞穴内【4 】。 还有不少种类和其他动物共栖生活，如有些绵蟹、隐绵蟹生活在珊瑚群体的 裂缝中，大部分种类均用末2 对步足携带一块海绵在它们的背上，关公蟹 第一章前言 ( d o r i p p e ) 则背上携带一块贝壳及海葵。蜘蛛蟹( m a j i d a e ) 大都与腔肠动物或海 藻共生，菱蟹科( p a r t h e n o p i d a e ) 中光菱蟹亚科( e u m e d o n i n a e ) 中的所有种类 均与棘皮动物共生。扇蟹科( x a n t h i d a e ) 也包括许多共生的种类，如t e t r a l i i n a e 或t r a p e z i i n a e 中的全部种类均与腔肠动物共生，所有豆蟹科的种类均与贝类、 蟹类和棘皮动物共生【3 , 5 1 。 蟹类是海洋生态系统的重要组成部分，在维持海洋生态系统的正常运作上有 举足轻重的地位，其幼体也均是海洋鱼类或其他海洋生物的良好天然饲料，是整 个海洋生态系统食物链中极为重要的一个环节。蟹类还具有重要的极高的食用、 经济价值，其肉味鲜美，是重要的海产品，如青蟹、梭子蟹、日本蝠、锈斑蝠、 绒螯蟹、皇帝蟹、雪蟹等经济价值极高的种类都是重要的海鲜产品【嗣随着经济 的发展，海鲜产品已经成为居民的日常需要，促进了海产养殖业的发展除了食 用外，还可用蟹壳提炼甲壳素作为工业用品，有些种可以作为药用，近代医用动 物仍然把日本蠕，三疣梭子蟹和中华绒螯蟹作为药品使用，在闽东也有用锯缘青 蟹治疗夜尿症的习惯【5 l 。因此蟹类得到了渔业研究者和行为生态学家的广泛关 注，并且蟹类是古老的生物类群，还得到古生物学家和进化生物学家的关注r 7 - 9 1 。 尽管蟹类的生态、进化、经济意义重大，但是其系统发生，进化起源仍然没有太 大发展，并且蟹类中的很多种类至今没有分清【l o l 。正确的物种鉴定和系统发育关 系对种质资源保护以及资源生物的可持续利用有至关重要的作用和意义【l 。 1 1 蟹类传统分类概述 1 1 1 传统分类研究内容和进展 形态特征是生物物种遗传多样性最直观和最直接的表现形式。形态特性是 蟹类分类学上的重要依据，因此，传统的形态学研究是研究物种差异的最直接的 分类方法。蟹类传统的分类方法主要以外部形态特征为依据，比较少见支序分析 ( c l a d i s t i ca n a l y s i s ) 的研究。 蟹类的形态特点是头胸部( c e p h a l o t h o r a x ) 非常发达，而腹部( a b d o m e n ) 极为退化，折附于头胸部腹面，各部均有形态结构和功能不同的附肢。传统分类 学上用来划分蟹类的重要特征包括以下方面：l 、头胸部。蟹类的头胸甲发达， 表面凸凹不平，分若干区域，形状多样、大小悬殊，并且均随种类而异，因而头 2 第一章前言 胸部及其附属物，如复眼，是分类上属别及种别的判断依据；2 、腹部。蟹类腹 部短小而扁，肌肉退化，位于胸部腹甲的中央。腹部的形状以及是否完全折叠在 头胸部之下可作为属别及种别的判断依据；3 、附肢。蟹类的附肢由于功能的不 同而在形态上有很大的变化，除第一节不具真正的附肢外，其余所有的体节均有 一对附肢，是蟹类属别和种别划分的主要依据。附肢主要由触角、口器、胸部附 肢、腹部附肢和尾肢组成。其中胸部附肢可分为3 对颚足( m o x i l l i p e d ) ，5 对螯 足( c h e l i e d ) 、步足( p e r e i o p o d ) ；腹部附肢分为第l 腹肢和第2 腹肢。附肢的形 状和大小是形态分类的主要依据，其中雄性第1 腹肢形态结构稳定，而且性状稳 定，是分类特征的非常重要依据【1 2 l 。但看似十分集中的形态特征却一直阻碍着研 究清楚这些广泛分布的蟹类的进化和系统发育关系 2 1 。并且蟹类形态和生态多样 性非常高，分析时很容易受到环境因素和主观因素的影响，用如此多的形态特征 对它进行系统发育分析很难达成一致的观点【l 】，所以蟹类的起源至今并未得到一 个十分肯定的结论。蟹类系统发育的资料比较贫乏，特别在初级蟹类的分类地位一 上存在着不同的见解，主要集中在真正短尾类与异尾类之间的界限问题上【3 】。 最早h m i l n e e d w a r d s 将较低级的短尾类如绵蟹( d r o m i i d s ) ，人面蟹 ( h o m o l i d s ) 和蛙蟹( r a n i n i d s ) 置入异尾派，而将狭隘的短尾派分为4 个大的 部分，即尖额派( o x y r h y n q u e s ) ，圆额派( c y c l o m e t o p e s ) ，方额派( c a t o m c t o p e s ) 及尖口类( o x y s t o m e s ) 。1 8 5 0 一1 8 9 0 期间，所有主要的甲壳动物工作大都采用 这一分类系统。在这期间d eh a a n 主要以蟹类口部的结构分为方口类 ( b r a c h y g n a t h a ) 及尖口类( o x y s t o m a t a ) 。d a n a 将短尾派分为5 亚派，即蜘蛛 蟹类( m a i o i d e a ) ，黄道蟹类( c a n c r o i d e a ) ，盔蟹类( c o r y s t o i d e a ) ，方蟹类 ( g r a p s o i d e a ) 和玉蟹类( l e u c o s o i d e a ) ，但未被分类学者广泛的采用。至1 8 9 2 1 8 9 6 年o r t m a n n 对h m e d w a r d s 的系统做了大量的补充和增订，但将短尾派 限于更狭隘的范围内，与绵蟹类( d r o m i i d e a ) ，尖口类( o x y s t o m a t a ) 和异尾类放 在并列的位置上。直到b o r r a d a i l e 才大致形成了近代短尾派的分类系统，尽管其 中少数原始科的分类地位尚有争议。他将短尾派分为3 亚派，即：尖口类 ( o x y s t o m a t a ) ，绵蟹类( d r o m i a c e a ) 及方1 2 类( b r a c h y g n a t h a ) 【包括方额总科 ( b r a c h y r h y n c h a ) 及尖额总科( o x y r h y n c h a ) 】【1 3 1 4 1 。 后来许多学者如c a l m a n n 刘c o c k , r a t h b u n , b a l s s ，s a k a i 等基本上是采用这个 3 第一章前言 系统【1 牝1 1 。 在近代的一段时期内，基于比较形态、个体发育等资料，将短尾派分为7 个 亚派，即绵蟹类( d r o m i a c e a ) ，裸胸类( g y m n o p l e u m ) ，尖口类( o x y s t o m a t a ) ， 尖额类( o x y r h y c h a ) ，盔蟹类( c o r y s t o i d e a ) ，方额类( b r a c h y r h y n c h a ) ，珊隐蟹 类( h a p a l o c a r c i n i d e a ) 。每一亚派中的类别也有着一些新组合和系统分类的修订 工作，如g o r d o n ，s e r e n e ，s t e p h e n s o n 等【2 2 , 2 3 , 2 4 】。近代s e r e n e ，s a k a i 等作者均采 用这一大的规范【2 3 捌。 绵蟹亚派( d r o m i a c e a ) 是最原始的蟹类，如绵蟹科( d r o m i i d a e ) 的涵状幼体 明显的具有异尾类( a n o m u r a ) 的特征，外形似虾状，尾节及第三颚足均比较发 达，腹部具有退化的尾肢。然而整个的形态已是蟹形，它们是现代蟹类的祖先。 1 9 2 2 年b o u r n e 根据蛙蟹科( r a n i n i d a e ) 的特殊形态，建立了裸胸亚派 ( g y n m o p l e u r a ) ，并沿用至今。但也有的作者，如s t e v c i c 根据形态，生理及生 态学等材料，认为r a n i n i d a e 应为绵蟹亚派下的一个总科：蛙蟹总科( r a n i n o i d e a ) 2 6 1 o 最近g u i n o t 根据蟹类两性生殖孔的位置将其分为3 个派：肢孔派 ( p o d o t r e m a t a ) 一即雌雄生殖孔分别在第二、四步足底节；胸孔派 ( t h o r a c o t r e m a t a ) 一雌雄孔分别位于第六、八节，而在各派之下设立了许多的 总科 2 7 1 。r i c e 通过大量代表性蟹类潘状幼体的形态比较，探讨了短尾派的分类 系统，进一步证实并补充修订了g u i n o t 的观点【2 8 1 。 近些年来，在形态差异研究中，对测量数据的处理己从简单的统计分析发展 到多元分析，其中聚类分析、判别分析和主成分分析是3 种主要的形态性状多元 分析方法。许加武等采用2 4 个形态特征对不同水系的中华绒螯蟹进行形态判别， 建立了分别适合长江、辽河及瓯江绒螯蟹群体的判别公式。o v e n o ne ta 1 对东南 亚3 个国家的青蟹雄性成体样本的2 2 个形态特征和2 0 个比率特征进行判别分 析，形态判别结果显示青蟹分为3 组，而比率判别结果则显示为2 组。柳广东对 中华绒螯蟹群体、合浦绒螯蟹群体和日本绒螯蟹群体的形态学特征进行了单因子 方差分析和聚类分析，认为三种绒螯蟹都是独立的种，中华绒螯蟹与合浦绒螯蟹 亲缘关系较近；单因子方差分析结果显示，中华绒螯蟹分别与合浦绒螯蟹和日本 绒螯蟹之间都有1 0 个变量存在显著差异，合浦绒螯蟹与日本绒螯蟹之间有9 个 4 第一章前言 变量有显著差异。 目前蟹类的分类要从认知的范畴有所突破，还要做大量的工作，如古生物学， 比较形态，个体发育，生理学及生态学等等。当各方面资料逐步丰富完善后，才 有可能使短尾派系统更接近于自然分类的客观实际1 3 。 1 1 2 传统分类的缺陷 以表型特征为依据的蟹类传统分类法具有直观、便捷等优点，但也存在许多 不足之处，从而带来一系列问题。首先，形态学分类对样品保存的完整性有比较 高的要求，尤其是蟹类划分重要特征集中的腹肢的完整性。其次，对形态特征的 选择和描述也会因人而异，其差异基本上属经验性、描述性鉴别，具有较强的主 观随意性。缺乏量化指标，不能准确地反映不同种群的形态特征差异【2 9 】。比如青 蟹属蟹类最初被认为只有单一物种，只是分类学家们所用的学名不同。1 9 4 9 年， e s t a m p a d o r 通过研究首先将该属蟹类归并为3 种l 亚种，即s s e r r a t a ， s o c e a n i e a ，s t r a n q u e b a r i c a 和s s e r r a t a 肼p a r a m a m o s a i n 3 0 l 。迄今，青蟹 分类尚存疑问，但多数学者认为青蟹属蟹类在分类学上应该不止存在1 个种【3 l 一 4 3 1 。还有许多学者对绒螫蟹的分类观点也也不一致，如酒井认为狭颚绒螯蟹与其 他绒螯蟹有显著的不同而将其定名为1 个新种，n e o e r i o c h e i f l 2 5 1 。但有些学者认 为酒并研究的狭颚绒螯蟹只是绒螯蟹幼体，不应将其归为新种。c h a n 等对直额绒 螯蟹原始标本进行分析后认为：直额绒螫蟹可能是日本绒螯蟹的幼蟹，是日本绒 螯蟹的同物异名，台湾绒螫蟹是c h a n 报道的1 个新种【4 4 1 。合浦的绒螯蟹是近年 来发现的1 个新种，1 9 9 0 年经戴爱云教授鉴定后定名为日本绒螯蟹合浦亚种( e a pd 甩i c u s h e pu e n s i s l 4 5 1 。 此外，生物体在相同外界环境压力下还会产生趋同进化现象，这些都导致鉴 定工作困难重重，有时无法正确判定种别，常把外形相似的生物认为是同一个种。 但是随着分子生物学技术的迅速发展，许多研究结果表明一些外形极其相似的广 布种实际上在遗传结构上已经有明显的差异，也就说存在隐蔽种。隐蔽种的存在， 将会导致科学家低估海洋生物的多样性i 删；同时由于无法准确判定种别，容易选 用错误的实验材料，影响后续研究的准确性。分子系统发育学的兴起，为解决以 上问题提供了可能。 第一章前言 l 。2 蟹类分子系统发育学的产生和发展 1 2 。l 产生和研究方法 2 0 世纪6 0 年代，分予系统发育学( m o l e c u l a rp h y l o g e n y ) 的建立开创了利用 分子标记研究生物系统发育酶途径蚓。f i t c ha n dm a r g o l i a s h1 4 8 l 在2 0 世纪7 0 年代在 细胞色素氨基酸序列的基础上建立了第一个系统发育树，并于1 9 8 8 年又提出以 d n a 序列为标准的观点；1 9 7 7 年，w o e s e 根据r r n a 序列相关性分析提出了既不 同于原核生物也不同于真核生物的第三类生物，称为古细菌( a r c h a e b a c t e r i a ) 4 吼 剐。但是当时人们对“吉细菌弹一名是否合适以及古细菌能否成为独立的系统有 不同的看法。1 9 9 6 年第一个古细菌基因组全序列问世，确证了古细菌是不同于细 菌和真核生物的独特类群f 5 1 - 5 3 1 。在随后的几十年巾，髓着分子生物学技术和计 算机数据处理技术的迅速发展和应用，分子生物学不仅用于分析原核生物的起 源、进化关系，还促进了各种真核生物类群的起源、进化及其内群分类单元之闻 的亲缘关系的研究【州。然而分子系统发育学在蟹类分类上的应用很晚，在2 0 0 3 年8 月5 日前，仅有1 种蟹类的线粒体基因组被报道玲习，郎y a m a u c h ie ta l 报道的兰 疣梭子蟹( p o r t u n u st r i t u b e r c u l a t u s ) i s 6 1 ，这几年由于充分认识到蟹类在海洋生态 系统上的重要性、渔业养殖的经济价值以及种质资源保护的现实意义，分子系统 发育学在蟹类的起源和各个分类阶元的不同类群间的系统发育研究中褥到广泛 的应用1 5 刀。虽然蟹类在分子研究方面起步较晚，但是起点较高，截止到2 0 0 5 年8 月，已有三种蟹类的m t d n a 的全部序列被测定：分别是s u ne ta l 报道的日本绒螫 蟹中华亚种( 关于其分类地位尚存争议) ( e r i o c h e i r j a p o n i c as i n e n s i s ) t 矧、p l a c ee t a l 报道的国朋f 糟岔隗墨印如矗龉1 5 9 1 和m i l l e r e ta l 报道的p s e u d o c a r c i n u sg i g a s l 6 0 1 ，截 止至1 j 2 0 0 8 年4 月，基因库公布的蟹类类基因序列已经达至u 4 2 5 4 条，并解决了一些 形态学分类无法解决或尚存争议的问题。 目前运用予蟹类分子系统发育研究的方法有染色体研究、蛋白质一同功异构 酶( a l l o z y m e ) 以及d n a 分析等。由于同功异构酶变异的基因座( 1 0 c i ) 数目或 每个基因座上的对偶基因( a l l e l s ) 数，都比d n a 序列少，在分析相近种的亲缘 关系时，灵敏度不够，无法将不同种分开，因两这神方法的利用受到很大的限制 f 6 卜刚。并且十足目甲壳动物的染色体数目极大，形状短小，着丝点不易辨认，给 6 第一章前言 核型分析带来一定的困难，因此有关绒螯蟹类染色体研究的报道很少；而且染色 体研究多集中在核型分析及生物个体表型水平上，在生物群体研究方面也存在 一定的局限性【6 1 1 。因此，d n a 技术逐渐取代了蛋白质标记和核型分析，成为研 究分子系统分类的主要工具。 当前，常用于系统发育的d n a 技术主要有限制性片段长度多态性( r e s t r i c t i o n f r a g m e n tl e n g t hp o l y m o r p h i s m s ，r e l p ) 、随机扩增多态d n a ( r a n d o m a m p l i f i e d p o l y m o p h i cd n a ，r a p d ) 、扩增片段长度多态性( a m p l i f i e df r a g m e n tl e n g t h p o l y m o r p h i s m ，a f l p ) 、单链构型多态性( s i n g l es t r a n dc o n f o r m a t i o n p o l y m o r p h i s m ，s s c p ) 以及d n a 序列分析等【6 9 】。 r f l p 是利用已知的限制性内切酶消化d n a ，然后根据得到的电泳酶切图谱 计算彼此间遗传距离，从而构建系统发育树，但是由于r f l p 步骤繁琐、工作量 大且成本较高，使其在蟹类分子系统发育上的应用比较少 7 0 1 ；r a p d 是利用人工 合成的单链寡核苷酸为引物，采用较低的退火温度对研究的基因组d n a 进行p c r 扩增，得到多态性的d n a 片段，经过分析处理后构建起系统发育树，黜廿d 一般 用在近缘种、复合种及种内生物型的遗传多样性和地理种群的进化遗传等方面的 研究，但是用在种以上类群间的比较时无法得到可靠的遗传距离，并且r a p d 还 存在再现性低i 电泳胶片上同一大小的片段可能不同源等问题【7 l 】；d n a 序列分 析是通过比较各类群个体间同源基因或基因片段的核酸序列，从而构建分子系统 发育树，推断类群间系统发育关系的方法，由于用于比较不同个体差异的同源基 因有很多种，并且不同基因进化速率不同，因此可根据不同的需要，选择合适的 区域来研究不同阶元类群的系统发育i 剐。d n a 序列分析是目前进行分子进化和 系统发育研究最有效、可靠的方法，也是蟹类分子系统发育运用最广的方法。 构建分子系统发育树主要有三种方法：简约法( p a r s i m o n y ) 、距离法( d i s t a n c e ) 和似然法( 1 i k e l i h o o d ) 【7 0 7 2 1 。 简约法构建系统发育树是在众多序列中，首先推定祖先种的序列，然后按照 进化过程中使碱基变化最小的方式选出系统树，简约法中最常用的是最大简约法 ( m a x i m u mp a r s i m o n y ) 【2 6 】。系统发育分析中简约性标准是指可能的系统发育树 中具有最少额外进化数目的树为最优树，优点是直接应用原始数据，避免了信息 丢失；较少依靠关于序列进化假说；计算机算法及程序较成熟，可做更深入的分 7 第一章前言 析。也有缺点：只适用于亲缘关系密切的种类或序列之间的分析，对于进化时间 较长的物种或序列，由于平行和回复突变的干扰，会得出不正确的结果；系统树 上不同支系在进化改变量上不等时也会引起误差。 距离法：在很多物种树的同一核酸之间，列出碱基置换情况，以置换率为基 础建立系统树。距离法基础建立在分子钟假设上，应用在有较近亲缘关系的物种 或群体的分化研究上能获得满意结果，但难以排除平行进化等的干扰。这类方法 首先要求原始数据以成对分类单元之间的距离形式表示，对于性状数据编码后要 转换成距离数据。其中邻接法( n e i g h b o r - j o i n i n g ) 和不加权对群分析法( u n w e i g h t e d p a i rg r o u pw i t hm a t h e m a t i c a la v e r a g e ) 最常用m ，7 4 1 。不加权成对群法一算术平均 数法常见于各种生物的系统聚类分析；邻接法是一种推论叠加树法，要求距离数 据非常接近叠加性条件，其在成聚过程中连接的是分类单元之间的结点而不是分 类单元本身。主要优点是方法简单和结果稳定，但也有缺点：将原始数据转换成 距离数据时，易丢失信息，大多没有次优树的能力，对于序列数据的分析无法考 虑不周位点上进化速率的差异或序列中可变位点数的差异，对远缘种类之间的距 离数据进行校正，需考虑进化过程和特征的知识。 似然法：首先需要确定一个序列进化的模型，然后寻找在该进化模型下最有 可能产生所研究的d n a 序列数据的系统树，其中影响最大的是最大似然法 ( m a x i m u ml i k e l i h o o d ) t s 】。最大似然法( m a x i m u ml i k e l i