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山东大学硕士学位论文：高效菌处理印染废水的研究 的最适降解p h 值为8 ，适应印染废水偏碱性的生长环境；原始菌在碱性 条件下去除率明显下降，生长条件要求较高。 补充钙盐有利于促进高效菌对印染废水的脱色降解，考虑到实际运 的可操作性和经济性，选择c a c 0 3 作为投加高效菌处理系统的促进剂。 关键词 高效菌印染废水脱色降解 一、- ，。一 a b s t r a c t a f t e ri s o l a t i n gt h eh i g h - e f f e c t i v eb a c t e r i af r o mp r i n t i n ga n dd y e i n gw a s t e w a t e r , s e q u e n ts t u d i e so nt h et r e a t m e n to fy u a ns h o ut e x t i l ep r i n t i n gw a s t e w a t e r ，c o m p a r e dt oi t so r i g i n a lb a c t e r i a t h u st h er e s u l t sa r el i s t e da sb e l o w 8s t r a i n so fb a c t e r i u ma r eg a i n e d ，i n c l u d i n g4s t r a i n so fb a c t e r i u ma n d 4 s t r a i n so ff u n g u s ，w h o s ed e c o l o r i z i n gr a t ei sa b o v e6 5 t h ed e c o l o r i z a t i o n a b i l i t yo ff u n g ii sb e t t e rt h a nb a c t e r i a a c c o r d i n gt ob a c t e r i a li n d i v i d u a la n d c o l o n ys h a p e ，i ti sp r e l i m i n a r i l yi d e n t i f i e da sw h i t er o tf u n g u s ( p h a n e r o c h a e t e c h r y s o _ s p o r i u m ) t h ed e c o l o r i z a t i o na b i l i t yo fm i x e db a c t e r i ag r o u pi sb e t t e r t h a ns i n g l es t r a i n o n eg r o u po f h i g h - e f f e c t i v eb a c t e r i a2 - 4 榉r b a c t e r i u ml 一 10a n df u n g u s8 4 8 ) i sg a i n e df i n a l l y w h o s ed e c o l o r i z i n gr a t ec a nr e a c h a b o v e9 0 d u r i n g4 - m o n t hs t a b l eo p e r a t i o n ，c o m p a r e dt oo r i g i n a lb a c t e r i a ，t h e h i g h _ e f f e c t i v eb a c t e r i as u i t a b l ef o rt h ep r i n t i n ga n dd y e i n gw a s t ew a t e rw i t h h i g hc o n c e n t r a t i o n ，a n dn o n s t e a d ye f f l u e n tq u a l i t ya n dq u a n t i t y , h a ss t r o n g e r a b i l i t yo fd e g r a d a t i o na n ds h o c kr e s i s t a n c e i th a st h eb e s td e c o l o r i z i n gr a t et o r e dd y e i n gw a s t ew a t e r ，w h i c hi s3 5 m o r et h a no r i g i n a lb a c t e r i a w h e nt h e c o d c rc o n c e n t r a t i o no fr a ws e w a g ei sa sh i g ha s5 0 0m g l - 6 0 0m g l ，t h e 2 山东大学硕士学位论文：高效菌处理f - i 染废水的研究 b i o d e g r a d i n g r a t eo fh i g h - e f f e c t i v eb a c t e r i ai s2 5 m o r et h a no r i g i n a l b a c t e r i a i ti sa l s op r e d o m i n a n to nt h es e p a r a t i o no fs u r f a c t a n t s w i t hl e s s h y d r o - r e s i d e n tt i m e ，h i g h - e f f e c t i v e b a c t e r i a s a v e r a g e s e p a r a t i o no fc o d c ri si t i o r es u p e rt h a no r i g i n a lb a c t e r i a w h e nh r t i s6 h ，t h e c o d c ro fe f f l u e n tc a nr e a c hb e l o w1 0 0m g l ，w i t hab i o d e g r a d i n gp o w e ru pt o 8 0 9 0 a b o u t2 0 m o r et h a no r i g i n a lb a c t e r i a h r t 2 6 hi sc o n s i d e r e d a st h eo p t i m u mh y d r o r e s i d e n tt i m e ，l e s st h a n2 hw h i c hi sa p p l i e db yy u a n s h o ua tt h el e a s t h i g h - e f f e c t i v eb a c t e r i ah a ss t r o n ga d a p t a t i o nt ot e m p e r a t u r e ，w i t ha h i g h e rb i o d e g r a d i n gr a t eo fc o d c ru pt o7 5 9 5 w h e nt h et e m p e r a t u r ei s b e l o w2 0 ，t h ec o d e rb i o d e g r a d i n gr a t eo fo r i g i n a lb a c t e r i ad e c l i n e s o b v i o u s l y , t i l l5 0 a t5 c t h eo p t i m u mp hv a l u ei sc o n s i d e r e da s8 ，w h i c hi s s i m i l a rt ot h er e a lc o n d i t i o n so fp r i n t i n ga n dd y e i n gw a s t ew a t e r t h er e q u e s t o fo r i g i n a lb a c t e r i at op hv a l u ei sh a r s h c a l c i u mi sb e n e f i c i a lt oh i g h - - e f f e c t i v eb a c t e r i ai nt h ed e c o l o r i z a t i o na n d b i o d e g r a d a t i o n c a c 0 3i sf i n a l l yc o n s i d e r e da si t sc a t a l y s t k e y w o r d s h i g h - e f f e c t i v eb a c t e r i a ，p r i n t i n g a n dd y e i n gw a s t ew a t e r , d e c o l o r i z a t i o n ， b i o d e g r a d a t i o n 3 山东大学硕士学位论文：高效菌处理印染废水的研究 高效菌处理印染废水的研究 第一章概述 长期以来，印染工业废水是公认的严重水污染源之一。根据美国c o l o r i n d e x 统计，目l j 世界上币在使用的染料达3 0 0 0 0 多种，年产量约为 8 0 0 - 9 0 0 1 0 3 t ，我国年产量已达1 5 0 1 0 3 t ，位居世界前列。通常，染化 料不能全部与被染纤维作用，估计大约占染化料和纤维总重量的 1 0 - - 1 5 的污染物直接随废水排入环境中。在我国这种现象更为严重， 根据1 9 9 8 年环境公报的数据，目前我国印染工业废水治理率约为8 7 4 ， 治理合格率仅为已有装置处理总量的6 3 。印染工业废水已经成为当前世 界性的废水治理的难点和研究的热点【2 1 【引。 i 1 印染废水的来源及特征 印染废水是指棉、毛、化纤等纺织产品在印染工业加工过程中所排 放的废水2 i 1 4 l 。印染工业加工主要分为前期处理( 包括烧毛、退浆、煮炼、 漂白、丝光等工序) 、染色( 包括染色、皂洗、水洗等工序) 、印花和整理 四部分。各工序水质特性如下： 退浆废水：退浆一般是用化学药剂( 主要为烧碱) 将织物上所带浆料 除去。其废水中含淀粉、海藻胶和羧甲基纤维素、聚乙烯醇等各类浆料， 另外还有润滑剂、防腐剂等，其c o d 、b o d 相当高。 煮炼废水：煮炼一般采用热碱液和肥皂等表面活性剂去除纤维中的棉 蜡、汕脂、果胶等杂质。其废水呈强碱性，深褐色，b o d 、c o d 均很高。 漂白废水：漂白是用次氯酸钠、亚氯酸钠、双氧水等氧化剂氧化去除 棉、麻纤维上的天然色素。其废水含残余漂白剂，污染较轻。 丝光废水：为提高纤维光泽和对染料的吸收，必须将织物浸在浓碱液 山东大学硕士学位论文：高效菌处理印染废水的研究 进行丝光处理，其废水碱性强。 染色废水：该废水中污染物主要有染料、助剂、表面活性剂和微量有 毒物质。染料分予在设计制造时为了在水环境或在光照和有氧化剂的条件 下稳定存在而具有人工合成的复杂的芳香烃分子结构，难于去除。此外， 由于不同纤维原料需不同的染料、助剂和染色方法，且染料上染性能、染 料浓度、规模各不相同，所以染色废水水质变化大，色泽深，可生化性差。 印花废水：印花废水主要来自配色调浆，印花滚筒或筛网的冲洗废水 及印花花柿的水沈和皂洗等。印花废水含染料、助剂、浆料，其c o d 、 b o d 较高。 印染废水中还常带有一些助剂，起促染( 加速染料上染) 或缓染( 延 缓染料上染，使染色更加均匀) 作用。印染助剂包括：中性电解质如n a c i 、 n a 2 s 0 4 等：酸碱调节剂如h c l 、n a o h 或n a 2 c 0 3 ；表面活性剂；膨化剂 如尿素等；胶粘剂如改性淀粉、脲醛树脂、聚乙烯醇等；稳定剂如磷酸盐 等。 印染废水成分复杂，主要是以芳烃和杂环化合物为母体，并带有显色 基团( 如一n = n 一、- - n = o ) 及极性基团( 如- - s 0 3 n a 、- - o h 、一n h 2 ) 。 染料分子中含较多能与水分子形成氢键的- - s 0 3 h 、- - c o o h 、- - o h 基因 如活性染料和中性染料等，染料分子能全溶于废水中；不含或少含一 s 0 3 h 、- - c o o h 、- - o h 等亲水基团的染料分子以疏水性悬浮微粒形式存 在于废水中：含少量亲水基因但分子量很大或完全不含亲水基团的染料分 子，在水中常以胶体形式存在。废水中残存的染料组分即使浓度很低，排 入水体也会造成水体透光率降低，导致水体生态系统的破坏。染料的降解 产物多为联苯胺等一些致癌的芳香类化合物，医学科学己证明：8 0 9 0 的癌症与环境因子有关，而已发现的致癌物中十之八、九是有毒有机化 合物。德国在发现部分以芳香胺为基础的偶氮染料用于印染织物会对人体 山东大学硕士学位论文：高效菌处理印染废水的研究 产生不利影响后已禁止使用和进口这些偶氮染料，印度也准备禁止类似偶 氮染料的生产和使用【6 1 【8 】。 总之，印染工业废水具有排放量大，成分复杂，水质变化大，色度深， 毒性强，有机物含量高，难降解，并向着抗氧化、抗生物降解方向发展等 特点，给废水处理工艺设计，运行管理等增加了许多困难，已成为我国各 大水域的重要污染源之一。 1 2 印染废水处理技术的研究进展 印染废水处理的突出问题是色度和难降解有机物的去除问题。处理印 染废水常用的方法大致分为三种：化学法、物理化学法和生物法【9 l i ”。 常用的化学处理法有混凝法、化学氧化法和电解法等。通常化学法 对c o d 的去除率和对疏水性染料的脱色率都较高，可以达到9 0 以上， 但对亲水性染料的脱色效果较低，且处理成本高，不适合大流量废水的处 理。其中混凝法需随水质变化而改变投药条件，对c o d 去除较低，生成 大量的泥渣且脱水处理困难。 常用的物化技术有吸附脱色技术、混凝沉淀技术、臭氧漂白或氯漂 白的化学氧化技术、合成吸附树脂的离子交换技术、超滤膜脱色技术、光 催化技术、高压脉冲电解技术等。物化方法虽然比较有效，但处理费用昂 贵。适应性有限，易产生大量难处理的污泥。 常用的生物处理方法有好氧处理，厌氧处理和好氧厌氧处理三种，其 中又以好氧处理与厌氧好氧处理为主1 1 5 l 。研究发现，染料仅在厌氧条 件下能被不完全降解，但易生成苯胺等有毒及致癌物质；i ：多染料在好氧 条件下属于难降解物质，厌氧预处理增加了好氧段的可生物降解性。印染 废水中的大部分有机物是可以生物降解的，即使是苯环结构，也能被诺卡 氏菌、环形小球菌等分解为有机酸，最终氧化为c 0 2 和h 2 0 。但是对于 山东大学硕士学位论文：高效菌处理印染废水的研究 含碱性染料和含蒽醌结构显色基团的印染废水生物处理法的脱色率却不 高，仅为5 0 左右【1 6 】【1 8 i 。 生物降解不仅是有机化合物在自然界中去除转化的重要途径，而且也 是化合物在自然界中再循环的重要方式。生物法以其处理费用低、二次污 染物排放少等优点成为目前国内外印染废水处理领域中最重要、最普遍利 片j 的方法。当i j 生物法发展的关键是增加处理系统中的生物量，强化生物 量对某一特定环境或特殊污染物的反应。投菌法，即针对所要去除的污染 物质，向生物处理系统中投加从自然界中筛选并经特殊培养的高效菌种， 对该污染物进行有效降解的方法，作为一种经济有效的生物处理方法，在 美囤、德国、= | 本、中国等国已被采用【。8 卜【2 0 l 。 1 3 微生物对印染废水的脱色降解机理及影响因素 所有染料的一个共同特点是具有不饱和结构的发色基团2 1 l1 2 4 i ，该基 团引入共轭体系后，能参与共轭作用，使共轭体系中j r 电子流动性增加， 分子激发能降低，缩小了电子出非键轨道或一成键轨道跃迁至一+ 反键轨 道的能量，化合物的吸收波长向长波方向转移，导致颜色加深。主要的发 色基团有偶氮基，亚硝基，硝基，氧化偶氮基，硫代羰基等。 染料分子中的助色基团的特点是含有未共用电子对的原子，作用原理 与发色基团类似。主要助色基团有- - o h ，一n h 2 ，- - n h r ，一h r 2 等。 生物法脱色降解的机理是利用微生物酶来氧化或还原染料分子，破坏 其不饱和键及发色基团。降解微生物对染料具有专一性，其降解过程分两 阶段完成：第一阶段为污染物向底泥絮凝、沉降、迁移、富集阶段；第二 阶段为微生物降解阶段。微生物降解又分为两步：一是染料分子吸附到菌 体上，部分透过细胞膜进入细胞体内；二是利用微生物产生的酶催化氧化 还原染料分子，破坏不饱和共轭体系，达到去色的目的，中问产物进一步 山东大学硕士学位论文：高效菌处理印染废水的研究 氧化还原分解并最终分解为c 吼和水或转化为细菌所需的营养物质，组成 新的原生质。 参与微生物降解染料的酶主要有3 类：对偶氮还原酶。偶氮染料降 解的关键是在厌氧条件下，经对偶氮还原酶的催化，偶氮键还原断裂形成 无色的芳香胺，在有氧条件下芳香胺脱氨生成酚类化合物，经丌环而完全 矿化。胞外过氧化物酶系。主要包括两大类：木质素过氧化物酶( 以藜 芦醇作为电子递体) 和m n - - 过氧化物酶( 以m n 2 + 作为中问递体) 。含苯 环染料的降解过程为：脱去苯环上的取代基、醌的形成、羟基化、甲基化， 再形成醌、接着发生脱甲基反应形成醌，再羟基化，最终发生苯环丌环反 应。其中两种酶与过氧化氢作用产生的羟基自由基在降解过程中起着重要 作用。链霉菌过氧化物酶。该酶属于血红素过氧化物酶，与m n 一过氧 化物酶的专一性和作用底物类型基本一致，该酶在缺乏过氧化氢的情况下 不能使染料脱色，而且其脱色过程被k c n 所抑制。 染料的生物可降解性与染料的结构有关。偶氮染料的生物降解性主要 与苯环上的取代基的性质、数目、位置及染料的分子量有关。羟基、氨基 和胺基等促进偶氮染料的生物降解，而甲氧基、磺酸基、硝基、甲基和羧 基等基团可抑制偶氮染料的生物降解性；含羧基的偶氮染料其脱色率顺序 为邻位 问位 对位，而含羟基和磺酸基的偶氮染料其脱色顺序为对位 问位 邻位，含硝基的偶氮染料其脱色率不受硝基位置的影响：在染料分 子结构基本相似的情况下，通常分子量越大越不易降解；即使是细微的结 构差别也会明显影响可降解性，这些差别包括空划结构，电子分布与电子 云密度等。 环境中的p h 值、温度、含碳量和含氮量都会对染料降解效果产生影 响。不同的菌种对条件的要求不同。无论真菌还是细菌对温度的要求都较 宽，一般在3 0 。c 情况下均可以。染料浓度剥降解性能也有一定的影响， 山东大学硕士学位论文；高效菌处理印染废水的研究 一般染料浓度越高，毒性越大，越能抑制微生物的活性。 1 4 降解印染废水的微生物种类 目前发现对印染废水有降解能力的微生物有真菌、细菌、藻类等。 已有报道发现f 2 5 】【3 0 1 ，对染料具有脱色降解能力的真菌有白腐真菌 p h a n e r o c h a e t ec h r y s 0 5 p o r i u m 、真菌m y r o t h e c i u mv e r r u c a r i a 、真菌c o r i o l u s v e r s i d o l o r 、真菌f 2 9 ( 未鉴定) 等。其中研究和讨论最多的为白腐真菌， 它在好氧条件下对染料具有广谱的脱色和降解能力，较典型的有：黄孢原 毛平革菌p h a n e r o c h a e t ec h r y s o s p o r i u m 、t r a m e t e sh i r s u t a 、z v e r s i c o l o r 、 b j e r k a n d e r as p 、p l e u t r o t u so s l r e a l u s 、p l e u r p t u s o s t r e a t u s 、c o r i o l u s v e r s i c o l o r 、p y c n o p o r o r u sc i n n a b a r i n u s 等。其培养温度一般在3 0 。c ，培养 p h 值为4 5 5 0 之涮，分子氧含量要求为高含氧环境，抑制性物质主要 有硫脲、叠氮化钠、氰化物等。白腐真菌生物技术将在难降解高分子有机 物的处理上具有广泛的应用前景，实用的反应器设计制造、处理系统的有 效控制、使用特殊填料极大地提高处理系统中的生物量以克服真菌生长速 度相对较慢等问题的解决已成为当务之急。 许多细菌对染料具有很好的降解效果【“】0 8 1 。已有研究发现，对染料 具有脱色降解能力的细菌有细菌b a c i l l u ss u b r i l i si f o3 0 0 2 、细菌k l e b s i e l l a p s e u m o n i n er s 一1 2 、细菌k l e b s i e l l ap n e u m o m i a er s 一1 3 、细菌 p s e u d o m o n a s l u t e o l a 、细菌s t r a i ns 5 ( 未鉴定) 、细菌a c e t o b a c t e r 砌u e f a c i e n s s 一1 、细菌s t r e p t o m y c e ss p p 、细菌s p h i n g o m o n a s s p b n 6 、细菌p s e 4 ( 假 单胞菌属) 、细菌p s e 9 ( 假单胞菌属) 等。 藻类降解染料主要取决于三个方面f 3 1 1 【3 3 】：一是染料的结构特征；二 是藻类的生理生化特性：三是环境因素。已有研究发现，藻类cv “l f a r i e s 剥1 0 种偶氮染料有5 0 以上的降解效果，藻类o s c i l l a t e r i at e n n i s 对偶氮 9 山东大学硕士学位论文：高效菌处理印染废水的研究 染料也有部分去除效果：藻类还能将偶氮染料分解出的芳香胺等物质进一 步降解为简单化合物或二氧化碳，从而提高了染料降解的矿化度。 ( 山东大学硕士学位论文：高效菌处理印染废水的研究 第二章研究的意义和内容 近年来【l i 4 1 ，由于化学纤维织物的发展，仿真丝的兴起和印染的整理 技术的进步，印染废水中水溶性染料和化学浆料的数量和种类不断增加， 花色繁多，结构复杂，目大多具有潜在毒性的特征，一些难生化降解的有 机物如p v a 染料、人造丝碱解物等也大量进入印染废水，使其c o d 浓度 出原来的数百m g l 上升到2 0 0 0 3 0 0 0 m g l ，且b o d s c o d 。，比值很低， 可生化性极差，使传统的生物处理工艺受到了严重的挑战，其系统c o d 去除率从7 0 左右下降到5 0 左右，甚至更低。因此筛选高效降解菌、 使用并构建具有降解能力和絮凝活性的菌株，有目的地控制坏境条件，使 染料降解微生物在环境中成为优势，从而扩大其对污染物的降解范围，使 降解、絮凝和脱色能在短时间内完成，以提高处理效率，降低成本，增强 其净化环境的作用，已经成为当前生物法发展的关键，具有十分重要的现 实意义。 本课题的主要研究内容与方法如下： 取实际印染废水与自配染料溶液为目标降解底物，配制培养基，经过 多次菌种分离纯化，筛选出具有良好降解脱色能力的单菌。 对优选出的单菌进行菌组优化组合实验，经过多次菌种配伍，筛选出 高效印染废水降解脱色菌组，并进行条件实验，确定高效菌组的最优 降解条件。 应用优选出的高效菌组对元首针织厂印染废水进行实验室挂摸、处理 研究，并与元首针织厂原有微生物处理系统进行对照实验，长期连续 运行，检测水质变化情况，比较实际处理效果，确定运行参数。 设计环境压力选择实验，通过比较高效菌处理系统与元首原有微生物 处理系统对印染废水的脱色降解效果，确定实际高效菌处理系统的促 进剂。 i l 山东大学硕士学位论文：高效菌处理印染废水的研究 第三章高效脱色降解菌的筛选分离与降解特性研究 3 1 高效印染废水脱色降解菌的单菌筛选与分离 3 1 1 实验材料与方法 3 1 1 1 主要实验仪器与基本培养基 主要实验仪器：高压蒸汽灭菌锅( l d i s - - 4 0 b i 型：上海蜂安医疗器 械厂) ：电热恒温台式干燥箱；全温振荡培养箱( h z q f 1 6 0 型：上海医 疗器械厂) ；生物振荡摇床；台式离心机( t j l - 一1 6 g 型：上海医疗器械 厂) ；电子显影仪( g e l d o c l 0 0 0 型w h i t el i g h ts o u r c e ：b i o - - r a d 公司) ； f 乜子分析天平( t g 3 2 8 b 型：上海天平仪器厂) 、恒温磁力搅拌器( 8 l 一2 型：重庆医疗器械厂) ；紫外一可见光分光光度计( 7 5 6 m c 型：上海第三 分析仪器厂) ；移液枪、培养皿若干。 基本培养基：培养基l b ( 胰蛋白胨1 0 、酵母粉o 5 、n a c i1 0 、 琼脂粉1 5 ) ：培养基w a t ( c a c l 20 1 5 、琼脂粉1 6 ) ；培养基t f ( 胰 蛋白胨1 o 、c 6 h 1 2 0 61 o 、p h = 7 o ) ；培养基c n s t ( k n 0 30 5 l 、 n a 2 h p 0 4o 2 5 9 l 、m g s 0 4 7 h 2 01 o g l 、f e c l 3o o l g l ) ：微量元素液 ( 1 0 o ) 。 3 1 1 实验方法 菌种纯化：稀释涂句平板法、平板划线分离法。 菌种筛选：目视观察法、分光光度法。 山东大学硕士学位论文：高效菌处理印染废水的研究 3 1 2 实验方案与设计 3 1 2 1 菌种来源 本实验所需原始菌种分别取自济南第一印染厂和济南元首针织厂的 印染废水、生产车问外地沟流经水、污水处理系统中的二沉池回流活性污 泥，以及济南盖家沟污水处理厂的进水、地沟流经水、二沉池回流活性污 泥，编号情况见表3 一l 。 表3 一l 菌源样品编号 编号 1 # 2 # 3 # 4 # 5 # 6 # 7 # 8 # 9 # 菌种来源 济南一印印染废水 济南一印活性污泥 济南一印地沟排水 济南盖家沟污水处理厂进水 济南盖家沟污水处理厂地沟排水 济南盖家沟污水处理厂活性污泥 济南元首印染废水 济南元首地沟排水 济南元首活性污泥 3 1 2 2 染料选择 疏水性或不溶于水的染料废水的脱色降解问题己基本解决，目前研究 的难点在于许多亲水性或水溶性染料废水的脱色降解。直接耐酸大红4 b s 属于水溶性染料，对纤维素纤维( 棉、麻) 和粘胶纤维具有相当强的亲和 力，耐晒性能优良，色泽鲜明，合成简单，价格低廉，染色方法简便，广 山东大学硕士学位论文：高效菌处理印染废水的研究 泛应用于印染工业加工中，因此选择直接耐酸大红4 b s 作为本实验中选 育高效菌种的底物染料具有普遍的指导意义。 此外，生物脱色受许多因素的影响和制约，其中分子结构的影响尤为 重要。本实验选取的直接耐酸大红4 b s 含有苯环较多，取代基数目较多 且靠近_ n = n 一，共轭体系较长，_ n = n 一的邻位有一0 h 易和_ n = n 一 形成分子内氢键，因此难以脱色，用于筛选高效脱色降解菌具有典型意义。 直接耐酸大红4 b s 分子结构如图3 一l 所示： s 0 3 n a 图3 1直接耐酸大红4 b s 分子结构示意图 颐k 腿e腑了，c o 丫叫s 耳叫 吼，埘9 糊 山东大学硕士学位论文：高效菌处理印染废水的研究 3 1 2 3 实验方案 分别以染料配水和实际印染废水为目标降解物，配制培养基，进行高 效印染废水脱色降解菌的分离筛选，实验流程图见图3 2 。 山东大学硕士学位论文：高效菌处理印染废水的研究 第1 轮初筛r i 增殖培养 第2 次原种斜面i 第1 次原种斜面 笫2 轮初筛 第2 次平板转接 复筛r ，i8 株较优菌种 第1 次平板转接 第2 次平扳分离 图3 2高效印染废水脱色降解菌的分离筛选流程图 第l 1 次平板分离( 稀释涂稚分离法) 根据印染废水降解脱色菌的特性，分别配制培养基1 8 l b 和培养基 w a t 各2 l ，加入2 0 m g l 、1 0 0 m g e 的染料直接耐酸大红4 b s 配水作为 目标降解物，普通实验室环境倒平板2 0 0 个，室温放置l 2 天，检查无 菌且皿盖无冷凝水后备用。培养基营养物质配比见表3 2 。 山东大学硕士学位论文：高效菌处理印染废水的研究 表3 2培养基营养物质配比表 培养基i 8 l b ( 营养型)培养基w a t ( 无营养型) 营养分析碳源、氮源、无机盐无机盐 条什p h = 7 0 、1 2 0 ( 2 高压蒸汽灭菌3 0 分钟 直接耐酸 人红4 b s 2 01 0 02 0l o o 浓度 ( m g l ) 编号l 2 0l 1 0 0w 2 0w 1 0 0 计数( 1 1 1 l ) 5 05 05 05 0 总计( 皿)2 0 0 分别取菌源样品1 # - - 9 # 进行菌液稀释，吸取原液及稀释度为1 0 、 1 0 _ 、1 0 _ 4 菌样稀释液作为接种液，以0 2 m l ( 平板) 的接种量分别接 入e 述配制的固体平板培养基中，以无菌三角玻璃刮刀在培养基表面均匀 涂和，每个稀释度重复三个样，将稀释涂御后的培养基平板倒置于3 0 恒温培养室中观察培养卜2 天，分离出能够脱色降解染料配水的高效菌。 第1 一1 次接种实验方案见表3 3 。 山东大学硕士学位论文：高效菌处理印染废水的研究 表3 3第1 1 次接种实验方案 培养基l 2 0培养基l 1 0 0培养基w 2 0培养基w 1 0 0 接种样品l # 、2 # 、3 # 、4 # 、5 # 、6 # 、7 # 、8 # 、9 # ( 9 ) 接 w 2 0 0w 1 0 0 一o 原液 种l 2 0 2l 1 0 0 一2 稀释 方l 2 0 4l 1 0 0 一4 w 2 0 lw 1 0 0 l 式 8 重复 3 总计( 皿)= 2 1 6 第1 2 次平板分离( 稀释涂布分离法) 根据印染废水降解脱色菌的特性，分别配制培养基i 8 l b 和培养基 w a t ( 琼脂粉加倍3 0 ) 各6 0 0 m l ，按照1 ：l 的体积比加入实际印染 废水l # 、3 # 、7 # 、8 # 作为目标降解物，普通实验室环境倒平板1 2 0 个， 室温放置l 一2 天，检查无菌且皿盖无冷凝水后备用。 分别取菌源样品2 # 、4 # 、5 # 、6 # 、9 # 进行菌液稀释，吸取原液及稀 释度为l o 3 的菌样稀释液作为接种液，进行稀释涂布分离，每个稀释度重 复三个样，倒置培养基平板于3 0 c 恒温培养室中观察培养卜2 天，分离 出能够脱色降解实际印染废水的高效菌。第1 2 次接种实验方案见表3 - - 4 。 山东大学硕士学位论文：高效菌处理印染废水的研究 表3 4第1 2 次接种实验方案 培养基| 8 l b ( 营养型)培养基w a t ( 无营养型) 目标降解物 l # 、3 # 、7 # 、8 # ( x 4 ) 接种样品 2 # 、4 # 、5 # 、6 群、9 # ( x 5 ) 接种方式 稀释l o 3原液l o o l 目标降解物接种样晶号3w 目标降解物接种样晶号一o 编号 ( 1 )( 1 ) 重复 3 总计( 皿) 1 2 0 第一次平板转接 根据第1 1 次、第l 一2 次平板分离培养结果，用无菌牙签挑取长势 优良的菌种，点接到与原培养基营养成分相同的新平板培养基上，每板均 分3 0 格，每格点接一次，每种形态相同的菌株点接3 4 次，共接3 3 0 株， 室温观察培养l 一2 天，用记号笔在平板底面圈出优选菌。 第二次平板分离( 平板划线分离法) 根据第一次平板分离优选出的菌落特征，分别配制6 0 0 m l c n s t 和 2 0 0 m l l b 作为第二次平板分离的基本培养基。为进一步探索第一次选育菌 种的营养来源，无菌室内配制含有多种营养搭配组合的染料培养基，k o h 调p h = 7 0 ，倒平板4 0 个，无菌室内放置l 一2 天，检查皿盖无冷凝水后 备用。用无菌接种环将第一次转接后用记号笔圈出的菌株挑取到组合营养 基上，“之”字划线接种，每板接种6 株菌，共接2 1 6 株，无菌3 0 。c 恒温 培养箱中观察培养1 2 天。配制组合营养基实验方案见表3 5 。 9 山东大学硕士学位论文：高效菌处理印染废水的研究 表3 5组合营养基配制方案 编号 组 成 浓度营养分析 c n s t ( 无k n 0 3 ) c 6 h 1 2 0 6 0 1 有碳源，无氮源、 c 1 染料 1 0 0 m l仅染料提供 琼脂 1 5 c n s t c 2染芈爿 l o o f f i l 无碳源，仅染料提供 琼脂 1 5 c n s t c 6 h 1 2 0 60 1 有碳、氮源， c 3 染料 1 0 0 m l同时染料提供， 琼脂 1 5 增殖培养 根据第二次平板分离的实验结果，优选长势旺盛并且形态典型的2 0 株菌，无菌室内分别配制液体真菌培养基t f3 0 0 m l 和液体细菌培养基l b 7 0 0 m l ，用无菌接种坏分别接种到盛有相应培养基的锥形瓶中，瓶口塞好 棉塞，扎紧牛皮纸，置3 0 + ( 3 恒温无菌培养室，摇床培养2 天。 第一轮初筛 分别将增殖培养的细菌菌体移入塑料离心管，转速4 0 0 0 5 0 0 0 r m i n ， 控温4 ，离心1 5 r a i n ，置电子天平分别称量菌体湿重，按最小菌体量配 成相同浓度的菌体溶液2 8 7 m g m l 。将全部真菌菌体和用移液枪准确吸取 各5 m l 的细菌菌液，分别注入盛有l l 浓度为1 0 0 m g l 染料直接耐酸大红 4 b s 的烧杯中，在不添加任何营养的条件下，均匀曝气2 天，分别测量最 山东大学硕士学位论文：高效菌处理印染废水的研究 大吸收波峰波长5 0 6 n m ( 吸收扫描谱图见附录) 下的吸光度，脱色率( r ) 由测定处理前后溶液的吸光度计算，即r = 1 一( a “a ) 1 0 0 ，根据 菌种脱色情况，优选良菌，并验证实验方案的可行性。 第二次平板转接及原种斜面培养 无菌室内分别配制真菌培养基t f3 0 0 m l 、细菌培养基l b5 0 0 m l ，倒 培养基平板t f 4 个、培养基平板l b l 0 个，倒培养基斜面t f l 0 支、培养 基斜面l b 4 0 支。根据第二次平板分离的实验结果，扩大优选菌株范围， 挑驳4 4 株菌分别“之”字划线转接到相应的培养基上。无菌3 0 。c 恒温培 养箱中观察培养，2 天后进行第二次原种斜面，4 c 冰箱保臧备用。 第二轮初筛 在第一轮初筛结果论证本实验方案可行的基础上，将第二次原种斜面 培养的4 4 株菌分别全部投人盛有1 l 浓度为1 0 0 m g l 染料直接耐酸大红 4 b s 的烧杯中，在每个投细菌的烧杯中注入1 1 0 l b8 0 m l ，每个投霉菌的 烧杯中注入1 1 0 t f8 0 m l ，每个烧杯均投放一根咖1 0 0 x1 0 0m m 2 弹性填料， 曝气方式、测量计算方法同第一轮初筛。 复筛 将两次初筛获得的2 3 株较优菌种在与第二轮初筛相同的实验条件及 操作步骤下，根据相同的计算方法进行高效脱色降解单菌的复筛，并进行 脱色率( r ) 的最终排序。 3 1 3 实验结果与讨论 3 1 3 1 第一次平板分离实验结果 经过第1 一1 次、第1 2 次平板分离与第一次平板转接，共得到3 3 0 山东大学硕士学位论文：高效菌处理印染废水的研究 个长势旺盛且性状特征明显的单菌落，4 8 h 后在电子显影仪上观察平板培 养基上的菌落形态与菌体生长量，结果见表3 6 。 表3 6第一次平板分离实验结果 山东大学硕士学位论文：高效菌处理印染废水的研究 尽管第一次平板分离过程中所使用的基本培养基l b 和w a t 均为细 菌营养基，但从显影仪上观察到的菌落特征可以初步鉴定，得到的3 3 0 个 单菌落大致可以分为两类：一类是外表光滑的细菌，另一类则是外表呈绒 毛状的真菌。由此可见，培养基中添加的底物染料直接耐酸大红4 b s 和实际印染废水是这些真菌生长繁殖所需要的主要营养源，即该类真菌具 有在此污染环境中生长繁殖的优势，是印染废水脱色降解的较优菌种。 以上优选出的单菌落在性状上具有一定的相同点：菌落面积较大，数 量较多，说明均能适应染料配水和印染废水的污染环境，具有生长优势； 菌落周围培养基均出现透明圈，在显影仪上亮度较高，说明均已对目标降 解染料实现了脱色降解；菌落颜色均不同程度上呈现红色，即染料直接耐 酸大红4 b s 的颜色，且随培养时间的延长菌落红色逐渐变浅直至接近菌 落本色，说明这些菌落均对目标降解染料具有相当的吸附能力，并可在吸 附之后继续脱色降解，这可能是由于染料的降解- - g g 分是山具有脱色降解 山东大学硕士学位论文；高效菌处理印染废水的研究 能力的胞内酶实现的，染料或者先被菌膜吸附，并在菌膜上被过氧化物酶 系降解，或透过细胞膜扩散到细胞内，由胞内的酶系统分解。 3 1 3 2 第二次平板分离实验结果 经过第二次平板划线分离及4 8 h 培养观察后，共得到5 6 个长势旺盛 且性状特征明显的单菌落，其中l o 株真菌，4 6 株细菌，在电子显影仪上 观察平板培养基上的菌落形态与菌体生长量，结果见表3 7 。 表3 7第二次平板分离实验结果 从真菌的性状特征初步认定可能为白腐真菌( p h a n e r o c h a e t e c h r y s o s p o r i u m ) 【3 4 】。该真菌在印染废水治理中具有其他微生物特别是细菌 所不具备的优点：染料的结构共性是以苯环为核心的稠环、杂环分子，与 其天然降解底物木质素在结构上相似；专一性较差，与被降解对象的 关系并非是酶与底物的一一对应关系，而是与一类乃至于多类底物的关 系，使其具有适用于降解组份复杂的混合染料废水的优点；降解酶系统存 在于细胞外，具有高效降解活性，有毒污染物不必先进入细胞再代谢，可 避免对细胞的毒害，能适应并降解浓度高、毒性强的印染废水。 2 4 山东大学硕士学位论文：高效菌处理印染废水的研究 尽管第二次平板划线分离的培养基在碳、氮等必需营养成分的来源上 进行了不同的搭配组合，但从培养观察的结果来看，菌落的生长情况并未 依培养基营养来源的不同而呈现明显不同，说明染料完全能够满足筛选菌 种生氏繁殖的各种营养必需，进一步证明了优选菌种对染料的良好的适应 能力与降解能力。 3 1 3 3 第一轮初筛结果 通过测量培养4 8 h 后的脱色率( r ) ，经第一轮初筛，获得8 株相对 高效的印染废水脱色降解菌，结果见表3 8 。 表3 8第一轮初筛结果 菌号脱色率r ( )高效菌 菌号脱色率r ( )高效曲 1 4 05 2 5 4 _ 6 85 6 3+ l 一5 4 8 64 74 7 9 1 75 8 7+ “4 8 “5 6 7+ l 1 06 2 1+ 4 一l o 。 6 4 2+ 2 一l 5 1 35 1 04 8 8 2 7 5 6 7+6 75 3 9 2 一l o 5 5 46 95 0 4 3 56 0 8+7 3 。6 8 8+ 3 一1 0 4 4 28 25 1 3 4 5 44 9 6 争一85 4 1 注：“+ ”初筛为较优菌种；标注“”；真菌：无标注：细菌 由实验结果可知，2 0 株菌种的4 8 h 脱色率基本维持在5 0 6 0 左右， 表现出一定的规律性，说明选取的菌种具有水平大致相当的脱色降解优 势，本次筛选分离印染废水脱色降解高效菌的实验方案可行。 2 5 山东大学硕士学位论文：高效菌处理印染废水的研究 3 1 3 4 第二轮初筛结果 通过测量培养4 8 h 后的脱色率( r ) 。经第二轮初筛，获得2 0 株相对 商效的印染废水脱色降解菌，结果见表3 9 。 表3 9第二轮初筛结果 曲号脱色率r ( )高效菌曲号脱色率r ( )高效菌 1 7 6 9 9+ ” 3 一1 2 6 2 9+ l 一8 5 8 0+3 一1 55 1 1 l 一9 4 7 64 l4 3 2 l 1 06 8 6+4 24 1 1 2 一l 4 6 74 3 4 1 1 2 26 47+ 4 一1 0 “4 7 0 5+ 2 34 8 4 5 一l 5 3 0 2 45 7 9+5 26 1 8+ 2 56 7 2+5 34 7 9 2 64 7 96 8 6 3 2+ 2 86 0 9+6 95 0 0 2 94 8 26 1 56 3 5+ 3 一i 5 8 9+7 2 5 4 7 3 25 2 17 3 8 8 0 6+ 3 3 6 1 9+7 4 “7 3 2+ 3 45 0 57 94 8 2 3 56 7 9+8 24 2 6 3 65 2 68 3 “6 4 2+ 3 74 2 1 8 4 “7 3 0+ 3 84 7 48 一1 06 2 3+ 3 94 5