（材料学专业论文）超分子组装非病毒基因载体及其仿生特性的研究.pdf

浙江大学博士学位论文 摘要 摘要 现代基因技术和人类基因组工程图谱的完成为采用基因分子生物学方法治 疗各类疾病，提高人类生命质量提供了广阔的前景。基因治疗的研究已经深入医 学研究的各个领域，成为当今最活跃的生物高技术领域之一。采用超分子组装技 术制备的非病毒基因传递体系，由于具有合适的纳米尺寸、可控的结构及良好的 生物相容性，显示出巨大的发展潜力及应用前景。如何提高非病毒基因载体在体 内的稳定传递和高效转染是这类传递体系所需解决的关键的科学问题。病毒是由 蛋白质壳层所包被的具有核壳结构的天然超分予组装体，其细胞外稳定存在、细 胞内解组装响应并高效转染的特点为非病毒基因传递体系的设计提供了很好的 启迪。本论文以构建稳定传递和高效转染的非病毒基因传递体系为研究背景，采 用超分子组装技术与基因技术相结合，制备了模拟病毒结构特点的非病毒基因超 分子组装体，初步探讨了超分子组装体的结构与基因转染效率的内在联系。 聚乙烯亚胺( p e l ) 具有的“质子海绵效应”有利于其从溶酶体中逃离出来， 是目前常用的一类非病毒基因载体。但p e i d n a 组装体在生理盐溶液中不稳定、 易聚集，制备p e g 化的基因超分子组装体可解决上述问题。本文首先通过含p e g 链段的两亲聚合物的自组织共混改性，采用超分子技术构建了基于疏水作用力的 新型p e g 化基因超分子组装体。胆固醇一聚乙二醇( c p e g ) 的加入用量及次序 对基因超分子组装体在生理盐溶液中的稳定性产生很大影响。将c p e g 与p e l 2 5 k 的 混合溶液加入到等体积的d n a 溶液中，制备的p e l 2 5 k c p e g d n a 组装体在生理盐 溶液中的稳定性得到很大提高；而在p e l 2 5 k d n a 组装体形成之后，再加入c p e g 则不能提高其稳定性。这一现象显示新型p e g 化基因组装体的形成，与疏水胆固 醇参与到疏水核( 由p e l 2 5 k 和d n a 静电中和形成) 的组装密切相关。研究进一步 采用以表达绿色荧光蛋白的质粒p e g f p 为模型，将制备的基因超分子组装体在生 理盐溶液中放置不同的时间，并转染h e k 2 9 3 t 细胞。荧光显微镜及流式细胞仪 结果表明：随着放置时间的延长，p e l 2 5 k d n a 组装体的转染效率显著降低；而通 过c p e g 共混改性后的p e l 2 5 f f c p e g d n a 基因组装体由于在生理盐溶液中的稳定 性得到很大提高，合适的粒子尺寸使其在体外的基因转染效率显著提高。含p e g 链段两亲分子的自组织共混为制备具有新型的p e g 化基因超分子组装体，提高其 在生理盐溶液中的稳定性及基因转染效率，提供了简单有效的新途径。 浙江大学博士学位论文摘要 针对基因载体与d n a 分子在传递过程中的稳定缔合和在细胞内的解离释放 这一对矛盾，本研究依据病毒的蛋白质壳层细胞内外响应传递的特点，开展了生 物响应型非病毒基因传递体系的研究。研究利用细胞内高浓度谷胱甘肽对s s - 键的响应特性，由低分子量p e l l 啪出发，通过与二甲基3 ，3 二硫代- 双( 丙亚氨 酸酯) 二氯化氢( d t b p ) 的交联反应，合成了一系列含- s - s - 键的交联聚乙烯亚 胺( c l p e i ) ，通过对交联程度和组装条件的调控，成功制备了谷胱甘肽响应的 c l p e l 5 0 d n a 基因超分子组装体。实验结果表明：c l p e i s o 具有最佳的缔合d n a 分子的能力，并在p h 值为7 4 到5 的范围内，依然具有足够的质子缓冲能力，有 利于基因超分子组装体从溶酶体中逃离出来。在p h 为6 0 、n a c i 浓度为2 0m m 的 条件下，能与d n a 形成直径在1 5 0n n l 左右的球形粒子。在模拟细胞内谷胱甘肽 浓度的条件下，c l p e l 5 似分子中s s 键的断裂导致高分子量聚阳离子转变为低分 子量片断，实现组装体的解组装响应。体外细胞培养结果表明：这种仿生交联的 基因组装体可显著降低细胞毒性，并有效转染细胞。 为进一步增强基因超分子组装体的稳定性和转染效率，研究以病毒组装过程 中生物大分子交联的“笼状”结构为启示，开展了“笼状”仿生交联组装体的研 究。合成了含巯基的聚乙烯亚胺( h s p e i ) ，与d n a 组装后，分别通过空气中 巯基的氧化交联制备壳层原位交联的基因超分子组装体；通过金纳米粒子 ( a u n p ) 与巯基的共价缔合，制备壳层纳米金交联的组装体。荧光光谱测定结 果表明：在n p 值为l o 的条件下，巯基化聚乙烯亚胺( h s p e i ) 能有效诱导 d n a 分子的缔合。在p h 为6 0 、n a c i 浓度为2 0 m m 的h e p e s 缓冲溶液中，这 种壳层交联的组装体的尺寸在1 5 0n m 左右。对于壳层a u n p 交联的 a u - s p e i d n a 组装体，由t e m 图片我们可清晰观察到壳层金纳米粒子的存在， 且随着a u n p 加入量的增加，壳层交联的金纳米粒子含量也显著增加。与壳层未 交联的基因超分子组装体相比，壳层交联的“笼状”结构可有效提高组装体在生 理盐溶液中的稳定性，并显示出很好的谷胱甘肽响应特性。体外细胞培养结果表 明：通过选择合适的组装条件，仿生交联的“笼状”非病毒基因传递体系可有效 转染。 采用超分子组装技术构建仿病毒基因传递体系，使其既具备非病毒载体的低 毒性、低免疫原性的特点，又具有病毒载体高效转染的特性，将是未来基因传递 体系的发展方向。本论文采用超分子组装手段，通过含p e g 链段两亲聚合物的 浙江大学博士学位论文摘要 自组织共混改性，制备了新型p e g 化基因超分子组装体；利用谷胱甘肽的生物 开关效应，设计了含二硫键的聚阳离子，制备了细胞内外响应传递的非病毒基因 传递体系；通过制备巯基化聚乙烯亚胺，构建了壳层原位交联和纳米金交联的“笼 状”基因超分子组装体，为新型仿病毒基因传递体系的设计提供了切实可行的途 径，并在基因治疗领域显示出广阔的应用发展前景。 关键词：基因治疗；超分子组装；非病毒基因载体；仿病毒结构；聚乙烯亚胺。 浙江丈学博士论文a b s t r a e t a b s t r a c t t h ed e v e l o p m e n to fg e n et e c h n o l o g ya n dt h ec o m p l e t i o no faw o r k i n gd r a f to f t h eh u m a ng e n o m eh a v em a d et h ec l i n i c a lu s eo fg e n em e d i c i n e sd e f m i t e l yp o s s i b l e g e n et h e r a p yi n v o l v e st h et r e a t m e n to fg e n e t i co ri n f e c t i o u sd i s e a s eb yi n t r o d u c i n g n e wg e n e t i cm a t e r i a lt oa p p r o p r i a t ec e l l s n o n - v i r a lg e n ec o m p l e x e sf a b r i c a t e db y s u p r a m o l e c u l a ra s s e m b l ys h o w e dg r e a tp o t e n t i a li ng e n et h e r a p yd u et ot h es u i t a b l e n a n o m e t e rs i z e ，c o n t r o l l a b l es t r u c l u r ea n de x c e l l e n tb i o c o m p a t i b i l i t y i m p r o v i n gt h e s t a b i l i t ya n dt r a n s f e c t i o ne f f i c i e n c yo fn o n - v i r a lg e n ed e l i v e r ys y s t e m si so n eo ft h e k e yp o i n t s v i r u si sak i n do fn a t u r es u p r a m o l e e u l a ra s s e m b l y , e n c l o s e di n f e c t i v e n u c l e i ca c i di nt h ec a p s i do fp r o t e i n s t h ev i r u sc o u l dk e e ps t a b l ei ne x t r a c e l l u l a r e n v f f o u m e n ta n dd i s - a s s e m b l yo ft h ep r o t e i ns h e l li n s i d et h ec e l l s f o l l o w i n gt h e i u s p i r a t i o no fv i m ls t r u c t u r e , b i o m i m e t i cn o n - v i r a lg e n ed e l i v e r ys y s t e m sw e r e c o n s t r u c t e d t h em i n i o nb e t w e e nt h es t r u c t u r eo fg e n ea s s e m b l ya n dt r a n s f e c t i o n e f f i c i e n c yw a sa l s oe x p l o r e d p o l y e t h y l e n i m i n e ( p e i ) w a sc o m m o nu s e d a sn o n - v i r a lv e c t o rd u et oi t s p r o t o n - s p o n g ee f f e c t b u tt h es t a b i l i t yo fp e l 2 5 k d n ac o m p l e x e sw a sq u i t ep o o ri n p h y s i o l o g i c a lc o n d i t i o n p e c o , l a t e dp o l y p l e x e sw e l ef a b r i c a t e dt os o l v et h ep r o b l e m i nt h i s r e s e a r c h ，p e g y l a t e dg e n ea s s e m b l y w a sf a b r i c a t e d b ya d d i n g t h e p e g - c o n t a i n i n ga m p h i p h i l i cp o l y m e r , s u c ha sp o l y ( e t h y l e n eg l y c 0 1 ) c h o l e s t e r o le t h e r ( c p e g ) i tw a so fi n t e r e s tt of i n dt h ea d d i t i o ns e q u e n c eo fc p e gh a v eg r e a te f f e c to n t h es t a b i l i t ya n dt r a n s f e c t i o ne f f i c i e n c yo f t h eg e n ec o m p l e x e s t h ea d d i t i o no f c p e g i n t op e l 2 s k d n ap o l y p l e x e sh a dn oe f f e c tt oi m p r o v et h es t a b i l i t ya n dt r a n s f e c t i o n e f f i c i e n c y w h e r e a st h ep e l 2 5 k c p e g d n ap o l y p l e x e s ，w h i c hw a sf o r m e db ya d d i n g c p e ga n dp e l 2 5 km i x t u r et ot h ed n as o l u t i o n ，s h o w e de x c e l l e n ta n t i - a g g r e g a t i o n e f f e c ti n p h y s i o l o g i c a l s a l tc o n d i t i o na n de n h a n c e dt r a n s f e c t i o ne f f i c i e n c y t h e i n f l u e n c eo fc p e ga d d i t i o ns e q u e n c eo ns t a b i l i t ym a yb ee x p l a i n e db yt h ep o s s i b i l i t y o fe n t r a p p i n gt h ec p e gi n t op o l y p l e x e s b ya d d i n gc p e ga n dp e l 2 5 km i x t u r et ot h e d n as o l u t i o n , c h a r g e - n e u t r a l i z e d h y d r o p h o b i cc o r e w a sf o r m e dd u et ot h e e l e c t r o s t a t i ca t t r a c t i o nb e t w e e np e l 2 5 ka n dd n a a tt h es a m et i m e ，c h o l e s t e r o lg r o u p w a se n t r a p p e di n t ot h ep o l y p l e x e sd r i v e nb yt h eh y d r o p h o b i ci n t e r a c t i o nb e t w e e nt h e c h o l e s t e r o lg r o u po fc p e ga n dh y d r o p h o b i cc o r e t h ep e gc h a i no nt h es u r f a c e s t e r i c a l l yh i n d e r e dt h ec o m p l e x e sf r o ma p p r o a c h i n ge a c ho t h e rt oi m p r o v et h e i v 浙江大学博士论文 s t a b i l i t yo fp e l 2 y , c p e g d n ac o m p l e x e si np h y s i o l o g i c a ls a l tc o n d i t i o n p e g f pw a s u s e dt oe v a l u a t et h et r a n s f e c t i o ne f f i c i e n c yo fg e n ed e l i v e r y t h ep o l y p l e x e sw e r e p r e p a r e dt oi n c u b a t ef o rap e d o do ft i m e i np h y s i o l o g i c a lc o n d i t i o na n dt h e n t r a n s f e c t e dt oh e k 2 9 3 tc e l l s f l u o r e s c e n c es p e c t r o s c o p ya n df l o we y t o m e t r yw a s u s e dt oe v a l u a t et h et r a n s f e c t i o ne f f i c i e n c y w i t he n h a n c e ds t a b i l i t yi np h y s i o l o g i c a l s a l tc o n c e n t r a t i o n ，p e l 2 5 l 【c p e g p e g f pp o l y p l e x e ss h o w e di m p r o v e dt r a n s f e c t i o n i n c o n c l u s i o n , t h ep e g y l a t e dp o l y p l e x e sc o u l db ec o n s t r u c t e dt oi m p r o v et h es t a b i l i t y a n dt r a n s f e c t i o nb ye n t r a p m e n to fp e g - c o n t a i n i n ga m p h i p h i l i cp o l y m e r i tp r o v i d e da s i m p l ea n df a c i l ea p p r o a c ht op r e p a r et h ep e g y l a t e dp e l y p l e x e s t h ec o n t r a d i c t i o nb e t w e e nt i g h tc o m p l e xf o r m a t i o no u t s i d ec e l l sa n dt h ee a s y d i s s o c i a t i o no f c o m p l e x e si n s i d ec e l l si sab i gc h a l l e n g eo f n o n - v i r a lv e c t o r sr e s e a r c h v i r u sc o u l dk e e ps t a b l ei ne x t r a c e l l u l a re n v i r o n m e n ta n dd i s - a s s e m b l yi n s i d et h ec e l l f o l l o w i n gt h ei n s p i r a t i o n , as e r i e so fc r o s s - l i n k e dp o l y e t h y l e n i m i n e ( c l p e i ) w i l l s s p e c i a l l yd e s i g n e dv i at h ec r o s s l i n k i n gr e a c t i o nb e t w e e nt h el o wm o l e c u l a rw e i g h t p o l y e t h y l e n i m i n e ( p e i i s o o ) a n dd i m e t h y l3 3 - d i t h i o p r o p i o n i m i d a t ed i h y d r o c m o r i d e ( d t b p ) t h ed i s u l f i d eb o n d sc a nb eb r o k e na tt h ei n t r a c e l l u l a rc o n c e n t r a t i o no ft h e r e d u e t i v eg l u t a t h i o n e ( g s h ) b ys e l e c t i n gt h ep r o p e rc o n d i t i o n , g l u t a t h i o n e - s e n s i t i v e g e n ed e l i v e r ys y s t e mw a ss u c c e s s f u l l yf a b r i c a t e d t h er e s u l ti n d i c a t e dt h a tc l p e i s 0 s h o w e db e s td n ac o n d e n s a t i o na b i l i t y a tap hr a n g ef r o m7 4t o5 ，c l p e i s 0 s t i l l p o s s e s s e de f f i c i e n tb u f f e rc a p a c i t y ，w h i c hw a ss u g g e s t e dt oi n c r e a s ee n d o s o m a l r e l e a s eo fd n a c o m p l e x e si n t ot h ec y t o p l a s m a tp hv a l u eo f6 0 a n dn a c i c o n c e n t r a t i o no f 2 0m m ，c l p e i s 0 d d n ap o l y p l e x e sw c r ea b o u t1 5 0n n li nd i a m e t e r t h ep o l y p l e x e sw e r eu n p a c k e dd u et ot h ec l e a v a g eo f t h ed i s u l f i d eb o n d si nc l p e i s 0 a ti n t r a c e l l u l a rg s hc o n c e n t r a t i o n t h i sk i n do fb i o m i m e t i cc r o s s - l i n k i n gg e n ev e c t o r s i g n i f i c a n t l yr e d u c e dt h ec y t o t o x i c i t ya n ds h o w e de f f e c t i v et r a n s f e c t i o n c r o s s - l i n k i n go fp r o t e i nm a c r o m o n o m e r sa c c o m p a n i e st h ea s s e m b l yo fv i r a l p a r t i c l e s ，w h i c hp r o v i d e st h ev i r u s e st h eh i g hs t a b i l i t y i nt h eh o s t f o l l o w i n gt h e i n s p i r a t i o n ，c a g e dp e l y p l e x e sv i ab i o m i m e t i cc r o s s l i n k e rw e r ef a b r i c a t e dt oi m p r o v e t h es t a b i l i t ya n dt r a n s f e c t i o n t h i o l a t e dp e i ( h s p e i ) w a ss y n t h e s i z e da n dt h e n c o m p l e x e dw i t hd n a i ns i t us h e l l c r o s s l i n k i n gp e l y p l e x e sw e r ep r e p a r e db yt h e o x i d a t i o no fs u l p h y d r y li na e r i a lc o n d i t i o n ；a uu a n o p a r t i c l e ( a u n p ) c r o s s - l i n k e d p o l y p l e x e s ( a u s p e i d n a ) w e r ea l s o c o n s t r u c t e d e t h i d i n mb r o m i d e ( e t b r ) e x c l u s i o na s s a yi n d i c a t e dt h a tt h i o l a t e dp e is h o w e ds u f f i c i e n td n ac o n d e n s a t i o n a b i l i t yt op r o t e c tt h eb i o a e t i v i t yo fd n a a tn pr a t i oo f1 0 t h em e a nd i a m e t e ro f 浙江大学博士论文 a b s t r a c t s h e l l c r o s s - l i n k i n gp o l y p l e x e sw a sa b o u t1 5 0n i na tn 伊r a t i oo f1 0 ，p hv a l u eo f 6 0 a n dn a c lc o n c e n t r a t i o no f2 0m m a u n pp a r t i c l e sw e r eo b v i o u s l yo b s e r v e da tt h e s u r f a c e so fa u - s - p e i d n ap o l y p l e x e sb yt e mp i c t u r e s i t sc o n t e n tw a si n c r e a s e d w i t ht h ea d d i t i o nd o s a g eo fa u n ec a g e dp o l y p l e x e si m p r o v e dt h es t a b i l i t yi n p h y s i o l o g i c a l s a l tc o n c e n t r a t i o n , a n ds h o w ng s h s e n s i t i v ep r o p e r t y t h ei n - v i t r o t r a n s f e c t i o ne x p e r i m e n ti n d i c a t e dt h a tb ys e l e c t i n gt h ep r o p e rp r e p a r a t i o nc o n d i t i o n , c a g e dn o n - v i r a lg e n ed e l i v e r ys y s t e m sw e r es u c c e s s f u l l yc o n s t r u c t e dw i t hh i g h s t a b i l i t yi np h y s i o l o g i c a lc o n d i t i o na n dt r a n s f e c t i o ne f f i c i e n c y c o m b i n i n gt h eb e s tc u r r e n to fn o n - v i r a la n dv i r a lv e c t o r s , u n d o u b t e d l yt h e a r t i f i c i a lv i r u sg e n ed e l i v e r ys y s t e m sr e p r e s e n t e dt h ef u t u r eo ft h eg e n ev e c t o rf o r h u m a ng e n et h e r a p y t h i ss t u d yp r o v i d e ds o m ef a c i l ea p p r o a c ht op r e p a r et h e b i o m i m e t i cn o n - v i r a lg e n ed e l i v e r ys y s t e m sb ys u p r a m o l e c u l a ra s s e m b l y i tm a yh a v e g r e a tp o t e n t i a l i nn o n - v i r a l g e n e v e c t o rr e s e a r c ha n da p p l i c a t i o n w i t ht h e d e v e l o p m e n to fe f f e c t i v e ，s a f ea n dt a r g e t i n gg e n ed e l i v e r ys y s t e m s ，g e n et h e r a p yw i l l b cw i d e l yu s e di nc l i n i c ，a n db r i n gm o r eh o p e st oh u m a nb e i n g k e y w o r d s ：g e n et h e r a p y ；s u p r a m o l e c u l a ra s s e m b l y ；n o n - v i r a lv e c t o r , b i o m i m e t i c ； p o l y e t h y l e n i m i n e 浙江大学博士学位论文绪论 第1 章绪论 1 1 课题背景 随着d n a 重组技术为代表的现代分子生物学技术的发展，人类对疾病认识 的不断深入，现代医学及相关研究越来越清楚地证明，多种疾病与基因的结构或 功能改变密切相关。现代基因技术和人类基因组工程图谱的完成为采用基因分子 生物学方法治疗各类疾病，提高人类生命质量提供了广阔的前景。所谓基因治疗 是将人的正常基因或有治疗作用的基因通过一定方式导入人体靶细胞，以纠正基 因的缺陷或者发挥治疗作用，从而达到治疗疾病目的的生物医学新技术1 一。广 义说，基因治疗也可以包括采取基因技术治疗某些疾病的措施和薪技术。基因治 疗主要包括：( 1 ) 基因置换( g o n er e p l a c e m e n t ) ：用正常的基因原位替换病变细胞 内的致病基因，使细胞内的d n a 完全恢复正常状态；( 2 ) 基因修复( g e n e c o r r e c t i o n ) ：将致病基因的突变碱基序列纠正，而正常部分予以保留；( 3 ) 基因 修饰( g e n ea u g m e n t a t i o n ) ：又称基因增补，将目的基因导入病变细胞或其他细胞， 目的基因的表达产物能修饰缺陷细胞的功能或使原有的某些功能得到增强；( 4 ) 基因失活( g e n ei n a c t i v a t i o n ) ：利用反义技术能特异地封闭基因表达特性，抑制一 些有害基因的表达，以达到治疗疾病的目的。如利用反义r n a 、核酸或肽核酸 等抑制一些癌基因的表达，抑制肿瘤细胞的增殖，诱导肿瘤细胞的分化；( 5 ) 免 疫调节( i m m u n ea d j u s t m e n t ) ：将抗体、抗原或细胞因子的基因导入人体内，改变 病人免疫状态，达到预防和治疗疾病的目的。目前，基因治疗的研究已经深入医 学研究的各个领域，成为当今最活跃的生物高技术领域之一。 通常质粒d n a 被引入病人细胞中，表达治疗所需的蛋白质，因此被称为前 体药物( p r o d r u g ) 。质粒d n a 为环型双螺旋结构( 图1 - 1 ) ，尺寸大约为5 0 0 哪。 核酸在水相中传递时，易被核酸酶水解且由于带大量负电荷而不容易被细胞内 吞，在主要器官中只能实现低层次的表达。因此具有高效安全和组织特异性的基 因传递体系的研制成为制约基因治疗发展的瓶颈问题之一1 3 4 1 。随着基因治疗研 究的不断深入，尤其是伴随着基因治疗l 临床试治肿瘤、感染性疾病、遗传性疾病 的广泛开展，人们越来越认识到选择合适的载体，使目的基因靶向、可控并有效 的表达，是基因治疗成功的关键。 浙江大学博士学位论文 绪论 f i g 1 - 1 a f mi m a g e so f ap l a s m i dd n a ( i nt h i sc a s e p b r 3 2 2 ，4 3 6 3 b p ) 目前，用于基因治疗的载体主要有病毒载体( v i r a lv e c t o r ) 和非病毒载体 ( n o n v i r a lv e c t o r ) 。常用的病毒载体有逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、疱疹 病毒等。病毒载体由于充分利用了病毒高度进化所具有的感染和寄生特性，因而 在多数情况下，病毒载体具有较高的转染效率。但目前研究和应用的病毒载体存 在许多不足，如免疫原性高、毒性大、目的基因容量小、靶向特异性差、制备较 复杂及费用较高等，限制了其在f 临床治疗中的应用。特别是1 9 9 8 年美国宾洲大 学人类基因治疗中心发生一例使用腺病毒基因治疗导致死亡的病例后，人们对人 体内使用病毒载体的安全性提出了质疑。 非病毒基因传递体系在基因治疗应用实验中较病毒载体晚，但其研究应用的 历史却比病毒载体要长。目前，常用的非病毒载体包括脂质体和聚合物两类。非 病毒基因载体具有以下优点：( 1 ) 相对安全、易于制造；( 2 ) 对载体大小及核酸 类型限制较小，可以携带的基因从2 0 b p 的寡聚核苷酸到1 0 0 k b p 的质粒d n a ， 甚至更大的d n a ：( 3 ) 免疫原性小，急性毒性小，对受者比较安全；( 4 ) 可以 容易地结合其他物质，使治疗基因的传递具有靶向特异性等。但是不利的生物分 布以及无效的胞内运转，导致活性基因转染率低。 如何提高非病毒基因传递体系的基因转染率成为当前非病毒基因传递体系 研究的热点问题之一【5 。9 】。要获得高转染率的基因传递体系，首先需选择合适的 载体，有效浓缩d n a 分子形成稳定的纳米粒子，保护d n a 分子的生物活性并避 免酶解；能从给药部分转运至靶向点并被靶向细胞有效内吞；在细胞内实现d n a 2 浙江大学博士学位论文绪论 分子的解离释放和表达。总之，治疗基因作用的发挥需要克服基因传递过程的各 种障碍，才能获得较高的转染效率。 1 1 1 基因传递的途径 基因传递的过程中需要克服胞外屏障和胞内屏障。 1 i 1 1胞外屏障 主要是指注射载体后在到达靶细胞之间的影响因素，其中主要包括：调理素 ( o p s i n i n s ，如血清抗体、补体等) 、吞噬系统、胞外基质、降解酶等。其中调理素 能与载体及其靶基因结合从而使基因和载体失活；吞噬系统，如肝和脾中网状内 皮系统( r e t i c u l o - e n d o t h e l i a ls y s t e m , r e s ) 则能捕获、内吞及消化载体系列1 0 】； 胞外基质则指细胞问具有保护靶细胞膜作用的多聚化蛋白和糖类的存在区域，从 而使相对较大的d n a 传递体系难以逾越 1 1 - 1 2 1 ；降解酶则能迅速消化未被保护的 d n a 分子。提高基因传递体系的生物相容性，延长基因传递体系在体内的循环 时间，从而克服上述一系列屏障，基因传递体系才能充分到达靶向细胞。 1 1 1 2 胞内屏障 当基因传递体系到达靶向位后，传递过程如下【1 3 l ：细胞内吞( c e l lu p t a k e ) 、 迷离溶酶体( e s c a p ef r o ml y s o s o m e ) 、基因d n a 解离并进攻细胞核( n u c l e a rt a r g e t i n g e n t r y ) ，其过程如图1 2 所示： f i g 1 - 2 s c h e m a t i cd r a w i n go f d n ad e l i v e r yp a t h w a y sa f t e rc e l lu p t a k e ( 1 ) 细胞内吞 浙江大学博士学位论文绪论 一般大分子缔合体很难通过扩散作用进入细胞膜，而是通过细胞内吞作用。 细胞内吞机理概括为三种：流体相内吞( f l u i d p h a s ee n d o c y t o s i s ) 、吸附内吞 ( a d s o r p t i v ee n d o c y t o s i s ) 、受体介导内吞( r e c e p t o r - m e d i a t e de n d o c y t o s i s ) 。由于细胞 膜表面带负电，带负电的d n a 分子不利于与细胞膜的吸附，通过与载体作用形 成表面带正电荷的基因传递体系，有利于细胞的吸附内吞作用。另外对于特定的 靶向细胞，其细胞膜表面含有很多特定的受体分子，通过在d n a 传递体系中引 入与之相匹配的配体或抗体分子，可提高d n a 传递体系的靶向性，有利于细胞 的受体介导内吞【1 3 】。 ( 2 ) 逃离溶酶体 基因载体缔合体的内吞是一个复杂过程，包括结合、内在化、形成内涵体 ( e n d o s o m e ) 、随后与溶酶体融合。溶酶体中p h 值很低且含有大量核酸酶，易使 d n a 分子水解，基因载体缔合体必须尽快逃离溶酶体，才能提高基因的转染效 率。选用p h 敏感型脂质体、具有“质子海绵效应”的聚乙烯亚胺i 悼1 8 1 、聚酰胺 胺树形聚合物( d e n d r i m e r ) 1 1 9 - 2 1 1 、在组装体中加入抑制溶酶体的药物( 如氯喹) 1 2 2 均可以促进基因传递体系从溶酶体中的逃逸。 ( 3 ) 基因d n a 进攻细胞核 基因载体缔合体逃离溶酶体后，进入细胞液。在胞液中复合物解离、释放 出d n a 并进攻细胞核，从而实现基因的转染。胞浆扩散并跨越核膜是限制基因 传递体系的很大障碍。通过设计带有核定位信号( n l s ) 肽的载体，有利于基因 载体跨越核膜1 2 如5 1 。b e h r 等 2 6 1 把单一的核定位多肽( n l s ) 与一个报告基因共价 结合，使基因的表达提高1 0 0 0 倍。 理想的基因传递体系要求在体内循环中保持稳定，有效到达靶向细胞并被吞 饮，实现在靶向细胞内的高效表达。基因传递体系只有克服上述各种障碍，才能 获得较高的转染效率。 1 1 2 超分子组装构建非病毒基因传递体系 超分子组装体是利用分子间相互作用力( 如亲水，疏水性作用、静电作用、 氢键、金属配位键等) 自组装形成的分子聚集体。超分子组装在自然界中普遍存 在。病毒就是由蛋白质与感染性核酸组装形成的、具有核壳结构的天然超分子 组装体。采用超分子组装手段设计新型的非病毒基因传递体系，提高非病毒基因 4 浙江大学博士学位论文 绪论 载体的转染率成为当前研究的热点之一。 d n a 分子链上含有大量的磷酸根基团，阳离子多聚物或高聚物与d n a 分子 通过静电吸引，组装形成非病毒基因传递体系，可有效诱导d n a 的聚集，使环 状或线形的d n a 分子转变为浓缩颗粒，提高d n a 的化学和物理稳定性，保护 d n a 分子的生物活性，避免酶解；在组装体中引入与靶向细胞特异识别的配体， 可提高基因传递系统的靶向性。这类超分子组装非病毒基因传递体系由于具有合 适的纳米尺寸、可控的结构以及良好的生物相容性，因此在基因治疗中显示出巨 大的发展潜力及应用前景。 常见的非病毒基因载体主要有脂质体、聚合物以及两者的复合。 1 1 2 1 脂质体d n a 超分子组装体 脂质体是具有双层膜的封闭粒子，其介导基因转染已有2 0 多年的历史。介 导基因转染的脂质体有阳离子脂质体、阴离子脂质体、p h 敏感型脂质体。而阳 离子脂质体是目前最常用的脂质体，主要由带电荷的脂类和中性辅助脂类组成。 用于基因转染的阳离子脂类品种很多，目前已有商品化的培养细胞基因转染用的 试剂盒l i p o f e c t i n 面市，由合成的阳离子脂质n - 【1 一( 2 ，3 二油酰氯) 丙基) - n ，n n 一 氯化三甲胺( d o t m a ) 和二油酰基磷酸酰乙醇胺( d o p e ) 以等摩尔比混合而成。 所有阳离子脂类都具有极性胺基和疏水性基团，胺基与d n a 通过静电作用浓缩 d n a ，疏水性基团有利于阳离子脂类自组装形成双层囊泡结构，而中性脂类有 利于基因载体穿透细胞膜屏障。通常形成的脂质体d n a 超分子组装体大小在5 0 n l n 1 | im 。这与基因载体制备过程中脂质体d n a 比例、加入的先后顺序、温度、 超声程度等密切相关1 2 7 1 。r a d l e r 等发现阳离子脂质体并不是将基因包裹在脂质 双分子层中，而是包裹在其脂质与脂质之间形成片层状。l i 等阴将阳离子脂质载 体暴露于小鼠血清中，发现组装体尺寸明显增加且相互聚集，通过复合物表面的 聚7 , -