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河南农业大学学位论文独创性声明、使用授权及知识产权归属承诺书 学位论一种定量分析双歧杆菌的新方法 学位 硕士 文题目 级别 学生 李岳桦 学科导师陈红歌副教授 姓名专业 微生物学 姓名 杨国宇教授 学位论文 如需保密，解密时间年月日 是否保密 独创性声明 本人呈交论文是在导师指导下进行的研究工作及取得研究成果，除了文中 特别加以标注和致谢的地方外，文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成 果，也不包括为获得河南农业大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材 料，指导教师对此进行了审定。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献 均已在论文中做了明确的说明，并表示了谢意。 特此声明。 研姓魏槲导师躲竹z 蝽 日期：弦伊f 月日日期：硝月哕白 学位论文使用授权及知识产权归属承诺 本人完全了解河南农业大学关于保存、使用学位论文的规定，即学生必须 按照学校要求提交学位论文的印刷本和电子版本；学校有权保存提交论文的印 刷本和电子版本，并提供目录检索和阅览服务，可以采用影印、缩印或扫描等 复制手段保存、汇编学位论文。本人同意河南农业大学可以用不同方式在不同 媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。 本人完全了解河南农业大学知识产权保护办法的有关规定，在毕业离 开河南农业大学后，就在校期间从事的科研工作发表的所有论文，第一署名单 位为河南农业大学，试验材料、原始数据、申报的专利等知识产权均归河南农 业大学所有，否则，承担相应的法律责任。 注：保密学位论文在解密后适用于本授权书。 勺_ 季搴 研究生躲擀导师虢秣知孕学院领导虢印建 日期：砂雄e 月) 4 ，日日期乡确辱乡奇吒日期：p 孚年6 月z 7 自 致谢 在我的毕业论文即将完成之际，首先感谢我的两位导师：陈红歌副教授和杨 国宇教授! 这是两位导师三年来辛勤教育和培养的结果。两位导师正直无私、严 于律己的人格魅力，广博而精深的学术造诣，精益求精、务实、创新的工作精神， 高度的工作激情与敬业精神、时时刻刻激励着我不停地奋斗，永远追求卓越、追 求科学的真理! 无论课题的选定、文献的查阅、试验方案的确立、试验的顺利进 展还是论文的撰写，无不凝聚着两位导师巨大的心血和汗水! 两位导师三年来不 但对我的学业上严格要求，工作生活上更是无微不至的关爱，这将是我一生受之 不尽的宝贵财富，也将永远激励着我前进! 我不仅学到了专业知识，更重要的是 从两位导师身上学到了为人处事的道理，他们将引领我走向更有意义的人生! 在 这里，我对我两位导师表示最衷心的感谢! 感谢河南农业大学的贾新成教授、邱立友教授、吴坤教授、宋安东副教授、 刘亮伟副教授、刘新育老师、王明道老师和赵柏叶老师，他们在专业学习、论文 开题、实验过程中都提供了很多好建议和意见，使我排除了不少困难，保证了试 验的顺利进行! 李平副书记、吴建宇副院长在我的学习和生活过程中给予了很多 建议和帮助，对他们的辛勤付出表示真心的感谢! 我还要感谢河南农业大学农业生物技术重点实验室的黄晓书副主任、河南省 疾病预防控制中心的张漾老师，他们为我试验的顺利进行提供了试验仪器和技术 指导，真诚地感谢他们! 感谢张东升、阮森林、黄慧敏、张小强、田建军、王慧琴、王艳颖、冯锋、 陈伟等同学，三年来的共同学习和生活，我们结下了深厚的友谊，他们的支持、 砥砺和帮助我解决了很多学习和技术难题。0 4 级的康静、吕帅、张品品、鲁晓 娟等师姐，0 6 级的张勇伟、吴宗伟、靖梅贞、管宁、刘艳芳等师弟师妹，他们 也给予了我很多的方便和帮助，在此一致表示真心的感谢! 感谢河南农业大学食品科技学院的祝美云副教授对我生活和学习上的关心 与帮助! 感谢我的同学与朋友多年来的帮助，使我顺利度过各种难关，顺利完成 了学业! 他们分担我的忧愁和烦恼，分享我的快乐和喜悦，他们是我人生路上的 一笔宝贵的财富! 感谢所有关心、支持和帮助过我的人! 最后，谨将本论文献给我的爷爷、父母和姐姐，无论求学过程还是工作生活 中，他们不仅物质上给予丰厚的支持，精神上也是一如既往的关爱、教诲、鼓励 和鞭策! 他们为我付出了巨大的奉献和牺牲，谨向他们表示我最衷心的感谢! 李岳桦 一鐾囊儿钲叨日千郸- f i - i 微生物学硕士论文一种定量分析双歧杆菌的新方法 摘要 作为人和温血动物体内最重要的益生菌，双歧杆菌对宿主显示了多方面的促进健康作 用。目前市场上以含有双歧杆菌的混合菌产品居多，而目前对该类产品却没有一个准确的检 测方法。 本文旨在建立一种新的双歧杆菌定量分析技术。论文首先建立了双歧杆菌的培养体系， 两歧双歧杆菌的培养结果显示：b b l 琼脂培养基和t p y 液体培养基对两歧双歧杆菌的培养 效果较好，作为两歧双歧杆菌的培养基。然后进行了双歧杆菌属特征性酶f 6 p p k 测定条件 的优化。试验首先改良了原初文献( s c a r d o v i 法) f 6 p p k 酶活测定中对照反应管的设置，又 对双歧杆菌培养时间、细胞破碎方法、底物浓度、比色波长、反应温度与时间等条件进行了 优化。结果表明，双歧杆菌培养1 8h ，收集菌体，以超声波法破碎细胞制备粗酶液，采用4 的底物浓度，将粗酶液与底物于4 0 保温3 0r a i n ，最终反应物于5 0 0 a m 比色，所得f 6 p p k 酶活测定结果更可靠。 在获得优化的f 6 p p k 酶活力测定条件的基础上，通过培养不同的时间来获取不同数量 的菌体，用厌氧箱法对双歧杆菌进行平板菌落计数，用优化过的酶活测定方法测定f 6 p p k 酶活力，分别建立了两歧双歧杆菌和长双歧杆菌的菌数与酶活力的对应关系的工作曲线。并 用市场上的产品对工作曲线进行了验证，结果与平板计数法的结果一致。证明该方法是一种 可靠的双歧杆菌的定量分析方法。 关键词双歧杆菌；f 6 p p k i 测定条件：定量分析 微生物学硕士论文一种定量分析双歧杆菌的新方法 1 文献综述 1 1 益生菌 益生菌( p r o b i o t i c s ) 的概念最早由l i l l y 于1 9 6 5 年提出的，当时是措对饲养动物肠道 菌平衡有益的促进物或微生物”【l 】。1 9 7 4 年，美国学者p a r k e r 认为“益生菌是维持宿主肠道内 微生物平衡的微生物或物质”团。1 9 8 9 年，英国学者f u l l e r 又一次提出益生菌是“某种或某 一类通过改善宿主肠道菌群平衡，对宿主发挥有益作用的活的微生物饲料添加剂”例。1 9 9 4 年，有入对益生菌的定义又作了修订：“益生菌是含活菌和死菌包括组份和产物的微生物制 剂，供口服或者经由其他粘膜途径投入，旨在粘膜表面处改善微生物和酶的平衡，或刺激特 异性和非特异性免疫机制”【4 】。根据2 0 0 3 年欧洲食品与饲料菌种协会对益生菌所下的定义， 益生菌( p r o b i o t i c s ) 是指当摄入充足的数量后，能对宿主产生一种或多种已论证的功能性健 康益处的活的微生物。联合国粮食与农业组织和世界卫生组织共同定义益生菌是“以适当剂 量服用时对宿主( 人或动物) 健康有益的活体微生物制剂”。国际营养学界普遍认可的定义 是：益生菌系一种对人体有益的细菌，它们可直接作为食品添加剂服用，以维持肠道菌丛的 平衡。目前，在世界范围内，研究者们对益生菌的定义还存在着一定的争议。考虑到各种基 本的影响因素，构成益生菌的条件如下【5 】所示：( 1 ) 对宿主的健康有益；( 2 ) 无毒副作用和 无致病性；( 3 ) 能在消化道存活和相关部位定植；( 4 ) 能适应胃酸和胆盐；( 5 ) 能够产生有 用的酶类和代谢物；( 6 ) 在加工和贮存过程中能保持活性；( 7 ) 具有良好的感官特性。 数据显示，当摄入的活菌数高于1 0 6c f u m l 时，益生菌对人类的健康具有明显的促进作 用 6 - 1 0 】。益生菌对宿主的健康促进作用主要有：作为肠道正常菌群直接参与构建机体的生物 防御屏障；合成多种维生素；促进机体对蛋白质的消化吸收；促进机体对钙、铁、维生素d 的吸收；降低胆固醇、抑制癌症、治疗胃肠疾病；帮助消化、增进食欲等。近年来，越来越 多的益生菌被应用于食品、药品、保健品、以及饲料制剂中，现在用于食品、人畜药品和饲 料中的益生菌主要有：乳酸菌、双歧杆菌、丙酸菌、芽孢杆菌、埃希氏菌属、酵母菌等【l 。 2 0 0 1 年我国卫生部公布了可用于保健食品的益生菌菌种名单：两歧双歧杆菌、婴儿双歧杆菌、 长双歧杆菌、短双歧杆菌、青春双歧杆菌、保加利亚乳杆菌、嗜酸乳杆菌、干酪乳杆菌干酪 亚种、嗜热链球菌等九种1 1 2 1 。 1 2 双歧杆菌的研究历史与现状 双歧杆菌( b i f i d o b a c t e r i u m ) 是法国巴斯德研究所的t i s s i e r 教授于1 8 9 9 年在母乳喂养 的健康婴儿肠道内发现并分离出的一种革兰氏阳性、弯曲和常分叉的杆菌，并将其命名为双 歧杆菌( b a c i l l u sb i f i d u sc o m m u n i s ) 【1 3 1 。当时曾经把双歧杆菌包含在l a c t o b a c i l l u s 属中，被 认为是a c i d o p h i l u s 的变种。1 9 6 9 年m i t s u o k 等将双歧杆菌划分为1 6 个种，1 9 7 4 年伯杰氏 细菌学鉴定手册( 第八版) 国际分类命名为委员会建议设立独立的双歧杆菌属，具体地位为 放线菌门、放线菌纲、双歧杆菌目、双歧杆菌科、双歧杆菌属。 目前已发现的双歧杆菌共有4 1 个种，来源于人类的有1 2 种，模式种是两歧双歧杆菌 2 微生物学硕士论文一种定量分析双歧杆菌的新方法 ( b b i f i d u m ) 。其中两歧双歧杆菌( b b i f i d u m ) 、婴儿双歧杆菌( 占i n f a n t i s ) 、青春双歧杆菌 ( 召a d o l e s c e n t i s ) 、长双歧杆菌( b 1 0 n g u m ) 和短双歧杆菌( b b r e v e ) 等现已广泛用于药品 或含活菌的保健食品、微生态调节剂的生产中。 以1 9 5 7 年为界，双歧杆菌的研究可划分为两个阶段： 第一阶段( 1 8 9 9 1 9 5 7 ) ：由于试验技术和仪器的限制，双歧杆菌在这个阶段没有受到 人们的重视。人们主要研究双歧杆菌的分类、培养与营养作用但，双歧杆菌在营养与对婴儿 的益生作用被夸大了。纯种培养技术还没有取得突破。双歧杆菌包含在l a c t o b a c i l l u s 属中， 曾被认为是l a c i d o p h i l u s 的变种。 第二阶段( 1 9 5 7 至今) ：二十世纪六十年代末七十年代初，由于厌氧微生物的分离和培 养技术的改进，以及大批研究成果的发表，如日本学者光岗对肠道菌群的研究，德国学者 v a i k e rr u s c h 和我国学者康白对微生态学的研究，人们逐渐对肠道中的优势菌种双歧杆菌产 生了极大的兴趣。在这一阶段，双歧杆菌的各方面研究都得到了长足的进展，生化特性( 包 括细胞壁组成、d n a 组成、糖代谢、细胞磷脂成分等) 、生理功能、分类、培养、鉴定、计 数、双歧因子、应用研究等得到了比较深入的研究【1 4 】。 1 3 双歧杆菌的生物学特征 双歧杆菌大小为( 0 5 1 3 ) p m ( 1 5 8 o ) 儿m 。细胞形态多变，尤易受营养条件影 响，不同种或同种不同龄、不同生长环境特别是不同的营养条件下可呈现不同的形态。常呈 y 或v 状分叉，也有棍棒状和匙状。 双歧杆菌为革兰氏阳性、无芽孢、不抗酸、不运动、专性厌氧杆菌。双歧杆菌不形成芽 孢，亚甲基染色茵体着色不规则。对葡萄糖进行异型乳酸发酵，生成l ( + ) 乳酸和乙酸( 摩 尔比为3 ：2 ) ，不产c 0 2 。脱氢酶、过氧化氢酶阴性，不还原硝酸盐，吲哚反应阴性，明胶 液化阴性，联苯胺反应阴性。最适生长温度为3 7 - 4 1 ，最适发酵温度为3 5 - 4 0 ， 最低生长温度为2 5 2 8 1 2 ，最高生长温度为4 3 4 5 ；起始生长p h 值为6 7 7 0 ， 在p h4 5 - 5 0 以下或8 0 8 5 以上的环境中都不生长。g + c m o l 值为5 7 6 6 ，为高g + c 含量的g + 菌。 双歧杆菌广泛存在于人体尤其婴儿小肠的下部和大肠( 结肠) ，小肠上部几乎检测不出， 小肠下部数量可达1 0 3 1 0 5 信，大肠粪便中可达1 0 8 1 0 1 2 儋。此外在口腔和阴道中也有双 歧杆菌栖居。许多种温血动物如鸡、猪、犬、鼠、狼、猴、家兔、牛、羊、马，甚至蜜蜂的 肠道中都有双歧杆菌，并且大都以优势菌群存在。 双歧杆菌在人体内的种类和数量是随着人体的年龄和健康状况呈动态变化的。一般来说 是随着健康情况的恶化和年龄的增长而呈减少趋势b 5 - 1 6 】，所以有人认为双歧杆菌是人体健康 的“雨晴表”，能反映机体的健康状况。不同年龄人体肠道中双歧杆菌种类的变化为：婴儿 期以婴儿双歧杆菌( b i n f a n t i s ) 、短双歧杆菌( b b r e v e ) 、两歧双歧杆菌( b b i f i d u m ) 和长双 歧杆菌( b 1 0 n g u m ) 为主；成年期以青春双歧杆菌( r a d o l e s c e n t i s ) 和长双歧杆菌为主；老 3 微生物学硕士论文 一种定量分析双歧杆菌的新方法 年期以青春双歧杆菌和长双歧杆菌为主，时而也有两歧双歧杆菌。 1 4 双歧杆菌的生物学作用 作为人和温血动物体内的正常生理菌和最重要的益生菌，人们对双歧杆菌的健康保健机 理做了长期的、大量而深入的研究和论证。迄今为止，已有大量的科学证据表明，双歧杆菌 具有维持肠道微生态平衡、营养与促机体生长作用、免疫增强、抗衰老作用、降低血脂和胆 固醇作用、抗肿瘤作用等。 1 4 1 营养与促机体生长作用 1 9 9 7 年德国r o s t o c k 大学的h e i n e 教授证明，7 5 以上双歧杆菌菌体的氮进入婴儿血流 的蛋白池中【1 。丌。双歧杆菌能合成人体所必需的多种维生素如维生素c 、b 2 、b 6 、b 1 2 、叶酸、 烟酸等、氨基酸和蛋白质等，作为营养物质直接向宿主提供，从而促进宿主的生长。双歧杆 菌通过代谢产生的维生素酶、蛋白酶来提高机体对膳食纤维和蛋白质的消化和吸收利用率。 另外，双歧杆菌代谢产生的乙酸和乳酸，能明显提高机体钙、磷、铁等元素的利用率及促进 维生素d 的吸收。 1 4 2 免疫增强 双歧杆菌菌体表面分子能增强机体的非特异性和特异性免疫反应，提高n k 细胞和巨噬 细胞活性，提高局部或全身的抗感染和防御功能。同时双歧杆菌具有诱生n o 的功能，n o 与 各种细胞因子交互作用，调节了c d 4 + t h l 细胞t h 2 细胞间平衡，并影响n o 自身的产生，使 机体的免疫调节水平处于适当的水平【1 引。蓝景刚等1 9 1 给小鼠腹腔注射两歧双歧杆菌后，发 现动物脾脏l a k 、n k 细胞活性，以及腹腔局部巨噬细胞来源的i l 一1 、i l 6 和t n f 等细胞 因子活性增强，从而提高了宿主机体的特异性和非特异性免疫功能。 1 4 3 维持肠道微生态平衡、预防和治疗肠道消化疾病 双歧杆菌能定植于肠粘膜表面，在肠粘膜表面形成菌膜屏障，对腐败菌及病原菌都具有 拮抗和抑制作用，如：病原性埃希氏大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、痢疾志贺氏菌、伤寒沙门 氏菌、乙型副伤寒杆菌、变形杆菌、白假丝酵母等。双歧杆菌通过产生的抑菌类物质如乳酸、 乙酸等，使肠道的p h 和e h 值下降造成酸性环境，故能抑制不耐酸的腐败菌的大量滋生。双 歧杆菌生长到一定阶段还能产生一种抗菌物质b i f i d i n ，即双歧杆菌素，对一些腐生菌( 金黄 色葡萄球菌、黄色微球菌等) 也有抑制作用【2 0 】，能有效抑制g + 的生长繁殖，双歧杆菌可刺 激肠道免疫细胞产生s l g a ，形成微生物学免疫屏障，抑制肠道病原菌的生长1 2 ，维持了以 双歧杆菌、乳酸菌等益生菌为优势茵的肠道微生态平衡，保证了宿主健康的微生态环境，从 而能预防和治疗肠道消化类疾病，如腹泻、便秘、急慢性肠炎、消化不良等。 1 4 4 抗衰老作用 腐生菌生长繁殖过程中，会产生大量有害物质，如胺类、过氧化物、超氧化物等。这些 有害物质可经血液循环毒害各种组织器官。现代科学研究表明：人体细胞的衰老与自身产生 的超氧阴离子自由基( s u p e r o x i d ez a d i c a l0 2 。) 有关。据报道，双歧杆菌能增加宿主体内的 4 微生物学硕士论文 一种定量分析双歧杆菌的新方法 超氧化物歧化酶( s u p e r o x i d ed i s m u t a s e 、s o d ) 的含量，能有效清除血液中的氧自由基等体 内代谢毒素和废物，减少其对机体的毒害作用，从而可以起到延缓人体衰老、防癌、抗辐射 等作用。巴布亚新几内亚高原人和我国广西巴马地区民族，肠道双歧杆菌较一般人多，健康 和长寿老人的比例比普通地区的多，也证实了这一点瞄】。 1 4 5 降低血脂和胆固醇作用 双歧杆菌及其发酵乳制品能干扰并减少胆酸与胆固醇的再吸收，使血液及肝脏中的胆 固醇降低口3 。2 4 】，提高女性血清中高密度蛋白胆固醇占总胆固醇的比率，其机理是双歧杆菌通 过影响p 羟基p - 甲基戊二酸单酰辅酶a 还原酶的活性，控制胆固醇的合成而降低血清胆固醇 的含量【2 5 之6 】。 1 4 6 抗肿瘤作用 肠道腐生菌在代谢中会产生许多胺类致癌物质，有的还能将一些致癌前体物质转化为致 癌物，而双歧杆菌能通过抑制腐生菌的生长和才产生分解致癌物质的酶如n 亚硝胺酶从而 起到预防癌症的作用f 2 7 五8 】。人体试验和动物试验证实，益生菌可降低粪便中由腐败菌产生 的致癌原合成酶，如肛葡萄糖醛酸酶、偶氮还原酶和硝基还原酶的活性，降解亚硝酸等物质， 提高机体的免疫功能。徐根兴【2 9 1 抑制血管生长的人内皮抑素基因转入双歧杆菌，研究出转 基因双歧杆菌口服制剂，经3 0 5 例多种实体瘤病人志愿服用，显示出明显的抑癌效果，没有 发现毒性反应。 1 5 双歧杆菌的培养 1 5 1 双歧杆菌对营养的要求 双歧杆菌对营养和环境要求非常苛刻，培养中必须含有氨基酸、维生素、核酸物质和盐 类。如果缺乏天冬氨酸活性降低5 0 ，如缺少含硫氨基酸( 半胱氨酸和蛋氨酸) 活性完全 丧失。维生素中的b l 、b 2 、b 6 、尼克酸、泛酸也是必需物质，有些菌种还需要叶酸。 为了研究需要，人们设计了许多种培养基用于双歧杆菌的分离、培养和计数。根据能否 用于培养其他细菌，这些培养基有非选择性培养基和选择性培养基之分。 1 p y 培养基是广泛采用的非选择性培养基之一，它含有胰酶解酪朊和植质蛋白胨，用于 不同环境来源的双栖杆菌属内不同菌种的分离。但乳酸菌和乳杆菌及其它类型菌也可以在其 上生长。 p y g 培养基是另一种非选择性培养基，也常用于双歧杆菌、乳杆菌、肠球菌、乳球菌的 分离、培养。 ， 为了选择性分离双歧杆菌，提高双歧杆菌的分离效果，人们在培养基中添加抗生素和其 他试剂，以抑制和防止其它菌生长，此为选择性培养基。常添加的化学物质有新霉素、多粘 菌素、卡那霉素、巴龙霉素、莫匹罗星、碘乙酸、氯化锂、丙酸钠、2 ，3 ，5 三苯基四唑化 氮、溴钾酚绿、山梨酸和叠氮化钠等。这些化学物质抑制其他菌的效果随条件而异，而且它 们也会或多或少的影响双歧杆菌的生长。遗憾的是，迄今为止，没有一种物质能完全抑制其 5 微生物学硕士论文一种定量分析双歧杆菌的新方法 它细菌的生长而所有双歧杆菌都不受影响。能抑制大部分非双歧菌而让大多数双歧杆菌生长 良好的培养基就是好的选择性培养基刚 1 5 2 双歧杆菌培养中隔氧的方法 双歧杆菌属于严格厌氧菌，体内缺乏过氧化氢酶和超氧化物歧化酶，对氧气的敏感性上 种和菌株之间存在着差异，但不能生长于琼脂平皿和试管斜面上，只有少数几种菌能在c 0 2 存在的情况下对氧气有弱的耐受性，能在含有1 0 c 0 2 的空气中生长。 双歧杆菌的培养方法有亨盖特厌氧滚管技术、厌氧箱法、厌氧袋法、厌氧罐( 缸) 法、 烛缸法等。这些方法均是利用物理或化学方法排走或除去环境中的氧气，造成厌氧或微氧的 环境，使厌氧菌在其中生长繁殖。 1 5 2 1 亨盖特厌氧滚管技术 亨盖特厌氧滚管技术是美国微生物学家亨盖特于1 9 5 0 年首次提出并应用于瘤胃厌氧微 生物研究的一种厌氧培养技术。以后此技术又经不断改进，从而使该技术日趋完善，并逐渐 发展成为研究厌氧微生物的一套完整技术，而且经多年来的实践证明它是研究专性厌氧菌的 一种极为有效的技术【3 。该技术的优点是：预还原培养基制好后可随时取用进行试验，任 何时间观察或检查试管内的菌都不会干扰厌氧条件。 亨盖特厌氧技术采用铜柱系统除氧，铜柱是一个内部装有铜丝或铜屑的硬质玻璃管。此 管两端被加工成漏斗状，外壁绕有加热带，并与变压器相连来控制电压和稳定铜柱的温度。 铜柱两端连接胶管，一端连接气钢瓶，另一端连接出气管口。由于从气钢瓶出来的气体如 n 2 、c 0 2 和h 2 等都含有微量0 2 ，故当这些气体通过温度约3 6 0 的铜柱时，铜和气体中的 微量0 2 化合生成c u o ，铜柱则由明亮的黄色变为黑色。当向氧化状的铜柱通入h 2 时，h 2 与 c u o 中的氧就结合形成h 2 0 ，而c u o 又被还原成了铜，铜柱则又呈现明亮的黄色。此铜柱可 以反复的使用，并不断起到除氧的目的。 操作时，先将预先配置好的培养基或者稀释液煮沸驱氧，而后趁热分装到螺口厌氧试管 中，一般琼脂培养基装4 5 - 5 0m l ，稀释液装9m l ，并插入通n 2 气的长针头以排除0 2 。当 看到培养基内加入的氧化还原指示剂刃天青由蓝到红最后变成无色，说明试管内已成为无 氧状态，然后盖上螺口的丁烯胶塞及螺盖，灭菌备用。 将置于4 6 - 5 0 恒温的水浴中的无氧无菌琼脂培养基取出，用无菌注射器吸取适当稀 释度的样品菌液，将其平放于盛有冰水的瓷盘中迅速滚动，加入的溶化琼脂在试管内壁会立 即凝固。亨盖特厌氧培养后，就会看到琼脂培养基内部和表面长有菌落。挑取菌落，镜检其 形态及纯度。如尚未获得纯培养物，需重复以上操作，直至获得纯培养物为止。 1 5 2 2 厌氧箱法 厌氧箱是目前国际上公认的培养厌氧微生物的最佳仪器之一。图1 是一种常用的厌氧培 养箱，为西班牙产a n a e r o b i cm i c r o b i o l o g ym i n i m a c s 型号。 6 微生物学硕十论文利t 定量分析双歧杆菌的新方法 图1a n a e r o b i cm i c r o b i o l o g ymi n i m a c s 厌氧箱 f i g 1 a n a e r o b i cm i c r o b i o l o g ym i n i m a c sa n a e r o b i cb o x 从图1 看出，此厌氧箱可分为两个部分：箱体和充气系统。箱体由有机玻璃和有机塑料 密封而成。箱体前面有两个于套筒，为双手伸进箱内操作和进出样品或试验用品用的，于套 筒内的大室，称为操作窒。操作室内有专用接种棒、红外灭菌器r 接种棒灭菌用) 、指示剂 ( 监视厌氧状态) 等，后部分有层隔板，用来盛放暂时不用的物品。下面有按钮、显示屏和 指示灯，用来调整、显示操作室的温度与工作状态。旁边的两个充气钢瓶，分别装有纯氮气 和氮气：氢气：氧化碳为8 0 ：1 0 ：1 0 的混合气体。厌氧箱内的厌氧环境是靠对操作室内 进行不断的抽气充气造成的。 厌氧箱法的优点很多，如从接种到培养的整个操作过程都是在厌氧环境巾进行的，操作 技术要求不高，厌氧环境严格等。但是厌氧箱价格昂贵，所占空间大，需要专用实验窒。其 次维持厌氧环境每天也需要消耗大量的混合气体，所以使用费用也比较高，适用于经常进行 厌氧菌试验的甲位和试验室。 1 6 双歧杆菌的特征性酶 果糖一6 一磷酸磷酸酮解酶( f 6 p p k ) 是双歧杆菌属的双歧代谢途径中的特征性酶，通过 特异的“果糖6 磷酸支路”( 又称为双歧支路) 对葡萄糖进行发酵：记】，这与其它细菌利用醛 缩酶和葡萄糖一6 磷酸脱氢酶明显不同。该酶催化果糖6 磷酸盐分解为乙酰磷酸盐和4 磷酸 赤藓糖。葡萄糖不经过糖酵解途径而经过f 6 p p k 酶进行双歧代谢途径最终生成乳酸和醋酸， 即双歧支路、果糖6 一磷酸支路，该酶已应用于双歧杆菌的鉴定与计数。在其它g 菌、假双 歧形态细菌如节杆菌属、棒杆菌属、丙酸杆菌属、放线菌中缺乏这种酶，但它存在于以下非 双歧菌种中：g a r a d e r e l l av a g i a l i s 、a c t i o n o m ) c g st u r i c e n ，曲、a c t o b a c t e r 以l i n u m 、l e n c o n o s t o c m e s s e n t e r o i d e s 等。 淀粉凝胶电泳显示，双歧杆菌f 6 p p k 有三型，依据它们在电泳中的迁移率依次是：蜜 蜂肠道的种( 蜜蜂型) 、来源于人的种( 人类型) ，最后是来源丁动物的种( 动物型) 。研究 发现，人类型的f 6 p p k 在底物、激活物、活性p h 范围和热失活等性质方面都和动物型的 不一致。动物型的f 6 p p k 是双底物酶，底物分别是果糖6 磷酸盐和木糖一5 磷酸盐，并且趋 7 微生物学硕士论文一种定量分析双歧杆菌的新方法 向于后者，而人类型的仅分解果糖6 磷酸盐旧。 由于f 6 p p k 是双歧杆菌属的特征性酶，故s c a r d o v i 等姗5 1 最早提出f 6 p p k 酶活测定法 是鉴定双歧杆菌的最可靠的非分子方法之一，f 6 p p k 阳性即是双歧杆菌。常有人以此来定 性检测双歧杆菌的存在( 3 6 - 3 9 1 。 另外，双歧杆菌代谢产生的a 、p 半乳糖苷酶的活性明显高于其他肠道菌h 1 1 ，p - 半乳 糖苷酶能分解乳糖，因此双歧杆菌还可以提高“乳糖不耐症”患者对乳制品的利用率【4 2 】。 1 7 双歧杆菌的鉴定 双歧杆菌的鉴定方法有常规鉴定和分子水平的鉴定。 常规鉴定有革兰氏染色、生理生化试验、糖发酵试验、运动性检测和胞壁酸组成测定 等。随着现代技术的发展，现已有商品的细菌编码鉴定系统软件，通过接种一定数目的试验 卡，室温培养一定时间，将所得的结果以数字方式表达，并与数据库数据比较，得到鉴定结 果。目前法国生物梅里埃( b i o - m e d e u x ) 公司生产的a p i 是目前国内外应用最广泛的一种， a p i 一5 0 c h l 适用于双歧杆菌等益生菌的鉴定 4 3 1 。 由于f 6 p p k 是双歧杆菌属的特征性酶，故s c a r d o v i 等 3 4 - 3 5 1 最早提出f 6 p p k 酶活测定法 是鉴定双歧杆菌的最可靠的非分子方法之一，能够用于检测双歧杆菌嗍，f 6 p p k 阳性即可 认为是双歧杆菌，这是目前鉴定和定性检测双歧杆菌的最常用的方法。 分子水平鉴定主要有d n a 的( g + c ) 含量、p c r 法和r f l p 、r a p d 等分子标记法。 1 8 双歧杆菌的定量分析 双歧杆菌的定量分析根据是否对双歧杆菌培养可分为培养法和非培养法计数。后者主要 有实时定量p c r 法、荧光原位杂交结合流式细胞计数法、e l i s a 法等。 1 8 1 平板计数法 可用于双歧杆菌培养和计数的培养基很多，常见的有b b l 、t p y 、b l 、m r s 、a m c 琼 脂培养基、p y g 液体培养基等。按对双歧杆菌的选择性来分可分为选择性培养基和非选择 性培养基两类，分别用于纯菌和混合菌产品中的双歧杆菌的计数。 双歧杆菌选择性培养基的营养基质与改良m r s 培养基的成分相同，另外添加3 种抑菌 物质，氯化锂( 2 l ) 、丙酸( 5m l l ) 和美蓝( 1 6m e , l ) ，p h5 5 ，称为p l m 培养基 纯菌检测和混菌检测结果表明，p l m 对双歧杆菌有较好地选择性。但一些其他乳酸菌能够 在p l m 中进行一定程度的生长【4 5 - 4 6 。加富布氏培养基( a m c ) 和添加半胱氨酸的m r s 培 养基被认为是工业品控试验室的较佳选择【4 7 1 。由于双歧杆菌的静半乳糖苷酶的活性比乳酸 菌的高，所以双歧杆菌的菌落呈蓝色，而乳酸菌的菌落呈浅蓝色或无色，从而能将它们区分 开来h “9 l 。 双歧杆菌平板计数法的优点是费用低，不足之处是费时费力；选择性培养基中添加的抑 菌剂对双歧杆菌都有不同程度的抑制作用，从而影响检测的精确度；需要特定的厌氧培养设 备；当用来做肠道微生物多样性分析时，会有一些不可培养微生物不生长，即便人工合成的 8 微生物学硕士论文一种定量分析双歧杆菌的新方法 培养基能培养出所有的可培养微生物，但特定的营养和培养条件( 氧气浓度、p h 、培养温 度等) 也会不适合一部分微生物的生长。所以，各种选择性计数方法都有其一定的缺陷和局 限性1 5 0 1 。 1 8 2 以p c r 技术为特征的分子检测 以双歧杆菌的1 6 s rr n a d n a 设计出双歧杆菌的属特异性引物，加上标记的荧光探针 ( 一般是s y b rg r e e ni 和t a q m a n ) 进行实时定量p c r 扩增，可以用来对双歧杆菌进行准确 定量，在双歧杆菌各个种属在肠道中的分布和临床应用中都有重要的作用。l 汪q 烈a 等认 为实时定量p c r 技术( t a q m a n ) 可以对来自婴儿样品中的双歧杆菌进行准确的定量l 5 l j 。 m a t s u k i 等【5 2 1 应用实时定量p c r ( s y b rg r e e ni ) 对双歧杆菌进行了定量检测，线性范围在 1 0 6 - 1 0 7 p c i 铲物，同时也发现当每克粪便中的双歧杆菌含量大于1 0 6 个时，可用这种方法检 测双歧杆菌。王超等5 3 1 建立了快速检测双歧杆菌的分子信标实时p c r 检测方法，纯双歧杆菌 菌液的检出限为2 1 0 3c f u m l 。 分子定量检测法的优点很明显，不需培养及培养设备，快速、特异性强、灵敏度高、 重复性好、定量准确、全封闭反应等，但操作成本高。 1 8 3 其它的双歧杆菌的定量分析方法 由于以荧光原位杂交结合流式细胞计数的方法结合了f i s h 的简易、直观和流式细胞仪 计数快捷的优点，在近几年已成为科学研究实践中常用的方法之一”4 】。2 0 0 4 年一项抗生素 对肠道菌群影响的实验室研究5 5 1 和同年f e r g u se t 蚓在炎性肠病的研究中都采用了此法对 双歧杆菌进行定量分析，取得了较为理想的结果。在一项应用益生菌治疗肠道感染的研究中 【5 7 】也显示了相同的结论。 袁耀武等强1 以用于发酵乳制品的菌种长双歧杆菌( b i f i d o b a c t e r i a 1 0 n g u m ) 和两歧双 歧杆菌( b i f i d o b a c t e r i a b i f i d u m ) 为材料，制备出来源两种动物( 家兔及小鼠) 的免疫血清， 并利用它们对双歧杆菌发酵乳品中的双歧杆菌进行双夹, i ) , e l i s a 法检测，最低浓度可达1 0 7 c f u m l ，仅耗时8 h ，未见血清和乳制品中常见细菌间发生交叉反应。 e v l k o v a 等5 9 1 对f 6 p p k 、a 半乳糖苷酶、甜葡糖苷酶的活性进行检测，并将检测结果 与经典培养计数法、荧光原位杂交法的结果进行比较，并无明显差异。所有的阳性样品均表 现较高的小半乳糖苷酶和p - 葡糖苷酶活性，而阴性样品缺乏此两种酶一种或两种的活性， 且所有的阴性样品均不表现f 6 p p k 活性。 针对不同的双歧杆菌产品，我们应结合各方法的特点选择不同的定量分析方法。 1 9 双歧因子的研究 g i b s o n 定义为益生元( p r e b i o t i c ) 的物质，是指那些“人体不能消化或难消化的食用成 分，这些成分可选择性刺激结肠生理活性细菌的生长和活性，从而对宿主产生健康效应”， 也称为双歧因子、双歧杆菌促生长因子，双歧杆菌增殖因子，双歧杆菌增殖剂等m 1 。双歧 因子一直就是双歧杆菌研究的热点之一。益生元和益生菌都是改善肠道微生态的主要手段， 9 微生物学硕士论文 一种定量分析双歧杆菌的新方法 许多保健品的主要有效成分就是益生元或益生菌、或者是二者的结合。 益生元一般是符合下列条件的一类物质：1 ) 在消化道上不能被消化酶消化；2 ) 能刺激 定植于肠道的一种或几种有益菌的生长或活化其代谢；3 ) 使肠道菌群向有利于宿主健康的 方向转化；4 ) 能诱导有利于宿主健康的肠道局部免疫或全身免疫反应。有益生元功能的物 质有很多，从化学成分来说，主要有类低聚糖，植物与中草药的提取物、蛋白质水解物( 酪 蛋白的水解物、a 乳清蛋白、乳铁蛋白等) 、多元醇( 木糖醇、甘露醇、山梨醇、乳糖醇等) 。 此外，多糖( 云芝多糖、胡萝卜中的含氮多糖) 也具有增殖双歧杆菌的功能。其中非消化性 功能性低聚糖是使用最广泛的益生元1 4 3 1 。低聚糖类主要有低聚果糖、低聚半乳糖、低聚木 糖、大豆低聚糖、棉籽糖、甘露低聚糖、异麦芽糖、龙胆寡聚糖等。大量的研究表明，双歧 杆菌是通过分泌到胞外的酶类来分解利用双歧因子成小分子物质，促进其生长繁殖的。 魔芋水解液1 、螺旋藻【6 1 1 、海带叫等也被证实有促进双歧杆菌生长的作用。 1 1 0 双歧杆菌微胶囊的研究 双歧杆菌活菌制剂都必需经过消化道才能到达肠道，由于双歧杆菌对抗低p h 的抵抗力 差，而胃酸的酸度很强，因而大部分菌体容易失去活性，甚至死亡【6 习。因此在双歧杆菌制 品中最为关键的问题是产品销售和保藏过程中活茵含量的下降。使双歧杆菌通过胃环境以大 量的存活菌到达肠道并定植于肠黏膜上，是双歧杆菌能够在人体内发挥出益生作用的关键。 目前，国内外多利用微胶囊技术来解决这一难题。日本森下仁丹公司畔j 采用疏水微胶囊技 术研制的b i f m a l 0 号，一次性把1 0 9 个活菌安全通过胃酸直接送达肠道，显示了良好的效果。 已报道的双歧杆菌微囊化一般以碳水化合物和蛋白质居多。碳水化合物类有海藻酸盐 等，蛋白质有明胶、阿拉伯胶、果胶、卡拉胶、黄原胶、乳清蛋白，其他类有聚丙烯酸树脂 等。在实际中，往往是几种物质复配使用 6 s o 双歧杆菌微胶囊的方法很多，大致来说有物理法和物理化学法两种。每种方法又可分为 几种，具体每种方法的优缺点见表1 。 表1各种双歧杆菌微胶囊方法比较【6 日 t a b 1 c o m p a r a t i o no f m i c r o c a p s u l a t i o nm e t h o d so f b i f i d o b a c t e r i a 杨汝德等6 7 1 采用流化床技术与喷嘴结合的微型包囊法。将3 种双歧杆菌、高效活菌保护 l o 微生物学硕士论文一种定量分析双歧杆菌的新方法 剂和双歧因子一起作为核心物质包封于无毒囊材中制成耐酸肠溶性微囊( 或微球) 。微囊在 人工模拟胃液( p h 值为1 5 2 o ) 中处理2h ， 其中的双歧杆菌活菌数仍保持在9 0 以上； 在人工肠液中处理1 5m i n ，微囊全部崩解释放出活性菌，3 7 下保存3 个月( 相当于常温下 1 年) 。其中的活菌数仍大于l o 垤。 由于微胶囊工艺和技术方面的限制，又增加了成本，所以国内外市场上为胶囊的双歧杆 菌产品还不是很多，具体见下表【嗍。 表2 国内外的微胶囊化双歧杆菌制品 t a b 2 m i c r o c a p s u l a t e db i f m o b a c t e r i ap r o d u c t so f d o m e s ta n df o r e i g n 1 1 1 双歧杆菌的应用研究 由于双歧杆菌对宿主有很多健康促进作用，世界各国都将双歧杆菌添加进食品或药品 中，来预防、治疗人或畜禽的疾病和促进机体健康成长。大致来说目前国内外的双歧制品主 要可分三类：含有双歧杆菌活茵的乳制品、饮料与口服液( 称为益生菌制品) 、含双歧因子 的制剂( 称为益生元制品) 和前两类的混合( 称为合生元制品，如三株公司的益而生口服液 等) 第一类产品的目的主要是补充双歧杆菌活菌，这类产品种类最多，效果迅速。但由于其 是双歧杆菌严格厌氧菌，对营养要求极为苛刻，且不耐胃酸和胆汁，所以生产起来比较困难， 口服了这类含有双歧杆菌活菌的乳制品或饮料后，真正能到达肠道并成功定植在肠粘膜上皮 的活双歧杆菌可以说是少之又少，而只有一定量的活菌定植后才能发挥其益生功能，所以这 类产品的实际保健作用远没有生产厂家所宣传的那么显著。并且活菌产品对运输、储存的要 求也很严格，故其保质期也比较短。 后来人们又研发出了双歧杆菌的混合菌产品，从目前所应用的情况来看，双歧杆菌与乳 酸菌及链球菌的复配比较理想。但菌种的配合并不是随意的，在新菌种投入使用前，应获得 充分的科学数据、严格的安全性评价和规范的申报批准文书等程序后才能确认为生产菌种、 进行生产。 既然活菌类双歧制品存在上述缺点，人们又研制出含有双歧因子的双歧制剂，目的是向 体内补充双歧生长因子，采用促进双歧杆菌增殖的物质来补充体内有益菌群，这是一条更易 被消费者接受的途径 6 9 1 。双歧因子的作用主要是在人和动物肠道内特异性促进双歧杆菌的 增殖，让双歧杆菌成为优势菌，从而定植于肠道内粘膜发挥其益生保健作用。市场上的双歧 微生物学硕士论文 种定量分析双歧杆菌的新方法 因子大多为低聚糖类，生产较易，成本也较低，化学性质稳定，故产品易于运输、储存，其 保质期也较活菌制剂长很多。而且，这些糖类还是一种广泛的免疫促进剂，具有免疫激活、 修复多种免疫缺损疾病、抗肿瘤、抗消化性溃疡、降低血糖血脂等功能f r o - 7 n 。 现在我国市场上最常见的双歧杆菌制品是双歧酸奶，一般都是双歧杆菌和乳酸菌的混合 发酵而成的，国内大型乳业集团如伊利、蒙牛、光明、三鹿、夏进等都有同类产品面世，受 到了消费者的喜爱。 我国包括双歧杆菌在内的微生态制剂至少有l o 多种，如培菲康、金双歧、促生菌、肠康 乐、定菌生、首源胶囊等产品。目前在市场上销售的双歧杆菌制剂有普乐拜尔、丽珠肠乐、 整肠生等益生菌药品。目前世界各国的双歧杆菌产品见表m - 7 6 1 。 表3 常见的双歧杆菌产品列表o i k ，巾j 1 二h 】从峨t l 匝iju u 7 1 帆 t a b 3 l i s to f c o m m o nb i f i d o b a c t e r i ap r o d u c t s 1 1 2 双歧杆菌的安全性研究 根据国内外学者的有关益生菌功能性与安全性的长期大量的研究结果( 包括大量的科学 试验证实并有足够的文献支持) ，均证明包括双歧杆菌在内的益生菌具有优良的益生功能， 可以安全服用、无毒害。关于益生菌的安全性问题，欧洲食品和饲料菌种协会( e f f c a ) 、 国际益生菌和益生原科学委员会( i s a p p ：s a p p ) 和罗森健康研究所l a w s o nh e a l t hr e s e a r c h i n s t i t u t e ) 的学者和专家们的观点一致：安全可靠，可以食用。至今没有证据( 包括人体临 床试验、动物试验等) 和实例表明，双歧杆菌( 不包括基因工程菌在内) 能导致人畜致病和 产生毒素等毒副作用。虽然发生在病重患者身上的极少数事例引起了人们对益生菌安全性的 1 2 微生物学硕士论文一种定量分析双歧杆菌的新方法 担忧与恐慌，但有关专家、学者一致认为现在我国现行规定的可添加于食品中的菌种对于所 有的正常人来说都是适宜的，但对于病重患者是否适宜，则不太清楚。迄今为止所发生的所 谓的益生菌致病的事例都是发生在重病患者身上的，以这些极少数的事例来否定包括双歧杆 菌在内的益生菌的公认的食用安全性是缺乏严格论证的和不科学的。 但研究者应加强对以下领域的研究：双歧杆菌对特殊人群的安全性研究、基因工程改造 过的双歧杆菌的安全性、双歧杆菌的抗药性质粒的转化问题、新菌种的安全性检测等，以确 保使用的双歧杆菌菌种的食用安全性。 所有中国允许使用( 尤其是持有“新资源食品原料”证书) 的益生菌菌株都有在食品和 膳食补充剂中长时间的安全使用历史，有充分的安全性研究资料的支持并经过完整和严谨的 安全性、毒理性试验，我国的相关部门也对益生菌的使用进行严格监管，以确保在中国市场 产品中使用的双歧杆菌菌株的安全。 1 1 3 双歧杆菌研究存在的问题及对策 市场上双歧杆菌产品( 特别是保健品) 的质量良莠不齐，质量很难有保证。中科院微生 物研究所的研究人员曾对1 0 种广告最多，知名度较大的含双歧杆菌的产品进行了检查分析， 发现所用菌种或名不符实、或有名无实、或不报菌名，甚至有溶血性细菌或带抗药性质粒的 细菌。有的成分或无或缺【7 7 1 。消费者只有购买大品牌、大厂家的产品才会到有些安全感。究 其原因是目前我国没有统一的检测标准，致使市场上的各种产品鱼目混珠，质量参差不齐。 市场上双歧杆菌活菌产品的保质期很短，而且对生产设备、生产管理、储藏和运输条件 等方面的要求很高，如运输和储藏必须冷链进行，这大大增加了成本。之所以如此是因为双 歧杆菌是严格厌氧菌，氧气对其有毒害作用，所以培育耐氧的菌株对生产厂家来说很重要。 近年也有很多研究人员进行双歧杆菌的耐氧驯化工作，如哈尔滨师范大学环境与生命科学院 的徐速等t 7 引。他们的耐氧菌株驯化方法大致为：初发菌株于t p y 液体培养基3 7 、厌氧培 养2 4h ，转入带胶塞的小口瓶1 1 p y 液体培养基中( 气体含量从5 递减至5 0 每一循 环递减5 ) ，3 7 ，有氧培养2 4 h ( 重复上次培养) ，然后接入l o 脱脂乳( 气体含量 5 0 ) ，3 7 好氧培养至凝乳，进行平板分离、挑取单菌落，最终得到一株耐受性的青春 双歧杆菌a d 。此菌已具有一定的耐氧能力，无须绝对厌氧，可在含有一定空气容积