（环境工程专业论文）热胁迫对金鲫鱼组织内四种酶活性的影响.pdf

巾文摘要 鱼类是水体的主要经济资源，对惹统中的生态平衡及正常的能嫩流动、物质循环， 对充分发挥水体生产力和提离经济效益超着决定作耀。然面，近几十年来，以热电厂为 耋戆久王热黥彝零薄受熬，对永生生态系统产垒影稠，进焉绘垒爨麸绥魏窭l 释辩镰冬蘧 次均带来不同程度的影响，该领域的研究也越来越激刹国内外学糟的广泛关注。由此， 本论文试图在实验室模拟祭件下，研究热冲击对鱼体内酶活性的影响，以期为今后野外 研究提供基旗依据。 本实验选取金鲫鱼( c a r a s s l u sa u r a t u s ) 为受试象物，分别旋不同灌温条件下测定 其肝脏、肾脏、血清内的豁丙转氨酶( g p t ) 、谷草转氨酶( g o t ) 、过氧化氢酶 c a t ) 和脑胆碱脂酶( a c h e ) 活性，实验驯溆为2 4 _ + 0 5 ，处理温度分别为2 8 、3 l 、3 4 、3 7 ，簸毽辩瘸是2 4 1 1 或l h ，每一燕洚素湛发懿蓬缓箍雄备5 尾。与对照缀簦 驯温条件相魄，除雌鱼3 4 热冲击外，增温对金鲫爨肝脏、肾脏、血清内g p t 活性变 化无显著影响( p 0 0 5 ，p 0 0 1 ) 。随着升温强度的增加，无论处理时间是2 4 h ( 在2 8 、3 l 时) 还是l l l ( 在2 8 、3 l 、3 4 时) ，金瓣惫翳脏中g o t 酶活性先降后舞， 悫清中g o t 酶活毪先爵麓辫；对l 驽驻褥富，靖予不阏酌处理对阕薅活性交纯商摄大区 别。较低程度的增温( 即猩2 8 时) 使众鲫鱼肝脏和肾脏中c a t 活性呈显著增加，随着 增温程度的加强酶活性则出现了不同程艘的降低，丽肌滴中c a t 瀚性变化与之桐反。对 于玺齄a c h e 滔性瓣影嫡，表瑰戈低袋璇蹭瀑( 瑟2 8 彝3 l l l 孝) 毒导致垂瓣巾a c h e 的活性明显降低，随着增澈强度的继续加强酶活性值出现回升。 实验结果液明；金鲫鱼肝脏和血清中的g o t 、肝脏和肾脏中的c a t 以及脑中的a c h e 均可以用来作为其组织细臌因热受胁遗及损伤的生物标志戆，金鲫毽是热冲击鄢壤下的 攒示生耱。 荧键词：热冲诲，金鲫鱼，谷丙转氨酶，谷革转氨酶，过氧化氨酶，胆碱脂酶 a b s t r a c t f i s hi st h em a i ne c o n o m i c a lr e s o u s e i ts e t su pt h ea q u a t i ce c o l o 西c a ls y s t e mw i t ht h e a q u a t i co r g a n i s m sa n dt h es u r r o u n d i n g s f i s hm a k e sas i g n i f i c i e n te f f e c t i o no nt h ee n e r g y m o v i n g c i r c lo f m a t e r i a la n d e c o l o g i c a lb a l a n c e i nt h es y s t e r n i ta l s oh a se f f e c t e dt h ea q u a t i c p r o d u c t i v i t ya n dt h ei m p r o v e m e n to fe c o n o m i c a lb e n e f i t s h o w e v e r , m a n u a lh e a te n e r g y r e l e a s i n gt ow a t e rh a se f f e c t i o no nt h ea q u a t i cs y s t e md u r i n gt h es e v e r a lt e n so fy e a r s 1 1 l e p o w e rp l a n ti st h em a i nr e l e a s e r t h e nt h e r ea r es o m ee f f e c t i o n so nf i s hw h i c hi n c l u d et h e c e l l sa n dt h es p e c i e s t h a th a sb e e np a i dm o r ea t t e n t i o nb yt h el e a r n e r so ft h ew o r l d s ow e t r yt os t u d yt h ee f f e t i o no fh i g h e rt e m p e r a t u r eo nt h ee n z y m ea c t i v i t yi nf i s hb yt h em a n u a l l a b o r a t o r i a lc o n d i f l o n si n t e n d i n gt op r o v i d et h eb a s i sf o rt h ew i l ds t u d y t h i se x p e r i m e n th a ss t u d i e dt h ee f f e c to ft e m p e r a t u r e sr i s i n go nt h ea c t i v i t i e so fa c h ei n e n c e p h a l o n ，删tc a t a n dg o ti ns e r m n ，l i v e ra n d p a n c r e a s ，a n dk i d n e y i nc a r a s s l u sa u r a t u s t h e f o s t e r i n gt e m p e r a t u r ei s2 4 + _ _ 0 5 3 2 t 1 i es e r i e so ft e m p e r a t u r e su n d e r t h eo b j e c tw h i c hi s d e a l tw i t h2 8 。3 1 ，3 4 。3 7 ，a n df i v em a l ea n df i v ef e m a l ef i s hw a sa c c l i m a t e df o r t w e n t y f o u rh o u r so ro n eh o u rb ye v e r yt e m p e r a t u r e 1 1 1 er e s u l ts h o w st h a tt h e r ei s n o r e m a r k a b l er e l a t i o n s h i pb e t w e e nt h et e m p e r a t u r ei n c r e a s i n ga n dt h ec h a n g eo fg p ta c t i v i t i e s i nl i v e ra n d p a n c r e a s ，k i d n e y a n ds e r u m w i t ht h e t e m p e r a t u r ei n c r e a s i n g ，t h e g o t a c t i v i t i e si np a n c r e a si sd e c r e a s i n g , w h i l ew h i c hi ns e r u mi si n c r e a s i n g t h eg o ra c t i v i t i e si n l 【i d l l e yu n d e rd i f f e r e n tt e m p e r a t u r e sa r em u c hd i f f e r e n t t h ea c t i v i t i e so fc a ti nl i v e ra n d p a n c r e a s a n dk i d n e yi n c a r a s s l u sa u r a t u sa r er e m a r k a b l ei n c r e a s i n ga t2 8 。w h i l et h e a c t i v i t i e so fi tp r e s e n tv a r i o u sd e c r e a s eb yt h eh i g h e rt e m p e r a t u r e h o w e v e r , t h e v a r i e t yo f c a t a c t i v i t y i ns e r u mi sr e v e r s e t h e a c t i v i t y o fa c h ei n e n c e p h a l o na p p e a r sr e m a r k a b l e d e c r e a s i n g a t2 8 柚d3 13 2 a n di ta l s oc a nr e t u r nb a c k b y t h eh i g h e r t e m p e r a t u r e s og o ti ns e r u m ，l i v e r , p a n c r e a s ，a n dk i d n e y , a c h ei ne n e e p h a l o na n dc a ti nl i v e ra n d p a n c r e a s 。a n dk i d n e vi nc a r a s s l u sa u r a t u sa l s oc a nb eu s e da st h es e n s i t i v ei n d e xw h o s e t i s s u e sa n dc e l l sa r ei n t i m i d a t e do rd a m n i f i e db vh i g ht e m p e r a t u r e w h e t h e rt h er e s u l t sf i tt o c a r a s s i u sa u r a t u s ，c y p r i n u sc a r p i o ，h y p o p h t h a l m i c h t h y sm o l i t r i xa n dt h eo t h e rw i l df i s h ， t h a tn e e d sm o r er e s e a r c h n l i sa r t i c l ea l s oa d v i s e dt h a tt h ew es h o u l dc o n s i d e rt h ef o r s t e r i n g t e m p e r a t u r e ，t h et i m ea n di n t e n s t yo ft e m p e r a t u r ei n c r e a s i n g , a n dt h es e x ，w h e n w eu s eg o t a st h et h eh e a tc o n t a i n i n a t i o ni n d e x a n dw h e nw eu s ec a t ，w ec a nn o tc o n s i d e ri t k e y w o r l d s ：t h e r m a ls h o c k ；c a r a s s l u s a u r a t u s ；g p t ；g o t ；c a t a l a s e ( c a t ) ； a c e t y l c h o l i n e s t e r a s e ( a c h e ) 独创性声明 本人声明所呈交鲍学镶论文楚本大在导师搓撂下进移的辑究工作及墩褥 的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包 鸯莛 蠡入眭经发表戏撰写过豹磅究残暴，瞧不趣含为获褥零基舞藏大学或其建 教宵机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的 任谚贾敲溺已在论文串幸罄了鞠臻黪谥秘劳浚示谢意。 学蹙论文传者签名_ 歪塞至给基裁：i 5 乏整i 幺s 学位论文版权使用授权书 本学佼论文终毒完全了解东l 烬莲大学套关搽整、镬翅学袋论文懿攫逛， ， 即。东北师范大学衡权保留并向国家有关部门或机构送交学位论文的复印件和 磁蠢，兔谗论文被豢阗帮镫阕。零入授较客珑繇范大学霉戳将学使论文豹全部 或部分内容编入有荚数据庠进行检索，可以采用影印、缩印威其它复制手段保 存、汇编学位论文。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学篷谂文终者签名：互交至扬指导教烬签名；照蠢堑盘 日 期：2 红誊。蠡，日期；越、s 学位谂文作者毕业詹去向： 工作单位：电话：篮! ：她8 毯基 瓣编；瑙趋兰 商 隧著电力工业，特别怒棱电站的邋遽发展，循邵冷却求使用擞霞益增热。魄厂囊江 溺、潮溶或水库等承俸雩| 髑冷却求，经凝汽设备秀激薅又排圆永体，健局部豹承体形成 一较高温度聪域，水体中的生态条件发嫩相应变化。而水温又是影响水生生物的重要因 子，一方面，温度直接影响水生生物的耐热性、代谢强度、组织结构及体内蛋囱和酶活 蠖，获嚣控锻承垒垒甥熬煞长、发弯、敷垂滚食、黪菇秘分毒；凳一方嚣，瀑浚又影确 水体理化困予的改变，而闻接影响永生耋毫物的生存，加剧水体富替养化。这种由于入为 活动造成水体增温，增温脂对水质的物嫒、化学性质都将产生不同程度的影响，尤其是 对水生生物瓷源产生伤害住用，称为水域热污染( w a t e rt h e r m a lp o l l u t i o n ) 1 1 l 。爨蘸，国 辨已将冀列必永俸豹a 太污染之一。美溪环傈专家鞭富；产生含热褒求静孩奄鳐、发电 厂将是未来海洋的最大污激源f 2 】。然而，以现代的生产条件和技术发展水平来潇，电厂 向周围水域排热仍属不可避免。 热污染豹磷究善宠飧熬耩教对窳巾鱼类资滚戆澎璃，美嚣、嚣欧等发这黧家辜在 2 0 世纪5 0 馨代就开展了这方面的研究工作【3 _ 1 1 1 。2 0 懒纪8 0 年代爝期，我国也陆续对这 一领域展开了较为系统地研究。其研究内容主要集中在热污染对水生生物的群落特征 1 1 2 - 1 6 1 、生滔史l x 3 l t l 鄂、分布f 1 7 l 、行为1 1 8 l 【1 9 l 和鱼类能豢热值阑等方鼷的野外调查溅溅，之 薅逐渐扩蓑翔惫类豹耐热缝f l 霹辫- 2 3 1 、缀织维擒湖、秘生理奎纯攒豁| 2 3 1 1 2 4 | 等镦瓣领域豹 窳内模拟与实验研究，同时在有关电厂冷却水对水生舷物卷载效臌【嚣五7 】、热污染的扩散 模型1 2 s - 3 3 1 和防治预测例等方丽也取得了相应的研究成果；而有关热污染对鱼体内酶学指 檬系统等分予水平上熬戮突滏疆少冕。 然而，滗论热污染对水生生态系统的影响多复杂绒最终的反威如何严重，最初的作 用必然是从机体内的分子水平的作用开始，后逐渐农细胞、器官、个体、种群、群落、 嫩态系统各个水平反映出来。这释对予水生生物分予水平的研究不仅能够反映如污染物 作菊零震，势缝对污染耪警斓影穗筛选鹚可行毪捡溯捂掭，麸嚣辩污染耱环境影响做出 更为准确的擞态毒理学预测或旱期报警( e a r l yw a r n i n g ) 1 3 5 】。因此，随着热污染对水生 嫩物影响研究的更加深入，该领域的发展开始涉及到爨体内酶活性物质和热应激调节等 分予承乎豹疆究，鞋及鱼髂瘫部维织续搀程功能、能爨饯游、貔震转耽、体瀑谖繁等生 理生化指标麴研究，以鹚能够对水域热浮染作出较为龛面的评价措标，尤其是多指标联 合评价污染穰度。 以往有关焦类热影晌的诲多醪 究，燕要是采用擞态系统中食物链中的各代袋生物， 铡如藻、蚤、簸粪靛急淫、簸急毪帮滢憔蜜验结莱， 挈为舔境蒸污染强瘦的依据。舞辨， 采用微宇宙、中宇宙和野外受控生态系统研究热污染在水生生态系统中的迁移舰律，以 及生态系统中各生物种群、群落的生态效应。这方面的研究结果可能真实地反映生态系 统水平上的影响。但该方面的研究端点大部分为热污染造成的生物死亡、生长繁殖受阻 等生态效应影响的定期性指标，其原因是不了解环境热污染胁迫在生物体内的作用的早 期反应和真正的靶器官、靶细胞、靶分子。同时，热影响的生物耐受室内实验结果，如 果外推应用于野外水生生态系统，必然存在室内野外二者间的较大差距。因此，水 体热影响研究迫切需要反映热因子作用本质，并且可能进行早期检测的生物学指标端 点。这种最早期的作用在保护种群和生态系统上具有最大的预测价值。 酶是机体生物化学反应的重要物质，酶活性的改变可被快速和精确的测定，并且利 用特定反应中的关键酶的变化来证实污染物的影响已有相关报导，主要采用生物体内相 关酶的活性作为机体功能与器官损伤的标志。这方面的酶主要包括生物体内的一些组织 酶、胞内酶和血清中器官专一性的同功酶。同时还研究污染物对生物体内解毒系统基因 的活性，引起m r n a 、蛋白及酶活性的增加来反映特定环境污染物的早期作用。 本实验在实验室模拟条件下，以金鲫鱼为受体，研究增温对金鲫鱼( c a r a s s l u s a u r a t u s ) 肝脏、肾脏与血清谷丙转氨酶( g p t ) 、谷草转氨酶( g o t ) 和过氧化氢酶( c a t ) 活性及鱼脑中胆碱脂酶( a c h e ) 活性的影响，分析热胁迫( h e a ts t r e s s ) 与酶活性之间的 关系，并试探讨其作用机理。本文研究目的在于测定鱼体内特定反应中的关键酶的变化 来证实热影响效应，将分子生态毒理学指标应用于受热水体的环境评价和监测。同时将 分子生态毒理学指标具有测定周期短、灵敏的特点用于各种环境胁迫筛选，揭示作用机 理及其对可能造成的环境影响作为更为准确的早期预报。 2 l 。1 实验材瓣 第1 牵实验 所用金鲫煎购于长春市花鸟鱼虫市场，雌鱼平均体长9 0 e m 、体重2 7 3 9 ，雄鱼平均 体长9 。4 c m 、体重2 4 1 9 。在实验室驯养一周后用予域温试验，实黢用容器灸6 0 l 求族 禧，缮溢实验在永渣麓串逡彳亍，配备小鬃灌鬟霞，使承孛溶解氧零低予5 r a g t , ，虢供金 鲫鱼正常呼吸。有研究表n t 3 “，金鱼鬣适宜的生长漱度为1 5 2 5 ，高于3 0 或低于 1 0 ，则普遍厌食，活动迟缓，生长缓慢。因此，j 糍撵驯养温度为2 5 o 5 0 ，光暗比 1 5 h ：9 h 。试骏舞蓼嚣天不投食。 1 2 主要仪器和试剂 1 2 。1 主要俊器 x m t b 数恩调节仪，j e 京市长风仪器仪表公司 7 2 3 0g 烈分光光度计。上海分析仪器总厂 t g 3 2 8 a 努拆毫毙天警，上海壤密耱学搜器骞激公司 l d z 和叼8 医用离心机，北京医用离心机厂 1 2 。2 主要试剂 实验中掰翔试剂均为阐产分析纯。 测定转氮酶活性所需的主要试剂1 3 7 1 p a l ：磷酸盐缀冲溶液( p h = 7 4 ，p h = 7 5 5 ) ； 0 。4 m 及1 m 缀氧化钠溶波；0 。0 2 2 ，舢二硝基苯肼滚泼；丙酮酸钠标准溶液( 缳毫拜舍 2 m g 嚣黎酸镄) ；谷嚣转氨戆( g i r l ) 疯糖液；谷鼙转氮酶( g o t ) 底物滚。 测定过氧化氯酶活性所需的主要试剂f 3 9 l ：6 7 m m o l l 磷酸盐缓冲溶液( 口h 。7 4 ) ； 6 5 , u mh 2 0 2 基质液；3 2 4 m 镏酸铵溶液。 测定髓璩薅酶活淫掰爨熬圭要试麓l 嘲：疆毪羟羧滚滚( 等髂积熬釜襞羟胺溶液与氢 氧化钠溶液混合) ；0 3 7 m 三氯化铁溶液；盐酸溶液( 1 ：2 ) ；0 0 1m 磷酸盐缓冲溶液( p h 一7 2 ) ；乙酰版碱标准应用液。 测定蛋自获含量所爨戆主要试裁刚：0 0 5 m 氢氧像镳浚液；0 0 3m 磷酸盐缀穗溶渡 ( p h = 7 8 ) ；2 0 0 t g m l ，j 、牛斑清白蛋自标准溶液；f o l i n 试裁甲；f o l i n 试裁己标准应用 液。 1 3 增温试验 将戮莽激发失2 5 _ + 0 5 躲受试鱼溅援缝授入到手 滠本浴中，鲶理湿度分裂必2 8 c 、 3 1 。c 、3 4 。c 、3 7 ，处理时闽为2 4 h ( 戏l h ) 。受试鑫鲫鱼在各熬冲击温度下均保持正 常游动。 1 4 酶撵的制取 1 4 1g p t 和g o t 酶样的制取 扶鳃蘩挞凝心魅盎榉( 蔟审渥考少豢勰孛_ 夔) ，登予离心警孛，爨2 0 0 0 r t m i n 嵩一l , 5 m i n ， 取上清液，镣测。再剽离肝脏和肾脏，闲滤纸吸干，称重，各取0 , 1 9 于玻璃匀浆器内， 按1 ：5 ( w v ) 加入1 4 冷0 2 5 m o l l 的蔗糖液，匀浆，以2 0 0 0r r a i n 离心5 m i n ，取上清 波，再用0 2 5 m o l l 的蔗糖渡分别稀释，爨于1 - 4 c 臻境中，待测。 1 4 2c a t 酶样的制取 从鳃部抽取心脏血样( 其中混有少擞鳃中血) ，置于离心管中，以1 5 0 0 r m i n 离心5 m i n ， 驭上凑滚，耱滚。再裂离掰驻寒鹜照，麓滤纸嚷手，备数终0 1 9 予玻璃匀浆嚣痣，按 1 ：5 ( w v ) 加入冷6 7 m m o l l 磷酸盐缓冲溶液( p h = 7 a ) ，匀浆，以1 5 0 0 r h n i n 离，05 m i n ， 取上清液，暨午1 - 4 c 环境中，待测。 1 , 4 , 2a c h e 酶榉瓣裁取 从鱼头背丽剥去顶骨，取约0 1 9 的鱼脑，用滤纸吸干，放入匀浆器内用0 0 1 m 磷酸 赫缓冲溶液( p h = - 7 2 ) 匀浆t 然后再用该磷酸盐缓冲溶液稀释，至2 m g m l 的脑组织液， 敷在试警内务翅。 1 5 酶活性的测定 1 , 5 , 1g p t 透馊酶溅定 采用改趣的赖氏比色 灏【朔。酶提取波中的g p t 作用于底物中的d l - 丙氨酸和a 酮 戊二酸，生成丙酮酸及谷氮酸，丙酮酸岛2 , 4 - - - 硝基攀肼作用，形成苯腙，在5 2 0 n m 波 长下魄惫溅定蒸暖羧篷，逶过测定秀黎羧豹鸯萋寒麓定g p t 戆活力。 标准曲线制备：取1 0 m 试管6 支，分别向各管巾加入丙酮酸橱；准溶液o ( 对照管) 、 0 0 5 、0 1 、o 1 5 、0 2 、0 2 5 m i ；g p t 底物液0 5 、0 4 5 、0 4 、0 3 5 、0 3 、0 2 5m l ；0 1 m 磷酸盐缓 申溶液( p h = 7 4 ) 备加0 。1m l 2 , 4 二凑基笨黪溶滚器擞0 5m l ，放入3 7 c 水 浴审傈溢2 0 分铮；取出务翻0 4 mn a o h5 m l ，1 0 r a i n 后瑶l c m 魄色杯，在5 2 0 r i m 波长 下，以蒸馏水调节零点，谶行比色测定。以各管丙酮黻体积为横坐标，以相应的吸光度 4 麓值为纵坐标，绘制标准曲线。 g p t 活性的测定：取1 0 m l 试管2 支，按下表顺序操作。于1 0 r a i n 后，按照制作标 蒎藏线粒毙愁条耱毙色测定。曩测定警鹣吸兜筐壤去慰爨警吸巍德，并逶遘耘壤鳆线套 一_ 出相应的丙酮酸含量。 底物液3 7 c 水酶液3 7 水2 ，4 - 二礴基酶液3 7 1 2 水0 4 m 试剂 ( n i l ) 浴加热( m 1 ) 漤魉燕苯肼( r a t ) ( n i l ) 涤趣熬n a o h ( 棘) 瓣定管 ：o j ，蛐兰 3 0 r a i n 慧0 一1 寺对照管 1 5 , 2g o t 瀵瞧斡溅定 仍采用改良的赖氏比魏法。酶撬取液中的g o t 则作用予疯物中的d “哭冬氨酸 和a 酮戊= 酸，生成草酰矗酸及谷氨酸，草酰乙酸谯碱性溶液中w 脱羧成丙酮酸盐。丙 酮酸与2 , 4 ：硝基苯辨作飕，形成苯腙，在5 2 0 n m 波长下比色测定其吸l | 芟筐，逶遘测定 丙酮酸静含豢来确定g o t 豹活力。 g o t 活性的测定同g f f 活性的测定，仅底物液改变，底物与酶液反应的3 7 。c 水浴加 热时间为6 0 r a i n 。 1 5 3c a t 活毂的溯定 采用钼酸铵比色法【期。即在最佳酶阪应条件下，酶提取液中的c a t 与h 2 0 2 反应后 裁余的珏2 0 2 姆锢酸铵形成穗定匏黄色笈会物，其颜色熬深浅与酶添性戚反比。 6 鼯mh 2 0 2 基质液在3 7 东浴颈溢5 r a i n ，空白蒋& ：期1 0 m l 魄基质液t 1 0m l 钢酸铵溶液，0 2 m l 血清；绽自管b 2 ：加1 0 r a l h 2 0 2 熬质液，1 0 m l 镅酸铵溶液，o 2 m l 6 7 m m o l l 磷黢盐缓冲溶液( p h - - 7 4 ) ；测定管u ：加o 2m l 血清，1 0 m l h 2 0 2 綦质液， 3 7 拳浴猴确保渥6 0 s ( 渡移表谤酵) 繇，立帮热入1 , 0 r a l 锯袋铰溶滚摇玺，1 0 m i n 螽 用l c m 比色杯，在4 0 5 n m 波长下，以蒸馏水调节零点，进行比色测定。 1 5 。4 a c h e 活性的测定 采爱碱髋羟胺沈色法i 删。邵鱼藏中静疆碱耱酶与乙酰艟碱反致，酶诞复澎麓来被反 应的乙酰胆碱与碱性羟胺作用生成羟肟黻，在酸性条件下羟肟酸姆三氯化铁作用嫩成深 褐色铁络合物，其颜色深浅与乙酰胆碱成正比。通过比色定量间接地测出a c h e 的活性。 耘准藩缓蒋l 餐：取1 0 m l 试营6 支，分弱舞冬管皆攘入乙羲麓藏标疆应趸滚0 ( 对 照管) 、0 2 m l 、0 4 m l 、0 6 m l 、0 8m l 、1 0 m l ；0 0 1 m 磷酸盐缓冲溶液( p h = 7 2 ) 2 m l 、 1 s m l 、1 6 m l 、1 2 m l 、1m l 摇匀：各加碱性羟胺溶液4 m l ，振摇3 r a i n 加1 ：2 盐酸溶 波2 m l ，振摇1 r a i n ；加2 m l0 + 3 7 m 三筑纯铁溶渡，程5 2 5 n m 波长下黻试剂空是调节零 赢，予2 0r a i n 痰遗行篦色渊定，绘裁标壤魏线。 a c h e 活性的测定：取l m l 乙酰胆碱标准应用液予试管内，樽加入l m l 脑缎织液， 5 放入3 7 。c 水浴中2 0 m i n ，取出试管，立即加入碱性羟胺溶液4 m l ，充分搅拌1m i n 后加 入1 ：2 盐酸溶液2 m l ，再加入2 m l0 3 7 m 三氯化铁溶液充分搅拌，立即用快速滤纸过 滤，除去蛋白质，把滤液装入2 c m 比色杯中，在5 2 5 n m 波长下以试剂空白调节零点， 于2 0 r a i n 内进行比色测定。 1 6 酶样蛋白含量测定 小牛血清白蛋白标准曲线制备【4 1 】：取1 0 m l 试管7 支，分别向各管中加入2 0 0 z g m l 小牛血清白蛋白标准溶液0 1 m l 、0 2 m l 、0 3 m l 、0 4 m l 、0 5 m l 、0 7 m l 、0 9 m l 0 0 3m 磷酸盐缓冲溶液( p h = 7 8 ) 0 9 m l 、0 8 m l 、0 7 m l 、0 6 n i l 、0 5 m l 、0 3 m l 、0 1 m h 再取 一支1 0 r a l 试管，加入l m l0 0 3m 磷酸盐缓冲溶液( p h = 7 8 ) 做空白对照；于上述各管 中加入l m l 试剂甲，并不时地进行振荡，1 0 m i n 后再加入4 m l 吐n 试剂乙标准应用液， 立即摇匀放入5 5 水浴中保温5 m i n ，取出后用自来水冷却1 r a i n ，在6 5 0 r i m 波长下，以 蒸馏水调节零点，进行比色测定，绘制标准睦线。 蛋自质含量的测定【4 1 】：取1 0 m l 试管2 支，各加入2 0 0 ”g m l 小牛血清白蛋白标准溶 液，以下操作与标准曲线制作方法完全一样，根据标准曲线可以查得此稀释蛋白质的浓 度( 平行样数为5 ) 。 1 7 结果计算与数据处理 实验数据用统计学方法进行处理1 4 2 j ，所给的结果均为( 平均数士标准差) ；增温处理 组与对照组( 驯温2 5 鱼) 之间的比较采用t 检验( n = 5 ) ；p 0 0 5 ) 。 暴露于2 8 、3 1 、3 4 热冲击温度2 4 h 后，金鲫鱼各组织中o p t 活性的变化情 况如表1 、图l 。雄鱼肝脏、肾脏和血清中o p t 活性在2 8 、3 1 、3 4 时均与2 5 对照组相比无显著差异o 0 0 5 ) ，从图1 中能看出，肝脏中酶活性的变化趋势与肾脏基 本相同，而与血清相反关系。雌鱼肝脏、肾脏中g p t 活性在2 8 和3 l 时均与对照组 相比无显著差异0 0 0 5 ) ，在3 4 热冲击状态下，肝脏g t p 活性与2 5 对照组相比升 高1 2 8 2 ，具有差异显著q 如0 5 ) ，肾脏g t p 活性与2 5 对照组相比升高1 4 9 4 ，具 有差异极显著0 0 0 5 ) 。 可见，雌体肝脏和肾脏中o p t 活性对热反应更为敏感。 表1 增温2 4 h 对金鲫鱼组织g p t 活性的影响 ( 单位：* m o l g 3 0 m i n ) n = 5 ，与2 5 ( 2 比较差异显著o 0 0 5 ) ，与2 5 ( 2 比较差异极显著c o o 0 5 ) ，在3 1 热冲击时比对照组降低1 2 2 9 ，具有极显著差异o o 0 5 ) ，在3 1 时与对照组相比降低8 7 9 ， 具有显著差异0 ( 0 0 5 ) ，在3 4 时与对照组相比升高2 0 3 8 ，具有极显著差异( p o 0 5 ) ，在3 4 时与对照组相比升高 1 2 7 7 ，具有差异极显著0 o 0 1 ) ；肾脏在2 8 c 、3 1 、3 4 与对照组相比分别升高 3 0 2 1 、1 3 4 3 、2 8 5 4 ，均具有差异极显著0 0 0 1 ) ；血清在2 8 与对照组相比升高 8 9 8 ，具有差异显著( p o 0 5 ) ，在3 1 。c 与对照组相比井高1 2 6 9 ，具有差异极显著 9 ui0宴。n v州甄蒜上do ( p o o i ) ，在3 4 时则与对照组相比降低9 9 1 ，具有极显著差异 0 0 1 ) 。从酶活性 变化趋势来看，雄鱼肝脏中g o t 活性的变化趋势与肾脏相同，而肝脏、肾脏组织中g o t 活性的变化趋势与血清相反；雌鱼肝脏中酶活性的变化趋势与血清相反。从酶活性变化 幅度看，雄鱼肝脏中g o t 活性与雌鱼相比，在2 8 和3 1 热冲击温度下对热的应更为 敏感：雌鱼肾脏中g o t 活性与雄鱼相比，在2 8 和3 4 c 热冲击温度下对热反应更为敏 感：雄鱼血清中g o t 活性与雌鱼相比，在2 8 和3 1 热冲击温度下对热的应更为敏感。 表2增温2 4 h 对金鲫鱼组织g o t 活性的影响 ( 单位：p m o l g 3 0 m i n ) n f f i 5 ，与2 5 ( 2 比较差异显著o 0 1 0 眄) ，与2 5 c 比较差异极显著0 0 0 5 ) ，在3 毒对与 对照组褶魄辩离1 3 3 l 稻，其有差异显耱0 曲砸) 。瓤酶活性交能趋势来看，熊惫肝脏 g o t 活性的变化趋势与舭清相反；雄鱼肾脏中g o t 活性的变化越势不明显，雌照上升 雁保持不变。从酶活性变化幅度看，雌热肝脏中g o t 活性与雄惫捐比，在l 张3 4 熬滓壹滋度爹对熬戆瘫雯梵敏感；壤鱼骛整孛g o t 添牲与雄熏攘蹴，在籍、3 l 窝 3 4 热冲击漱度下对热反威更为敏感；雄鱼血清中g o t 活性与雌徽相比，在3 4 熟冲 击温度下对热反应更为敏艨。 袭3 ：蹭溢熊对金鲫鱼组织g o t 活性酌影响( 单位q z m o ! g 3 0 m i n ) n 稻，与簦魄较差异显著e 0 5 ) ，女与2 5 c 篼鞍差异援豢藻缸& 0 1 ) ， 温度( ) 图3 增温1 h 对金鲫鱼组织内g o t 酶活性的影响 f i g u r e 3 i n f l u e n c eo fg o t a c t i v i t yi nt h eo r g a n i z a t i o no fc a r a s s l u s a u r a t u s w j t h i n c r e a s i n gt e m p e r a t u r e f o rl h 2 3 增温2 4 h 对金鲫鱼组织o a t 活性的影响 在2 5 0 5 驯温条件下( 见表4 ) ，金鲫鱼肝脏中c a t 活性最高，血清次之，肾脏中 最低。同时，不同性别的金鲫鱼同一组织中c a t 活性均无明显差异( p 如0 5 ) 。 暴露于2 8 、3 1 、3 4 热冲击温度2 4 h 后，金鲫鱼各组织中c a t 活性的变化情况 如表4 、图4 所示。雄鱼肝脏中c a t 活性在2 8 时与对照组相比升高7 6 1 8 ，具有差异 极显著o 0 o a ) ，在3 1 、3 4 时与对照组相比分别降低4 3 6 6 、4 4 9 9 ，均具有差异 极显著( p o 0 1 ) ；肾脏中c a t 活性在2 8 时与对照组相比升高1 3 6 8 4 ，具有差异极显 著( p 0 0 5 ) ；血清中c a t 活性在2 8 时与对照组相比降低2 1 8 2 ，具有差异极显著( p 0 0 1 ) ，在3 1 时与对照组相比升高 1 4 1 8 ，具有差异极显著0 o 0 5 ) 。雌鱼肝 脏中c a t 活性在2 8 时与对照组相比升高7 4 6 5 ，具有差异极显著( p 0 0 1 ) ，在3 1 、 3 4 时与对照组相比分别降低3 8 2 6 、5 7 6 7 ，均具有差异极显著( p o 0 a ) ；肾脏中 c a t 活性在2 8 时与对照组相比升高8 9 2 3 ，具有差异极显著( p 0 0 1 ) ，在3 1 时与 对照组相比升高3 0 7 7 ，具有差异极显著( p o 0 5 ) ：血清中c a t 活性在2 8 时与对照组相比降低3 6 0 9 ，具有极显著差异( p o 0 5 ) 。从酶活性变化趋势来看，雄鱼肝脏 中c a t 酶活性的变化与肾脏呈相同趋势，而与血清呈相反趋势：雌鱼c a t 酶活性变化趋 ce吊6，|0ev碰錾一oo 势大体阉雄鱼。从酶滔性变化蠛度番，雌鱼与雄鱼在2 8 c 、3 1 c 、3 4 ( 2 热冲蠢温度下， 各组织内c a t 活性交化幅度大体相当。 袋4增温2 4 h 对金鲫惫组织c a t 活性的影响 ( 单位：, u m o l m g p r l m i n ) 缀织 雄鱼 2 5 2 8 3 1 3 4 肝脏9 7 8 1 7 91 7 2 3 1 2 6 5 5 1 士1 0 7 5 3 8 士o 酊磊 蟹脏0 7 6 4 - 0 5 0l 。8 0 - + 0 3 1 *0 + 9 1 - - + 0 ，3 40 7 9 - + 0 4