（茶学专业论文）茶树红紫色芽叶中花青素组分的分离及鉴定.pdf

山东农业大学硕士学位论文 中文摘要 花青素是一类广泛存在于植物中的水溶性色素，属类黄酮化合物，具 有抗氧化、抗突变等多种生物学功能。本课题以茶树红紫色芽叶为材料， 研究茶叶中花青素类物质的分析和分离纯化方法、并对部分花青素组分的 结构进行了初步鉴定，以期为茶树紫色芽叶的发生机理、花青素单体药理 与生物学作用的研究提供分析方法和理论基础。研究结果如下： 1 、建立了茶叶花青素的h p l c 分析方法。其色谱条件为：b d sh y p e r s i l c 1 8 色谱柱；流动相a 相为2 甲酸水溶液，b 相为乙腈；洗脱梯度为：o 4 0 m i n ，b 相由1 0 - * 4 0 ；流速0 8 m l m i n ：进样量1 0 9 l ，柱温2 8 0 c ， 二极管阵列检测，检测波长5 2 0 r i m 。 2 、应用所建立的h p l c 方法分析茶叶花青素粗品，经分析可以分离 出9 个主要的色谱峰，仅有1 个峰为双组分，其余均为单组分：运用 h p l c d a d m s m s 联用技术，获得了其中7 个组分的紫外可见光谱信 息、质谱数据，同时结合文献资料报道的花青素组分的出峰顺序，推测了 茶叶花青素中5 个主要组分分别为：飞燕草3 半乳糖苷、矢车菊3 - 半乳 糖苷、飞燕草3 芸香糖苷、矢车菊3 芸香糖苷、天竺葵3 芸香糖苷，另 外2 种同分异构体的结构有待进一步确定。 3 、以矢车菊3 葡萄糖苷为标样，建立了茶叶花青素含量测定的外标 法，其标准曲线方程为：y = i 8 7 x1 07 x 8 1 3 6 0 ，r 2 = o 9 9 8 5 ，花青素含量在0 - - 0 3 0 1 t g 呈良好线性关系。经测定制备的茶叶花青素粗品纯度为3 2 o 。 4 、探讨了h s c c c 分离纯化茶叶花青素组分的方法，初步确定了适 合茶叶花青素组分分离的溶剂体系为：m t b e ：正丁醇：乙腈：水：三氟 乙酸( 3 ：1 5 ：1 ：5 ：o 0 1 5v v ) ，上相为固定相，下相为流动相；分析 型h s c c c 仪器参数为：转速1 8 0 0r m i n ，流速o 8m l m i n ，温度2 5 ， 进样体积2 0 p 1 ；半制备型h s c c c 仪器参数为：转速9 0 0 r m i n ，流速 2 m l m i n ，温度2 5 c ，进样体积2 0 m l 。 关键词：茶叶；花青素；分析方法；结构鉴定；分离纯化 茶树红紫色芽叶中花青素组分的分离及鉴定 a b s t r a c t a n t h o c y a n i n sa r eo n eo fw a t e r s o l u b l ep i g m e n t sw i d e l yt h r o u g h o u tt h e p l a n tk i n g d o m t h e y a r ec l a s s i f i e dt of l a v o n o i d sa n dc a na t t r i b u t et o a n t i o x i d a n t ，a n t i m u t a t i o na c t i v i t ya n do t h e rb i o l o g i c a lf u n c t i o n s i nt h i s a r t i c l e ，t h er e d - p u r p l et e as h o o t sw e r eu s e da sm a t e r i a l ，t h ea n a l y s i s ，i s o l a t i o n a n dp u r i f i c a t i o nm e t h o do fa n t h o c y a n i n si nt e aw e r ei n v e s t i g a t e da n ds e v e r a l c o n s t i t u e n t sw e r ei n d e n t i f i e d t h e s ew o r k sa i mt op r o v i d et h ea n a l y s i sm e t h o d a n dt h e r o t i cb a s i sf o rs t u d i e so fo c c u r r e n c em e c h a n i s mo fr e dp u r p l et e as h o o t s ， p h a r m a c o l o g ya n db i o l o g i c a la c t i v i t yo fa n t h o c y a n i nm o n o m e r t h er e s u l t sa r e a sf o l l o w s ： 1 t h eh p l ca n a l y s i so fa n t h o c y a n i n si nt e aw a se s t a b l i s h e d t h e c h r o m a t o g r a ms e p a r a t i o n sw e r ec a r r i e do u to nab d sh y p e r s i lc 1 8c o l u m n m o b i l es o l v e n t sc o n s i s t e do f2 f o r m i ca c i d a q u e o u ss o l u t i o n ( a ) a n d a c e t o n i t r i l e ( b ) ，l i n e a re l u t i o ng r a d i e n tf r o m10 t o4 0 ba t0 4 0 m i n ；f l o w r a t ew a s0 8m l r a i n ；i n j e c t i o nv o l u m ew a s10 此，c o l u m nt e m p e r a t u r ew a s 2 8 。c ，d i o d ea r r a yd e t e c t o rw a su s e da n dt h ed e t e c t i o nw a v e l e n g t hw a ss e ta t 5 2 0 h m 2 a n a t h o c y a n i n si n c r u d et e ae x t r a c tw a sa n a l y z e d b yu s i n gt h e e s t a b l i s h e dh p l cm e t h o da n d9 p e a k s c o u l db eo b s e r v e di nt h e c h r o m a t o g r a m ，a m o n gt h e s ep e a k s ，o n l yo n ep e a kc o n t a i n e dt w o a n a t h o c y a n i nc o n s t i t u e n t s ，t h e o t h e r sa r ep u r i t y ；b y u s i n gi - i p l c - d a d m s m s ，t h ei n f o r m a t i o ni n c l u d i n gu v v i s i b l es p e c t r u m ，m a s sd a t ao f7 t y p e so ft e aa n a t h o c y a n i n sw e r eo b t a i n e d o nt h eb a s i so fa b o v ei n f o r m a t i o n a n dc o m b i n e dw i t ht h el i t e r a t u r ea b o u ts e q u e n c eo fa n t h o c y a n i n si nh p l c c h r o m a t o g r a m ，f i v em a i nc o n s t i t u e n t so ft e aa n t h o c y a n i n sw e r ei d e n t i f i e da s ： d e l p h i n i u m - 3 - g a l a c t o s i d e ，c y a n i d i n - 3 - g a l a c t o s i d a s e ，d e l p h i n i u m 3 - r u t i n o s i d e ，c y a n i d i n - 3 一r u t i n o s i d ea n dg e r a n i u m 一3 一r u t i n o s i d e o t h e r w i s e ， t h em o l e c u l a rs t r u c t u r eo ft w oi s o m e rc o n s t i t u e n t si s n e c e s s a r y t ob e i n d e n t i f i e di nt h ef u t u r e 山东农业大学硕士学位论文 3 u s i n gc y a n i d i n - 3 一g l u c o s i d a s ea st h es t a n d a r ds u b s t a n c e ，t h ee x t e m a l q u a n t i t yh p l cm e t h o do ft e aa n t h o c y a n i n s w a se s t a b l i s h e d ，t h es t a n d a r d c u r v ee q u a t i o n ：y = 1 8 7 1 07 x 8 1 3 6 0 = 0 9 9 8 5 w h e n 也es a m p l e c o n t a i n e da n t h o c y a n i n sa tt h er a n g eo f0 - 0 3 0 9 9 ，t h ec u r v es h o w e di ng o o d l i n e a rr e l a t i o n s h i p n ep u r i t yo fa n t h o c y a n i n si nc r u d et e ae x t r a c tw a s3 2 0 b yu s i n gt h ee s t a b l i s h e dh p l c m e t h o d 4 t h eh s c c cm e t h o dw a sa p p l i e dt os e p a r a t ea n dp u n f ya n t h o c y a n i n si n c r u d et e ae x t r a c t t h es o l v e n ts y s t e mc o n s i s t e d o fm t b e n - b u t a n 0 1 a c e t o n i t r i l e w a t e r t f i f l u o r o a c e t i ca c i d ( 3 ：1 5 ：1 ：5 ：0 015v v ) t h eu p p e r l a y e rw a su s e da st h es t a t i o n a r yp h a s e ，t h el o w e rl a y e ra st h e m o b i l ep h a s e ；t h e i n s t r u m e n tp a r a m e t e r sf o ra n a l y t i c a lh s c c c ：r e v o l u t i o ns p e e da t18 0 0r m i n , f l o wr a t ea to 8m l r a i n ，t h et e m p e r a t u r ea t2 5 ，i n j e c t i o nv o l u m ew a s2 0 9 l ； a n df o rs e m i p r e p a r a t i v eh s c c c ：r e v o l u t i o ns p e e da t9 0 0 r m i n ，f l o wr a t ea t 2 m l m i n 。t 1 1 et e m p e r a t u r ea t2 5 ，i n je c t i o nv o l u m ew a s2 0 m l k e yw o r d s ：t e a ；a n f l a o c y a n i n s ；a n a l y s i s ；m o l e c u l a r i d e n t i f i c a t i o n ； s e p a r a t i o na n dp u r i f i c a t i o n 3 中英文对照 关于学位论文原创性和使用授权的声明 本人所呈交的学位论文，是在导师指导下，独立进行 科学研究所取得的成果。对在论文研究期间给予指导、帮 助和做出重要贡献的个人或集体，均在文中明确说明。本 声明的法律责任由本人承担。 本人完全了解山东农业大学有关保留和使用学位论文 的规定，同意学校保留和按要求向国家有关部门或机构送 交论文纸质本和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授 权山东农业大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入 有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或其他复制手 段保存论文和汇编本学位论文，同时授权中国科学技术信 息研究所将本学位论文收录到中国学位论文全文数据 库，并向社会公众提供信息服务。 保密论文在解密后应遵守此规定。 论文作者签名：鍪墼 导师签 日 名：弦钐 名：主兰匆笏 期：丝圹否、 茶树红紫色芽叶中花青素组分的分离及鉴定 引言 1 花青素化学研究进展 1 1 花青素简介 花青素( a n t h o c y a n i n ) 是一类广泛存在于植物中的水溶性色素，属 类黄酮化合物，是植物花瓣中的主要呈色物质，在植物细胞液泡不同的 p h 值条件下，使花瓣、叶片或果实等呈现蓝、红、紫和黄色等五彩缤纷 的颜色( 庞志申，2 0 0 0 ；卢钰，2 0 0 4 ；赵宇瑛，2 0 0 5 ；王振江，2 0 0 6 ；顾 红梅，2 0 0 4 ) 。对于植物而言，花青素绚丽的色泽在植物授粉和避免紫外 线伤害方面起着重要作用；对于人类而言，花青素可以作为一种天然色素， 具有安全、无毒、资源丰富的特性，已广泛应用于食品、化妆品领域。此 外，花青素也是一类具有保健功能的生物活性成分，有大量研究表明：花 青素具有抗氧化、抗突变、预防心脑血管疾病、保护肝脏、抑制肿瘤细胞 发生等多种生理功能( 李娟娟，2 0 0 7 ；徐渊金，2 0 0 6 ) 。 目前，国内外对花色苷的研究主要集中在两个方面：一是对各类植物 中花青素的种类数量的研究；二是对花青素的药理学研究( n u n o m a t e u s a ，2 0 0 2 ；a n af a f i a ，2 0 0 8 ：a n ac m a n h i t a ，2 0 0 6 ) 。本文仅对花青 素的提取、分离纯化、分析方法和结构鉴定方面的研究进展作一简要综述。 1 1 j l 花青素的种类与结构 花青素的基本结构单元为q 苯基苯并毗喃型阳离子( 见图1 ) ，由于b 环上r l 、r 2 位置的取代基不同( 羟基或甲氧基) ，形成了各种各样的花青素 苷元。在自然状态下，花青素在植物体内与各种糖结合形成苷，称为花色 苷( 杨秀娟，2 0 0 5 ) 。花色苷中的糖苷基和羟基还可以与一个或几个分子 的芳香酸和脂肪酸通过酯键形成酰基化的花色苷( m i n u s s ir c ，2 0 0 3 ) 。 还有些花色苷以c c 键与单宁氧化聚合，形成聚合花青素( r o m i n ad a n i e l a d ip a o l a - n a r a n j o ，2 0 0 4 ；a r i ac m a n h i t a ，2 0 0 6 ；n o r i h i k ot e r a h a r a ，2 0 0 1 ； g l e n d aa m a c z p o p ，2 0 0 6 ) ( 图l 、2 、3 ) 。已知天然花青素苷元有3 0 多种，在植物中常见的有六种，即天竺葵色素( p 曲、矢车菊色素( c y ) 、飞 燕草色素( d p ) 、芍药色素( p n ) 、牵牛花色素( p t ) 和锦葵色素( m v ) ( p a n a g i o t i s a r a p i t s a s ，2 0 0 8 ；王日为，2 0 0 2 ；杨正宪，1 9 9 4 ) 。茶叶中主要含前三种花 4 山东农业大学硕士学位论文 青素，另茶叶中还有花白素及由儿茶素聚合形成的原花色素( p r o a n t h o c y a n i d i n s ) ，酸性条件下两类物质可部分转化为花青素。在茶叶中还发现 一种翘摇紫苷元( 又称三策啶) 也属花青素类( 杨贤强等，2 0 0 3 ) 。迄今 为止在植物中分离鉴定的结合不同种类和数量的糖以及酰基化的花青素 种类超过6 0 0 多种。植物中新的花青苷种类的分离鉴定还在增加 ( p a n a g i o t i sa r a p i t s a s ，2 0 0 8 ) 。 茬害素 图1 最常见的花色苷以及糖酐和酰基 f i 9 1 t h em o s tc o m m o na n t h o c y a n i n sa sw e l la si t ss u g a ra n da c y la n h y d r i d e 图2 连接d 环的花青素结构 f i 9 2 t h es t r u c t u r eo ft h ea n t h o c y a n i n sc o n n e c t e db yd - r i n g h h h h h h m h h 钮 h 佣 嘲 h e 强 循 瞒 喝 螂 蛆 茶树红紫色芽叶中花青素组分的分离及鉴定 肥瞄。r 。出“ 础聊_ l - 幽 础铆。h 螂鼬”瞅螂- l 。二蝴帖铺h 峭 由够t - r 。p _ 棚嘲，岫啊 盘1 1 9 3 幺哪 m z l l 3 s _ 冀- 蕾竹蜘如雌 _ 旺l 9 翼。p 蝴撕哪埘- - 图3 c - c 聚合的花膏素结构 f i g 3 t h es t r u c t u r eo fa n t h o c y a n i n sp o l y m e r i z e dw i t hc cb o n d 1 1 2 花青素结构中的配基 与花色素成苷的糖主要有葡萄糖、半乳糖，阿拉伯糖、木糖、鼠李糖， 葡萄糖醛酸和由这些单糖构成的均匀或不均匀二糖和三糖，其中，3 单 糖苷、5 双糖苷、3 ，5 二糖苷和3 ，7 二糖苷是最常见的。花色素及其 糖苷也存在甲氧基化形式，甲氧基化的位置多数位于c 3 和c 5 ( 刘 栋，2 0 0 3 ) 。花色苷也经常以酰化的形式存在，引起酰化的主要有机酸有 咖啡酸、对香豆酸、芥子酸、对羟基苯甲酸、阿魏酸、丙二酸、苹果酸、 琥珀酸、酒石酸、没食子酸、草酸和乙酸，最常见的酰化形式是酰化取代 基与c 3 位的糖键合，或与c 6 位的羟基酯化( p a n a g i o t i s a r a p i t s a s ，2 0 0 8 ：n u n om a t e u s ，2 0 0 2 ：a r i am g o n z a l e z - p a r a m a s ，2 0 0 6 ：a n a f a r i a ，2 0 0 8 ) ( 图4 、5 ) 。 葡萄糖甄洲木糖 图4 糖结构 f i 9 4 s u g a rs t r u c t u r e 6 山东农业大学硕士学位论文 乙酸丙二酸苹果陂草酸琥珀馥酒石酸 m 妣h 沁 对香豆酸咖啡酸阿魏酸芥子酸 图5 酰化花青素的有机酸 f i g 5a c i d sa c y l a t e dw i t ha n t h o c y a n i n s 1 1 3 花青素的理化性质 没食子酸 对羟基苯甲段 花青素分子中存在c 6 c 3 c 6 高度分子共轭体系，具有酸性与碱性基 团，易溶于水、甲醇、乙醇、稀碱与稀酸等极性溶剂中。在紫外与可见光 区域均具较强吸收，紫外区最大吸收波长在2 8 0 r i m 附近，可见光区域最 大吸收波长在5 0 0 5 5 0 n m 范围内。 花青素类物质的颜色随p h 变化而变化，p h 1 时呈蓝色。茶叶细胞液呈弱酸性，故当茶芽叶花青素含量较 高时则芽叶呈紫红色( 赵保路，2 0 0 2 ；杨贤强等，2 0 0 3 ) 。 在溶液介质中，花青素会随p h 有几种结构的变换。对于一个给定的 p h 环境下，在花青素的4 种结构之间存在着平衡：蓝色的醌式( 脱水) 碱、 红色的花青素韦羊正离子、无色的甲醇假碱和查尔酮。非酰基化和单酰基 化的花青素在p h 很低时，其溶液呈红色。随着p h 的增大，花青素的颜 色将褪至无色，在高p h 条件下又会变成紫色或蓝色。但是具有两个或两 个以上酰基的花青素在整个p h 范围内都表现出了相当好的颜色稳定性。 花青素在不同外界环境所显现出来的色泽的变化，不仅取决于它的组成 ( 羟基数目、甲基化和糖基化) ，而且和它的解离状态以及是否与金属离子 ( 如f e 计，a 1 3 + ) 络合有关( 任玉林，1 9 9 5 ；m a r k a k i s ，1 9 8 2 ) 。 由于花青素具有特征性很强的c 6 c 3 c 6 碳骨架和相同的生化合成来 源，因此，人们也将花青素视为黄酮类化合物。但花青素因强烈吸收可见 光而区别于其它天然黄酮类化合物。花色素与各种糖结合形成不同的配糖 茶树红紫色芽叶中花青素组分的分离及鉴定 体。花色素及其糖苷也存在甲氧基化形式，甲氧基化的位置多数位于c r l 和c r 2 。花青素也经常以酰基化的形式存在。在酸性条件下，非酰基化 和单酰基化的花色苷的颜色在很大程度上取决于连在糖苷配基b 环上的 取代基。羟基越多，颜色越向紫移，而甲氧基化却导致红移。花青素的糖 基化和酰基化一般都具有紫移效应( 杨兆艳，2 0 0 7 ；a r i af a r i a ，2 0 0 8 ) 。 1 2 花青素的分析方法 茶叶中花青素总量测定多采用分光光度法，样品经沸水提取，加酸性 乙醇显色，生成特有的刚果红，于波长5 3 5 n m 处测吸光度，该法不受黄 酮苷及儿茶素的干扰，但受原花色素、花白素干扰，分析结果往往偏高， 灵敏度也不够理想( 钟罗，1 9 8 3 ) 。茶叶中花青素总量分析沿用此法。 已有采用h p l c 测定植物中花青素种类和含量的报道。s t r a c kd 等 ( 2 0 0 2 ) 从欧洲越桔花青素提取物中分离检测到1 6 种花色苷。孙视( 2 0 0 0 ) 等从引种越桔中检测到1 5 种花色苷，色谱分析条件为：采用a q u a p o r e r p 3 0 0 色谱柱，1 0 甲酸水溶液作a 泵流动相，体积比为1 ：1 的甲酸和 乙腈作b 泵流动相，流速l m l m i n ，柱温2 客，检测波长5 3 0 n m ，经梯度 洗脱，在6 5 m i n 内完成检测。采用矢车菊3 葡萄糖苷作对照品进行方法 考察显示：方法线性关系、重现性良好，准确度较高。成浩等利用r l o i p a l e 等的方法分析了茶叶细胞培养体系中花色苷组成，证实细胞培养系中主要 存在一种花色苷。樊谦腾( 1 9 9 7 ) 等人以h p l c 法分离山竹果壳中的花色 苷，采用野村公司的d e v e l o s i l o d s 柱( 2 5 0 2 0 r a m ) ，流动相：乙酸：c h 3 c n ： 水( 4 ：5 ：1 1 ) 的3 磷酸水溶液( 樊谦腾，1 9 9 7 ) 。j o h a n n a b a k k e r e t a l 采 用的是5 u m s p h e f i s o r bo d s 柱( 1 0 0 8 m m ) ，柱温4 0 ，流速2 m l 一m i n ，流动相1 t f a 和甲醇的线性混合物( 甲醇2 0 4 6 在4 6 m i n ) ，分 离红酒复杂的花色苷( j o h a n n ab a k k e r ，1 9 9 7 ) 。 刘超等人利用高效液相色谱法分析不同品种紫甘薯中花青素组分及 其含量，色谱柱为江苏汉邦l i c h r o s p h e r 5 c 1 s 柱( 15 0 m i n x 4 6 m m ，5um ) ， 流动相a 为1 0 0 的色谱乙腈，流动相b 为1 0 乙酸重蒸馏水溶液( v v ) ，在3 0 m i n 内流动相a 从1 0 线性增加到2 0 ；体积流量为0 3 r n l r a i n ：检测波长5 3 0 n m ；柱温3 5 ：进样量：2 0ul ，分析了紫甘薯的花 青素组分和含量( 刘超，2 0 0 8 ) 。 山东农业大学硕士学位论文 i c h i y a n a g it 用h p l c 等度洗脱法分离了欧洲越桔中的1 5 种花青素。 色谱条件：d e v e l o s i lo d s h g 柱( 4 6 m m x l 5 0 m m ) ，流动相为含0 5 三氟 乙酸的甲醇水( 2 0 ：8 0 ) ，流速2 m l m i n ，柱温4 0 ，检测波长5 2 0 n m ，进 样量1 0 0 u l 。该植物中1 5 种花青素在5 0 m i n 内完全分离。( i c h i y a n a g it ， 2 0 0 4 ) 。张军翔等人采用反相c 1 8 柱，调整流动相p h1 6 ，二元梯度洗脱， 检测波长5 1 8n i i l ，建立葡萄酒酒龄花青素h p l c 指纹图谱，区分鉴定不 同酒龄( 年份) 蛇龙珠葡萄酒( 张军翔，2 0 0 6 ) 。 王贞强等人用h p l c 法测定梅鹿辄和黑比诺葡萄中的花色素苷，色 谱条件波长5 3 5n l n ，流速1m l m i m ，柱温3 0 ，进样体积2 0ul ，流 动相：水乙腈甲酸a = 8 0 1 0 7 ，b = 4 0 5 0 7 ；梯度：om i n ，0 b ；1 5m i n , 3 0 b ；2 5m i m ，5 0 b ；3 0m i n ，0 b ；3 5m i n ，0 b ( 王贞强，2 0 0 7 ) 。 1 3 花青素的提取、分离和纯化 1 3 1 提取 通常使用酸性乙醇提取植物中的花青素，还有用三氟乙酸( t f a ) 甲 醇、醋酸甲醇溶液，最后以提取的含量最多提取方法为最佳提取方法。 提取方法的选择取决于提取的目的( 纯化学的分析、食用、药用、化 妆品化工产品等) 和花色苷本身的组成和性质。如果提取出来的色素还进 行定性或定量分析，那么应该选择一种使色素尽可能处于天然状态的提取 方法。对于提取溶剂，甲醇是最佳选择，因为甲醇提取效率比乙醇高2 0 ， 比水高7 3 。酸性溶剂在破坏植物细胞膜的同时溶解水溶性色素。最常用 的提取溶是1 的盐酸甲醇溶液，但是提取用于食品着色的花青素时，考 虑到甲醇的毒性，可以选择1 盐酸乙醇溶液。用盐酸酸化可以保持较低 p h ，有利于花青素的提取，也能保持稳定状态( 江丽芳，2 0 0 2 ) 。张玉 清等在研究桑椹花青素的时候，采用0 5 盐酸一9 5 乙醇( 1 ：1 ) 溶 液提取花色苷，通过单因子实验确定了从桑椹果实中提取花色苷的单个工 艺参数，桑椹花中花青素的适宜提取条件为：温度7 5 ；提取剂o 5 盐 酸一9 5 乙醇( 1 ：1 ) ；p h 值2 ；提取时间2 小时：料液比1 ：5 ： 提取次数3 次。得到稳定的花青素( 张玉清，2 0 0 7 ) 。刘桂玲等研究了不 同提取方法对甘薯花青素含量测定的影响，以1 盐酸作为提取剂，有利 于花青素保持结构的稳定性；延长提取时间可导致花青素的部分降解( 刘 9 茶树红紫色芽叶中花青素组分的分离及鉴定 桂玲，2 0 0 7 ) 。王二雷等在笃斯越桔中花青素含量分析中，采用0 2 5 m o l l 的h c l 与体积分数为9 5 的乙醇( 体积比1 5 ：8 5 ) 的混合溶液，提取时间为1 h ， 提取温度为6 0 。c ( 王二雷，2 0 0 7 ) 。徐亚民等以8 0 乙醇与0 2 m o l l 柠檬 酸混合物为提取剂研究了紫玉米色素提取条件，料液比为1 ：1 0 ( w v ) ，6 0 下提取2 h ( 徐亚民，2 0 0 7 ) 。 经初步浸提和过滤的花色苷提取物通常浓度很低，因此在纯化之前或 用于食品着色之前需要进行浓缩，为了防止色素的降解，最好采用真空浓 缩，温度不超过3 0 * 0 ，这样可以保持花青素含量较高( f p o m a r ，m n o v o ，2 0 0 5 ) 。 1 3 2 纯化 花青素纯化的方法有：液液萃取法、固液萃取法、薄板层析法( 钟 瑞敏，1 9 9 6 ) 、纸层析法( 石冬梅，2 0 0 3 ) 、柱色谱法( 硅胶、x a d 7 柱色谱法) ( 孙芸，2 0 0 7 ：z h a o q iz h a n g ，2 0 0 4 ) 、高效液相色谱法( s e 华， 2 0 0 5 ) 、超高效液相( 更小微粒柱) 法( t o r g i l sf o s s e n a ，2 0 0 3 ：p a n a g i o t i s a r a p i t s a s ，2 0 0 8 ) 、高速逆流色谱( m i c h a e ls c h w a r z ，2 0 0 3 ) 、制备色谱 法法等( r o b e ab y a m u k a m a ，2 0 0 5 ) 。 1 3 2 1 柱色谱法 徐杰等( 2 0 0 3 ) 利用柱层析和纸层析相结合的方法，从贵州黑糯米 稻米种皮中分离得到3 种花青素，获得了其中一种花青素的针状结晶。用 h p l c 法测出经强烈水解后的3 种花青素中的糖均为葡萄糖。测定3 种花 青素的光谱特性、荧光特性和纸层析的r f 值，并和多种花青素文献值相 比较。表明贵州黑糯米稻米种皮含矢车菊3 g 和矢车菊3 g g ，另一种未 确定。 柱层析分离提纯花花青素的填料有氧化铝、大孔吸附树脂，凝胶等。 蔡正宗等人在分析红凤菜中所含花色苷时，采将花色苷混合物浓缩后上 p o l y r c a ra t c 聚乙烯吡咯烷酮管柱，以酸化5 0 甲醇解吸，得到两种主要 花色苷( 蔡正宗，1 9 9 5 ；姜平平，2 0 0 3 ) 。蔡正宗、陈叔凰等人也采用将 色素浓缩液上b i oo e l p 2 管柱，以水( p h = 2 o ) 洗脱，再以a m b e f l i t e x a d 7 树脂柱浓缩，再过b i o g e l p 2 管柱纯化的方法获得黑米花色苷的主要成分： 芍药素3 葡萄糖苷和矢车菊3 葡萄糖苷( 蔡正宗，陈叔凰，1 9 9 6 ) 。武 山东农业大学硕士学位论文 彦文等人以葡聚糖凝胶s e p h a d e x g 2 5 做柱层析，酸化甲醇水溶液洗脱， 成功得到萝卜红色素的主要花色苷成分( 武彦文，1 9 9 8 ) 。 工业化生产纯化花色苷，利用吸附树脂纯化比较经济。国内许多学者 利用大孔吸附树脂对花色苷的纯化进行了研究。为分析目的纯化花色苷 时，花色苷纯化的传统方法是纸色谱，薄板色谱和柱色谱也用于花色苷的 纯化，z a p s a l i s a n df r a n c i s 曾用乙酸铅沉淀法和离子交换树脂法纯化花色 苷，f r a n c i s a n da n d e r s e n 曾用微滴逆流色谱( d c c c ) 纯化花色苷。高速逆流 色谱( h s c c c ) 已经用于花青素的分离和纯化。国外许多学者利用s e p p a k c a r t r i d g ec 1 8 柱、反相高效液相色谱( r p h p l c ) $ i 半制备高效液相色谱 对花色苷成功的进行了纯化( a r i ac m a n h i t a ，2 0 0 6 ；g l e n d aa m a c z p o p ， 2 0 0 6 ) 。 1 3 2 2h s c c c 法 高速逆流色谱是一种连续高效的液液分配色谱技术。由于不需要固 体支撑体，物质的分离依据其在互不相溶的两相液体中的分配系数的差异 而实现，因而避免了固体固定相不可逆吸附而引起的样品损失、失活、变 性等问题，样品回收率高，回收的样品更能反映其本来的特性，特别适合 于天然产物中有效成分的分离。( 李爱峰，2 0 0 8 ；贵晓霞，2 0 0 8 ；江和源，2 0 0 5 ) 袁黎明等应用氯仿甲醇磷酸二氢钠缓冲液( 2 3 m m o l l ，p h = 5 6 ) ( 4 3 2 ，v ) 溶剂系统，分离绿茶中总生物碱提取物，以上相作固定相， 下相作流动相。结果表明该逆流色谱技术可以较好地分离、纯化茶叶中的 三种生物碱，具体逆流条件为流动相流速2 m l m i n ，逆流色谱仪器转速 7 0 0 d m i n ，在线检测波长为2 5 4 n m ，一次性分离5 0 m g 总生物碱提取物， 进样体积为2 m l 。试验结果还表明，d h 在5 6 时分离效果最好。( 江和源， 2 0 0 3 ；1 9 9 9 ) 杜琪珍等( 2 0 0 4 ) 应用甲基叔丁基醚正丁醇乙腈水三氟乙酸( 1 ： 4 ：1 ：5 ：o 0 l ，v ) 溶剂系统，以上相做固定相，下相为流动相，分离 了越橘中的花青素，转速在6 5 0 r m i n ，流速是1 5 1 m m i n ，一次进样 5 0 0 m g 2 0 m l ，成功分离了5 种花青素单体。 1 4 花青素的结构鉴定 1 4 1 花青素的光谱特征 茶树红紫色芽叶中花青素组分的分离及鉴定 紫外可见光谱很早就被人们应用于花色苷的结构鉴，该法主要有如 下几点：花色苷最大吸收波长一个在可见光区的5 0 0 5 4 0 n m 附近，另一 个在紫外2 7 5 n m 附近，通过测定色素的最大吸收波长即可判断是否为花 色苷类色素。如果向花青素的0 0 1 盐酸甲醇溶液中滴加3 5 滴a i c l 3 甲 醇或乙醇溶液，出现蓝移，即最大吸收波长增加，说明b 环有邻位酚羟 基，即可区分b 一环无邻位酚羟基的天竺葵色素、芍药色素、锦葵色素和 b 环有邻位酚羟基的矢车菊色素、牵牛花色素、飞燕草色素。根据花色苷 最大吸收波长处的吸光度和4 4 0 n m 处的吸光度的比值a 4 4 0 a m 积，参考文 献后、可以判断糖苷的位置。根据花青素在3 0 0 3 3 0 n m 间有无吸收峰可 判断该色素分子是否有酰基，如果有吸收峰，表明该色素有酰基存在。根 据花色苷在4 4 0 r m a 处是否有肩峰，可以判断该色素5 号位的羟基是否被 取代。如果5 号位的羟基没有被取代，则该色素在4 4 0 n m 处有肩峰。根 据花色苷在紫外光下是否有荧光，可判断该色素是否在5 号位有取代基， 如果有荧光则表明该色素在5 号位有取代基( 徐杰，林正眉，3 0 0 3 ) 。目 前，红外吸收光谱应用于花青素的结构鉴定不太广泛。花色苷的红外光谱 主要有苯环、含氧杂环、糖和羟基甲氧基四部分。李景琳、吴信子曾用红 外吸收光谱对蓝靛果花色苷进行研究。 1 4 2 花青素结构鉴定的进展 花青素结构最早由b a t e s m i t h 引入纸色谱方法进行鉴定，后来， h a r b o m e 系统总结了利用纸色谱进行花色苷定性的方法，并提供了大量有 价值的数据。完整的结构表征一般包括：糖苷配基的鉴定、糖和酰化基团 ( 如果有的话) 的鉴定以及糖和酰化基团的连接位置的确定( p a n a g i o t i s a r a p i t s a s ，2 0 0 8 ；q i n g g u ot i a n ，2 0 0 5 ；n o r i h i k ot e r a h a r a a ，2 0 01 ) 。 随着分析技术的进步，越来越多的方法应用于花色苷结构鉴定。如气 相色谱( o c m s ) 、质谱联用( l c m s ) ( 刘密新，杨成对，2 0 0 4 ) ，( 樊金 玲，2 0 0 7 ；张正竹，2 0 0 5 ；j y o t h im v e i g a sa , 2 0 0 7 ；s e i c h h o m ，p w i n t e r h a l t e r ，2 0 0 5 ) 快速原子轰击质谱f f n b m s ) 、飞行时间质谱( t o f - m s ) 等可以精确测定花色苷的分子量，( f u m it a t s u z a w a ，2 0 0 8 ；t a k a s h i i c h i y a n a g i ，2 0 0 8 ) 紫外光谱、( o l e n d aa m a c z p o p ，2 0 0 6 ) h 枷和 c - n m r 适用于丙二酸酰基化的花色苷结构鉴定( g l e n d aa 山东农业大学硕士学位论文 m a c z 。p o p ，2 0 0 6 ；f p o m a r ，m n o v o ，a m a s a , 2 0 0 5 ； r o m i n ad a r d e l ad i p a o l a - n a r a n j o ，2 0 0 4 ) 。 2 本课题研究的目的、意义 在人类健康逐渐成为焦点问题的今天，茶叶因其多种医疗保健功能而 被越来越多的消费者接受和喜爱。茶叶对人体健康最有益的物质是茶多酚 类物质( t e ap o l y p h e n n o l s ，t p ) ，其含量通常可达18 3 6 ( 干重) ( 赵保 路，2 0 0 2 ；m i n u s s ir c ，e t a l ，2 0 0 2 ；韩驰，2 0 0 3 ) ，茶叶中的茶多酚是由黄烷 醇类( 儿茶素类) 、花色素类( 花青素和花白素) 、花黄素类( 黄酮及黄 酮醇类) 、酚酸及缩酚酸类组成( 杨贤强王岳飞，2 0 0 3 ) 。花青素是一 类具有保健功能的生物活性成分，大量研究表明：花青素具有抗氧化、抗 突变、预防心脑血管疾病、保护肝脏、抑制肿瘤细胞发生等多种生理功能 ( 方忠祥倪元颖，2 0 0 1 ；王日为，2 0 0 3 ) 。 山东茶树在春末到整个夏季生长过程中，因光照、温度、营养等条件 的影响，茶树新梢中紫色芽叶发生较多，已有研究表明：茶树紫色芽叶中 含有的花青素类物质是其呈紫色的主要原因( 王日为，2 0 0 3 ) 。研究茶树 生长过程中花青素苷的发生机理与制茶过程中花青素苷的变化具有重要 意义。作为茶叶中一类具在重要生物学作用的多酚类物质，迄今为止，对 茶叶中花青素的分离与分析方法、组成和结构的研究未见报道。 本课题以茶树红紫色芽叶为材料，研究花青素类物质的分析方法，并 对花青素组分进行初步分离纯化和结构鉴定，为茶树紫色芽叶的发生机 理、高含量花青素茶树品种的培育、高花青素特种花的研制、花青素单体 药理与生物学作用的研究提供依据。 茶树红紫色芽叶中花青素组分的分离及鉴定 第一章茶树红紫色芽叶中花青素h p l c 分析方法的建立 作为一类多酚类物质，花青素种类繁多，广泛存在于自然界的许多植 物中，不同类型的植物、同一类植物的不同品种，其花青素的组成与含量 不同，为了研究茶叶中花青素组成和含量、不同环境条件和加工过程中茶 叶花青素含量的动态变化规律，必须建立一种准确、灵敏、快速稳定的花 青素分析方法，而目前普遍应用的酸性乙醇比色法无法满足上述要求。对 葡萄、葡萄酒、越桔等材料中的花青素组成与含量的h p l c 分析方法的研 究已有报道( 王振江，2 0 0 6 ；顾红梅，2 0 0 4 ) 。本实验旨在建立一种茶叶 中花青素组成与含量的h p l c 分析方法。 1 材料与方法 1 1 材料 、于2 0 0 7 、2 0 0 8 年夏季在山东省日照市黄山群体种茶园中采摘红紫色 芽叶( 1 芽2 、3 叶) ，蒸汽固样l m i n ，8 0 。c 烘干，剪碎，于2 0 冰箱中 低温保存。 ， 1 2 仪器与试剂 仪器：k q3 2 0 0 b 型超声波清洗器( 昆山市超声仪器有限公司) ， r e 5 2 a a 旋转真空浓缩仪( 上海亚荣生化仪器厂) ，真空冷冻干燥仪 ( l g j 1 8 s 型) ，d h l 电脑恒流泵( 上海湖沪西分析仪器有限公司) ， s b s 1 0 0 数控计滴自动部分收集器( 上海湖沪西分析仪器有限公司) ； f i n n i g a ns u r v e y o r ( 菲尼根l c q ) 型高效液相色谱仪，包括四元梯度泵、 自动进样器、柱温箱、光电二极管阵列检测器、自动脱气机： 试剂：甲醇、三氯甲烷、乙酸乙酯、盐酸( 均为分析纯) 、乙腈、甲 酸、三氟乙酸、磷酸( 均为色谱纯) 、矢车菊3 葡萄糖苷花青素标准品 ( 天津一方科技，纯度9 9 ) o 1 3 花青素粗品的制备 山东农业大学硕士学位论文 取茶叶红紫色芽叶样品5 0 9 ，置于5 0 0 m l 的三角瓶中，加入2 0 0 m