（遗传学专业论文）棉花ghmapk6的表达及功能分析.pdf

硕士学位论文 m a s t e r st h e s i s m i i iii i i q l ll lliqlli i i i ii i l l l1111 18 9 8 7 0 2 华中师范大学学位论文原创性声明和使用授权说明 原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师指导下，独立进行研究工作 所取得的研究成果。除文中已经标明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或 集体已经发表或撰写过的研究成果。对本文的研究做出贡献的个人和集体，均已在 文中以明确方式标明。本声明的法律结果由本人承担。 作者签名：骆蜗 日期：? , o i l 年- 6 月f 日 学位论文版权使用授权书 学位论文作者完全了解华中师范大学有关保留、使用学位论文的规定，即：研 究生在校攻读学位期间论文工作的知识产权单位属华中师范大学。学校有权保留并 向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许学位论文被查阅和借阅； 学校可以公布学位论文的全部或部分内容，可以允许采用影印、缩印或其它复制手 段保存、汇编学位论文。( 保密的学位论文在解密后遵守此规定) 保密论文注释：本学位论文属于保密，在年解密后适用本授权书。 非保密论文注释：本学位论文不属于保密范围，适用本授权书。 作者签名： 凳蛹 日期：加j 1 年6 月f 日 导师签名： e l 期：伽f 阵6 月 豸 e l 本人已经认真阅读“c a l i s 高校学位论文全文数据库发布章程”，同意将本人的 学位论文提交“c a l i s 高校学位论文全文数据库 中全文发布，并可按“章程 中的 规定享受相关权益。 作者签名：臻 日期：劢f j 年6 月1 日 日期：牌月日 硕士学位论文 m a s t e r st h e s i $ 摘要 促分裂原激活蛋白激酶( m a p k ) 是细胞内重要的信号分子，它是以蛋白磷酸化 的形式将细胞外的刺激信号传递到细胞内，同时特异性地放大信号，并引起细胞反 应的一类酶蛋白信号系统。m a p k 级联系统具有高度的保守性，包括3 种蛋白激酶： 即m a p k ，m a p k k 和m a p k ，这3 种激酶通过各种途径将上游的信号受体和下游 的效应器联系起来。m a p k k k 是这个磷酸化途径的第一部分，它能够通过磷酸化丝 氨酸和苏氨酸残基来激活m a p k k ，而m a p k k 又通过磷酸化t - l o o p 的苏氨酸和酪氨 酸残基来激活m a p k 。 脱落酸( a b a ) 是一种重要的植物激素，它在种子的形成、萌发、休眠、幼苗的 生长过程中具有重要的调控作用。另外，a b a 在植物对环境的胁迫响应中也具有重 要作用。大量实验表明，在a b a 的信号转导途径中m a p k 发挥重要作用，m a p k 参 与并介导了a b a 对胁迫的调控。植物中的m a p k 与各种生理、发育和激素反应相 关。进一步的研究表明，病原体、伤害、低温、干旱、渗透、高盐和活性氧都可能 引起m a p k 在转录和蛋白水平及酶活性的改变。实验证明，a b a 能诱导h 2 0 2 的合成， 而h 2 0 2 作为逆境胁迫应答中的一个信号分子，在逆境胁迫应答中能激活一些 m a p k 。本研究从棉花e d n a 文库中分离得到一个编码m a p k 蛋白的基因( 命名为 g h a 私p k 6 ) ，对该基因的表达及功能等方面进行了分析，取得如下主要研究结果： 1 g h m a p k 6 基因的分离克隆及其编码的蛋白质序列分析 从棉花e d n a 文库中分离克隆了1 个编码m a p k 蛋白基因的c d n a ，与拟南芥 中a t m a p k 6 的同源性高，因此命名为g 忍 纠p k 6 。同时，利用p c r 技术从棉花基 因组中分离了长3 9 0 7 b p 的g h m a p k 6 基因全长序列，通过与c d n a 序列比较分析 发现，g h m a p k 6 基因的全长结构由6 个外显子和5 个内含子组成。序列比较和进 化分析结果表明，g h m a 尸膨基因编码的蛋白属于a 类m a p k 蛋白。 2 g h m a p k 6 基因在棉花中的表达分析 利用q r t - p c r 技术，对g h m a p k 6 基因在棉花组织中的表达模式进行了研究。 结果表明，g h m a p k 6 在棉花组织中呈组成型表达，在各组织中都有表达，其中在 根和下胚轴中表达量相对较高。逆境胁迫实验表明，g h m a p k 6 在高盐和干旱胁迫 下，在根中表达水平升高。而且，g 胁纠纠断表达量随着a b a 处理的时间变化而变 化，a b a 处理l h 后该基因表达水平开始升高，到5 h 时达一个最大值。据此推测 g h m a p k 6 可能参与a b a 应答。 3 g h m a p k 6 蛋白定位于细胞质 硕士学位论文 m a s t e r st h e s i s 利用e g f p 报告基因，构建这个基因o r f 区域与p 觎p 的融合表达载体，研究 g h m a p k 6 的亚细胞定位。将g h m a p k 6 - e g f p 转化棉花下胚轴，获得棉花愈伤组 织。利用激光共聚焦显微技术，观察g h m a p k 6 g f p 融合蛋白的定位情况，结果表 明，g h m a p k 6 定位在植物细胞的细胞质中。 4 过量表达g h m a p k 6 基因能恢复拟南芥t - d n a 插入突变体a t m k k l 的表型 为了研究g h m a p k 6 基因的功能，将g h m a p k 6 基因导入t - d n a 插入突变体 a t m k k l 拟南芥，获得转基因植株。通过潮霉素抗性筛选及r t - p c r 分析表明， g h m a p k 6 在转基因拟南芥植株中过量表达。得到纯合体后用于实验分析，结果表 明，g h m a p k 6 基因过量表达能互补和恢复拟南芥a t m k k l 的缺陷表型，使该突变体 回复到野生型。据此，推测g h m a p k 6 可能与a t m a p k 6 的功能类似，参与a b a 介 导的植物过氧化物酶基因c a t l 表达及h 2 0 2 生成的调控。 关键词：棉花；m a p k 基因；过量表达；a b a ；敏感 n 硕士学位论文 m a s t e r st h e s i s a b s t r a c t t h em i t o g e n a c t i v a t e dp r o t e i nl 【i n a s e ( m a p k ) c a s c a d ei si n v o l v e di nv a r i o u sb i o t i c a n da b i o t i cs t r e s sr e s p o n s e s ，h o r m o n er e s p o n s e s ，c e l lp r o l i f e r a t i o n ，d i f f e r e n t i a t i o n , a n d d e v e l o p m e n t a lp r o c e s s e si np l a n t s at y p i c a lm a p kc a s t l ec o n s i s t so ft h r e es t e p s ：a m i t o g e n a c t i v a t e dp r o t e i nk i n a s e k i n a s ek i n a s e ( m a p k k k ) a c t i v a t e sap a r t i c u l a r m i t o g e n - a c t i v a t e dp r o t e i nk i n a s ek i n a s e ( m a p k k ) t h r o u g hp h o s p h o r y l a t i o no nt w o s e r i n e t h r e o n i n er e s i d u e si nac o n s e r v e ds 厂i x 3 5 一s tm o t i f , a n dt h e nt h ea c t i v a t e d m a p k kc a l li nt u r np h o s p h o r y l a t eam a p ko nt h r e o n i n ea n dt y r o s i n er e s i d u e si nt h e i n v a r i a n ts e q u e n c et x y a b s e i s i ea c i d ( a b a ) i sa ni m p o r t a n tc e l l u l a rs i g n a la n ds t r e s sh o r m o n e i tp l a y s c r u c i a lr o l e si nr e p o r t i n ge n v i r o n m e n t a ls t r e s s e s ，i n i t i a t i n gs t r e s sr e s p o n s e sa n d p r e p a r i n g p l a n t st oc o p e 、析n lt h es t r e s s e s e v i d e n c ef o ra b ai nt r i g g e r i n gt h ep r o d u c t i o no fh e 0 2 h a sb e e np r o v i d e d , a n dh 2 0 2h a sb e e ns h o w nt ob eas i g n a lm e d i a t i n gv a r i o u ss t r e s s t o l e r a n c er e s p o n s e s n l er e s p o n s ec h a i n sf o l l o w i n ga b i o t i cs t r e s s e st h a ta l t e rm a p k s i g n a l i n gm a y ，i nf a c t , b em e d i a t e da tl e a s ti np a r tt h r o u g ho x i d a t i v ep r o c e s s e s ，b e c a u s e h 2 0 2h a sb e e ns h o w nt ob ea b l et oa c t i v a t et h e s em a p k s i nt h i st h e s i s ，o n eg e n e e n c o d i n gm a p kp r o t e i nw a si s o l a t e df r o mc o t t o nr o o t sc d n al i b r a r y ，d e s i g n a t e d g h m a p k 6 0 u rs t u d i e s m a i n l y f o c u s e do nt h e c l o n i n g ，e x p r e s s i o n , s u b c e l l u l a r l o c a l i z a t i o na n dt h ef u n c t i o n a la n a l y s i s n l em a i nr e s u l t sa r ea sf o l l o w s ： 1 i s o l a t i o na n dc h a r a c t e r i z a t i o no fg h 纠p 硒 b ys c r e e n i n gt h ec o t t o nc d n al i b r a r y ，o n ee d n ae n c o d i n gm a p kp r o t e i nw a s i s o l a t e d t h ep u t a t i v em a p kc l o n ef r o mc o t t o ne x h i b i t e dh i g l ll e v e l so fs e q u e n c e s i m i l a r i t yt oa r a b i d o p s i sa t m a p k 6 , s ot h en o v e lc o t t o nm a p kg e n ew a sd e s i g n a t e d 私 g h m a p k 6 a3 , 9 0 7 - b pg e n o m i cf r a g m e n to fg h m a p k 6w a si s o l a t e df r o mc o t t o n g e n o m i cd n ab yp c r , u s i n gg e n e s p e c i f i cp r i m e r s c o m p a r i s o no ft h es e q u e n c e s b e t w e e nt h eg h m a p k 6g e n o m i ec l o n ea n di t se d n ar e v e a l e dt h a tf i v ei n t r o n sw e r e p r e s e n t i nt h e g e n e p h y l o g e n e t i ca n a l y s i sr e v e a l e dt h a tg h m a p k 6s h a r e dh i 曲 s i m i l a r i t i e st oa t m a p k 6 ，n t s i p ka n dn b s i p k , w h i c hw e r ea l lg r o u pam e m b e r s 2 g h m a p k 6e x p r e s s i o nw a si n d u c e db ya b a ，s a l ta n dd r o u g h ts t r e s s e s t oe v a l u a t et h er o l eo ft h ei s o l a t e dg h m a p k 6g e n ei np l a n t s ，w ef i r s ta n a l y z e di t s e x p r e s s i o np a t t e r n q u a n t i t a t i v ep c ra n a l y s i ss h o w e dw i d e s p r e a de x p r e s s i o no f g h m a p k 6g e n ei nc o t t o nt i s s u e s ，w i t hr e l a t i v e l yh i g hl e v e l si nr o o t sa n dh y p o c o t y l s t o i n v e s t i g a t ew h e t h e rg h m a p k 6e x p r e s s i o ni sr e g u l a t e db ya b i o t i cs t r e s s e s ，c o t t o n s e e d l i n g s w e r e s u b j e c t e d t o n a c l ，p e g ( p o l y e t h y l e n eg l y c o l4 0 0 0 ) a n da b a t r e a t m e n t s t h e e x p r e s s i o n l e v e l so fg h m a p k 6w e r e s i g n i f i c a n t l yu p r e g u l a t e db y d r o u g h ta n dn a c i i np a r t i c u l a r , t h et r a n s c r i p t i o n a ll e v e lo fg h m a p k 6w a su t m o s t l y i n c r e a s e da f t e ra b at r e a t m e n t a f t e ra b at r e a t m e n tf o r1h o u r ，g 办拗引陌t r a n s c r i p t s b e g a n t ob ea c c u m u l a t e di nr o o t s ，a n dr e a c h e di t sh i g h e s tl e v e l sw i t h i n5h o u r s t h e s e r e s u l t ss u g g e s t e dt h a tg h m a p k 6m a yb ei n v o l v e di np l a n tr e s p o i l s et oa b as i g n a l i n g 3 g h m a p k 6p r o t e i nl o c a l i z e si nc y t o p l a s m t oi n v e s t i g a t et h es u b c e l l u a rl o c a l i z a t i o no fg h m a p k 6p r o t e i n ，g r e e nf l u o r e s c e n t p r o t e i n ( g f p ) f u s e d t oc - t e r m i n a lo ft h eg h m a p k 6w a se x p r e s s e di nc o t t o nc a l l u sc e l l s u n d e rt h ec o n t r o lo fac a u l i f l o w e rm o s a i cv i r u s35 sp r o m o t e r t h ee x p e r i m e n t a lr e s u l t s r e v e a l e dt h a tg m 脚k 6 ：e g f pf l u o r e s c e n c es i g n a l sw e r ed e t e c t e do nc y t o p l a s mo ft h e t r a n s f o r m e dc e l l s t h er e s u l t ss u g g e s t e dt h a tt h eg h m a p k 6p r o t e i nm a yl o c a l i z ei n c y t o p l a s m 4 o v e r e x p r e s s i o no fg h m a p k 6r e c o v e r st h ew i l d t y p ep h e n o t y p eo fa t m k k l m u t a n t t oi n v e s t i g a t ei t sr o l ei np l a n t s ，g h m a p k 6u n d e rt h ec o n t r o lo fc a u l i f l o w e rm o s a i c v i r u s ( c a m v ) 3 5 sp r o m o t e rw a se x p r e s s e di nh o m o z y g o u sa t m k k lm u t a n tp l a n t s t r a n s g e n i ca r a b i d o p s i sp l a n t sw e r eo b t a i n e do n as e l e c t i o nm sm e d i u mw i t h2 5 0 m g l h y g r o m y c i nb t h r o u g hh y g r o m y c i n b - r e s i s t a n c ea s s a ya n dp c ra n a l y s i s ，t h e h o m o z y g o u st r a n s g e n i cp r o g e n yl i n e sw e r es e l e c t e df o rf u r t h e rs t u d y 1 1 圮r e s u l t s i n d i c a t e dt h a to v e r e x p r e s s i o no fg h m a p k 6i na t m k k lt - d n ai n s e r t i o nm u t a n tc o u l d r e c o v e rt h ed e f e c t sc a u s e db ya t m k k lm u m f i o ms u g g e s t i n gt h a tg h m a p k 6h a sas i m i l a r f u n c t i o nt oa t m a p k 6i na b a - i n d u c e dc at ie x p r e s s i o na n dh 2 0 2p r o d u c t i o n k e yw o r d s ：c o t t o n ( g o s s y p i u mh i r s u t u m ) ；m i t o g e n a c t i v a t e dp r o t e i n l 【i n a s e ( m a p k ) ；o v e r - e x p r e s s i o n ；a b s c i s i ca c i d ( a b a ) ；h y p e r s e n s i t i v i t y i v d a b e b e d t a h y r k a r l m s m c s l b o d o r f p i p v p p b s p c r r o s r r p c r s d s w t d i a m i n o b e n z i d i n e e t l l i d i u mb r o m i d e e t h y l e n ed i a m i n et e t r a a c e t i ca c i d h y g r o m y c i n k a n a m y c i n m u r a s h i g ea n ds k o o gm e d i a m u l t i p l e c l o n es i t e s l u r i a - b e r t a n im e d i u m o p t i c a ld e n s i t y o p e nr e a d i n gf r a m e i s o e l e c t r i cp o i n t p o l y v i n y l p y r r o l i d o n e p h o s p h a t eb u f f e r p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n r e a c t i v eo x y g e ns p e c i e s r e v e r s et r a n s c r i p t i o np c r s o d i u md o d e c y ls u l f a t e w i l dt y p e 二氨基联苯胺 溴化乙锭 乙二胺四乙酸 潮霉素 卡那霉素 m s 培养基 多克隆位点 l b 培养基 光吸收密度 开放阅读框 ， 等电点 聚乙烯吡咯烷酮 磷酸盐缓冲液 聚合酶链式反应 活性氧 反转录p c r 十二烷基磺酸钠 野生型 v 摘要 硕士学位论文 m a s t e r st h e s i s 目录 a b s t r a c t 本文缩写符号 一、引言 i i i v l 1 1 植物m a p k 级联途径参与调控a b a 信号转导1 1 1 1m a p k 可以被a b a 激活2 1 1 2 磷酸化、去磷酸化与a b a 信号转导的关系3 1 1 3m a p k 级联途经参与调控a b a 信号转导过程“5 1 2 植物中的m a p k s 蛋白1 0 1 2 1 植物中m a p k s 的结构特点”1 l 1 2 2 植物中m a p k s 的分类1 1 1 2 3 棉花中的m a p k s 1 2 l - 3 立题依据及本文研究的意义1 3 二、材料与方法 2 1 实验材料。15 2 1 1 菌种和载体l5 2 1 2 植物材料l5 2 1 3 化学试剂l5 2 1 4 工具酶15 2 1 5 常用储液“15 2 1 6 常用缓冲液15 2 1 7 常用培养基16 2 1 8 棉花基因组d n a 提取试剂”1 6 2 1 9 棉花总r n a 的提取试剂1 6 2 1 1 0p c r 分析扩增试剂1 7 2 1 1 1d n a 测序l7 2 1 1 2 仪器设备1 7 2 2 实验方法一l7 硕士学位论文 m a s t e r st h e s i $ 2 2 1 目的基因c d n a 序列的分离1 7 2 2 2 基因和蛋白序列分析2 0 2 2 3 棉花各组织材料的收取2 1 2 2 4 棉花基因组d n a 的提取”2 1 2 2 5 基因结构分析2 2 2 2 6 基因的表达模式分析2 2 2 2 7g m 纠纠巧j e 觎p 载体构建2 3 2 2 8 农杆菌感受态细胞的制备和转化2 4 2 2 9 农杆菌介导的棉花转化2 4 2 2 1 0 棉花愈伤组织细胞荧光观察2 5 2 2 1 1 拟南芥的培养以及农杆菌介导的遗传转化2 5 2 2 1 2g 。h 刎尸五万过量表达转基因拟南芥的筛选及鉴定2 7 2 2 1 3g m 纠肷6 过量表达转基因拟南芥的表型分析2 9 三、结果与分析 3 1 3 1 棉花c 删幽p k 6 基因分离克隆及结构进化分析3 1 3 1 1 棉花g 办 纠尸玉砸基因的分离3 1 3 1 2 棉花g l 脚k 6 蛋白结构分析3 2 3 1 3 棉花g h m a p k 6 蛋白的疏水性分析3 3 3 1 4 棉花g h m a p k 6 与其它植物m a p k 蛋白的进化关系分析3 4 3 1 5 棉花g 纠蹦6 基因d n a 全长序列分析3 5 3 2 棉花g 捌幽p k 6 基因的表达分析3 6 3 2 1r n a 击邑取3 6 3 2 26 m 私p k 6 基因在棉花不同组织中的差异表达3 6 3 2 3g 忍 纠p k 6 基因在不同胁迫处理下的差异表达3 7 3 3 棉花( m m a p k 6 亚细胞定位分析3 8 3 3 1g m 纠尸腼p 觎p 融合载体的构建3 8 3 3 2 删尸焉而p p 的棉花转化和e 叩p 融合蛋白的荧光定位3 8 3 4g h m a 尸焉巧在转基因拟南芥中的功能分析。3 9 3 4 1g h m a p k 6 过量表达载体的构建和拟南芥a t m k k l 突变体的转化3 9 3 4 2 过量表达转基因拟南芥的鉴定4 0 3 4 3g h m a p k 6 过量表达能互补和恢复拟南芥突变体a t m k k l 的表型4 2 硕士学位论文 m a s t e r st h e s i s 四、讨论 4 5 4 1 棉花g h m a p k 6 基因及其编码蛋白结构同源性及进化分析4 5 4 2g m 纠p k 6 基因在棉花中的表达调控4 5 4 3g h m a p k 6 可能参与调控h 2 0 2 介导的a b a 信号转导4 6 参考文献 附录 在校期间发表的论文 致谢 4 9 5 6 5 7 5 8 硕士学位论文 m a s t e r ? st h e s l s 一、引言 1 1 植物m a p k 级联途径参与调控a b a 信号转导 m a p k 级联途径是在动植物和酵母系统中普遍存在的保守的信号传导通路。当 植物遭受非生物和生物胁迫时，m a p k 就会被激活。这些胁迫包括：低温、干旱、 机械损伤以及植物体与病原菌之间的相互作用( 病原体侵染) 。关于植物m a p k 的研 究，最初主要集中在新基因的克隆，应用以m b p 为底物的凝胶内激酶活性分析 ( i n - g e lm a p ka c t i v i t ya s s a y ) 技术、n o r t h e mb l o t 技术、免疫沉淀技术以及通过激酶 抑制剂( p d 9 8 0 5 9 ，u 0 1 2 6 ) 将m a p k 级联途径与某种刺激信号联系起来的技术等【l 】。 近几年，酵母双杂交技术、病毒诱导的基因沉默( v i g s ) 技术、r n a 干涉( r n a 0 技术、反向遗传技术( r e v e r s eg e n e t i ca p p r o a c h e s ) 、功能缺失型突变体、功能获得型 突变体以及其他一些新技术的应用，使m a p k 级联途径在具体的信号传导过程中的 功能得以逐步阐明。 脱落酸( a b s c i s i ca c i d ，a b a ) 是植物中研究较早的逆境激素和信号分子。随着研究 的深入，人们发现a b a 并非器官脱落的主要控制因子，而是有其自身特殊的功能， 特别是作为“逆境激素 ，在植物抗旱、抗寒和抗盐中具有重要作用。a b a 调节植 物的生长发育进程，促使种子内蛋白质和脂类合成，促进种子休眠，抑制种子萌发 及萌发后生长，抑制植物由营养生长向生殖生长的转变【2 】。a b a 还作为一种重要的 逆境信号分子，将外界不良环境刺激转化为细胞可识别信号，诱导胁迫相关基因的 表达，引发相应的生理反应【3 - 1 1 】。研究发现，植物遭受干旱、高盐、低温、机械伤 害、病害等刺激后，体内迅速积累大量a b a ，引起气孔关闭。a b a 调控气孔运动 的信号转导过程极为复杂，c a 2 + 、h 2 0 2 、n o 以及多种激酶、磷酸酶、磷脂酶等信 号分子都参与其中【2 1 。大量试验表明，h 2 0 2 在m a p k 级联途径调控的a b a 信号 转导过程中起第二信使作用。近年来关于a b a 作用机制的研究取得显著进展，对 a b a 信号转导途径的研究也越来越多，特别是对影响和参与a b a 信号转导途径各 成分及相互关系的研究已成为探究的热点。人们普遍认为在干旱、高盐或低温条件 下，可能存在的机制是：缺水胁迫首先引起体内a b a 的积累效应，然后内源a b a 再至少通过两种途径分别诱导某些基因的表达。从胁迫刺激到植物作出反应实际是 一系列复杂的信息传递过程：感受细胞或组织对原初信号( 环境刺激) 的感知传导和 反应，结果产生胞间信号；胞间信使在细胞或组织间传递，并最终到达受体细胞的 作用位点；受体细胞对胞间信使的接受、转导和反应，结果导致受体组织中生理生 化和功能的最优化组合，最终体现为植物对环境刺激或逆境的适应或抗性。 硕士学位论文 m a s t e r st h e s i s 1 1 1m a p k 可以被a b a 激活 十多年前就已提出m a p k 参与植物体内a b a 信号转导的证据，其中比较有力 的证据是在大麦糊粉粒细胞中a b a 可以激活以m b p 为底物的蛋白，该蛋白能与抗 e r k l 抗体发生免疫沉淀，并且与e r k l 有着相同的相对分子质量，还能与抗酪氨 酸抗体发生免疫沉淀，这就说明a b a 确实能造成大麦糊粉粒细胞m a p k 的短暂激 活【1 2 】。m o i l 和m u t o 【1 3 l 证明其他m a p k 也参与a b a 信号传导，来自蚕豆( v i c i a f a b a ) 的3 种蛋白在保卫细胞原生质体中具有活性，其相对分子质量分别为4 6k 、4 8k 和 4 9k 。其中，4 8k 蛋白由a b a 强烈诱导，在刺激1 0m i n 后达到最大活力。不过该 蛋白不能用抗磷酸化酪氨酸抗体免疫沉淀，表明它不是m a p k 。而4 6k 、4 9k 有 活性时可经抗磷酸化酪氨酸免疫沉淀，表明它们是m a p k 。不过它们只能由a b a 轻微诱导，所以对于a b a 介导的气孔关闭显得不那么重要。k o b a y a s h i 等u 4 j 从水稻 基因组中分离到1 0 个s n r k 2 ( s n f l r e l a t e dk i n a s e2 ) 基因，进一步实验证实其中有3 个可以被a b a 所激活。x i o n g 等【1 5 j 从水稻中分离到的o s m a p k 5 基因可以在外源施 力i a b a 时被激活，并且该基因可正调控与干旱、高盐和低温相关基因以及负调控 p r 基因的表达。许多实验也证实m a p k 参与了a b a 信号转导过程，而a b a 也激 活相关m a p k 基因的表达，进而调控其他相关基因的表达。当然a b a 对于m a p k 的 激活不是直接的，它需要经过一系列复杂的信号传递过程来间接激活m a p k 级联途 径。j a m m e s 等【1 6 j 通过实验证明了拟南芥 卵k 9 和m p k l 2 在保卫细胞中优先表达并 且正向调控由活性氧介导的a b a 信号途径，m p k 9 和m p k l 2 位于活性氧、c a 2 + 通道 的下游以及阴离子通道的上游。此外，结合2 0 0 9 年最新的研究结果可总结出一条 f l 了r o s ( r e a c t i v eo x y g e ns p e c i e s ) 介导的保卫细胞q 了a a a 信号途径工作模型：a b a 结合 其受体p 己p y l ，使其与p p 2 c 结合，从而抑制了p p 2 c 的磷酸酶活性，使得s n r k 2 能够磷酸化下游的组分，然后以n a d p ho x i d a s e ( a t r b o h d & f ) - - r o s - - - - c a 2 + c h a n n e l s - - - - c a 2 + 】c y t 的顺序激活m p k 9 和m p k l 2 ，最后激活阴离子通道从而引起气 孔的关闭，但是其中有些细节还不是很清楚，需要进一步地研究( 图1 1 ) 。 2 1 1 2 磷酸化、去磷酸化与a b a 信号转导的关系 蛋白质的磷酸化与去磷酸化是许多信号转导途径中的重要步骤，植物中已确定 了许多蛋白激酶和磷酸酶。在a b a 信号转导中磷酸化与去磷酸化过程同样有着非常 重要的意义。l e u n g 等i l7 j 采用a b a 不敏感型拟南芥基因a b i l ，并对其进行克隆，结 果发现它能编码一种信号蛋白，此种蛋白的羧基端控制区s e r t h r 磷酸酯酶2 c ，氨 基端延伸出e f 手形的c a 2 + 结合位点，这表明a b i l 蛋白是一种c a 2 + 调节的磷酸酯 酶，它通过磷酸化反应连接a b a 至! u c a 2 + 之间的信号传递。m e y e r 等【1 8 】与l e u i l g 等【i 刀 同时发现，a b i l 基因编码产物与经典的s e r t h r 蛋白磷酸酯酶有同源序列，并有 a t p ( 或g t p ) 结合位点和氨基端延伸出的c a 2 + 结合位点。l e u n g 等【1 9 j 以另一种 a b a 不敏感型突变体为材料进一步证实a b i 2 基因与a b i l 一样能编码涉及信号转 导的p p 2 c 。h e i m o v a a r a - d i j k s t r a 等1 2 0 j 的实验表明，有3 种磷酸酯酶抑制剂能明显抑制 a b a 诱导的基因表达，同时使膜上两种相对分子质量接近4 0k 的蛋白质超磷酸化。 他们以抗磷酸酪氨酸的抗体证实，这两种蛋白的等电点变化与两种酪氨酸蛋白 等电点变化一致，因此认为a b a 信号转导除含s e r t h r 的蛋白外，还有含酪氨酸的蛋 白质磷酸化，去磷酸化参与。蛋白质去磷酸化过程对于a b a 诱导的气孔关闭至关重 要，a b l l 和a b l 2 编码蛋白磷酸酶，是a b a 信号转导的负调控因子，a b i l 。1 和 a b i 2 1 对a b a 调控的气孔关闭表现不敏感1 2 们。最近r c a r p y r ( r e g u l a t o r y c o m p o n e n t so fa b ar e c e p t o r p y r a b a c t i nr e s i s t a n c e ) 家族蛋白已经被确认为是a b a 的 受体，并且能够以a b a 介导的模式抑锋i l j p p 2 c 活性。首先p p 2 c 与s n r k 2 的c 末 端结构域i i 相互作用，这种相互作用是稳定的且不需要a b a 的参与。当不存在a b a 时，p p 2 c s 通过去磷酸化使s n r k 2 s 失活来抑制a b a 信号途径；当存在a b a 时( a b a 被环境或者其他因素诱导) ，r c a r p y r 与p p 2 c 结合，并且s n r k 2 从依赖于p p 2 c 的负调控过程中释放，这就使得s n r k 2 去磷酸化下游的底物，包括b z i p 转录因子 ( a i 乏3 e b a b f s ) 等等，来激活a b a 响应的基因表达或者其他的响应。相反，p p 2 c 的 3 硕士学位论文 m a s t e r st h e s i s 主要突变体，例如a b i l 1 ，能够使该蛋白避免与r c a r p y r 结合，就会使s n r k 2 组 成型的失活 2 2 之5 】( 图1 2 ) 。 腻r 螽一国 玉b童 ji d ，嗡 蚋i 2 囫圈翻 图1 - 2a l i a 与受体结合并引传递胁迫信号( u m e z a w ae ta l 。2 0 0 9 ) 另外，m a p k 与它的负调控因子m k p ( m a p k p h o s p h a t a s e ) 可以调控相同的生理 过程，m k p 能够使m a p k 脱磷酸化从而起到一个反向调节作用。m a p k 磷酸酶2 能 够使得m p k 3 和m p k 6 脱磷酸化并且失活，从而正向调控氧化胁迫信号途径l z 6 1 。其 他的m a p k 磷酸酶，i b r 5 最近也被证实能够与m p k l 2 相互作用并且使其失活。这 种磷酸酶激酶模型能够负调控生长素的信号途径却对根部的a b a 响应不起作用， 尽管i b r 5 突变体显示了减弱的a b a 敏感性。生长素处理同样可以导致m p k l 2 的激 活。这些结果指出了一个潜在的由m p k l 2 介导的生长素以及a b a 信号途径之间的 “交谈 ( c r o s s - t a l k ) 。因此，检测m k p 2 和i b r 5 是否参与保卫细胞的a b a 途径是 非