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(分析化学专业论文)微流动注射和微型生物传感器芯片.pdf.pdf 免费下载
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文档简介
微流动注射和微型生物传感器芯片 刘海生 摘要本论文由综述和研究报告两部分组成。 第一部分为综述部分,介绍了微流动注射和微型生物传感器芯片的原理、分 类、制作过程、主要技术、检测手段,简要概括和总结了近年来微流动注射和微 型生物传感器芯片的研究进展,并展望了这两种芯片未来的发展趋势。 第二部分为研究报告,包括四部分: ( 一) 设计出一种将微注样阀和发光试剂均集成化的微流动注射化学发光芯 片。利用l u m i n 0 1 k a f e ( c n ) 6 一h 2 0 2 化学发光体系,研究了这种芯片的分析特性。该 芯片测定h 2 0 2 的线性范围为2 1 0 4 - 8 1 0 - g m o l l ,检出限为3 ,6 1 0 一m o l l ,相对标准 偏差r s d = 4 4 ( c = l 1 0 - 6 m o l l ,n = 1 1 ) 。与常规的流动注射化学发光分析法相比, 浚芯片具有简单、快速、灵敏度高、耗样量少等特点,结合酶促反应成功地用于 人体血清中葡萄糖的测定。 ( 二) 利用激光雕刻机在聚甲基丙烯酸甲酯( p m m a ) 上雕刻微流动注射通 道,采用控制时间进样模式,将分离系统( 离子交换树脂) 引入到微流动注射系统 中,结合l u m i n 0 1 c 0 2 + h 2 0 2 化学发光体系,建立了化学发光微流动注射芯片测定 过氧化氢的方法。结果表明,该方法测定h 2 0 2 的线性范围为1 1 0 - 42 1 0 m o l l , 检出限为9 5 1 0 “m o l l ,相对标准偏差r s d = 2 9 ( c = l 1 0 一m o l l ,n = 1 1 ) ,已应 用于雨水中过氧化氢的测定。 ( 三) 在微流动注射芯片上设计了螺旋形流通池,并采用精确时间控制进样 方式,基于利巴韦林对l u m i n 0 1 h 2 0 2 化学发光体系的抑制作用,建立了化学发光 微流动注射芯片测定利巴韦林的新方法。该系统中螺旋形流通池由激光雕刻机在 聚甲基丙烯酸甲酯( p m m a ,5 0 r a m 4 0 r a m 3 m m ) 上雕刻而成。在实验所建立的 最佳条件下,该方法在2 l o - 5 = 2 x 1 0 6 m o l l 范围内具有好的线性关系,检出限为4 1 0 7 m o l l ,相对标准偏差r s d = i 5 ( c = 8 1 0 - 6 m o l l ,n = 1 1 ) ,已应用于尿样中利 巴韦林的测定。 ( 四) 基于微透析注样和微流动注射化学发光芯片相结合,建立了在线检测 活体血液中铬( i i i ) 的代谢。微流动注射芯片是由上、下两片聚甲基丙烯酸甲酯 ( p m m a ,5 0 m m 4 0 r a m 5 m m ) 组成,上片的下表面用激光雕刻成宽2 0 0 b t m , 深1 0 0 9 m 的微通道和阴离子交换树脂池( 长1 0 m m ,宽1 5 m m ) 。用微透析探针从 兔子的静脉取样,透析液体积约为0 4 9 l ,灌注液的流速5 9 l m i n 。结合 c r ( i i i ) 一l u r n i n o l h 2 0 2 化学发光体系,在线连续检测了兔子血液中铬( i i i ) 的代谢。 关键词微流动注射系统微型生物传感器芯片化学发光 i i m i c r o - f l o wi j e c t i o na n dm i c r o b i o s e n s o ro n c h i p h a i s h e n g l i u a b s t r a c tt h i st h e s i si n c l u d e sar e v i e wa n dar e s e a r c hs e c t i o n i nt h er e v i e w , t h ep r i n c i p l e ,f a b r i c a t i o n ,c h a r a c t e r i s t i c so fm i c r o f l o wi n j e c t i o na n d m i c r o b i o s e n s o ro n c h i pa r ep r e s e n t e d r e s p e c t i v e l y t h ea p p l i c a t i o n so ft h et w ok i n d s o f c h i pa r er e v i e w e d t h er e s e a r c hs e c t i o nc o n t a i n sf o u rs u b t m i t s i nt h ef i r s ts u b s e c t i o n ,an e wc h e m i l u m i n e s c e n c e ( c l ) m i c r o f l o wi n j e c t i o nc h i p i n t e g r a t e dw i t hm i c r o v a l v ea n dr e a g e n t si sp r o p o s e d t h ea n a t y t i c a lc h a r a c t e r i s t i co f t h ec h i pw a ss t u d i e dw i t hh i m i n o l k 3 f e ( c n ) 6 一h 2 0 2c h e m i l u m i n e s c e n c es y s t e m t h e l i n e a rr a n g e f o r h 2 0 2d e t e r m i n a t i o n w a s 2 x 1 0 - 5 8 1 0 9 m o l l w i t h t h ed e t e c t i o n l i m i t o f 3 6 1 0 一m o l l a n dt h er e l a t i v es t a n d a r d d e v i a t i o nw a s r s d = 4 4 ( c = lx l o 曲m o l l ,n = l1 ) t h cc h i pi ss i m p l e ,r a p i da n dh i g hs e n s i t i v ew i t hl e s s r e a g e n tc o n s u m p t i o n 1 1 1 ep r o p o s e dc h i p h a sb e e n s u c c e s s f u l l ya p p l i e d t ot h e d e t e r m i n a t i o no f g l u c o s ei nh u m a n s e r u m i nt h es e c o n ds u b s e c t i o n ,an e wc h e m i l u m i n e s c e n c e ( c l ) m i c r o f l o wi n j e c t i o nc h i p i n t e g r a t e dw i t hs e p a r a t es y s t e m sa n ds a m p l i n gb yr u n n i n g t i m ei sp r o p o s e d i ti sb a s e d o nc h e m i l u m i n e s c e n c es y s t e mo fl u m i n o l c o ”h 2 0 2f o rd e t e r m i n a t i o no fh y d r o g e n p e r o x i d ei nr a i n w a t e r t h e l i n e a rr a n g ef o rh 2 0 2w a sl 10 4 2 x10 。m o l lw i t ht h e d e t e c t i o ni i m i to f9 5 x 1o 5 m o l l ,a n dt h er e l a t i v es t a n d a r dd e v i a t i o nw a sr s d = 2 9 ( c = 4 x 1 0 6 m o l l ,n = 1 1 ) i nt h et h i r d s u b s e c t i o n ,a m i c r o - f l o w i n j e c t i o nc h i p w a s p r e p a r e d f o rt h e d e t e r m i n a t i o no fr i b a v i r i n ,b a s e do nl u m i n o l h 2 0 2c h e m i l u m i n e s c e n c e s p i r a lf l o wc e l l c h a n n e l sw e r ef a b r i c a t e du s i n gl a s e ro np o l y ( m e t h y lm e t h a c r y l a t e ) ( p m m a ) ,s a m p l i n g w a sp r e c i s e l yc o n t r o l l e db yt i m e t h el i n e a rr a n g ef o rr i b a v i r i nw a s2 10 - 5 2 x10 6 m o l l w i t ht h ed e t e c t i o nl i m i to f4 x1 0 m o l l ,a n dt h er e l a t i v es t a n d a r dd e v i a t i o nw a s r s d = 1 5 ( c = 8 x l o 6 m o l l ,n 2 11 ) t h ep r o p o s e dm e t h o d h a sb e e n s u c c e s s f u l l ya p p l i e d t ot h ed e t e r m i n a t i o no fr i b a v i r i ni nu r i n e i nl a s ts u b s e c t i o n ,am i c r o f l o wi n j e c t i o nc h e m i l u m i n e s c e n c es y s t e mf o ri nv i v o o n l i n em o n i t o r i n go fc h r o m i u m ( i i i ) m e t a b o l i s mi nb l o o db ym i c r o d i a l y s i ss a m p l i n gi s d e s c r i b e d t h e s e p a r a t i o np a r t ( a n i o ne x c h a n g er e s i n ) w a s a l s o i n t e g r a t e d o nt h e i i m i c r o f l o w s y s t e m t h ei n t e g r a t e d m i c r o f l o wi n j e c t i o n s y s t e m w i t ht h e c r ( 1 l i ) - l u m i n o l - h y d r o g e n p e r o x i d e c h e m i l u m i n e s c e n c e s y s t e m s w a sf a b r i c a t e di n p o l y m e t h y lm e t h a c r y l a t e ( p m m a ) o f t w op l a t e s t h ew i d t ho ft h em i c r o c h a m m lw a s 2 0 0 9 ma n dt h ed e p t hw a s10 0 p mi nt h ec h i p ( 5 0 x 4 0 x 5 m m ) am i c r o d i a l y s i sp r o b e , i m p l a n t e di nt h ev e i no fr a b b i t ,w a sp e r f u s e dw i t hp e r f u s a t ea ta f l o wr a t eo f 5 9 l r a i n a n dt h ed i a l y s a t es a m p l ev o l u m ew a sa b o u t0 4 乩t h em e t a b o l i s mo f t h ec h r o m i u m ( 1 1 1 ) i nt h eb l o o do ft h er a b b i tw a sm o n i t o r e da f t e ra d m i n i s t r a t i o no ft h ec h r o m i u m ( i i i ) t o d e m o n s t r a t et h ef a v o r a b l er e s o l u t i o na n dr e l i a b i t yo ft h es y s t e mf o ri nv i v oo r l l i n e m o n i t o r i n g k e y w o r d s m i c r o f l o wi n j e c t i o ns y s t e m sm i c r o b i o s e n s o rc h i pc h e m i l u m i n e s c e n c e v 学位论文独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是我在导师的指导下进行的研究工作及取得的 研究成果尽我所知,除文中已经注明引用的内容外,论文中不包含其他个人 已经发袭或撰写过的研究成果,也不包含为获得陕西师范大学或其它教育机构 的学位或证书而使用过的材料。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体,均 已在文中作了明确说明并表示谢意。 作者签名z 日期 学位论文使用授权声明 本人同意研究生在校攻读学位期间论文工作的知识产权单位属陕西师范大 学。本人保证毕业离校后,发表本论文或使用本论文成果时署名单位仍为陕西 师范大学。学校有权保留学位论文并向国家主管部门或其它指定机构送交论文 的电子版和纸质版;有权将学位论文用于非赢利i i 的的少量复制并允许论文进 入学校图书馆、院系资料室被查阅;有权将学位论文的内容编入看关数据库进 行检索;有权将学位论文的标题和摘要汇编出版。 作者签名:日期 第一部分综述 微流动注射和微型生物传感器芯片 1 1 微流动注射系统 1 1 1 原理及加工技术 微流动注射系统的构建有两种主要的方法:种就是芯片实验室,这种方法 就是把整个分析系统微型化【l 。3 j 。其优点是实现了化学分析系统从试样处理到检测 的整体微型化、自动化、集成化与便携化。另一种方法是混合型,就是把流动注 射系统中的某一个核心部件( 如采样部件、混合池、反应池等) 微型化 4 卅,其它 部件足常规方法制作。其优点制作成本低。这种方法在普通实验室普遍使用。 微流动注射系统制作方法很多,如近年来从多样化的c e 一型熔融石英毛细管f 7 】 到模块微泵系统】,然而,微流动注射通道的制作起源于微机械单片集成电路装置 的制作,采用标准集成电 路照相平版印届4 ( s t a n d a r d i c p h o t o l i t h o g r a p h i c ) 技术、 蚀刻( e t h c h i n g ) 技术、键 合( b o n d in g ) 技术制成平 面结构。前些年用于 制作微流动注射系统的 材料主要集中在硅材料 及玻璃上。玻璃和石英有 很好的电渗性质和优良 的光学性质,便于表面改 性,使用光刻和蚀刻技术 可以使微通道网络刻在 玻璃和石英上。其加工的 主要步骤如图l 所示【l l _ | 。 裔嚣点s 哗时 嚣嚣k 囊咋s 扁n h n w io f p h o 口l - i m n dd i m m l u m i a ,疆 m | k h 日 i om n c h f o 啪m 母u _ n z r m 口v 刚耐 砷i ,s l r 日io f 埘甲酬埔i o 珊i u m 冉t 翻i p 牲l 啦呼h r b 糍警怒赫d 埔 一a i u l 蝌i o n 酣挑雌a n d 呐h p 哪籼坤 图1 各向异性蚀刻制作微流动注射装置 f i g 1s c h e m a t i cd i a g r a mo f t h es t e p si n v o l v e di nt h ea n i s o t r o p l c e t c h i n gf o rt h ef a b r i c a t i o no f “f i a d e v i c e s t h ea r r o wi ns t e p1 r e p r e s e n t sr a d i a t i o n 制作的整个过程多次涉及到在基片上沉积各种材料薄膜,方法主要包括氧化、 化学气相沉积1 2 1 、蒸发、溅射f ”1 等。m a l u f 等对二氧化硅氧化层的相关研究进行 了评述。刻蚀分湿法n n ( w e te t c h i n g ) 和干法刻蚀( d r ye t c h i n g ) t 15 】两大类。前一 种的刻蚀荆是水溶液,后者的刻蚀剂则是等离子体 1 “。还有其它一些玻璃、石英 芯片的加工方法u 7 j 8 1 。 高分子聚合物( 如聚甲基丙烯酸甲酯( p m m a ) ) 微流动注射通道加工方法,主 要有膜塑法【1 9 、热压法( h o te m b o s s i n g ) 2 0 - 2 2 】、l i g a 技术 2 3 1 、激光烧蚀法( 1 a s e r a b l a t i o n ) f 2 4 2 6 1 和软光刻( s o f tl i t h o g r a p h y ) 2 7 2 s l 。还有其它一些聚合物芯片加工方法 2 9 , 3 0 1 。 刻有微通道的基片上面必须要封合。基本的方法有热键合( f u s i o nb o n d i n g ) 和阳 极键合( a n o d i cb o n d i n g ) 两种。玻璃和石英材料的微流控芯片一般用热键合的方法封 合。高温炉升温速度为1 06 c m i n ,在6 2 0 。c 时保温3 5 h 再以1 0 。c m i n 的速率升温【3 1 】。 严格清洗可使键合温度降低 3 2 1 , 为防止热键合可能发生的通道变形甚至塌陷,阳极 键合引起了人们的广泛关注。b e r t h o l d 等人通过在玻璃表面沉积上一层薄膜材料如 多晶硅、氮化硅为中间层完成了阳极健合 3 3 1 。b o l m 等还进行了指定位点的阳极键 合i 3 4 l 。将基片和盖片表面用等离子体处理或紫外线照射的封合技术也逐步成熟 3 5 , 3 6 1 。还有其他一些键合方法7 1 。 1 1 2 微流体的驱动和控制 1 1 2 1 进样方式 微流动注射主要有两类进样方式,基于时间( 或门式) 和基于体积的进样方 式。基于时间的进样方式中试样体积由注样流速和注样时间决定。这种方法流路 简单,注样体积可调,但存在歧视效应,且换样不方便。1 9 9 4 年,j a c o b s o n 3 8 l 提出 门式进样法( g a t e di n j e c t i o n ) 通过控制充样电压和时间可以控制进样量。该法便于换 样,但歧视效应依然存在。基于体积的进样方式,最常用的方法有使用包括采样 环( 体积一定) 的旋转式阀或滑阀【3 蚍,三通螺线管阀洳l ,采样环进样4 0 4 烈,自动 取样器进样【4 3 j ,注射器进样1 4 4 , 4 5 1 ,这种方式可减少液体样品的扩散。电渗流驱动 方式进样通常其通道为“十”形f 4 7 8 1 或“双t ”形 , 1 9 , 5 0 1 。这样可以消除注样过程的 歧视效应,但进样体积固定,且液流泄漏比时间进样更为严重。还有悬空液滴进 样 5 1 , 5 2 】等。 1 1 - 2 2 微泵与微阀 微流动注射系统中的操作核心是对流体的控制,基本技术包括:微泵控制、 微阀控制、微流动注射微通道构型控制、通道表面改性控制。虽然电渗流是主要 的控制手段,但对于有机相反应、生成沉淀或气体的反应就受到了局限。目前对 微泵主要有体积、流速、泵压三方面的要求。体积方面尽可能小,流速要求重现 性好,泵压则依不同分析要求而不同。目前出现的微泵类型有压电微泵口3 1 、可加 热气室致动的热气动微泵、静电微泵 5 5 】、离心力驱动泵f 1 、重力驱动泵、热 毛细作用泵【5 8 j 、直线型蠕动致动的气动微泵圈、活塞型微泵、平面微离子拖拉 泵【6 0 】。已报道的微阀有三通螺线管阀、旋转式阀或滑阀口9 1 、aj a s c om l 4 2 2 微 阀洲,由膜和固定的阀座制成的微阀通过膜的移动打开或关闭流路,如y a n g 等川 制作的硅树脂橡胶膜阀是基于热空气作用,而b & h m 等【6 2 j 提出相似结构的微阀,但 原理是基于电磁作用。 1 1 3 微型混合器和反应器 由于分析系统微型化后,出现了典型的低雷诺数的层流特征,流体不易达到 均匀混合,从而影响了检测的灵敏度和检出限。为克服这一障碍,人们开展了关 于混合器和反应器的一系列研究工作。v e e n s t r a 等【6 3 j 设计了基于扩散的混合器并用 于酚和水的混合。l i u 等1 6 4 l 利用三维的逶迤形盘管来促进混合。b e s s o f l l 等制成 了分流混合装置在1 5 m s 内可达到9 5 的混合,这一装置已经实现商业化。j a c o b s o n 等 6 6 1 提出了平行和连续微混合器,电渗流作驱动力,实现了样品的混合。s t r o o c k 等【67 1 还研究了微管道长度与混合程度之间的关系。还有人用超声振荡的方法制成 混合器 6 8 1 。j o h n s o n 等人 6 9 1 提出在管道底部刻蚀出一些倾斜的内壁达到快速混合。 总之,各种各样的混合器都是通过破坏系统固有的层流状态引入湍流、对流或增 加扩散从而实现快速混合。已报道的一些微型反应器有化学反应器1 7 0 1 ,酶反应器 硎免疫反应器【7 2 1 ,以提高检测灵敏度为目的的柱后反应器和以为检测需要而进 行衍生反应或为分离需要而进行试样预处理为目的的柱前反应器【3 8 i 以及凝胶反 应器f 7 4 j 。 有些设计中的微型流通池反应器既起到混合器的作用,也起到反应器的作用。 典型的有蜿蜒形和螺旋形流通池,m u r a k a m i 等1 75 j 通过各向异性蚀刻法在n 型硅晶 体( 7 01 1 1 1 1 1 7 0m r n 0 5 m m ) 表面蚀刻成蜿蜒形流通池,流通池的长2 6 3 6 c m , 宽1 0 0 9 m ,深7 0 1 x m ,内表面固定葡萄糖氧化酶,通道区域面积2 8 5 x3 9 r a m 。 z h a n g 等1 7 6 】用聚四氟乙烯毛细管( 内经1 0 0 a m ,长为7 5 c m ) 绕成螺旋形微流通池, 体积5 5 1 a l 。k i b a 7 7 等通过备向异性蚀刻法在硅芯片( 2 5n u n 2 5m m xl m m ) 上 制成螺旋形微通道流通池,该微通道流通池长5 0 c m ,宽1 5 0 i t m ,深2 0 i t m ,共2 0 圈,体积1 4 乩,酶固定在微流通池通道内表面( 如图2 ) 。 图2 微流通池不意图 f i g 2 s c h e m a t i cd i a g r a mo f t h e m i c r of l o wc e l l 1 1 4 分离与富集 微流动注射系统中分离方法有多种,t a n g 等l 碍1 用玻璃管( 长2 o o c m ,内径 o 2 0 c m ) 制成的微型聚酰胺树脂柱在线分离富集矿物中的微量a u 3 + 。微型活性碳柱 7 9 1 富集分离测定c d ,m n ,p b 。c h a r l e s 等t 9 1 凋微石英液相色谱柱在线分离葡萄球 菌肠毒素b ( s e b ) 。对于n 0 2 的测定困难在于纯净的n 0 2 在室外分析的地方不易处 理,而且n 0 2 费用高,为了发展一种简单、快速、灵敏度高、费用低廉的原位、短 期检测大气中的n 0 2 ,w e i 等 5 9 1 提出微流动注射与含有三乙醇胺( t e a ) 作为吸收剂 的三孔的色谱膜池相结合在线富集大气中的n 0 2 ,从而可以在线测定大气中的 n 0 2 。在有预涂层的结反应池( k r ) 的富集【8 l 】。a n d e r s e n 等f 8 3 】用p h 梯度离子交换 色谱法对脱脂牛奶中的蛋白质等电点分离,该方法是由微型的流通p h 探针和阴离 子交换毛细管柱组成。以电渗流作为驱动力,在毛细管中填充体积约为3 h m 的小粒 子的介质,根据填充介质属性不同选择分离不同的物质的毛细管电色谱分离,它 一方面以平头流型的电渗流代替了普通色谱的抛物线型压力流,因此具有毛细管 区带电泳( c a p i l i a r z o n ee l e c t r o p h o r e s i s c z e ) 的高柱效特点,另外,它还使用固定 相,故又具有h p l c 的高选择性特点。它既能分离带电物质也可分离中性物质,微 型化加工简便岬j 。 除了表面修饰外,场流动分馏法的物理效应作为分离过程也可以合并在毛细 管系统中【8 5 】,这种情况下。外力如磁力、重力推动馏分到通道壁;停止外力,样 品馏分通常以分子大小【8 6 , 8 7 1 逐渐扩散到液流中。然而到目前为止,场流动分馏法 在微流动注射系统中并没有被广泛研究,但是场流动分馏法和使用磁场修饰电位 法在未来的研究中是很感兴趣的课题。 十微流动注射系统中的固相萃取分离 4 该法利用选择性吸附和选掸性沈脱的分离原理,达到分离富集的目的。 t e m p e l s a 等i g o 】提出了通过t 型裂口界面把固相萃取( s p e ) 柱和毛细管电泳f c e ) 相联 合,充分利用固相萃取( s p e ) 柱在线富集与毛细管电泳( c e ) 在线分离的优点结合起 来,已应用于脑啡肽的混合物的测定。 $ 微流动注射系统中的液一液萃取分离 h a l v o r s e n 等【8 2 j 用超i 临界液相萃取( s f e ) 和微液相色谱( a l c ) 结合,微液相色 谱是在毛细管中均匀填入粒径5 1 a m 的k r o m a s i l1 0 0 c 1 8 ,测定苹果中的杀螨王。 $ 微流动注射系统中的过滤分离 该法主要用于将试样中的不溶性颗粒除去。h e 等【8 踟制成了横向过滤器,它由 通道内很多立方型微柱构成,流体流过时,直径大于1 5 k t m 的微粒被拦截在柱的上 方,而滤液则横向流过滤床。k h a n d u r i n a 等 8 卅则通过过滤膜实现了大分子的预富 集。 1 1 5 各种检测方法及化学发光检测研究进展概述 目前最常用的检测方法有激光诱导荧光( l i f ) 9 3 】。该法灵敏度极高选择性好, 甚至可以达到单分子检测,但l i f 检测器,需要体积庞大、技术复杂的光学系统的 支持,难以适应系统微型化的要求。纤维光学耦合发光二极管( l e d ) 1 5 ,吸收光度 检测器( 受微通道检测区限制,光程短、体积小但可通过改变光程提高灵敏度) 8 0 , 8 2 1 ,安培检测器( 灵敏度高但要求对象有电活性且与电泳结合时有电压祸合问 题) 4 0 , 4 4 , 5 1 ,诱导耦合等离子质谱( i c p m s ) 【9 0 , 4 6 1 ,液相色谱电喷雾质谱,荧光熄 灭吲和催化动力荧光光谱法( 7 8 】,原子吸收7 9 , 8 1 等都作为微流动注射系统中的检测 途径得到研究。 化学发光( c l ) 7 7 , 7 6 , 4 3 , 9 2 】检测系统不需要光源,避免了背景光及瑞利散射等杂散 光的干扰,具有仪器结构简单、成本低、操作方便、灵敏度高、线性范围宽、分 析速度快等优点。因而成为微流动注射系统最具吸引力的检测方法之一。近年来 它的应用发展很快,覆盖的范围也很广泛。也为人们以往科研中的难题带来曙光。 比如常规毛细管电泳与化学发光检测器的接口较为复杂,同时容易引入死体积和 湍流现象,造成分离效率下降,而微流动注射系统能利用微细加工技术制作零死 体积的柱后反应器从而避免这些问题,因此微流动注射系统利用化学发光达到高 灵敏度和高选择性的检测是具有潜力的。 1 2 微型生物传感器芯片的构建 1 2 1 原理及分类 微型生物传感器芯片就是一种能选择性地、连续地、可逆地感受某一生物量 的芯片装置。其组成和原理与生物传感器相似,它是由具有分子识别功能的感受 器( r e c e p t o r ) ,换能器( t r a l l s d u c e r ) 和检测器( d e t e c t o r ) 三部分组成,唯一不同的是整个装 置集成或半集成于芯片上。待测物质经具有识别功能的感受器识别后产生的化学 量,再由换能器将其转化为与分析物浓度( 或活度) 有关的电信号或者光信号进 行输出,通过检测器进行显示。 传感器的性能一般由以下几个方面考察( 阱j : ( 一) 选择性 选择性是生物传感器最重要的性能之一。选择性主要取决于传感器的分子识 别系统。一般来说,由于生物化学反应的特异性很好,如酶催化专一性、免疫反 应的特异性等,使得生物传感器的选择性很高。 ( 二) 灵敏度、检出限、测量范围 和其它分析方法一样,灵敏度、检出限、测量范围是生物传感器必须考察的 性能。传感器这方面的性能主要是由物理换能器决定的。 f 三1 响应时间 响应时间的长短决定着分析速度的快慢,而且影响传感器的应用范围,一些 实时、在线、原位、活体的分析需要晌应时间快的传感器。 ( 三) 使用寿命 传感器的使用寿命主要取决于固定分子识别元件的使用寿命。影响分子识别 元件因素有以下几点:( 1 ) 生物物质的保存。( 2 ) 生物物质固定的基体要有好的 生物相容性,以便能保持生物分子的活性。( 3 ) 固定化试剂要牢固。( 4 ) 机械损 伤。( 5 ) 对于光敏材料,长期在检测光照射下会引起不同程度的光分解而使有效 成分含量减少。 ( 四) 稳定性和可逆性 传感器的稳定性是个很重要的指标。一个响应信号漂移的传感器很难用于 实际工作中。从严格意义上说,传感器应该是可逆的。 目前,按照检测对象基本可将传感器分为物理传感器和化学传感器。物理传 感器主要检测力、热、光、磁等五力量。化学传感器则检测物质的化学量,随着 生命科学的发展,化学传感器领域又增加了一个新的分支生物传感器。生物 传感器是指主要用生物成分作为敏感元件并用以测定生物物质的传感器。近2 0 年 来人们对生物传感器进行了广泛的研究与探索,已发展一系列测定有机化合物和 生物分子的生物传感器,尽管到目前为止 但相关的研究论文和专利数 量急剧增加。 1 2 2 加工技术 微电子铸造技术,这种 技术常用半导体处理方法 9 5 1 ,n i s h i z a w a 等交叉指 形阵列电极如图3 ,电极的大 小不到1 0 1 - t m ,而v a ng e r w e n 等【9 7 l 制作的交叉指形阵列电 极,电极的宽度和间距只是 5 0 0 - 2 5 0m 微机械制造技术 真正成为商品的生物传感器并不多 s 鹳黯州e 鳓搴d 抽i 妇if i l m i n s u l a l i gs u b i t r a t e 图3 交叉指型阵列电极 f i g3i n t e r d i g i t a t e dm i c r o a r r a ye l e c t r o d e ( m i c r o m a c h i n i n g t e c h n i q u e s ) ,这种技术选用一定的材料,广泛使用光刻 ( 1 i t h o g r a p h y ) 、蚀刻( e t h c h i n g ) 、丝网印刷术( s c r e e n p r i n t i n g ) 等技术,通过微加工制 成各种类型的传感器如弯曲金属盘重力传感器【9 8 】,电致发光的微池【9 9 】,微型p e r 系 统【1 0 0 】,下面是典型的生物传感器制作的程序( 图1 ) 和常见的微型生物传感器制 作技术】( 表一) 。 表一微型生物传感器和化学传感器的制作技术 f a b l e1m i c r o f a b r i c a t i o nt e c h n i q u e sw h i c hc a l lb eu s e df o rt h ec o m p o n e n t so fm i c r o c h e m i c a l s e n s o r sa n db i o s e n s o r s c o m p o n e n tt e c h n i q u e so rm a t e r i a l s e l e c t r o d ep a t t e r n p h o t o l i t h o g r a p h ye t c h i n g ,l i f t - o f f ,m e t a lm a s k i n g ,s c r e e n p r i n t i n g i n s u l a t i o nc h e m i c a lv a p o rd e p o s i t i o n ,h y d r o p h o b i cp o l y m e r e l e c t r o l y t el a y e rp a t t e r n s c r e e n p r i n t i n g , p h o t o s e n s i t i v ep o l y m e r c o n t a i n e r a n i s o t r o p i ce t c h i n g ,f i e l d a s s i s t e db o n d i n g ,p h o t o s e n s i t i v e p o l y m e r f l o wc e l l a n i s o t r o p i ce t c h i n g , i s o t r o p i ce t c h i n g , f i e l d a s s i s t e db o n d i n g , p h o t o s e n s i t i v ep o l y m e r ,d i c i n g - s a w l i q u i d j u n c t i o na n i s o t r o p i ce t c h i n g ,p o r o u ss i l i c o n ,h y d r o p h i l i ep o l y m e r i m m o b i l i z a t i o no f e n z y m e l i f t - o f f , i n k - j e tp r i n t i n g ,s c r e e n - p r i m i n g n e e d l es t r u c t u r e a n i s o t r o p i ee t c h i n g , e t c h s t o p t 2 3 传感器识别系统中固定化原理及方法 1 2 1 3 1 自然生物识别系统( 如酶,抗体,细胞) 一百宙 圆寓图宙 图4 传感器识别系统的同定化原理 f i g 4i m m o b i l i z a t i o np r i n c i p l e so f r e c o n l z n i z a t i o ns v s t e m si nb i o s e n s o r 传感器的识别系统是传感器的核心部分,又称分子识别元件。自然生物识别 是指酶、辅酶、生物受体、抗原抗体、核酸、d n a 、动植物组织或细胞和微生物 等。其固定原理如图所示f 1 0 2 】( 图4 ) : 常见的几种固定化方法: ( 1 ) 吸附法 通过吸附作用或离子结合的方式使传感器组分固定在载体表面,如离子交换 树脂和细胞结构中的带电宫能团。是一种最直接、最简单的方法。 ( 2 ) 共价键合法 通过共价键使传感器组分与载体结合而固定的一种方法1 3 3 , 1 3 4 , 1 4 4 , 1 4 9 ,这种方 法是化学传感器固定传感组分蜃有效的方法。对于生物组分,可能有部分活性部 位与载体键合而失活。 ( 3 ) 包埋法 包埋固定法是应用最普遍的固定化技术,特别是生物传感器制作中。一般采 用凝胶或聚合物包埋【1 0 3 , 1 0 4 , 1 3 5 , 1 3 7 , 1 4 6 , 1 5 ”,即把酶或细胞包埋并固定在高分子聚合物 三维空间网状结构的基质中,最常用的凝胶有藻酸盐、角叉( 菜) 胶和硅胶凝胶, 常用的聚合物有聚丙烯酰胺。电聚合高分子包埋是将酶和单体混合溶于溶剂中, 然后以此为电解液,通过电化学聚合直接在电极表面形成包有酶的高分子膜 1 3 9 1 。 ( 4 ) 交联法 通过采用取功能或多功能试剂进行化学键合,最常用的试剂戊- - n r 嵋2 ,“o 1 4 2 ,1 4 3 - 1 4 8 ,1 5 0 1 ,有同质交联和异质交联。 ( 5 ) 膜隔离法 高分子薄膜把传感器组分包裹起来。如微胶囊i 1 ”j ,膜反应器。 1 2 32 新识别系统( 重组抗体或酶片段) 传统的自然生物识别系统是把酶、抗体抗原、细胞等用物理或化学的方法使 其固定,但是它易碎、昂贵、含有多余的生物量和固定后易失活等缺点。而新方 法是重组抗体片断1 0 酣,通过定点突变来改善酶【1 0 ,对于微生物传感器,通过物质的 适应性、使用突变或新生有机体1 0 8 提高选择性来解决特殊困难。 1 2 4 典型的微型生物传感器芯片 1 2 4 i 微型的量热生物传感器芯片 量热生物传感器是基于在催化反应中产生的总热量与摩尔焓成正比,也与溶 液的热容量有关,温度变化与热焓成正比而与热容量成反比( t = h n p c p ) 。 在微型传感器中测量反应体系温度的变化就可以计算整个反应放出的热量,进而 根据反应式可计算待测物的浓度。 1 2 4 1 1 基于热电堆微型生物传感器芯片 一种由p 型硅点阵或铝带集成于5 9 m 的硅膜上的热电堆微型生物传感器检测尿 素、青霉素和葡萄糖,敏感度是10 5 v k t 0 9 ,而由x i e 等 1 1 0 1 提出的把热电堆集成于 石英芯片上,热电堆是由在多晶硅( 含有铝) 中的掺杂的硼层组成检测葡萄糖, 传感器的敏感度为2 m v k ,硅树脂橡胶形成和密封微通道,柱子总体积2 0 9 l ,样 品1 u l 。葡萄糖的线性范围2 2 5 m m 。p i z z i c o n i 掣j 提出一种“混合型”微生物传 感器,利用生物分子的联接构建柱状细胞界面于微制作的热电堆,通过诱导抗原的 柱状细胞活化过程引起瞬时热变化的换能来实时检测抗原,实验发现,柱状细胞 的活化和脱粒以热量的形式从代谢行为加以区别。这种方法在生物体外的诊断中 具有重要的意义。 1 2 4 ,1 2 基于电热调节器微型生物传感器芯片 x i e 等2 1 设计了流动注射量热微型阵列传感器同时测定多种分析物,传感器由 五个薄膜的电热调节器组成。电热调节器为通过微机械加工技术集成于石英芯片 的微通道中,使用琼脂糖把酶固定于微通道,从而可以测定待测物。接着他3 】又 设计了集成化的热微型阵列传感器,利用微机械加工技术在芯片上制作了六个薄 膜的电热调节器,通过不同的微通道在三个不同的区域几乎同时检测三种不同的 分析物( 尿素、青霉素和葡萄糖) ,每一个区域有种固定酶和一对电热调节器, 尿素和青霉素的线形范围1 - 2 5 m m o l l ,葡萄糖的线形范围1 2 0 m m o l l 。r a g h a v a n 等4 1 用上述装置成功检测了胆固酵的代谢。s h i m o h i g o s h i 等 5 1 设计一种便携、成 本低的电热调节器生物芯片。酶和牛血清蛋白( b s a ) 固定在两个珠形电热调节器周 围。通过在绝热细胞中测得酶的电热调节器币i b s a 的电热调节器温度的不同而检 测葡萄糖的浓度,葡萄糖的线形范围1 - - 4 m m o l l 。 1 2 4 2 微型集成化的光学生物传感器芯片模型 1 2 4 2 1 完全集成化的单片电路传感器芯片模型 这种模型的传感器不仅仅是传感器芯片,而且代表了能提供检测生物量所有 功能的完整的传感器系统。叠层式单片电路多级排列是基于在光电子集成电路中 放置平面光学换能器于主波导顶部不同的附加层“。把高分子膜涂附在刚性物质 上得到波导层“,这种方法是通过高分子和波导层完成压纹的平面效果和对光电 子平台的保护。还有反叠式传感
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