（作物遗传育种专业论文）大豆Q蛋白单克隆抗体的制备及其检测应用.pdf

摘要 大豆q 蛋白 q 简称q q s 包含3 种同功酶 0 1 0 2 0 3 通过催化不饱和脂肪酸的 加氧反应 产生豆腥味和苦涩味 降低食品的风味和营养价值 是大豆当中的抗营养因子之一 在大豆的加工贮藏过程中必须将q 除去 即脱腥 选育q 缺失新品种将是去除豆腥味的有效途 径 而目前在无腥大豆的选育及产业化应用过程中遇到了一个卡脖问题 没有一套经济快捷 的大豆q 蛋白检测方法 为此 本研究利用免疫学技术探索建立可以普遍应用的经济快捷的大 豆q 蛋白检测技术体系 成功探索了利用n a t i v ep a g e 即采用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳结合电洗脱法 鉴定和 分离制备3 种q 同功酶的新方法 通过设计不同实验确定最佳条件为 电泳样品浓度3 0 i m l 电泳样品中含有03 m l 预样品 电泳时间6 h 分离胶浓度1 1 通过电泳洗脱仪洗脱纯化3 种q 的酶带 并分别测定纯化后的3 种q s 的分子量分别为 9 3 8 1 k d 9 5 7 9 k d 9 6 1 0 k d 酶 活分别为 2 6 4 5 4 3 1 2 达到了免疫抗原要求 由于0 2 的纯化效果不佳 所以本试验采用2 套免疫方案进行单克隆抗体制备 首先以纯化 后的q 1 q 3 作为抗原采用常规免疫方案制备q 1 和q 3 单克隆抗体 其次以j 1 2 铲1 2 3 大豆种 子总蛋白及同时缺q l 和q 3 的大豆种子总蛋白作为免疫抗原 采用免疫消减法制各q 2 的单克隆 抗体 解决了纯化后的q 2 的含量过低不能满足免疫要求的问题 采用间接e l i s a 法对所得杂交瘤进行阳性筛选 通过1 3 次亚克隆得到了分泌抗不同q 单抗 的杂交瘤细胞株6 株 经鉴定 各阳性细胞株具有以下特性 所得单抗均属i g g l 亚类 单 抗腹水效价均在1 5 万 1 1 0 0 万之间 亲和力常数的大小顺序为 q 卜1 0 2 i 0 3 4 0 3 3 一2 0 3 1 4 株0 3 分泌的抗体均识别相同的抗原表位 所得单抗的特异性强 不但与 大豆中其它蛋白不存在交叉 并且在不同q 之间也无交叉 选用s i g m a 公司t y p ei b 大豆q 蛋白混合蛋白作为免疫抗原 按照常规方法制各兔抗大豆 q 蛋白多克隆抗体 共得到2 8 m l 多抗血清 该多抗具有如下特性 与3 种q 效价均达l 5 万 与大豆种子中其它杂蛋白无交叉 经对比试验 确定以多克隆抗体作固相抗体 3 种单抗作标记抗体建立检测大豆0 蛋白的 检测程序 初步建立了大豆q 蛋白检铡技术体系 通过与目前常用的i e f 检测方法同时对6 4 份材料进行检测 结果表明两种方法的q 检测的符合率达到了1 0 0 利用本检测技术体系对q 缺失的f 2 家系世代籽粒进行检测分析 并对q 的遗传规律进行分 析 结果表明 3 种q s 在f 2 家系世代籽粒中野生型与突变型分离比例均符合5 3 控制 q l 与q 2 的基因紧密连锁 控制q 3 与q l 和q 2 的基因之间不存在连锁关系 本研究建立的大豆q 蛋白检测技术体系可为无腥大豆的良种繁育 商品生产 收获储运 加工提供经济快捷的检测方法 同时为更多的科研单位开展无腥大豆选育提供方便 关键词 大豆 q 蛋白 非变性p a g e 单克隆抗体 双抗体夹心法 p r e p a r a t i o no fm o n o e l o n a ia n t i b o d i e st os o y b e a n qp r o t e i na n di t sa p p l i c a t i o n a u t h o r m az h i m m m a j o r c r o pg e n e t i c sa n db r e e d i n g s u p e r v i s o r p r o f z h a n gm e n g c h e n p r o f m az h i y i n g a b s t r a c t s o y b e a nqp r o t e i ni n c l u d e st h l 呛eqi s o z y m e sd e s i g n a t e dq 1 q 2 q 3 t h e s ee n z y m e s c a l lc a t a l y z et h eo x i d a t i o no fu n s a t u r a t e df a t t ya c i d s w h i c hg e n e r a t e su n d e s i r a b l e g r a s s y h e a r t yf l a v o ra n db i t t e rt a s t e s ot h a td e s t r o yc e r t a i nv i t a m i na n t ip r o t e i ni nt h e s o y b e a n s o y b e a nl i p o x i g e n a s ei s t h em o s tl i n l i t i n gf a c t o ro fc o n t r o l l i n gs o y b e a n n u t r i e n tv a l u ea n df l o u r w em u s tr e d u c eqp r o t e i nd u r i n gt h ep r o c e s s i n go fs o y b e a n d e t e c tq p r o t e i nl a c k i n gm u a n t ss e l e c t i v e l y 船b r e e d i n gm a t e r i a l s a tp r e s e n t i ti sd i f f i c u l t t oi m p r o v ea n ds p r e a dt h en o n o d o rs o y b e a n 嘶sr e s e a r c he s t a b l i s h e das i m p l e s e n s i t i v e a n dr a p i dm e t h o do fd e t e r m i n i n gq p r o t e i ni ns o y b e a ns e e d st os o l v ei m p r o v e m e n ta n d s p r e a do f t h en o n o d o rs o y b e a n n a t i v ep o l y a c r y l a m i d eg e le l e t r o p h o r e t i e n a t i v ep a g e a n de l e c t r o p h o r c t i ce l u l i o n m e t h o dh a v eb e e na p p l i e dt ot h es e p a r a t i o na n dp r e p a r a t i o no ft h r e es o y b e a nqp r o t e i n n l eo p t i m a le x p e r i m e n t a lc o n d i t i o n sf o rn a t i v ep a g ei st h a t0 3 m le x t r a c ti si n1m l e l e c t r o p h o r e s i sm a t e r i a l t h el d t a le l e c t r o p h o r e s i st i m ei s6h o u r s t h ec o n c e n t r a t i o no f n a t i v ep o l y a c r y l a m i d eg e li s11 t h r opg hd e s i g n i n gd i f f e r e n te x p e r i m e n t t h r e ee n z y m e b a n d sw e r ee l u t e df i g h ta n do b t a i n e dp u r i f i c a t i o no fqp r o t e i n t h em o l e c u l a rw e i g h to f t h r e eq p r o t e i ni s9 3 8 1 k d 9 5 7 9 k da n d9 6 1 0 k dr e s p e c t i v e l y e n z y m ea c t i v i t yi s2 6 4 5 4a n d31 2r e s p e c t i v e l y w h i c hw e r ea l lr e g a r d e d 嬲c o m p l e t ea n t i g e n t w om e t h o d sw e r eu s e dt op r e p a r em o n o c l o n a la n t i b o d i e s m a b s i nt h i ss t u d yf o r t h eu n s a t i s f a c t o r ye f f e c to ft h eq 2 f i r s t l y w ep r e p a r e dm o n o c l o n a la n t i b o d i e s m c a b s a n t i q ia n dq 3 谢t l lr o u t i n ei m m u n i t yp r o g r a mr e s p e c t i v e l y s e c o n d l y w ep r e p a r e d m o n o c l o n a la n t i b o d i e sa n t i q 2u s i n gt h et o t a lp r o t e i no fj i d o un o 1 2a n dt h es e e do f l a c k i n gq 1a n dq 3a tt h es a m et i m e 鸽a n t i g e n sw j 也a n b t r a c t i v ei m m u n i z a t i o n t e c h n i q u e s w h i c hs o l v e dt h ep r o b l e mt h a tt h ec o n t e n to f t h ep u r l e dq 2 i st o ol o wt ou s e a sa n t i g e n w eo b t a i n e dt h em c a ba n t i q 1 t h em c a ba n t i q 2a n dt h em c a b sa n t i q 3f i n a l l y n 坞h y b r i d o m ac e l l sw h i c hp r o d u c e st h em c a b sa n t i q l q 2 q 3w e r es u b c l o n e d1 3t i m e s b yd e t e c t i n gt h ep o s i t i v ec e l lv i r i 山t h ei n d i r e c te u s a e a c hp o s i t i v ec e l l h a v et h e s e c h a r a c t e r i s t i c s o t b es i xm e a b sw e r em o u s ei g g l t h ca s c i t i ct i t r e so f t h ea n t i b o d i e s r a n g e df r o ml 5 0 0 0 0t ol 1 0 0 0 0 0 0 d c o m p a r i s o no f t h e i rr e l a t i v ea f f i n i t yw a sq 1 l q 2 l q 3 4 q 3 3 q 3 2 q 3 l f o u r m c a b sa n t i q 3a l lc o u l di d e n t i f yt h es a m e a n t i g e n i ce p i t y p e s t l l em c a b sh a v eh i g i ls p e c i f i c i t y t h em e a b sc o u l dn o tr e a c tw i t h t h eo t h e r sp r o t e i ni ns o y b e a n a n dh a v en o tc r o s sr e a c t i n gb e t w e e nt h et h r e eq sp r o t e i n w ep r e p a r e dr a b b i tp o l y c l o n a la n t i b o d i e s 伊c a b s a g a i n s ts o y b e a nq sp r o t e i nb y i m m u n i z i n gr a b b i tu s i n gt y p el bs o y b e a nqp r o t e i no fs i g m a a n do b t a i n e d2 8 m l p o l y c l o n a la m i b o d ys c n u l l w h i c hh a st h e s ec h a r a c t e r i s t i c s 龇a s e i t i et i t r e so ft h e p c a b sw i t he a c hq p r o t e i ni s1 5 0 0 0 0 i td i d n tr e a c tw i t ht h eo t h e r sp r o t e i ni n s o y b e a n t h em e a s u r i n gp r o c e s s e so fs o y b e a nq sp r o t e i na l ee s t a b l i s h e dp r e l i m i n a r yw i t h a s c e r t a i n i n gt h ep c a ba st h ec o a p e c la n t i b o d ya n dt h et h r e et y p e sm c a b sa st h et e s t i n g a n t i b o d yb yt h ec o m p a r a t i v e l ye x p e r i m e n t a ls t u d y mc o i n c i d e n c er a t ei s1 0 0 b y u s i n gt h i sm e a s u r i n gp r o c e s sa n dt h ec o i l l n o nm e t h o d sf o rs o b e a nq s i e fa sm e a s u r i n g 6 4m a t e r i a l sa tt h es a n l et i m e n e d e t e c t i o n o f t h ef 23f a m i l i e sn u l l t y p e so f q s u s i n g t h e d e t e c t i o n t e c h n o l o g y c o n s t r u c t c di nt h i ss t u d y a n da n a l y s d i n gt h ei n h e r i t a n c eo ft h es o y b c a nq p r o t e i nb yt h e d e t e c t i o nr e s u l t s t h er e s u l t si n d i c a t et h a t 1 1 1 es e g r e g a t i o nr a t i oi nt h ef 2 3f a m ilie s o fd o m i n a n tt or e c e s s i v ew a s5 3 t h eq 1i st i g h t l yl i n k e dt ot h eq 2 a n dt h eq 3w a s n o tl i n k e dt ot h eq la n dq 2 t 1 1 i ss t u d yn o to n l yp r o v i d ea ne f f i c i e n ta n dc h e a pm e a s u r i n gp r o c e s s e st ot h e c u l t i v a rb r e e d i n g t h ec o m m o d i t yp r o d u c t i o n h a r v e s t s t o r a g e l x a n s p o r t a t i o n p r o d u c t i o n a n ds oo n b u ta l s oo f f e rt h ec o n v e n i e n tt om o r er e s e a r c hi n s t i t u t i o n sb r e e d i n gt h e n o n o d o rs o y b c a n k e yw o r d s s o y b e a n qp r o t e i n m o n o e l o n a la n t i b o d y n a t i v ep a g e d o u b l ea n t i b o d y s a n d w i e hm e t h o d 缩略语 缩略词英文名称 中文名称 q q p r o t e i nq 蛋白 i e f p a g ei s o e l e c t r i cf o c u s i n gp o l y a c r y l a m i d e等电聚焦凝胶电泳 g e le l e t r o p h o r e s i s s d s a c r a p b i s t e m e d t r i s o d u a b a g s p 2 o f c a f i c a d m s o p b g e u s a t m b s p 姒t h t d m e m k d a m c a b p b s p c a b s o d i u md o d e e y ls u l f a t e十二烷基硫酸钠 a e r y l a m i d e 丙烯酰胺 a m m o n i u mp e r s u l f a t e过硫酸铵 b i s a c r y l a m i d e 甲叉双丙烯酰胺 n n n n t e t r a m e t h y l e n e d i a m i n e四甲基乙二胺 t r i s h y d r o x y m e t h y l a m i n o m c t h a n e 三羟甲基氨基甲烷 o p t i c a l d e n s i t y 光密度 u n i t单位 a n t i b o d y 抗体 a n t i g e n 抗原 p 2 0a g l 4小鼠瘤细胞s p 2 0 f r e u n d sc o m l p l e t ea d j u v a n t弗氏完全佐剂 f r e u n d si n c o t r d p l c t ca d j u v a n t弗氏不完全佐剂 d i m e t h y ls u l p h o x i d e 二甲基亚砜 p o l y e t h y l e n eg l y c o l 聚乙二醇 e n z y m e 1 i n k e di m m u n e o s o r b e n ta s s a y 酶联免疫吸附试验 3 3 5 5 t e t r a m e t h y lb e n z i d i n e 3 3 5 5 一四甲基乙二胺 s 缸 e p t o m y t i n p e n i c i l l i n 青霉素 链霉素 h y p o x a n t h e n e a m i n o p t e i n t h y m i d i n e 次黄嘌呤一氨基喋呤一胸腺嘧啶核苷 h y p o x a n t h e n e t h y m i d i n e 次黄嘌呤一胸腺嘧啶核苷 d u l b e c c o sm o d i f i e de a g l em e d i u md u l b e e c o 氏改良培养基 k i l o d a l t o n 千道尔顿 m o n o c l o n a la n t i b o d y 单克隆抗体 p h o s p h a t e b u f f e r e ds a l i n e 磷酸盐缓冲液 p o l y c l o n a la n t i b o d y 多克隆抗体 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得 的研究成果 据我所知 除了文中特别加以标注和致谢的地方外 论文中不包 含其他人已经发表或撰写过的研究成果 也不包含为获得丑些壅些太堂或其它 教育机构的学位或证书而使用过的材料 与我一同工作的同志对本研究所做的 任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意 学位论文作者签名 弓意民 签字日期 二e 9 7 年 月f 多日 关于论文使用授权的说明 本学位论文作者完全了解扭韭盛些太兰有关保留及使用学位论文的规定 有权保留并向国家有关部门 机构 送交论文的复印件和磁盘 允许论文被查 借 阅 本人授权迎j t 蕉些太堂可以将论文的全部或部分内容编入有关数据 库进行检索 可以采用影印 缩印或扫描等方法加以保存或编成学位论文 保密的学位论文在解密后应遵守此协议 学位论文作者签名 弓志晟 导师签名 签字日期 工p d 7 年 月f 日签字日期 锈一 年 筝哆 大豆q 蛋白单克隆抗体的制备及其检测应用 1 引言 大豆对于改善我国人比膳食中夤白质不足的现状和提高国民素质具有非常重要的意义 作为高蛋白和优质油料作物 其子粒的蛋白质含量高达4 0 左右 且必需氮基酸组成合理 富含多种维生素平 矿物质 可为人体提供均衡的营养川 近年来已成为世界上最经济的食品蛋 白质来源 具有较高的营养特性及保健作用 并著有 植物肉 的美称 但是大豆制品中的豆腥味却制约其作为蛋白质资源的广泛利用口j a n d r c 和h o u 1 9 3 2 首先发现了大豆蛋白制品产生豆腥味是因为其中多元不饱和脂肪酸发生酶促反应的结果 其 中关键的酶就是q q q e c l 1 3 1 1 1 2 属氧化还原酶 通称q 它广泛地存在于动植物界 中 其结构中含有非血红素铁 能专一催化具有c i s c i s l 4 一戊二烯结构的多元不饱和脂 肪酸 使后者通过分子加氧 形成具有共轭双键的氢过氧化衍生物 图1 o o i 仨5 c n l 1 o i y 鸯f l v v w 一 l 昌 一 一b h f i l l l i i 1 3 一k t d r p l i l d 围10 僵化亚油酸加氲反应的两种初级产物 f i g u r e1t w op f j m a r p r o d u c t so f d i o x y g e n a t i o nc a t a l y z e db yq 1 9 4 7 年t h e o r e l l 等 1 首次从大豆中获得了q 的结晶 分子量为1 0 2 k d a 在随后的2 0 2 5 年里 有关q 的研究进展缓慢 自1 9 7 2 年c h a n 1 在国际会议上宣布每摩尔大豆q 蛋白 q 1 含有1 摩尔铁后 有关q 的研究迅速升温 豆科植物种子如大豆 蚕豆等中富含q 大豆中 蛋白含量为4 0 左右 成熟的种子中q 占总蛋白含量的l 2 是大豆中比较活跃的酶 1 1q 蛋白研究进展 1 i 1 理化性质 1 9 7 0 年 c h r i s t o p h e r 等例利用离子交换层析法将q 分离成i 型和i i 型两个组分两组分在 许多性质上都不同 如酶活最适p h 热稳定性 c a 2 相关性 等电点 底物专一性等 大豆 q 蛋白有四种电泳类型 q l 主要出现在层析法分离的i 型中 也正是最早被t h e o r e l l 分离结 晶的那一种 q 2 和q 3 出现在i i 型中 层析法的不断改进又将q 3 分离成3 a 和3 b 两种 这两 者在许多性质上相似 q 的几种同功酶的性质比较见表1 河北农业大学硕士学位 毕业 论文 寰1 几种0 同功酶性质比较州 t a b l eip r o p a x i c so f v c r a joi s o c n z y m e j q 1 1 2 催化机理 q 对于它作用的底物具有特异性的要求 含有顺 顺 1 戊二烯的直链脂肪酸脂肪酸酯和 醇都有可能作为q 的底物 最普通的底物是砸油酸 砸麻酸平 花生四烯酸 在不饱和脂肪酸 中 顺 顺 1 冉戊二烯的位置对q 的作用有显著的影响1 1 0 ij 1 2 1 3 1 如果采用从 c h 3 末端起编号 的u 编号系统 那么u 6 具有取键是必要的 翻2 而顺 顺 1 4 戊二烯单位的弧基在u s 位 的脂肪酸异构体是o 的最佳底物 顺 顺 1 4 戊二烯的亚基单位在u 1 0 或u 1 l 位的脂肪酸异 构体不能作为q 的底物 在u 3 位增加一个顺 顺双键并不影响o 对底物的作用 例如亚麻 酸是o 的良好底物 在脂肪酸的u 1 0 位和羧基之间增加烈键仍然可以作为q 的底物 如花 生四烯酸和8 l l 1 4 二十碳三烯酸都是o 的底物 甘窟 c y 窟 9 妒但 三 6 h 田2d 雇物脂肪酸的部分结构i f i g u r e 2p m t i a l 姗蛳o f s u b s u m cf o ro f 埘 注 采j 1 j 从来蛐 o h 3 开始的蝙号方法 u 犏号系统 q 的作用机制可用大豆q 蛋白的同功酶q 1 作用于通常底物亚油酸 r o o h 来解释 图 3 酶处在未活化状态时 酶分子中的f c 以还原态存在i l 酶与微量的1 3 s 亚油酸氢过 氧化物作用即激发为活化态 此时酶分子中的f e 以三价氧化态存在 图3 中已指出 活化态 q 作用于亚油艘的第一步是从c 1 l 立体有选择地取走一个氢i l 在图中所指出的同功酶q l 2 一 腿9耳 一 大豆o 蛋白单克隆抗体的制各及其检测应用 作用机制中 酶取走了h l s 产生黄色的亚油酸自由基一酶络合物l i 同时 q 分子中的f e 从三价氧化态变成二价还原态 接着的一步反应是 0 2 接到亚油酸自由基一酶络合物上去 有可能伴随着发生0 2 被活化成0 2 的过程 0 2 通过反面 o p p o s i t es i d e 机制接到砭油酸分子 上被取走的h l s 的相反一侧 氢过氧化亚油酸游离基从酶分子中的f e 上取走一个电子并 从介质中得到一个质子形成1 3 s 一砸油酸氢过氧化物 同时酶再生 在1 3 s 亚油酸氢过氧化物 1 3 s 氢过氧化 顺 9 反 1 1 十八碳 二烯酸 形成时 双键从c 1 2 移到c 1 构型从顺式转 变成反式 在p h 9 时 大豆q 蛋白的同功酶q 1 以亚油酸为底物的主要产物是1 3 一s r o o h 此外 还可能产生其它三种异构体 1 3 r r o o h 1 3 r 氢过氧化一反 9 反一11 一十八碳二烯酸 9 r r o o h 9 r 氢过氧化 反 1 0 顺 1 2 十八碳二烯酸 和9 s r o o h 9 s 氢过氧化 反 1 0 反 1 2 十八碳二二烯酸 除了酶的特异性外 还有许多其它因素决定了q 作用的产物究竟是哪一 种异构体或哪几种异构体及其比例 在o 的催化作用下 亚油酸不仅在u 6 位上发生氧化 形成1 3 s h p o d 也会在u 一1 0 碳 上发生氧化形成少量9 s h p o d f 正是这种在 6 和u 1 0 碳上的 双重氧化性使得在q 1 的作 用下 亚麻酸 花生四烯酸及其它一些脂肪酸生成二氢过氧化物 v a no s 等人证明这些二氢 过氧化物均是s 构型 u 1 0 碳上的氧化及二氢过氧化物的形成在高p h 值时受到抑制 当p h 值从9 降至中性时会促进u 1 0 碳上的氧化及二二氢过氧化物的形成 根据图2 弧油酸自由基遵循非酶机制生成少量的外消旋氢过氧化弧油酸 在无氧条件 f 油酸自由基一酶络合物分解成砸油酸自由基和 酶 e f c 后者同1 3 s r o o h 作用 产生自由基r o 和o h 同时酶中的铁变为三价 亚油酸自由基同r o 和o h 作用生成二聚 体 氧代二烯酸和正戊烷等 臂袖三蠢删忙r 幽 广 上 置捆 i m d e i c 略试 醒 m 妇血i 试 q 0 g q 1 3 过t 赡基一亚抽t 1 3 垃曩謦基一重 t 1 3 一峥d r 叩e 哪叮i i i e k e i d 1 3 h c l r 卵口o 甲l i r o l e a 妇 叫 砰0 0 严i 删岫 日墨o 叫 a 己静 i 磐曩 5 己娜尊 i 柚 幽一3 一h 蝴删 一3 一i i e i 已l h 鼍枷 i f 瞳一0 一己怖睡 登臣一2 一己 尊 f 惟一2 一l t 钟 n 鼬一2 一h 埘嘣i 图3 大豆种子q 参与从弧油酸和亚麻酸形成主要挥发性化合物的途径 f i g u r e3t h ep a t h w a yf b rt h el i p o x g e n o s ac a t a l y z i n gt h ep e c o x i d a t i o no f i i n o l c i c r i d a n dl i n o l e n i ca c i dl of o r mt h ev 耐o v o l a t i l ec o m p o u n d si n 叫m is e e d f 州 1 1 3 深入研究 最近几年 人们对大豆种子q 缺失体的研究逐渐深入到分子生物学水平 目前三种q 同 河北农业人学硕士学位 毕业 论文 功酶基因的c d n a 序列基本清楚 s h i b a t a 等1 2 0 测定了q l 的c d n a 全序列 全长2 8 k b 含 8 3 8 个氨基酸 分子量9 40 3 8 s h i b a t a 等口l 还报道了q 2 c d n a 全序列 并推导出含9 6 5 个氨 基酸 分子量为9 70 3 6 r i c h a r d 等1 2 2 1 报道q 3 基因组d n a 及c d n a 全序列 由9 个外显子 和8 个内含子组成 其蛋白质包含8 5 9 个氨基酸 分子量9 66 6 3 孙君明等田i 以缺失q 基因 的c e n t u r y 近等基因系为材料 利用f 2 材料作为定位群体 寻找与 基因位点紧密连锁的 r a p d 标记 为大豆q 蛋白分子定位及标记辅助育种提供可靠的依据 段红梅 邱丽娟 2 0 0 3 利用s s r 标记进行遗传背景分析 探索分子标记辅助遗传背景选择时所需适宜的标记致和方 式 获得进一步回交的鲁豆4 号的缺失株系 从而加速培育鲁豆4 号q 缺火近等基因系1 2 4 0 5 j 闫彩霞 2 0 0 5 等利用s s r 标记对 肋7 j 新 胁两对基因进行精细定位 同时对 砌 进行了初步定位 1 2 单克隆抗体概述 1 2 1 抗原 抗原是能引起机体产生免疫应答反应的异源性物质 根据免疫应答的效果可以将抗原分 为完全抗原和半抗原 完全抗原是指能够直接诱导机体产生特异性免疫应答的一类物质 完 全抗原的分子量一般都大于5 0 0 0 其化学成分多为蛋白质或脂多糖 其它如腊蛋白 糖蛋白 多糖体 多肽 核酸等也都是完全抗原 半抗原能与抗体特异性结合 但不能激发机体产生 抗体 必须与蛋白质 载体 结合后进入机体 才能产生有效的免疫应答 大分子的半抗原 在体外能与对应的抗体结台发生可见反戍 凝集 沉淀 小分子的半抗原能与对应抗体结 合而不出现可见反应 此外 抗原还可以按照臼身的物质属性分为可溶性 毒素 异种蚩白 或颗粒性 细菌 细胞 抗原 或按临床意义分为外源性和内源性抗原 人豆种子中q l q 2 q 3 的分子量都远大于5 0 0 0d a l 其化学成分为天然蛋白质 而且酪氨酸的含量较高 免疫原 性和抗原性都较强 可作为抗原直接进行免疫 抗原的反应性取决于抗原决定簇 a n t i g e n i cd e t e r m i n a n t 或称为表位 印i t o p e 可以 决定其刺激机体所产生抗体的特异性 个抗原分子可带有不同的决定簇 抗原分子量愈大 决定簇数量愈多 决定簇数目代表抗原分子的结合价 因此 分子量大的抗原 将会产生相当 丰富的杂交瘤细胞株1 2 s 2 啦 1 2 2 单克隆抗体制备 单克隆抗体 m o n o c l o n a la n t i b o d ym c a b 的概念来源于5 0 年代b u m e t 的无性繁殖细胞系选 择假说 b 淋巴细胞在抗原的刺激f 能增殖分化 转变成产生抗体的浆细胞 若将单个产生特 异性抗体的b 淋巴细胞分离出来 使之在体外分化增殖 产生一火群即一个克隆的细胞 这 样便得到大量的 结构相同的 均一的 针对抗原某一决定簇的抗体 这种由一个克隆b 捧 巴细胞产生的抗体称为单克隆抗体l 卫l 1 杂交瘤技术基本原理 一 4 天豆q 蛋白单免隆抗体的制备及其检测应用 动物脾脏的淋巴细胞即b 淋巴细胞能够产生特异性抗体 但在体外培养时 最多只能存 活1 0 2 0 天 而骨髓瘤细胞虽可以在体外长期人量繁殖培养 但不具备有分泌特异性抗体蛋 白的功能 在前人的工作基础上 k o h l e r 和m i l s t e i n 1 9 7 5 1 3 2 l 成功建立了能无限制产生特异性 抗体的杂交瘤技术 他们将小鼠产生抗体的脾淋巴细胞与同系小鼠的骨髓瘤细胞融合在一起 形成杂交瘤细胞 融合成功的细胞既获得了亲代脾细胞分泌特异性抗体的特性 又有骨髓瘤 细胞无限增殖的特性 由于每一个免疫淋巴细胞只能分泌针对单一抗原决定簇的特异性抗体 所以由杂交瘤细胞分泌是针对特异性抗原的纯一分子单克隆抗体 细胞融合时 骨髓瘤细胞与分泌抗体的淋巴细胞在特定的融合剂如5 0 p e g 作用下融合 其中只有一小部分融合成杂交瘤细胞 大量细胞没有融合 也存在同种细胞闯的融合 虽然 未经融合的淋巴细胞及淋巴细胞间形成的融合细胞在体外不能长期存活 但未经融合的骨髓 瘤细胞以及骨髓瘤细胞间的融合细胞仍然在培养基中生长繁殖 干扰杂交瘤细胞的生长 为 了筛选出杂交瘤细胞 l i t t l e f i e l d 1 9 6 4 使用了h a t 选择性培养基 它可以杀死未融合的骨髓 瘤细胞及骨髓瘤细胞问形成的融合细胞 只有骨髓瘤细胞与淋巴细胞融合形成的杂交痞细胞 才能存活 细胞内d n a 的合成有内源性和外源性两个途径m l d n a 的内源性生物合成途径是指细 胞可以利用谷氩酞胺与尿嘧啶核苷单磷酸合成d n a 这是主要的合成途径 返一合成途径可 以被叶酸的拮抗物 氨基嘌吟 a 所阻断 d n a 的外源性生物合成途径包括 细胞通过鸟嘌 岭磷酸核糖转移酶 h g p r t 利h j 次黄嘌呤 h 合成嘌呤核苷酸 通过胸腺嘧啶激酶 t h y m i d i n e k i n a s e t i c 利用胸腺嘧啶核苷 d 合成嘧啶核苷酸 进而合成d n a h a t 选择性培养基是在常 规培养基内加了氨基嘌呤 a 用以阻断d n a 的内源性生物合成途径 同时提供核苷酸合成 的前体次黄嘌呤 h 和胸腺嘧啶核苷 t 供细胞利用外源途径合成d n a m l 用于细胞融合的骨髓瘤细胞是经过8 氮鸟嘌呤处理缺失h g p r t 的营养缺陷型细胞 或经 5 溴脱氧尿苷处理的缺失t k 的缺陷型细胞 该细胞只有核苷酸合成的内源性途径 而没有外 源性合成途径 所以在h a t 培养基中骨髓瘤细胞和它们彼此融合的骨髓瘤细胞均被杀死 未 融台的淋巴细胞和它们彼此融合的淋巴细胞不能传代而最终也会死亡 而杂交瘤细胞获得了 骨髓瘤细胞的遗传信息 能在体外无限生长 又从鼠脾淋巴细胞获得了h g p r t1 或t k 在 该培养基中可利用生物合成的外源途径合成d n a 因此 只有杂交瘤细胞能够在h a t 培养基 中大量生长繁殖1 3 6 j 2 杂交瘤技术基本流程 其主要步骤包括 动物免疫 骨髓瘤细胞培养 细胞融合 杂交瘤细胞的筛选 阳性孔筛选 杂交瘤细胞的克隆 融合细胞的冻存 腹水的制备及单克隆抗体的纯 化和鉴定等 图4 5 河北农业人学硕十学位 毕业 论文 l 动物免疫j 卜e l i s a 法测鼬清 1 分离脾细胞lls p 2 0 城i f j 亭蝴井t h a t 培养基选择培养 一z l x s a 蝴 睡i 性孔亚克隆并扩大培养f 与 翩 饲养细胞 叫 l 融哑强l j r 克隆并扩大培养 l 冻璃 l 连续两 趺亚克隆阳i 性率达1 0 日 之后 i 扩大培养收集上淆fl 腹腔接种收集腹水j ii 革克隆抗体纯化 围4 单克隆抗体杂交疆技术基本流程 f i g u r e4t h ep r o c e d u r eo f p r o d u c t i o no f m a bw i t hh y b d d o m at e e h n o l o l d 3 免疫消减法制备单克隆抗体 制各单克隆抗体的过程中 免疫小鼠和检测常需用特异性抗原 然而 对于一些组织或 细胞 如肿瘤细胞 组织抽提物等1 因成分复杂 不易提纯 或者提纯方法繁琐 得率低 或 者在提纯过程中易使目的抗原失活 故只能用复杂得抗原混合物进行免疫 这样势必降低或 干扰特异性抗原诱导的免疫应答 同时还增加筛选的工作量口 在用混合抗原免疫小鼠时存在着一种偏倚 即获得的抗体多是针对强免疫原性抗原的抗 体 为了获得对弱免疫原性抗原或稀有抗原的理想免疫效果 曾采用了多种免疫方案 如体 内免疫 皮下 腹腔 静脉和脾内免疫等 及体外免疫等吲 1 9 8 3 年m a t t h e w 等口目首次应用免 疫制剂一环磷酰胺 c y c l o p h o s p h a m i d e c p 免疫小鼠 开创了以免疫抑制法制各特异性单克隆抗 体的工作 该方法的理论基础是 当抗原诱发一种正常的免疫应答时 圈5 b 细胞与t 细胞克隆 均发生增殖 处于增殖期的细胞易被烷基化药物 环磷酞胺选择性的杀死 因而当相同成 分的抗原再次进入体内时 对其免疫应答便被抑制 因此 c p 被用来抑制非目的抗原的免疫 6 人豆o 蛋白单克隆抗体的制各及其检测应刚 原性 减少非目的抗体产生 从而增加了对目的抗原免疫应答的儿率 减少了筛选 作量 有可能在不纯化抗原的基础上有目的地获得预期的单克隆抗体 丝 琏录饬卜黢 辩e 掰子 摊 一锾 疆蝉 眵 盼 啦l i i 固5 免疫应答示意图 f i g u r e 5s c h e m a t i c d r a w i n g o f i m m u n er e s p o n s e 1 2 3e l i s a 技术原理及研究进展 1 9 7 1 年e n g v a l 和p e n2 m a r m 及v a n w e e m e n 和s c h u u r s 两组学者分别用酶代替放射性同位 索制备了酶标记试剂 刨立了酶免疫分析技术 e n z y m ei m m u n 0 0 a y e t a 酶联免疫吸附试 验 e n z y m el i n k e di m m u n o s o r b e n ta s s a ye l i s a 是根据e t a 原型发展的一种技术 e l i s a 法在免 疫学检测中应用最广 最为普遍 因其灵敏度高 准确性好 操作简单 无需特殊仪器 且 试验时间短 深受广大科研工作者喜爱 1 e 认的特点及发展趋势 当今三大免疫标记技术 免疫酶和免疫荧光 放射免疫 它们分别用酶 荧光素 放射 性核索标记抗体或抗原进行抗原抗体反应 酶是能催化化学反应的特殊蛋白质 其催化效力 超过所有人造催化剂 酶一般可便反应加速1 0 s 1 0 倍 酶还具有高度专一的特性 每一种酶 只催化一种或一组密切相关的反应 e t a 是将酶催化放火作用和抗原与抗体免瘦反应的特异性 相结合的一种微萱分析技术 酶标记抗体或抗原后 既不影响抗体或抗原的免疫反应的特异 性 也不改变酶本身的活性 e t a 以底物被酶分解后的显色深浅检测样品中的抗体或抗原含量 常用辣根过氧化物酶 h r p 酶底物为二二氨基联苯胺 d a b 底物被分解后里棕黑色 可目测 或比色 该技术特异 敏感 快速 能定性 定量和定位 且易于观察 因有较高的敏感性 一般传统的血清学方法测不出的都可用这些方法检测 由于能定位 对一些疾病的致病机制 可提供有力佐证 例如可在细胞或孤细胞水平上观察和鉴定抗原 受体 抗体或免疫复合物 等 1 9 7 5 年问世的杂交瘤技术可大量生产抗不同抗原决定簇的单克隆抗体 大大促进了e t a 的发展 明显提高了e t a 的灵敏度和特异性 推动了新一代e t a 的设计 现在e t a 己发展成 形式各异 各有其优点和用途的定位 定量 半定量和超微量分析技术 同放射免疫相比较 e i a 除可避免放射性同位素伤害以外 最重要的优点是酶标记物的有效期长 在无菌或防j 香 的 条件下 4 或冻千放室温的保存期可超过一年 在医学和生物学中 e t a 的应用越来越广泛 致以百计的e t a 诊断试剂盒己投放市场 取得了极为显著的社会和经济效益 到上世纪末 河北农业大学硕十学位 毕业 论文 8 0 以上的放射免疫已被e i a 等非放射性同性索标记免疫分析所取代 2 e m s a 基