（物理化学专业论文）纳米技术在rna研究中的应用.pdf

上海师范大学硕士学位论文 纳米技术在对峨研究中的应用 学位论文独创性声明 本论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。论文中除 了特别加以标注和致谢的地方外，不包含其他人或机构已经发表或撰写过的研究 成果。其他同志对本研究的启发和所做的贡献均已在论文中做了明确的声明并表 示了谢意。 论文作者签名寺牟阖眺8 年。锄 论文使用授权声明 本人完全了解上海师范大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权 保留送交论文的复印件，允许论文被查阅和借阅；学校可以公布论文的全部或部 分内容，可以采用影印、缩印或其它手段保存论文。保密的论文在解密后遵守此 规定。 论文作者签名弓孑闰日期：z 参，易年s 月2 甸 黜名：私辛眺圳年j 咖 上海师范大学硕士学位论文纳米技术在r n a 研究中的应用 沧文题目：纳米技术在r n a 研究中的应用 等业：物理化学 学位申请人：于平国 曾导教师：朱龙章副教授 摘要 自从费曼提出纳米科技的概念以来，纳米技术受到了广泛的关注并得到了 迅速的发展。纳米科学的发展带动了许多其他学科的发展，同时也产生了很多 斫兴的交叉学科。纳米技术与生物技术相结合所产生的纳米生物技术是目前世 界上的研究热点课题，已经有了很大的发展。本文主要探究了纳米技术在r n a 开究中的应用。 1 化学共沉淀法合成磁性纳米粒子，通过反相微乳液法在其表面包裹一层 二氧化硅。再通过化学反应在其表面修饰上具有活性的巯基官能团，然后连接 慕核苷酸探针将这样的功能化磁性纳米粒子应用于m r n a 的分离。结果表明， 行制备的功能化磁性纳米粒子能够有效地从悬浮培养细胞中把m r n a 分离出来， 勾生物学上i r n a 的研究提供了技术手段。 2 通过采用“半量逼近法”从培养体系中分离得到单个细胞，使用选择性 型解液n p - 4 0 使细胞膜裂解。利用功能化磁性纳米粒子从裂解体系中分离得到 i r n a ，采用两步法进行r t p c r ，并将逆转录反应在纳米粒子固相表面直接进行， 甏胶电泳结果显示单个细胞m r n a 被分离并成功扩增。 3 基于纳米技术与生物学上反义技术的理论基础知识，通过“复凝聚法一 成了具有磁导向性的壳聚糖一s i r n a 复合物，结果显示粒子磁响应性良好，包 寸效率较高而且壳聚糖对s i r n a 有显著的抗酶降解保护作用，复合粒子对k 5 6 2 田胞有明显的促凋亡作用。 键词：功能化磁性纳米粒子单个细胞m r n ar t p c r 琼脂糖凝胶电泳 s i r n a 细胞凋亡 上海师范大学硕士学位论文 纳米技术在r n a 研究中的应用 a b s t r a c t s i n c et h ei n t r o d u c t i o no ft h ec o n c e p t0 fn a n 0t e c l l l l o l o g yb yr f e y 舳a ni n 1 9 5 9 ，i th a sb e e np a i d 伊e a ta t t e n t i o na n dd e v e l o p e dr a p i d l y ：t h ed e v e l o p m e n to ft h e n a n ot e c l l l l o l o g yd r o v et h ed e v e l o p m e n to fs o m eo t h e rs u b j e c t s 觚db r o u g l l ts o m e n e wi n t e r d i s c i p l i n e s n o w a d a y s ，n a n ob i o t e c l l n o l o g yi st h er e s e a r c h0 ft h ew o r l d ，a n d w h i c hh a sb e e nd e v e l o p e d 擎e a t l y t 1 l i sp a p e ri sf o c i l s e do nt h ea p p l i c a t i o no f l e n a n o t e c l m o l o g yi nt h ef i e l do ft h er e s e a r c ho ft h er n 八 1 n e m a g i l e t i cn a i l o p a n i c l e s w e r e s y n t h e s i z e db y t h ec h e m i c a l c 0 p r e c i p i t a t i o n a n dt h em a g n e t i cn a n o p a n i c l e sw e r ec 0 a t e dt h es i l i c ai nt h er e v e r s e m i e m u l s i o n n es u 血c eo ft h cn a l l o p a n i c l e sw a sm o d i f i e dw i t ha c l i v et h i 0 1 t h e nt h eb e a d sw e r ec o n n e c t e dw i t ho l i g o ( d dp r o b e t 1 l ef u n c t i o n a l i z e dm a g n e t i c n a n o 弘r t i c l e sw e i eu s e da st h eg e n e r a la g e n tl os e p a r a t et h em r n a f t o mk 5 6 2c e l l t h er c s u l t ss h o w e dt h a tt h ef u n c t i o n a l i z e dm a g n e t i cn a n o p a n i c l e ss e p a m t e dt h e m 心泼舶m 飚6 2c e l le 饿c t i v e l y ，w h i c ho 虢r e dav a l u a b l et 0 0 lt 0t h cr c s e a r c ho f t h em r n a 2 as i n 酉ek 5 6 2c e l lw a sa c h i e v e df b mt h em a s s i v ec l l l t u r a ls 0 1 u t i o nt h r o u 曲 s e m i q u a n t i t i v et e “q u e ，t n es e l e c t i v el y s i sn p - 4 0w a su s e dt 0c f a c kt h em e m b r a n e t h e nt h em r n aw a ss e p a r a t e d 自o mt h e l y s a t ew i t ht h eo l i g o ( d d - m o d i f i e d n a n o p a r t i c l e s t 1 7 i r os t e pr t - p c rm e t h o dw a sp e r f o n n e dw i t ht h es o l i dp h a s er e v e r s e t r a n s c 订p t i o n t h er e s u l to ft h ea g a r o s eg e le l e c t r o p h o r e s i ss h o w st h e 1 险姨w 弱 e x t r a c t e d 蠡r o mt h es i n 百ek 5 6 2c e na i l dw a s 锄p l i 丘e ds u c c e s s f i l l l y 3 b a s e d0 nt h et h e 0 巧o ft h en 猢t e c h n o l o g y t h em a g n e t i co r i e n t a t i o n c o m p o s i t ep a n i d c sw e r es y n t h e s i z e dt h r o u g ht h em e t h o do fc o m p l e xc o a c e r v a t i o n n er e s u l t ss h o wt h a tt h ec o m p o s i t ep a n i d e sh a v eg o o dr c s p o n s et ot h em a 朗e t i c f i e l d强dh i g l le n c a p s u l a t i o ne f f i c i e n c yt ot h es i r n 八髓ec o m p o s i t ep a n i d e sh a v e t h ee f f e c t i v ef u n c t i o no fi n d u c i n ga p o p t o s i so nk 5 6 2c e l l s k e y w b r d s ：f u n c t i o n a l i z e ds u p e 叩a r a m a g n e t i cn a i l o p a r t i d e s ；s i n 酉ec e l l ；m r n a ； r e v e r s et r a n s 嘶p t i o n - p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n ；a g a r o s eg e le l e c t r o p h o r e s i s ；s i i 心a ； a p o p t o s i s 2 上海师范大学硕士学位论文 第一章文献综述 1 1 研究意义 第一章文献综述 纳米科技是2 0 世纪8 0 年代末、9 0 年代初才逐步发展的前沿、交叉性新兴 学科，被公认为是2 l 世纪最具有前途的科研领域。纳米科技给物理、化学、材 料学、生物学、医学等学科的研究带来了新的机遇，为交叉学科的发展提供了新 的思路。1 9 5 9 年1 2 月费恩曼的“t h e r e sp l e n t yo fr o 伽a tt h eb o t t o m 的报告则被视为纳米科技发展的起源n 1 。1 9 9 0 年，首届国际纳米科技会议在美国 巴尔的摩的举办标志着纳米科学的正式诞生；自此，历经十几年的时间，纳米科 学取得了迅速的发展。纳米技术是指在卜1 0 0 衄的量度范围内研究原子、分子的 结构及相互作用并加以应用的技术，物质被用“纳米 技术“细化 之后，失去 原有特性，产生新的特性，直接以物质在纳米尺度上表现出来的新颖的物理、化 学和生物学特性制造出具有特定功能的产品叫做纳米产品。纳米科学和技术是在 纳米尺度上研究物质( 包括原子、分子) 的特性和相互作用，并且利用这些特性 的多学科的高科技。其最终目的是直接以物质在纳米尺度上表现出来的特性，制 造具有特定功能的产品，实现生产方式的飞跃。随着纳米科技的迅猛发展，纳米 研究、纳米工程、纳米产品，其范围正在扩大。虽然纳米科技主流技术全面进入 产业化可能还需要相当长的时间，但是在纳米材料等领域已经有一些技术正在进 入产业化时代，特别是在一些传统产业的改造和升级中，纳米科技已经发挥出了 一些优势。纳米技术和纳米产品也在不断地渗透进了我们生活的方方面面。由于 纳米材料具有许多优良的特性诸如高比表面、高电导、高硬度、高磁化率等，不 仅备受材料工作者的青睐，在自然科学的其它领域也受到了极大的关注。纳米粒 子具有比表面积大、表面活性中心多、反应活性高、吸附和催化能力强的特点， 因此，会产生体积效应、表面效应、量子尺寸效应、宏观量子隧道效应，必然也 会产生特殊的生物学效应。由于它所研究的领域是介于宏观和微观之间的，是过 去人类很少涉及的医疗、材料、生物、化学等方面，从而将人类认知世界的角度 推到了一个新的层次【2 。纳米科学不再仅仅局限于物理、化学或生物等某一学 科，而是各门学科交叉形成的一门高新学科技术。目前，已经并且正在研究的纳 米生物领域的材料有纳米机器人、生物芯片、药物和基因纳米材料载体、纳米生 物传感器，分子马达等等。此外，纳米载药系统和纳米载药缓释系统的研究对于 上海师范大学硕士学位论文第一章文献综述 医学上各种恶性疾病的治疗也起着及其重要的作用。综合各个方面的发展态势， 纳米生物学已经作为一门独立的学科而吸引越来越多的研究人员的关注。 1 2 研究进展 1 2 1 磁性纳米粒子及其在生命科学领域的应用 磁性材料从组成上来分可以分为有机磁性材料和无机磁性材料【4 l 。有机磁性 材料的代表是有机磁性高分子材料，主要是指金属有机络合型磁性高分子材料， 通常可以用作为记忆材料和轻质宽带微波吸收剂等，此外有机磁性高分子材料在 磁控传感器以及微波通讯器件方面也出现了广泛的应用前景；通常的无机磁性材 料主要包括铁、钴、镍、锰分离及其合金、氧化物和稀土金属永磁材料等，更为 重要的是这类的无机磁性材料具有有机磁性高分子材料无法比拟的磁学性质。磁 性纳米材料由于其特有的磁性性质，具有在外加磁场下进行可控运动的特点，从 而使得磁性纳米材料在生物活性物质的富集、药物运输和定向治疗等方面具有巨 大的应用潜力。磁分离是利用功能化磁性纳米粒子的表面配体与受体之间的特异 相互作用来实现对靶向生物目标的快速分离【5 1 。目前，磁分离方法已广泛地用于 细胞、蛋白质、核酸和酶等多种生物物质的分离与纯化。 1 2 1 1 磁性纳米粒子的制备方法 从总的方面来讲，磁性纳米粒子的制备方法可以分为物理法、生物法和化学 法。其中物理法以机械球磨法为主要代表，球磨法是将微米或亚微米的粒子进行 长时间研磨，然后分散到油基介质中而得。这种制备方法得到的粒子的粒径分布 比较宽，同时这种制备方法所消耗的时间也比较长，所以这种方法不适合用于制 备生物医用的磁性纳米材料。磁性纳米粒子的生物制备法主要是指：磁性纳米粒 子广泛地存在于各种生物体如细菌，鸽子等体内。利用生物法制备的粒子粒径比 较均一且形貌规则。生物法制备纳米粒子的主要缺点在于细菌培养较为困难，粒 子提取的过程也较为繁琐，最为主要的是所得到的粒子的粒径可控范围受到了很 大的限制【6 】。所以目前来说，对于研究磁性纳米粒子的合成主要还限于化学法制 备的磁性纳米粒子。磁性纳米材料的化学合成法又可以分为均相制备法和非均相 制备法，其中均相制各法包括共沉淀法( c o p r e c i p i t a t i o n ) 和高温分解法( h i g l i t e m p e r a t u r ed e c o m p o s i t i o n ) ，非均相制备方法有微乳液法( m i c m e m u l s i o n ) 、溶胶 凝胶法( g e l - s 0 1 ) 、超声化学法( s o i 眦h e m i s 时) 、激光分解法( 1 a s e rp y r o l y s i s ) 6 上海师范大学硕士学位论文 第一章文献综述 和电化学沉积法等。在均相体系中，纳米粒子的形成过程主要包括成核过程和生 长过程。在非均相体系中，由于有反应微区，所以粒子的生长过程不仅受到其自 身生长动力学的控制，还同时受反应微区性质的控制。 1 2 1 2 核壳型纳米粒子的制各及表面的修饰 y f e 2 0 3 和f e 。0 4 是最常见的具有良好磁性的铁氧体，它们都是表现为亚铁磁 性阴。它们不仅在工业上具有重要的用途( 如磁性记录材料等) ，而且在生物医 疗等方面也具有重要的应用前景( 如核酸和蛋白质的分离、磁共振成像造影剂 等) 。然而，虽然它们具有优良的磁性，但是由于裸露的y f e 2 0 3 和f e 。0 4 的磁性 容易受到环境的影响( 尤其在生物体系中) 并且个体容易团聚等，这使得它们的 应用受到限制。更为重要的一点是将磁性纳米粒子应用于生物领域时必须通过表 面修饰赋予其良好的水溶性和生物相容性。因此，对磁性纳米粒子进行表面修饰 使其具有更好的分散性和生物相容性的研究具有重要的意义。磁性纳米粒子的表 面修饰可分为以下几类：( 1 ) 采用有机小分子修饰粒子；( 2 ) 采用有机高分子 修饰粒子表面；( 3 ) 采用二氧化硅修饰粒子表面；( 4 ) 采用其它无机纳米材料 修饰粒子表面。表面修饰的效果则可以概括为以下几个方面：( 1 ) 调解和改变 粒子的溶解和可分散性；( 2 ) 为粒子提供表面功能性；( 3 ) 赋予磁性粒子特殊 的物理化学性质；( 4 ) 提高粒子的稳定性和抗氧化性及其胶体溶液的稳定性。 总之，磁性纳米粒子的表面修饰研究具有重要的科学意义和实际应用价值，在今 后相当长的一段时间内它将是磁性纳米材料研究领域的热点和难点问题之一。无 机物磁性纳米粒子一般是由二氧化硅等无机物基体与磁核纳米粒子组成，其中二 氧化硅包裹的磁性纳米粒子通常是经过正硅酸乙酯在碱性条件下水解而形成。二 氧化硅包裹的磁性纳米粒子因其良好的稳定性和与核酸键合的特殊性质，这是由 于s i 0 2 具有以下的优点：( 1 ) 可以屏蔽磁性纳米之间的偶极相互作用，阻止粒 子发生团聚嗍；( 2 ) 具有优良的生物相容性、亲水性以及非常好的稳定性【9 l ；( 3 ) 采用水解有机硅氧烷的方法制备尺寸均一的s i 0 2 微球技术已经相当成熟，为制 备高质量的磁性微球提供了保证，而发展成熟的硅化学又为磁性微球的表面生物 修饰和硅球在生物医学中的应用提供了重要保阿埘。 1 2 1 3 核壳型磁性纳米粒子在生物大分子分离和纯化中的应用 表面功能化的核壳型磁性纳米粒子能够高效地偶联目标产物，因而利用其优 7 上海师范大学硕士学位论文第一章文献综述 良的磁性，在外磁场的作用下，能够方便地对目标生物大分子进行分离和纯化。 与传统的电泳、层析以及离心等方法相比较，磁性分离操作程序上简单而且适合 大量生物分子的分离和纯化，因而在核酸细胞蛋白质的分离和提纯中有着广泛的 应用。 在核酸的分离纯化中，传统方法有超离心密度梯度技术和凝胶电泳等，例如 目前纯化质粒d n a 最常用的是氯化艳密度梯度平衡超离心法，分离提纯砌叮a 和d n a 通常采用琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳等。然而这些方法操作 程序比较复杂、需要较长的时间而且成本也较高。如果采用磁性分离，能够节省 大量时间而且操作也非常方便，例如偶联有o l i g o ( d d 2 5 的磁性纳米粒子可以快 速、高效地对m 对峪进行纯化，且纯化后的m r n a 可以直接用来建立c d n a 库 和i m p c r 扩增【l l 】。s m i t h 【1 2 l 等人发明了一种用磁性二氧化硅纳米粒子分离生物 目标物质的方法，利用此法可以从混合溶液中分离出目标生物大分子( 例如核酸， 包括d n a 和r n a ) 。在该方法中二氧化硅磁性纳米粒子与生物目标物质在一定 的环境中形成一种复合物，用外加磁场从混合体系中分离该复合物。最佳状态时， 二氧化硅磁性纳米粒子和目标物质能形成2 m g 偿的复合物，在洗涤步骤中，至少 能得到6 0 的目标物质。b o s e 和王柯敏等人分别通过抗生素与生物素的特定相 互亲和作用【1 3 1 5 l ，把与目标d n a 互补的探针d n a 连接到磁性底物上，并利用 磁性纳米粒子的磁性对目标单链d n a 进行富集和分离。 采用磁性纳米粒子来进行核酸分离与纯化的优点主要有以下几点：( 1 ) 在 没有外磁场存在的情况下，具有超顺磁性的纳米粒子的磁流体表现出非常低的黏 度：( 2 ) 在外磁场作用下所形成的磁柱之间的距离可根据器件内的通道尺寸 和磁性颗粒浓度在非常大的范围内进行调节；( 3 ) 。该方法最重要的优势是有 可能用来实现其他中等尺寸生物体的分离。 1 2 2m r n a 结构及其功能 r n a 是分子生物学研究的一个重要组成部分，不论是c d n a 文库的构建、 r t p c r 、l n a 序列分析、差异显示( m r n ad i f f e r e n t i a ld i s p l a y ) 、代表性差 异分析( r e p r e s e n t a t i o n a ld i f f e r e n c ea n a l y s i s ，r d a ) 、抑制性消减杂交 ( s u p p r e s s i o ns u b t r a c t i o nh y b r i d i z a t i o n ，s s h ) 、n o r t h e r n 印迹分析、蛋 白质的体外翻译等均依赖于高纯度完整r n a 。因此，如何获得高质量的r n a 是 8 上海师范大学硕士学位论文第一章文献综述 研究人员关注的问题。m r n a 的含量最少，约占r n a 总量的2 。m r n a 一般都不稳 定，代谢活跃，更新迅速，半衰期短。m r n a 分子中从5 一末端到3 一末端每三 个相邻的核苷酸组成的三联体代表氨基酸信息，称为密码子。m r n a 的生物学功 能是传递d n a 的遗传信息，指导蛋白质的生物合成。细胞内m r n a 的种类很多， 分子大小不一，由几百至几千个核苷酸组成。 成熟的m r n a 的结构如图1 1 所示，其结构特剧1 6 】如下： ( 1 ) 5 端帽子结构m 删端这种7 甲基鸟嘌呤核苷三磷酸鸟( 腺) 苷“m 7 g p p p n ( g 或a ) m ”结构被称为帽子结构( c 印s e q u e n c e ) 。5 - 端帽子结构 是由鸟苷酸转移酶加到转录后的m r n a 上的，与m 砒怆中所有其它核苷酸呈相 反方向。帽子结构的鸟苷酸及相邻的a 或g 都可以发生甲基化，由于甲基位置 的差别可产生数种不同的帽结构。 m 砌峪的帽结构可以与一类称为帽结合蛋白( c b ps ) 的分子结合，这种 m r n a 和c b p s 复合物对于m r n a 从细胞核向细胞质的转移、促进与核蛋白体 的结合、与翻译起始因子的结合、以及增强m r n a 的稳定性等均有重要作用。 ( 2 ) 3 端多聚a 尾巴在真核m 时怆的3 末端，大多数有一段长短 不一的多聚腺苷酸( p o l y a ) 结构常称为多聚a 尾。一般由数十个至一百几十个腺 苷酸连接而成。因为在基因内没有找到它相应的结构，因此认为它是在m r n a 转 录完成后额外加入，催化这一反应的酶为p 0 1 ) ，a 转移酶。p o l y a 在细胞内与p o l y a 结合蛋白( p a j 3 p ) 相结合而存在，所以真核细胞的m r n a 的3 端实际上是p o l y a 和蛋白质多聚体形成的复合物，一个随着m r n a 存在时间的延续，这段聚a 尾 巴慢慢变短。因此，目前认为这种3 末端结构可能与m 砌峪从核内向胞质的 转位及m 对峪的稳定性以及翻译起始的调控有关。 原核生物的m 砌呛未发现有这种特殊的首、尾结构。 鳓菱熬慧夸镶 懿粥。鞠哮豫鼍 瀣5 9 3 槲援瑟勰嚣期 图1 1 真核生物成熟n l 】冰a 结构示意图 上海师范大学硕士学位论文第一章文献综述 ( 3 ) 遗传密码m 对呛从5 至3 方向，a u g 开始，每3 个核苷酸为 一组，可以决定肽链上的一个氨基酸，称为三联体密码或遗传密码。 生物体内各种m 砒怆的长短差别很大，主要是由其转录的模板d n a 区段大 小所决定的。m i 心队分子的长短，又决定了由它翻译出的蛋白质分子量的大小。 在各种砌姨分子中，m 砌蛆的半衰期最短，由几分钟到数小时不等，这是细胞 内蛋白质合成速度的调控点之一。 m r n a 的功能是把核内d n a 的碱基顺序( 遗传信息) ，按照碱基互补的原则， 抄录并转送至胞质，在蛋白质合成中用以翻译成蛋白质中氨基酸的排列顺序。 m r n a 在总r n a 中所占比例很小，因此从总r n a 中富集m r n a 是构建c d n a 文库和其它应用所必需进行的步骤。通过降低r r n a 和t r n a 含量，可大大提高 筛选到目标基因的可能性。目前纯化m r n a 的方法都是在固体支持物表面共价结 合固定一段由脱氧胸腺嘧啶核苷组成的寡聚核苷酸 o l i g o ( d t ) 链，由它与 m r n a 的p 0 1 y ( a ) 尾巴杂交，从而吸附固定住m r n a ，进而将m r n a 从其它组 分中分离出来的。 1 2 3 壳聚糖在药载中的应用 壳聚糖( c h i t o s a n ) 是一种天然高分子化合物，为天然多糖中唯一的碱性多 糖，在有水存在的条件下可发生降解，降解的最终产物为二聚、三聚葡聚糖等低 聚物，并具有良好的物理性质、生物相容性。它的分子链上有丰富的一n h ：基团和 一o h 基团，使其易于进行化学修饰。壳聚糖分子结构如图卜2 所示： 悟。翰 图1 2 壳聚糖分子结构 壳聚糖是应用广泛的新型药用辅料之一，所制成的壳聚糖纳米粒子( c s n p s ) 具有靶向、缓释、增加药物吸收、提高药物稳定性等作用，已成为药物新剂型研 究的热点。对于负载了药物和核酸的粒子，有研究者对c s n p s 本身和被负载物都 做了相应的研究，c p r e g on 7 1 认为纳米粒子为药物的传输提供了更多的保护和更 好的方法，t l 6 p e z l e 6 n n 8 1 的研究表明粒子本身的特有结构使被包裹的药物或 1 0 上海师范大学硕士学位论文第一章文献综述 核酸受到了更有效的保护。 c s n p s 在抗癌药物包裹方面的应用：a b o z k i r n 们采用溶剂挥发法，用壳聚 糖包裹5 一f u ，得到的粒子粒径在1 6 0 一4 0 0 舳，药物负载率达到7 8 3 。被壳聚糖纳 米粒子包裹的5 一f u 显示出良好的可控缓释效果，药物随着c s n p s 表面结构被缓慢 的溶破出现空洞而逐步释放出来，药效可维持1 4 0 h 以上，达到了长效释放和降低 毒副作用的目的。而具有超顺磁性的磁性壳聚糖纳米粒子更是以其特有的磁嘲 导航靶向效应显示出更为诱人的应用前景。 c s n p s 在氨基酸和小肽的包裹方面的应用：y a nc h e n 瞰1 等采用复凝聚法制得 包裹了抗肿瘤血管生成寡肽的c s n p s ，粒子的粒径范围2 2 3 n r n 左右，z a t a 电位大致 在一3 2 6 m v ，包封率达到了7 5 。复合物相当稳定，且药物持续释放可达6 天。 c s n p s 在蛋白的包裹和输送方面的研究：m a m i d i 嘲等用离子凝聚法将n 一三 甲基色氨酸修饰c s n p s 用来包裹蛋白通过鼻部吸收。得到的粒子粒径大约在 3 5 0 珊，z a t a 电位显示粒子表面携带正电荷。蛋白的包裹效率9 5 ，缓释实验显 示在3 7 的p b s ( p h7 4 ) 中孵育，有7 0 9 6 以上的蛋白在3 h 后仍然显示有活性。 c s n p s 在d n a 的包裹方面的研究：研究者们在c s n p s 做为质粒d n a 和治疗基因的 包裹方面都进行了尝试，并验证了c s n p s 做为基因载体的可行性。复凝聚法制备 的质粒d n a - c s n p s 平均粒径为2 1 8 9 姗，多分散度为0 2 7 6 ，z a t a 电位为+ 2 1 2 m v ， 质粒d n a 的包封率为9 9 6 嘲，凝胶阻滞分析和荧光扫描显示基因几乎全部被包封 在纳米粒子内部。体外基因转染实验表明壳聚糖纳米粒子能够转染人胚胎肾细胞 ( h e k 2 9 3 ) 和肝癌细胞( h e p g 2 ) 并能在这两种细胞中表达。而络合一复凝聚法嘲1 制得的纳米粒子经肺部给药使转基因大鼠，d a n 疫苗h l a _ a 木0 2 0 1 对于肺结核分枝 杆菌t 一细胞抗原决定簇的免疫原性得到了明显增强。实验结果表明，带有表面正 电荷的c s n p s 不仅能把基因疫苗输送到指定的靶细胞，还能明显增强疫苗的免疫 原性。 1 2 4r n a 干扰研究进展 r n a 干扰( r n ai n t e r f e r e n c e ，r n a i ) 现象广泛存在于生物界，从低等的原 核生物到人类均已有发现。将与靶基因的转录产物m r n a 对应的正义r n a 和反义 r n a 组成的双链r n a ( d o u b l es t r a n d e dr n a ，d s r n a ) 导入细胞，可以使该m r n a 降解，导致靶基因沉默。这种转录后基因沉默机制( p o s t t r a n s c r i p t i o n a lg e n e 上海师范大学硕士学位论文第一章文献综述 s i l e n c i n g ，p t g s ) 被称为r n a 干扰。1 9 9 8 年，f i r e 等嘲首次将双链r n a 导入线 虫( c a e n o r h a b d i t i se l e g a n s ) 研究基因沉默机制，发现双链r n a 较正义和反义 r n a 更能高效地特异性阻断相应基因的表达，他们称这种现象为r n a 干扰，才揭 开了研究双链r n a 介导特异性基因沉默机制的序幕并从此蓬勃发展起来。 目前r n a 干扰的分子机制还未彻底弄清，但比较公认的机制模型为：外源性 或内源性的双链r n a 与r n a s e 家族的核酸酶d i c e r 结合，随即被后者切割成长 约2 卜2 3 n t 的s i r n a ( s m a l lo rs h o r ti n t e r f e r e n c er n a ) ，其具5 单磷酸和 3 羟基末端，且互补双链的3 端均有2 n t 的单链突出( 通常是尿嘧啶核苷酸) 。 s i r n a 形成之后与一系列特异性蛋白结合形成r n a 诱导沉默复合体( r n a _ i n d u c e d s i l e n c i n gc o m p l e x ，r i s c ) 。s i r - n a 作为引导序列，按照碱基互补配对原则识 别靶基因转录的m r n a ，并引导r i s c 结合m r n a ，随后通过依赖于a t p 的解螺旋酶 解开s i r n a 的双链并将其正义链与靶m r n a 置换，即m r n a 取代正义链与反义链互 补，继而核酸酶将m r n a 切割成2 卜2 3 n t 的小片段，切断部位大约在与s i r n a 反 义链配对序列的中部，而后m r n a 进一步降解：另一方面，r i s c 中的r d r p 以s i r n a 反义链作为引物，以靶m r n a 为模板合成新的d s i i n a ，然后由d i c e r 切割产生新 的s i r n a ，新s i r n a 再去识别新m r n a ，又产生新的s i r n a ，经过若干次合成一切 割循环，沉默信号不断放大例，甚至穿过细胞界限，在不同细胞间长距离传递和 维持刎。 对姨干扰的特点有：( 1 ) 降解靶m r n a 的中介分子为2 1 - 2 3 n t 的d s r n a ； ( 2 ) 序列特异性：一方面是指只有针对靶基因编码区的d s 砌呵a 才能产生对峨 干扰，而针对靶基因内含子或启动子区域的d s 砌呵a 不能产生r n a 干扰，另一 方面是指s i 对怆与靶m 砒叮a 的结合严格遵循碱基配对规律，s i 鼢队除3 末端 两尿嘧啶碱基不起识别作用外，序列中的任何一个碱基改变都可导致砌叮a 干扰 作用减弱，甚至完全失效1 。( 3 ) 高稳定性：由于d s r n a 3 端突出u 碱基而使其 不易被细胞内核酸酶类降解；( 4 ) 可传递性：删抑制基因表达的效应可在生 物体内的不同细胞之间传递和维持，在线虫中干涉效应甚至可通过生殖系传递到 后代中去豳1 ；( 5 ) 高效性：相对于反义r n a 而言，r n 刖抑制靶基因的特异性和 效率均较之高1 0 倍以上姗；( 6 ) 时间剂量依赖性：在一定范围内与d s 砌悄剂量 1 2 上海师范大学硕士学位论文第一章文献综述 成正比，而与作用时间成反比；( 7 ) 双干扰系统：非特异性干扰反应由大于3 0 b p 的d s r n a 介导，导致整个细胞非特异性蛋白合成抑制及砌叮a 降解；特异性干扰 反应由2 1 2 3 n t 的s i 砒峨介导，特异性地降解相应基因的m 砒峪；( 8 ) 需要瑚曙 参与其效应m 湖1 。 目前，已有研究证明在培养的哺乳动物细胞中，r n a i 可用于抗病毒和抗肿 瘤等的基因治疗。w i l d a 等用对m _ b c r 脚l 融合基因特异的s i r n a 转染白血病细 胞k 5 6 2 ，发现k 5 6 2 细胞中相应的m r n a 被清除，并出现强烈的细胞凋亡现象嘲。 g i t l i n 等报道了将特异性s i r n a 提供给培养的人和鼠细胞，发现s i r n a 象药物 一样能进入细胞并有效地抗脊髓灰质炎病毒的感染跚，还有人应用s i r n a 成功抑 制了呼吸道合胞病毒( r s v ) 嘲、乙肝病毒( h b v ) 跚、丙肝病毒( h c v ) 1 基因 的表达。针对人类免疫缺陷病毒( h i v ) ，n o v i n a 等侧实验表明，合成的s i r n a 可特异性地沉默h i v 一1 细胞受体c d 4 ，病毒结构蛋白g a g 和调节蛋白n e f ，h i v - l 复制周期的每一个环节都可以受到s i r n a 的有效抑制臼町。美国加州理工学院 b a l t i m o r e 实验室的研究人员以c c r 5 ( c c r 5 是内源性人受体蛋白，主要的h i v 一1 受体) 为r n a i 的目标，用s i r n a 转染外周血t 细胞，发现c c r 5 表达量减少约 1 0 倍，从而使感染细胞数减少6 倍以上洲。 k h a n m l 发现，超支状阳离子聚合物( c a t i o n i ch y p e r b r a n c h e dp o ly i i l e r ) 在 其所携带正电荷和r n a 所携带的负电荷的比值大于某一个数值时，这种超支状阳 离子聚合物就会对所包裹的r n a 显示出保护作用，电泳实验显示，当z + - _ 7 或者 z + _ - 5 时，r n a 被有效保护不受r n a s e 的降解，而z + - 3 时，r n a 只能部分受到保 护而会有部分被降解，z + - - 1 时，c h p 对所包裹的r n a 不具有保护作用，c h p - r n a 在2 6 0 姗处的紫外吸收变化也给出了同样的结果。壳聚糖表面有很多一n h ：，是自 然界唯一的一个碱性多糖，如果能实现壳聚糖包裹s i r n a 并用于基因治疗，一定 能给医药领域带来一次很大的推进。 1 3 实验方法和表征手段 纳米技术与众多的其他学科结合，产生了许多新兴的交叉学科和边缘学科。 在这些学科兴起的同时也带动了许多表征技术的发展，如：各种电子显微镜在纳 米粒子形貌表征方面的应用，原子力显微镜在纳米粒子以及纳米级生物分子的 表征方面的应用，聚合酶链反应( p o l y m e r 弱ec h a i nr c a c t i o np c r ) 在核酸体外分 上海师范大学硕士学位论文第一章文献综述 析中的应用等等，这里将本论文所涉及到的部分实验方法简要综述如下： 1 3 1 原子力显微镜( a f m ) 原子力显微镜( a t o m i cf o r c em i c r o s c o p e ，a f m ) 是利用一个对力敏感的探针 探测针尖与样品之间的相互作用力来实现表面成像的。将一个对微弱力极敏感的 弹性微悬臂一端固定，另一端的针尖与样品表面轻轻接触。当针尖尖端原子与样 品表面间存在极微弱的作用力( 1 矿1 矿时，微悬臂会发生微小的弹性形变。 针尖和样品之间的力f 与微悬臂的形变z 之间遵循胡克定律( h 0 0 k ei 丑w ) ： f = k z 。其中，k 为微悬臂的力常数。测定微悬臂形变量的大小，就可以获得 针尖与样品之间作用力的大小。由于a f m 与电流无关，因此它既可以用来观察导 体的表面形貌，又可以用来观察非导体的表面形貌，弥补了s t m 只能观察导体的 不足。针尖与样品之间的作用力与距离有强烈的依赖关系，所以在扫描过程中利 用反馈回路保持针尖和样品之间的作用力恒定，即保持微悬臂的变形量不变，针 尖就会随表面的起伏上下移动，记录针尖上下运动的轨迹即可得到表面形貌的信 息。若在x y 扫描过程中，不使用反馈回路，保持针尖与样品之间的距离恒定， 检测器直接测量微悬臂z 方向的形变量来成像，称之为“恒高 模式。这种方式 由于不使用反馈回路，可以采用更高的扫描速度，通常在观察原子、分子像时用 得比较多，而对于表面起伏较大的样品不适合。 常规扫描模式有传统的接触模式和非接触模式【4 3 】，但是这两种模式都不适合 于柔软、易碎以及粘附性较强的样品( 例如生物样品) 的测试。对于这类样品， 常规的接触模式扫描会在样品表面形成划痕，或将样品碎片吸附在针尖上，破坏 了样品本身的结构，分辨率较差，而理想的非接触模式又是难于有效地进行实际 应用。为了适应这一需要，近年来发展了一种介于接触模式和非接触模式之间的 轻敲扫描模式，它的特点是在扫描过程中微悬臂被压电驱动器激发到共振振荡状 态，针尖随着悬臂的振荡而极其短暂地与样品表面进行接触，同时由于针尖与样 品的接触时间非常短，因此剪切力引起的对样品的破坏几乎完全消失，却同样可 以清晰观测到完好的表面结构而不受表面高度起伏的影响。因此，这种模式特别 适用于对柔软且黏附性强的生物等样品的检测m 4 5 】。 自从m d s a y 【矩1 等首次用a f m 获得脱氧核糖核酸分子的图像以来，a f m 已 经成为研究核酸分子结构的重要工具。b u s t a m a i l t e 【4 7 1 等用舢即m 观测到质粒d n a 1 4 上海师范大学硕士学位论文第一章文献综述 图像，分辨率达到分子水平，可以清晰观测到三维环状d n a 分子结构，并可估 算分子的宽度和高度。h 蠲s m a 【牾1 等在丙醇体系中用轻敲模式研究小片段 ( 1 0 0 b p ) 和双链d n a ( 2 0 0 b p ) 的分子结构，得到分辨率高达2 n m 的高清晰 图像，是目前所能得到的最高分辨率，可以估算d n a 螺旋的螺距。另外脚蹦 还被广泛的应用于细胞生物学领域的研究，如用触即m 观察细胞形态及细胞表面 局部的物理特征；观察细胞超微结构；监测细胞骨架变化；观察测定细胞间的相 互作用力及其作用过程；观察细胞表面的抗原抗体反应；研究细胞在病理或生 理条件下的生物过程等【4 9 】。 1 3 2 透射电子显微镜 电子显微镜与光学显微镜的成像原理基本一样，所不同的是前者用电子束作 光源，用电磁场作透镜。电子显微镜是根据电子光学原理，用电子束和电子透镜 代替光束和光学透镜，使物质的细微结构在非常高的放大倍数下成像的仪器。电 子与物质相互作用会产生透射电子，弹性散射电子，能量损失电子，二次电子等 等。电子显微镜就是利用这些信息来对试样进行形貌观察、成分分析和结构测定 的。电子显微镜有很多类型，主要有透射电子显微镜( t e m ) 和扫描电子显微镜 ( s e m ) 两大类刚。 透射电子显微镜的成像原理是基于阿贝成像原理。其具体描述为当一束平行 光束照射到具有周期性结构特征的物体时，便产生了衍射现象，除零级衍射外， 还有各级衍射束，经过透镜的聚焦作用。在后焦面上形成衍射振幅的极大值，每 一个振幅极大值又可看成为次级相干源，由它们发出次级波在像平面上相干成 像。 透射电子显微镜( t e m ) 是最常用的电子显微镜，由电子枪、电磁透镜系 统、荧光屏( 或照相机) 、镜筒、镜座、变压器、稳压装置、高压电缆、真空泵 系统、操纵台等部分组成。电子枪相当于光学显微镜中的光源，供应和加速从阴 极热钨丝发射出来的电子束。电镜所用的电压一般在2 0 3 0 万伏特，才足以使电 子枪里的电子以高速飞出。电子通过聚光透镜，达到标本上，因为标本很薄，高 速电子可以透过，并且由于标本各部分的厚度或密度不同，通过的电子就有疏密 之分。电压需要严格稳定才能使成像稳定，很小的电压改变就会引起严重干扰。 像的亮度可以通过电子枪来控制。 上海师范大学硕士学位论文第一章文献综述 电磁透镜组相当于光镜中的聚光器、物镜及目镜系统。电子束通过各个电磁 透镜的圆形磁场的中心时可被会聚而产生像。电镜的透镜系统由4 组电磁透镜组 成，包括聚光透镜、物镜、中间透镜和投射透镜( 目镜) 。可改变聚光透镜的电流使 电子束对标本聚焦并提供“照明 。物镜靠近标本的焦点上。通过物镜、中间镜 和投射镜的三级放大，能在一定的距离处得到高倍的放大像，最终形成的像投射 到荧光屏上。在荧光屏部位可换用黑白胶片以制取相片底板。改变电磁线圈中的 电流量从而使电磁透镜调焦，并产生不同的放大率。 为了尽量减少电镜中电子与空气分子相碰撞而产生散射的机会，镜筒中的真 空度要求很高，因此密封的镜筒与真空泵相连。由于标本需置于真空的镜筒内， 因此不能检查活材料印5 1 1 。 光镜主要利用可见光波作为光源，样品染色后改变了光的波长( 颜色) 和振幅 ( 亮度) ，影响了反差从而得到图像。电镜使用电子射线。电子束的穿透力不强， 所以供电镜检查的标本必须切到薄至5 0 1 0 0 i l m 厚度的切片。电镜切片的制作步 骤与光镜切片类似，也是由固定、脱水、包埋、切片和染色等【8 7 】程序组成：首 先从欲观察的标本上取材，体积约1 m m 3 。通过戊二醛和四氧化锇双固定后，逐级 酒精( 或丙酮) 脱水，环氧树脂包埋，超薄切片机切片。在电镜中像的形成是组织 片各个部分对电子束的电子产生不同散射的结果，标本中致密的地方( 细节) 散射 强。可使用各种重金属盐