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河南农业大学仪 器 分 析 课 程 论 文论文题目： 气相色谱及气质联用在水稻 抗病性分析的应用时 间： 2011-2012学年度第一学期课程名称： 仪器分析 班 级： 09级植物保护三班学 号： 0907101080 学生姓名： 袁 向 东气相色谱及气质联用在水稻抗病性分析的应用摘 要：为建立一种快捷且准确的方法用于水稻抗病性机制的判断，以外源真菌的侵袭进行诱导，分析出水稻抗病性机制是由于诱导生成了抗真菌物质，类似于植保素（PA），他们是植物主动防卫体系中的一类低分子化合物，这种物质一般是在植物入侵组织中用于抑制外源病原物的扩展。本文结合诱导物质的测定重要性综述了细胞内相关物质的提取前常用的几种样品处理新技术，以及气相色谱和气质联用技术在水稻抗病性中的应用为今后水稻抗病性的判断提供依据。关 键 字：水稻；诱导生成；气相色谱；气质联用5水稻是世界三大作物之一，也是我国的重要粮食物资源，在我国主要集中在东北和南方，但近年来水稻病害的连续发生给我国水稻的产量和质量造成了严重的打击13，从而影响了我国水稻的品级和国际竞争力。因此提高水稻的抗病性和抗病性机制显得尤为重要。目前普遍认为植物具有各种抗逆防御机能，植物保卫素（PA）2又称为植保素就是其中之一。PA是植物受到侵染或恶劣环境或外来有害生物的侵袭下蓄积在植物体内的低分子物质3。该物质具有杀菌或抑菌的作用，实验表明一般植物受到侵染后，在植物组织表面浸出的而在健全组织中检测不出的抗菌类物质统称为PA有的文献上也把在健全植物组织中痕量存在，但由于侵染而显著增加的物质也称为PA，迄今为止，人们已经从10余中水稻中分离除了PA并就PA的钝化、分子结构、活性及生成诱导、生物合成机制等方面进行了深入研究。本文就上述PA中的具体成分，做进一步的定性和定量分析，以期为将来更好地研究水稻抗病性提供科学依据。一 水稻内抗菌活性物质的分类植物防御机制可分为系统的、局部的或者是结构的。水稻抗菌真菌化合物则分为预先防御机制和诱导防御机制1。下面分别加以概括。1 预先的抗真菌活性物质预先的抗真菌活性物质成分以糖苷形式存在于完整的植物组织内，据研究在水稻叶片的下表皮组织内都有一定的先天性抗真菌活性物质，这也是外来病原菌必须达到一定数量后，才能导致作物发病的主要原因之一。由于实验所用的水稻为同一品种同一时期地区种植的，所以预先的抗真菌物质对试验几乎没有影响。2 诱导的抗真菌物质诱导的抗真菌物质主要是植保素类（PA）他们是植物主动防卫体种的一类低分子活性有机化合物。根据现有水稻PA的分子骨架可将目前所发现的水稻PA分为4种类型分为：Pimarane型 Stemarance型 Lactone型 Flavanone型。二 抗真菌活性物质的提取及分析1 抗真菌物质的组织提取不同水稻组织可能含有抗不同真菌的活性物质成分，不同生长阶段水稻组织中含有抗真菌物质的浓度、成分也有差异3，因此选取合适的感染阶段至关重要，一般先对其粗提取液进行活性检测而后进行提取、纯化和结构鉴定。从受稻瘟病菌感染的200.00kg水稻中收集到2.00kg的病斑叶子，可用研磨的方法或者用匀浆器破碎或者超声波处理法破碎组织提取可用真空抽滤也可结合离心或萃取等技术。目前国内常用甲醇和乙醇对新鲜或冷冻干燥样品进行真空抽滤，其优点是：提取物不含色素和细胞碎片等杂质，因而较纯净。另外，也可以用非极性溶剂如正己烷、乙酸乙酯和甲醇等将上述粗体物进一步纯化，进而可以在乙酸乙酯组分里分离到植保素（PA）2 抗真菌物质的分离纯化随着分离技术的不断提高各种电泳方法4已经广泛用于抗真菌活性成分的分离，例如薄层层析、柱层析等。凝胶层析和离子交换层析可以用来分离纯化抗真菌相关蛋白，复杂的生物分子的分离需要用亲和层析技术，即生物大分子与一种连在不溶性基质上的配体发生特殊的生物作用。在分离纯化（PA）时必须合理搭配各种层析技术，如果采用方法不适合，分离的物质活性低、收率低甚至失败，所以最好先检测物质的分子量、等电点、溶解性及稳定性等基本性质之后再决定采用何种分析分离方法5，14。3 抗真菌物质的结构鉴定抗真菌物质的结构鉴定中广泛应用到波谱分析技术，其中包括紫外、红外、核磁共振、质谱法（MS）和气质气谱（MSGS）联用，他们的基本原理都是根据不同功能的特征谱带对物质进行结构分析11。现在许多PA在细胞内都是微量甚至痕量级的化合物，传统的检测方法，不仅繁杂、耗时而且不易检测到痕量活性物质，从而阻碍了新的水稻内PA的发现进程。随着色谱和质谱开始应用于痕量混合物的分析，许多高灵敏度检测器的使用，大大推动了痕量分析技术的发展，从而提高了细胞内微量或痕量PA的检测精度6。由于气相色谱法具有分离效率高、分析速度快、选择性好、样品用量少，检测灵敏度高等优点，因此被广泛应用于分离气体和易挥发或转化为易挥发的液体及固体样品中，目前，该方法已成为作物抗性物质成分分析中最常用的方法，而气相色谱质谱联用法（MSGS）将髙效分离与高性能鉴定仪器组成联用技术，是仪器分析在痕量混合物检测领域的重大技术进展，其中现在MSGS联用技术是目前最成熟普及应用最广泛的一种联用模式8，7。质谱法具有灵敏度高、定向能力强等优点，但是要求进样要纯，且定量分析较差，气相色谱法则分离效率高定量分析简便，但定性能力差12，因此这两种方法联用，可以相互取长补短。既发挥色谱法的高分离能力有发挥了质谱法的高鉴别能力，适用于做多组分混合物中未知物的定性鉴别，可以判定化合物的分子结构，准确测定未知组分的相对分子质量9，15。从而鉴定部分分离甚至未分离的色谱峰，因而气相色谱质谱联用法对于探索新型PA具有重大的现实意义。4 抗真菌物质的活性分析抗真菌物质的活性分析常在体外进行，其优点是髙效、经济。大量样品可以在同一批实验的基础上得到分析。就目前而言抗真菌活性物质的成分常采用薄层层析生物学方法、孢子萌发法试验以及生长速率法。具体方法的选择要基于四个原则：适用、可靠、髙效、经济。另外，一个样品的活性分析常常需要一种以上的方法才能进行确定。（1）薄层层析生物学分析方法这种方法应用极为普遍，特别适用于成分多或同时要进行化学分析的样品，这种分析方法还可以确定样品的活性成分的数量、Rf值、药剂的相对毒性、相对浓度等特征。用此方法对健康组织或感病组织提取物进行分析，可以检验有无抗真菌活性物质（PA）的存在。若有则感病组织可看到抑菌圈，健康组织则无抑菌圈，若两者都有抑菌圈则说明存在先天性抗真菌物质成分，从抑菌圈将胶板刮下来，将生物活性物质溶解，对这些部分纯化的物质可以做进一步分析，从而为生产生物农药提供新的途径。但与其他方法相比这种方法的不足是：一般的TLC生物学分析需要2-3天，耗时长，且抗真菌物质易分解，尤其是在该分析条件下不稳定的物质，对于易光解的物质应放在暗处进行操作。另外由于脂类物质对孢子的萌发具有抑制作用，所以在实验之前要清除样品中的脂类，以免造成孢子受到抑制的假象。（2）孢子萌发试验法这种方法局限于部分或完全水溶性物质的分析，通过向培养基质中加入5%-20%甲醇或乙醇，而不明显影响真菌的生长可以弥补其不足。待测物质对真菌孢子任何结构的破坏可借助孢子萌发试验在显微镜下观察到。这种方法也可检验物质对真菌的作用是永久性的还是暂时性的。（3）生长速率法将健康组织或感病组织提取物和热的培养基混合，用这种含毒培养基培育病菌，以病菌的生长速率来测定是否有植保素的存在。生长速率的表示方法有：1.菌落达到一定大小所需要的时间2.一定时间菌落直径的大小。三、抗真菌物质的应用前景水稻植保素抗真菌活性物质的提取、分析及其定位研究对于阐明水稻抗病机制并指导合成新的抗真菌化合物具有重要的意义。这项研究正日益成为水稻抗病研究的热点，随着对抗真菌防御机制研究的深入和现代分子生物学技术在水稻抗病性研究中的应用，鉴定和克隆基因基因以及对目的基因进行加工和重组，借助合适载体转入植物已获得抗病植株为水稻的抗病性研究带来新的希望，但有关水稻PA构型与抗菌活性的关系，水稻PA的活性位点以及水稻PA与病菌的作用模式等方面尚缺乏深入的研究，而这些问题正是探明水稻自我防御机制有的放矢地开发生产环境相容性新农药的关键所在，因而重视和利用现代仪器分析技术对这些方面做深入细致的研究工作，将对发展绿色农业保护环境具有重要意义。参考文献1陈志宜，徐志刚，陆凡等.拮抗细菌B196对水稻植株的抗性诱导作用J.西南农学报，2001，14(2):44-48.2范军，彭有良.一种新的水稻植保素的诱导纯化及特性研究J.植物病理学报，1996，26：217.3富山宏平，尹福祥.植物的感染生理M.北京：农业出版社，1986.4郭尧军.蛋白质电泳技术M.北京：科学出版社，1999：8-9.5蒋鹏志.一种新型的样品前处理技术探讨固相微萃取技术J.现代商留工业，2008(9):375-377.6吕芬，梁春穗，黄伟雄等.气相色谱法快速测定蔬菜水果中痕量拟除虫菊酯J.中国卫生杂志.2008，20(5):413-417.7李云飞，彭云霞，张承聪.气相色谱质谱联用仪测定果蔬中12种农药残留量J.云南大学学报，2004，26(s1):176-180.8刘腾飞，谢修庆，刘文婷.气相色谱及气质联用在农药残留分析中的应用J.现代农业科技，2010，3：35-37.9师治贤，王俊德.生物大分子的液相色谱分析和制备M.北京：科学出版社，1996，119-142.10王金生.分子植物病理学M.北京：农业出版社，1999：361-362.11万郑凯，何娟，康长安等.气相色谱质谱联用在农药残留检测方面的应用进展J.分析测试技术与仪器.2006，12(1):51-54.12吴丽华，李建科.气相色谱法在农药残