表面增强拉曼光谱技术在生物学中的应用(论文).pdf

年 月 广西师范学院学报: 自然科学版d e c 第 卷 第期 j o u r n a l o fg u a n g x it e a c h e r se d u c a t i o nu n i v e r s i t y:n a t u r a l s c i e n c ee d i t i o n v o l n o 文章编号: ( ) 表面增强拉曼光谱技术在生物学中的应用 孙美娟 , 陶站华 ( 百色学院 物理与电信工程系,百色 ;广西科学院 生物物理实验室,南宁 ) 摘 要: 表面增强拉曼光谱技术(s e r s) 作为一种高探测灵敏度、 高分辨率的检测方法, 在生物学中有广阔的 应用前景.该文综述了s e r s在微生物标记鉴别、 定量分析、 单分子检测以及活体检测方面的探索, 同时针对 s e r s技术进步, 分析表面增强在生物技术领域未来发展方向和存在的问题. 关键词: 表面增强拉曼光谱; 生物学; 应用 中图分类号:o q 文献标识码:a 引 言 拉曼光谱是一种产生于分子振动光子的非弹性散射光谱, 根据拉曼光谱特征峰的位置、 强度和线宽 反映出分子中不同化学键和官能团的信息, 可用于分析分子结构及含量等有用信息 .激光技术发展 使得拉曼光技术克服信号微弱的限制, 凭借不触及试样非入侵性, 原位实时监测, 高效、 灵敏、 重复性好 等优势现已广泛应用于生物学研究领域.由于拉曼散射原因, 拉曼散射的信号较弱, 因此不能检测含量 较少的成分.无论如何, 在生物学探测、 识别、 分选及动力学研究中, 要获得准确、 精细的光谱信息, 进一 步提高信号强度成为研究目标. 年f l e i s c h m a n n等第一次在吡啶吸附的粗糙银电极上观察到表面增强拉曼散射(s e r s) , 随后v a nd u y n e及其合作者通过实验计算发现粗糙表面拉曼散射信号相比于原溶液中拉曼信号增强 约 倍.表面增强拉曼光谱技术是在拉曼光谱技术上发展的, 具有更高探测灵敏度、 敏锐分辨率, 还可 有效避免溶液中相似信号的干扰, 由此可获得高质量的拉曼信号.该信号强度相当于把表面单分子层 放大到 万层, 相比于另一种增强技术 共振增强拉曼光谱, 只可检测处于可见光区的激发光相匹 配的电子吸收能级, 表面增强检测范围更广. 表面增强的机理说法不一, 物理增强理论被广泛研究, 认为具有一定表面粗糙的类自由电子金属基 底存在, 使得入射激光在表面产生的电磁场强度增大, 由于拉曼散射强度和分子所处光电场的平方成正 比, 因此极大地增加吸附在表面的分子拉曼散射强度 .目前主要采用碱金属以及贵金属金、 银和铜等 自由电子金属产生表面等离子体共振, 进而产生增强拉曼散射, 这些金属的表面增强因子和金属表面本 身的光学性质、 表面粗糙颗粒的密度和尺寸等有关.为保证表面增强拉曼信号的稳定性, s e r s基底的 制备便是s e r s技术最重要的研究领域,其中金属溶胶是用的较多的s e r s活性基底 , 制作成本低、 制备工艺简单且溶胶易于储存.随着纳米材料合成技术发展并应用到s e r s领域, 也为s e r s技术发 展及实际应用提供新领域 ,. 收稿日期: 基金项目: 国家自然科学基金( ) ; 百色学院一般项目( k b ) 第一作者: 孙美娟( ) , 女, 硕士, 助教, 研究: 光谱学(s u n m e i j u a n c o m) ; 通讯作者: 陶站华( ) , 男, 副研究员, 研究: 生物光子学(t a o z h a n h u a c o m) 广 西 师 范 学 院 学 报: 自 然 科 学 版 第 卷 s e r s技术在生物学方面的应用研究 s e r s标记鉴定微生物的研究 在人们的生活领域越来越多的涉及到病原微生物, 危害也相当大, 比如食品安全、 饮水卫生等 等 ,.在微生物识别和筛选方面s e r s技术高效、 灵敏, 无需制备试样等特点使分选周期缩短, 误差减 小.因而日益广泛应用于环境病原微生物的检测与鉴定领域.吕璞通过制备s e r s纳米颗粒核酸探 针, 利用苯甲酸作为活性分子, 选取嗜肺军团菌治病基因片段, 通过两次杂交测试嗜肺军团菌拉曼信号, 结果显示杂交样品有显著的拉曼信号而对照样品没有信号 .同样, 利用表面增强拉曼方法检测并鉴 别志贺氏菌和大肠杆菌, 实验说明与纳米银颗粒混合的志贺氏菌和大肠杆菌拉曼信号明显增强, 对照样 品则几乎没有拉曼信号.m i r k i n等人 通过制备多种 s e r s纳米颗粒标记的核酸探针, 实现了用 d na杂交技术同时检测了b型肝炎、a型肝炎、 艾滋病毒, 天花病毒等多种致病菌.v a nd u y n e小 组 利用表面增强传感器快速检测炭疽微生物标志物.p o r t e r小组 采用表面增强拉曼免疫分析法 成功检测副结核分枝细菌. s e r s在生物学定量分析方面的探测 首先待测分析物应具有s e r s活性, 将其吸附到增强基底的表面, 可通过检测其s e r s光谱, 达到 定量分析的目的, 在此增强拉曼信号的稳定性是影响实验准确性的重要因素.s t o s c h等 使用硼氢化 钠还原硝酸银的方法制备银胶体溶液作为增强的基底, 然后用于血清中肌酐浓度的快速定量检测, 对肝 损伤和肾衰竭进行早期诊断有重要意义.p a r k等 设计的鳄鱼齿状的聚二甲基硅氧烷微流控通道, 利 用共焦显微拉曼光谱系统结合表面增强技术检测染料标记的双链d na.实验采用不同染料标记的 d na混合物, 之后在微流控通道内充分混合, 采集拉曼光谱信息并对染料的特征峰强度进行计算, 可分 析出混合物中d na的浓度. 目前, s e r s技术定量检测试验的重现性主要受限于增强基底物质的表面纳米级颗粒的大小和形 貌, 大小一致表面均一的增强基底是得到准确有效定量分析结果的必要前提条件.因此, s e r s基底的 制备一直是s e r s技术发展中最重要的研究领域,对扩大s e r s的研究范围和应用领域起着关键的作 用.随着纳米材料的制备技术日趋成熟, 可按照实验要求控制纳米颗粒形状和大小, 将其作为模型材料 进一步研究s e r s的增强机理及完善定量检测技术.总体s e r s的基底重现性是难于控制, 另外要求 所检测的分子必需含有某些具有拉曼活性的基团, 如芳环、 氨基以及硫原子等基团, 对检测对象有所 限制. s e r s高灵敏度可进行单分子检测 现代生命科学研究越来越多关注单分子阶段, 希望可以从单个大分子水平研究着手, 获取掩盖在群 体信息下的单个生命活动的规律, 为医学研究领域中疾病的发生与发展、 药物与机体的相互作用等奠定 基础.随着s e r s研究理论的深入以及实验方法的改进, 超高灵敏度检测为生命科学及单分子研究提 供很好手段 . 表面增强共振拉曼光谱( s e r r s) 即表面增强和共振拉曼光谱联用 , 可检测液体环境中分子的 s e r s光谱以及干燥银胶膜层中分子的拉曼光谱.周增会 等研究了不同偏振光激发条件下 r g单 分子表面增强共振拉曼光谱, 该方法检测灵敏度提高 倍, 准确测定单分子拉曼光谱.在活细胞和生 物大分子层面, e f r i m a等 将银溶胶纳米颗粒选择性的吸附在 e c o l i细菌中或细胞壁上, 不难观测到 细菌壁不同成分的s e r s光谱, 其中包括蛋白质、 肽和氨基酸等.w e l d o n等 利用极细的硅基底银探 针作为s e r s增强基底, 使待测物吸附其表面, 可检测到脂质中的脂肪酸位置和成份, 用来模拟皮脂腺 的实时体内检测, 对脂类分子的化学成分、 代谢过程及空间分布进行探测. 作为一门分析测试技术, s e r s需进一步提高其稳定性和易操作性.随着激光器稳定性增强和探 第期 孙美娟, 等: 表面增强拉曼光谱技术在生物学中的应用 测器灵敏度的提高, 以及计算机处理微弱信号等技术的进步, 具有单分子探测灵敏度的s e r s技术在细 胞生命活动及活体组织层面上的应用将会得到长足有效发展. s e r s在活体检测中的应用前景 s e r s技术具有非破坏性的特点和指纹特征识别能力, 正是这些独特的优势使得s e r s在活体检 测中具有广阔的应用前景.n a b i e等 制备新型s e r s活性培养基用以建立细胞内部物质动力学和相 互反应模型, 该技术在活细胞内药物代谢过程以及分析细胞膜组分等方面发挥作用.为减小荧光干扰 和活性物质对细胞活性的影响,k n e i p p等 制备具有与生物细胞相容的金溶胶纳米颗粒, 与酵母细胞 共同孵育培养将金溶胶颗粒引入活细胞内, 根据表面增强拉曼光谱可得到活细胞内核酸、 蛋白质等物质 组成和分布.由于s e r s技术的检测和诊断具有灵敏度高, 对样品限制少的优势, 可用于一些重大疾病 的早期检测和基础研究, 如s c h u t和m o实验小组 , 结合p c a、 l a d等数学统计分析方法, 用s e r s 技术分析发育异常组织和癌症早期组织, 显示正常组织和非正常组织高灵敏度和高特异性效果. 年m o r i t zfk i r c h e r等 通过一种磁共振光声成像增强拉曼光谱多技术联合对小鼠脑癌组织进行 成像, 具有特异性强、 界面清晰等优点, 以至于手术彻底切除脑癌组织.s e r s技术针对活体检测方面 的不断完善是最终应用于临床疾病检测和诊断必不可少的前提过程 . s e r s技术新进展及其在生物分析方面应用 表面增强与其他生物学技术联用 表面增强与其他生物学技术联用可充分发挥其在样品检测与分析方面的独特优势, 扩大s e r s技 术的应用范围.表面增强和分离技术( 毛细管电泳、 液相色谱仪、 气相色谱仪、 薄层技术等) 的联用目前 取得良好进展.毛细管电泳是一类以毛细管为分离通道、 以高压直流电场为驱动力的新型液相分析技 术, 拉曼毛细管电泳的在线联用方法不仅能测量得到高质量的样品结构信息, 而且适用于水溶液体系 中组分的直接检测.m o r r i s等 利用拉曼毛细管电泳联用系统研究水溶液中肾上腺素、 核苷酸等, 获得了上述化学物质结构、 含量等信息, 光谱信息也是为生物内涵的揭示服务的, 不过信号较弱, 因此需 要较高浓度的样品.s e p a n i a k等 根据表面增强拉曼光谱技术建立研究罗丹明 g的拉曼 毛细管电 泳系统并测定成功.表面增强拉曼与高效液相色谱(h p l c) 联机可对核酸化合物样品进行在线联机分 析研究, 在适当的激光照射、 温度、 p h 条件下获取丰富的s e r s图谱 . 针尖增强拉曼光谱 光学中空间分辨率受到衍射作用的限制, 因而拉曼技术分辨率受激发光半波长的限制无法达到更 优.针尖增强拉曼光谱技术是将扫描探针显微技术与拉曼光谱技术联用, 可获取具有高空间分辨的图 像.同时位于针尖正下方的基底上吸附分子的拉曼信号得到增强, 检测灵敏度获得极大提高.p e t e r h e r m a n n小组 将针尖增强技术将光谱学用于生物纳米级结构的表征, 考察光谱技术鉴别不同病毒 颗粒的能力, 包括禽痘病病毒和腺病毒, 通过银包裹针尖a fm相图采集显示出比对应的形态学电镜扫 描更精细的结构, 为不同病毒颗粒形态学鉴别提供了更有用的信息. 结 语 表面增强拉曼光谱技术在生物大分子的界面取向及构型、 构象研究和结构分析, 膜结构分析等方面 有独特优势; 还可实现超低浓度和超薄膜中的分子检测, 在单分子检测方面的应用也取得较大突破, 可 与传统分子生物学技术互补; 在生物医学领域, 通过将纳米颗粒引入到活体细胞中, 可得到活细胞内部 的表面增强拉曼光谱.s e r s将凭借其具有单分子探测灵敏度的独特优势在细胞内生命基本活动及生 广 西 师 范 学 院 学 报: 自 然 科 学 版 第 卷 物组织层面上得到长足发展, s e r s在组织层面及活体检测方法的应用总体来说较少, 其中关键问题是 寻找合适的拉曼标签、 提高其稳定性. s e r s和其它生物实验技术一样,既有它的优势也存在缺点和不足.随着s e r s的应用范围不断 地拓宽,已涉及化学物理、 材料表征、 生物医学等众多领域, 但为适应复杂的检测要求, 还有许多问题尚 待解决, 包括测定灵敏度的进一步提高和易于推广的实用系统的建立, 发展可以优势互补的联用技术仍 是重要方向.同时利用光纤传导技术, 将s e r s实验材料组装到光纤上, 作为高灵敏的检测传感器可实 现原位实时检测.表面增强拉曼光谱仍是一个很有挑战的研究, 将有可能开辟一个全新而广泛的研究 领域. 参考文献: 陶站华,姚辉璐,王桂文, 等利用拉曼光谱分析顺铂诱导的胃癌细胞凋亡j光谱学与光谱分析, , () : f l e i s chmann m,he n d r apj,mc qu i l l an a r a m a ns p e c t r ao fp y r i d z n ea b s o r b e da tas i l v e re l e c t r o d e j c h e m i c a lp h y s i c sl e t t e r s, , () : 高敏侠均匀的强表面增强拉曼光谱基底的制备及表征d厦门: 厦门大学, chr i s t yl hayn e s,a d am d mc f a r l an d,r i cha r dp vand uyn e s u r f a c e e n h a n c e dr a m a ns p e c t r o s c o p yj a n a l c h e m , , ( ) : s chl u c k e r,s e b a s t i an s u r f a c e e n h a n c e dr a m a ns p e c t r o s c o p y:c o n c e p t sa n dc h e m i c a la p p l i c a t i o n sj a n g e w a n d t ec h e m i e i n t e r n a t i o n a le d i t i o n, , ( ) : n i ma,z a,b i swa s,a,b ay e r,i se ta l a p p l i c a t i o n so fs u r f a c e e n h a n c e dr a m a ns c a t t e r i n gi na d v a n c e db i o m e d i c a l t e c h n o l o g i e sa n dd i a g n o s t i c sj d r u gm e t a b o l i s mr e v i e w s, , () , z he n g,j k,he,l l s u r f a c e e n h a n c e dr a m a ns p e c t r o s c o p y f o r t h ec h e m i c a la n a l y s i so ff o o dj c o m p r e h e n s i v er e v i e w s i nf o o ds c i e n c ea n df o o ds a f e t y, , () : l idw,z ha iwl,l iy t r e c e n tp r o g r e s s i ns u r f a c ee n h a n c e dr a m a ns p e c t r o s c o p y f o r t h ed e t e c t i o no f e n v i r o n m e n t a l p o l l u t a n t sj m i c r o c h i m i c aa c t a, , : 吕璞表面增强拉曼技术检测环境中病原微生物的研究d长沙: 湖南大学, cha r l e sc aoy w,j i nr,m i r k i nca n a n o p a r t i c l e sw i t hr a m a ns p e c t r o s c o p i cf i n g e r p r i n t sf o rd naa n d r nad e t e c t i o nj s c i e n c e, , ( ) : z han gx,young m a,l yan d r e s,e ta l r a p i dd e t e c t i o no fa na n t h r a xb i o m a r k e rb ys u r f a c e e n h a n c e dr a m a ns p e c t r o s c o p yj j o u n a l o fam e r i c a nc h e m i c a ls c o c i e t y, , ( ) : j e anyak e sb,l i p e r trj,b annan t i n ejp,e t a l d e t e c t i o no fm y c o b a c t e r i u ma v i u ms u b s p p a r a t u b e r c u l o s i sb ya s o n i c a t e i mm u n o a s s a yb a s e do ns u r f a c e e n h a n c e dr a m a ns c a t t e r i n gj c l i n i c a l a n dv a c c i n e i mm u n o l o g y, , () : s t o s ch r,he n r i ona,s ch i e ld s u r f a c e e n h a n c e dr a m a ns c a t t e r i n gb a s e da p p r o a c hf o r q u a n t i t a t i v ed e t e r m i n a t i o no f c r e a t i n i n e i nh u m a ns e r u m a n a lc h e m, , : p a r kt,l e es,s e ongghe t a l h i g h l ys e n s i t i v es i g n a ld e t e c t i o no fd u p l e xd y e l a b e l l e dd nao l i g o n u c l e o t i d e s i nap dm sm i c r o f l u i d i cc h i p:c o n f o c a ls u r f a c e e n h a n c e dr a m a ns p e c t r o s c o p i cs t u d y j l a bc h i p, ,: k i m,z e ehwans i n g l e m o l e c u l es u r f a c e e n h a n c e dr a m a ns c a t t e r i n g:c u r r e n ts t a t u sa n df u t u r ep e r s p e c t i v ej f r o n t i e r so fp h y s i c s, ,() : mc nayg,e u s ta c ed,s m i th we s u r f a c e e n h a n c e dr a m a ns c a t t e r i n g(s e r s)a n ds u r f a c e e n h a n c e dr e s o n a n c er a m a ns c a t t e r i n g(s e r r s) :ar e v i e wo fa p p l i c a t i o n sj a p p l i e ds p e c t r o s c o p y, , () : 周增会,王桂英,徐至展表面增强拉曼光谱技术在生命科学及单分子研究中的应用与进展j激光与光电子进 展, , ( ) : e f r i mas,b r onkbv s i l v e rc o l l o i d si m p r e g n a t i n go rc o a t i n gb a c t e r i aj j p h y s c h e m , , : we l d on m k,z he l ya s kovvr,mo r r i sm d s u r f a c e e n h a n c e dr a m a ns p e c t r o s c o p yo f l i q p i d so ns i l i v e r m i c r o p r o b e sja p p l s p e c t r o s c , , () : 第期 孙美娟, 等: 表面增强拉曼光谱技术在生物学中的应用 na b i e vi,chour p ai,man f a i t m a p p l i c a t i o no fr a m a na n ds u r f a c e h a n c er a m a ns c a t t e r i n gs p e c t r o s c o p y i nm e d i c i n ej j r a m a ns p e c t r o s c , , : kn e i p pk,hakaas,kn e i p phk,e t a l s u r f a c e e n h a n c e dr a m a ns p e c t r o s c o p y i ns i n g l e l i v i n gc e l l su s i n gg o l d n a n o p a r t i c l e sj a p p ls p e c t r o s c , , () : s chuttcb,w i t j e sm,wt e r e n b o r gh,e t a l i nv i v od e t e c t i o no f d y s p l a s t i c t i s s u eb yr a m a ns p e c t r o s c o p yj a n a l c h e m, , ( ) : moj,z he ng w,l owjjh,e ta l h i g h w a v e n u m b e rr a m a ns p e c t r o s c o p yf o r i nv i v od e t e c t i o no fc e r v i c a l d y s p l a s i aj a n a lc h e m , , ( ) : mo r i t zfk i r che r,a d amd el az e r d a,j e s s evj ok e r s t e t a l ab r a i n t u m o rm o l e c u l a r i m a g i n gs t r a t e g yu s i n gan e wt r i p l e m o d a l i t ymr i p h o t o a c o u s t i c r a m a nn a n o p a r t i c l ej n a t u r em e d i c i n e, , s aman t aa,j anas,d a sr k s u r f a c e e n h a n c e dr a m a ns c a t t e r i n g i nc a n c e rd e t e c t i o na n d i m a g i n gj n a n o m e d i c i n e, ,() , wa l k e rpa,kowa l chy k w k,mor r i s m d o n l i n er a m a n s p e c t r o s c o p yo fr i b o n u c l e o t i d e sp r e c o n c e n t r a t e db yc a p i l l a r y i s o t a c h o p h o r e s i sj a n a lc h e m, , : n i r o d ewf,d e vau l tgl,s e p an i ak mj,e t a l o n c o l u m ns u r f a c e e n h a n c e dr a m a ns p e c t r o s c o p yd e t e c t i o n i nc a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i su s i n gr u n n i n gb u f f e r sc o n t a i n i n gs i l v e rc o l l o i d a ls o l u t i o n sj a n a lc h e m , , : s he n grn if,c o t tont m d e t e r m i n a t i o no f p u r i n eb a s e s b yr e v e r s e d p h a s eh i g h p e r f o r m a nc e l i q u i dc h r o m a t o g r a p h yu s i n gr e a l t i m es u r f a c e e n h a n c e dr a m a ns p e c t r o s c o p yj a n a lc h e m , , : p e t e r he rmann,a an t j e he rme l i nk,a v e r on i ka l au s ch e v a l u a t i o no ft i p e n h a n c e dr a m a n s p e c t r o s c o p yf o r c h a r a c t e r i z i n gd i f f e r e n tv i r u ss t r a i n sj t h er o y a ls o c i e t yo fc h e m i s t r ya n a l y s t, , : a p p l i