（发酵工程专业论文）黄酒酿造酵母（saccharomyces+cerevisiae）酿造特性的研究.pdf

摘要 摘要 酿酒酵母( s a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a e ) 的酒精发酵功能被广泛应用于包括黄酒在内的 酒精饮料行业，其酿造性能的优劣直接影响到黄酒的生产与品质。长期以来由于对黄酒 酵母的酿造特性缺乏系统而深入的研究，至今尚未能建立一套科学行之有效的筛选方法 用于指导菌种的筛选，亦无法指导黄酒的生产。本论文首次系统研究了工业黄酒酵母的 酿造特性( 包括发酵特性、耐受性能和风味特性) ，为建立科学合理的黄酒酵母筛选体系 奠定基础；同时通过研究细胞生理结构及其变化规律探讨黄酒酵母酒精耐受性能的生理 机制，并对黄酒发酵过程中酯类化合物合成关键酶进行研究，从理论和实践上指导黄酒 的发酵，改善其风味，对生产出高质量的黄酒具有积极的指导作用。 本研究中，首先从两种不同类型的黄酒生产用酒药中筛选出两株优势酿酒酵母结合 已有的黄酒工业化生产用菌株，以清酒和青岛葡萄酒酵母为对照，系统研究黄酒酵母的 发酵性能：通过对酵母形态、培养特征、发酵力、凝聚性、泡沫特性、致死温度、发酵 过程主要指标参数的变化、发酵成品酒常规理化参数和酒中尿素含量等指标进行分析， 发现黄酒酵母与清酒酵母和葡萄酒酵母之间以及不同来源的黄酒工业化生产酵母菌株 间存在明显区别，表明各菌株之间发酵性能存在明显差异，通过筛选能获得性能优良的 菌株。 通过对工业黄酒酵母胁迫条件下耐受性能的研究发现：所测定菌株普遍对不同胁迫 条件( 如1 0 酒精，4 0 糖浓度，1 2mk c i 渗透压，4 1 高温，6 c 低温，高浓度乳酸 和营养饥饿) 均有定的耐受性，但对于单因素胁迫条件不同菌株表现出不同的耐受能 力。同时对清酒酵母( k 7 ) 耐受性能进行比较研究，发现其在4 1o c 的高温条件下生长受 抑制程度较黄酒酵母要小，耐高浓度糖和高浓度乳酸能力明显较黄酒酵母要弱，在高糖 浓度下其菌体浓度仅为酵母1 的5 0 3 ，而在高浓度乳酸下发酵总失重仅为酵母3 的 4 7 4 。 通过研究细胞脂质脂肪酸组成与黄酒酵母酒精发酵能力和耐酒精能力之间的关系 及作用机制发现：细胞脂质脂肪酸主要由棕榈酸、棕桐油酸、硬脂酸、油酸以及微量的 癸酸和月桂酸组成。在高浓度酒精冲击下细胞存活率由高到低的排列顺序与细胞在酒精 冲击下胞外核苷酸平衡浓度和细胞膜透性系数妒，) 由小到大的排列顺序完全一致，细胞 脂质脂肪酸组成不饱和指数较低和棕榈酸含量较高的菌株在酒精冲击下具有较高的存 活率和较低的细胞膜透性系数，并且其发酵速率和生成酒精浓度亦具有明显的优势。黄 酒酵母耐酒精能力与发酵能力不存在必然的联系。由此可得出，细胞脂质脂肪酸组成不 饱和指数较低和棕榈酸含量较高的菌体具有较强的耐酒精和发酵能力与其在酒精环境 下可维持较低的细胞膜透性，保存细胞完整性，保持较高的存活性有关。 关键词：黄酒酵母发酵性能耐受性脂质脂肪酸组成 a b s t r a c t a b s t r a c t a l c o h o l i cf e r m e n t a t i o np e r f o r m e n e db ys a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a eh a sb e e nw i d e l yu s e d t op r o d u c ea l c o h o l i cb e v e r a g e si n c l u d i n gc h i n e s er i c ew i n e t h ep r o d u c t i v ee f f i c i e n c ya n d q u a l i t yo fc h i n e s er i c ew i n ea r cd e e p l yi n f l u e n c e db yt h eb r e w i n gc h a r a c t e r i s t i co fy e a s t s d u et ot h el a c ko fe x t e n s i v e l ys t u d yo nc h i n e s er i c ew i n ey e a s t ，s of a ras c i e n t i f i ca n d e f f e c t i v es e l e c t i o nc r i t e r i o nh a dn o tb e e ne s t a b l i s h e d ，a n ds oi tc a nn o tc o n t r i b u t et ot h e d i r e c t i o no fy e a s ts e l e c t i o na n db r e w i n gp r o c e s s t h i sp a p e rf i r s t l ys y s t e m a t i c a l l ys t u d i e dt h e c h a r a c t e r i s t i c ( i n c l u d i n gf e r m e n t a t i v e ，s t r e s sr e s i s t a n c ea n df l a v o u rc h a r a c t e r i s t i c ) o fc h i n e s e r i c ew i n ey e a s ti no r d e rt oc o n t r i b u t et os e tu pas u i t a b l ec r i t e r i o nf o rc h i n e s er i c ew i n ey e a s t s e l e c t i o n s i m u l t a n e o u s l yt h em e c h a n i s mo fe t h a n o lt o l e r a n c ef o ry e a s tw e r es t u d i e dt h r o u g h t oa n a l y s et h ep h y s i o l o g i c a lc o m p o s i t i o no fc e l la n di t st r e n do fv a r i e t y t h ek e ye n z y m ef o r e s t e rf o r m a t i o nw a sa l s os t u d i e dd u r i n gf e r m e n t a t i o np r o c e s s s oi tc a ni n s t m c t et h e f e r m e n t a t i o no fc h i n e s er i c ew i n ei nt h e o r e t i c sa n dp r a c t i c e ，i m p r o v i n gf l a v o r so fc h i n e s e r i c ew i n e ，e n h a n c i n gt h eq u a l i t i e so fc h i n e s er i c ew i n e i nt h i sp a p e r , t w oy e a s ts t r a i n sw e r es e p a r a t e df r o mt w ok i n d so fc h i n e s er i c ew i n e s t a r t e r s c o m b i n e dw i t ht h ei n d u s t r i a ly e a s t sm a i n t a i n e di no u rl a b o r a t o r y ，t h ef e r m e n t a t i o n c a p a c i t yo f c h i n e s er i c ew i n ey e a s t sw e r es y s t e m i cs t u d i e dc o m p a r e dw i t hs a k ey e a s tk 一7a n d q i n g d a ow i n ey e a s t t h e c e l l u l a rf o r m s ，c h a r a c t e r i s t i c so fc u l t u r e ，f e r m e n t i n gp o w e r ， c o h e s i o n ，f o a mp r o d u c t i o n ，l e t h a lt e m p e r a t u r e ，p h y s i c a la n dc h e m i cs t a n d a r dv a r i e t yd u r i n g f e r m e n t a t i o np r o c e s s ，t h eg e n e r a lc o m p o s i t i o na n du r e ac o n c e n t r a t i o no fc h i n e s er i c ew i n e a m o n g t h es t r a i n sw e r ec o m p a r e d t h er e s u l t ss h o w e dt h a tt h e r ew e r eg r e a td i f f e r e n c e sa m o n g y e a s t so ff e r m e n t a t i o nc a p a c i t y ，a n db e t t e rs t r a i n sc a nb eg o ta c c o r d i n gt os e l e c t i o n t h es t r e s sr e s i s t a n c eo fi n d u s t r i a lc h i n e s er i c ew i n ey e a s t sw e r ea n a l y z e d i tw a s o b s e r v e dt h a tt h ey e a s t st e s t e dw e r et o l e r a n tt os e v e r a ls o m ed e f i n i t ed e g r e eo fs t r e s s r e s i s t a n c e ( 10 ( v v ) e t h a n o l ，4 0 g l u c o s e ，t e m p e r a t u r eo f4 1 a n d6 ，p h2 5 m g h - c o n c e n t r a t i o nl a c t i ca c i da n dn u t r i t i o ns t a r v a t i o n ) ，b u tt h e r ew e r ed i f f e r e n c e sb e t w e e n t h e s es t r a i n si nt h e i rp a t t e r n so fr e s p o n s et oi n d i v i d u a ls t r e s sc o n d i t i o n s s i m u l t a n e o u s l yt h e s t r e s sr e s i s t a n c eo fs a k ey e a s t ( k 一7 ) w a sa l s oa n a l y z e da st h ec o m p a r i s o n i tw a ss h o w e dt h a t k 一7a p p e a r e dt ob et h el e a s ta f f e c t e dy e a s tt ot h eh i g h - t e m p e r a t u r eo f41 ，a n di ts e e mt ob e t h el e a s tt o l e r a n ty e a s tt oh i g h - c o n c e n t r a t i o ns u g a ra n dl a c t i ca c i d i t sb i o m a s so n l ya c c o u n t e d f o r5 0 3 t h a to f y e a s t1w h e ns u b j e c t e dt oh i g h c o n c e n t r a t i o ns u g a r , a n di t sl o s tw e i g h to f f e r m e n t a t i o no n l ya c c o u n t e df o r4 7 g t h a to fy e a s t3w h e ne x p o s e dt oh i g h c o n c e n t r a t i o n l a c t i ca c i d t h ee f f e c to fc e l l u l a rl i p i df a t t ya c i dc o m p o s i t i o no nf e r m e n t a t i v ea c t i v i t ya n de t h a n o l t o l e r a n c eo fc h i n e s er i c ey e a s t s ，a n di t sm e c h a n i s mw e r es t u d i e d t h ec e l l u l a rl i p i df a t t ya c i d 江南大学硕士学位论文 i n c l u d e dp a l m i t i ca c i d ，p a l m i t o l e i ca c i d ，s t e a r i ca c i d ，o l e i ca c i da n ds o m em i n o rd e c a n o i ca n d l a u r i ca c i d t h eo r d e ro fc e l l v i a b i l i t yf r o mh i g h e s tt ol o w e s tu n d e rh i g h c o n c e n t r a t i o n e t h a n o ls h o c kp r e c i s e l yc o r r e s p o n d i n gt ot h er e v e r s er a n k e do r d e ro ft h el e a kd e g r e eo f i n t r a c e l l u l a rn u c l e o t i d ea n dp l a s m am e m b r a n ep e r m e a b i l i t yc o e f f i c i e n t 伊) mc e l lw i n l l o w e rf a t t ya c i du n s a t u r a t i o ni n d e xa n dh i g h e rr a t i oo fp a l m i t i ca c i dp o s s e s s e do fh i g h e r v i a b i l i t ya n dl o w e rp 。a n di t sf e r m e n t a t i v er a t ea n de t h a n o l - p r o d u c t i o nw e r er e g n a n t t h e r e w a sn on e c e s s a r yr e l a t i o n s h i pb e t w e e ne t h a n o lt o l e r a n c ea n df e r m e n t a t i v ea c t i v i t y s oi tw a s i n d i c a t e dt h a tt h ei n c r e a s e de t h a n o lt o l e r a n c ea n df e r m e n t a t i v ea c t i v i t yo fl o w e r e df a t t ya c i d u n s a t u r a t i o ni n d e xa n dp a l m i t i ca c i d e n r i c h e dc e l l sw a sa s s o c i a t e d 、) l ，i t hi t sa b i l i t yt ok e 印a l o w e rp l a s m am e m b r a n ep e r m e a b i l i t ya n dc e l li n t e g r i t ya n dm a i n t a i na h i g h e rv i a b i l i t yw h e n c e l l sw e r ee x p o s e dt ot h e h i g hc o n c e n t r a t i o no fe t h a n 0 1 k e yw o r d s ：c h i n e s ed e ew i n ey e a s t ；f e r m e n t a t i o np o w e r ；s t r e s sr e s i s t a n c e ；l i p i df a t t ya c i d ； c o m p o s i t i o n m 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究5 - 作及取 得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文 中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含本人为获得江南 大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料与我一同工作的同志 对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。 签名：举日期：翘：2 ： 关于论文使用授权的说明 本学位论文作者完全了解江南大学有关保舒、使用学位论文的规定： 江南大学有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允 许论文被查阅和借阅，可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库 、 进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文， 并且本人电子文档的内容和纸质论文的内容相一致。 保密的学位论文在解密后也遵守此规定 签名：导师签名： e t 期： r 7 以 v 厶 ，厶一、厶乙 第一章绪论 立题意义与背景 第一章绪论 黄酒是具有我国民族特色的传统酿造酒，它是以稻米、黍米、玉米、小米等为主要 原料，经蒸煮、加曲、糖化、发酵、压榨、过滤、煎酒、贮存、勾兑而成的【。作为中 华民族历史最悠久的特有酒种，其独特的糖化发酵并行的双边工艺在世界酿造酒中独树 一帜，加上其深厚的历史文化底蕴，被誉为“天下一绝”。它酒性柔顺，酒体丰满，酒味 醇厚，体现了华夏民族的内在敦厚，寓刚予柔的文化精神。它以美妙的色泽，丰富的营 养，独特的滋味而著称于世。同时黄酒酒精度低、耗粮少，符合我国提倡的饮料酒发展 方向，更符合当今世界饮酒风尚的发展潮流。然而自古以来，黄酒始终处于小规模的作 坊式生产，技术进步缓慢，劳动强度大，解放后才逐步发展成工业化生产，2 0 世纪8 0 年 代末新工艺黄酒的诞生才真正实现了黄酒的机械化生产【2 】。随着社会的进步和人民生活 水平的提高，黄酒产量逐年在增加，人们对酒精饮料低度、营养、保健的消费理念的转 变，对黄酒质量与风味提出了更高的要求，低耗粮、高出酒、淡爽、优雅、风味好i 正 成为黄酒发展的目标和趋势。因此我们应在继承传统的基础上，把生物发酵领域的最新 科技成果应用到黄酒的技术创新中来，实现黄酒酒体及口感向现代化黄酒的转变，使之 符合消费者的口感向多样化变化的需求。 从古代起酿酒酵母便被广泛用于包括黄酒在内的酒精饮料的生产。从传统的酒母到 现代纯种酵母发酵，黄酒酿造工艺得到大大简化并且易于实现机械化，黄酒的发酵过程 和品质亦变得更加稳定，而黄酒酵母始终是作为关键微生物主导酒精发酵过程，其酿造 性能的优劣更直接影响到黄酒的出酒率和品质。在发酵过程中，由于发酵活动造成酵母 细胞外环境的不断改变导致细胞不可避免地会受到各种生物或非生物胁迫条件的影响， 而酒精胁迫便是最主要的胁迫因素之一，而当胁迫抵消外界环境造成的影响吲。 发酵过程中酵母除生成大量酒精和二氧化碳外，还生成许多作为黄酒风味来源的次 级代谢产物，据国外研究报道葡萄酒和蒸馏酒精饮料中有超过4 0 0 种的挥发性物质是由 酵母发酵产生的，而这些化合物的性质和浓度则是由参与发酵的酵母所决定【4 j 。酒的风 味和口感是由大量具有不同风味特性的化合物所组成的，高品质的酒，其良好的香气和 口感是建立在各种组分( 如酸、醇、酯、醛和酮等) 平衡协调的基础上。虽然一些风味物 质已经存在于原料中，但大部分都形成于酵母的发酵过程【5 6 】，其中醇类和酯类是其中 最主要的两类物质，而不同酵母具有不同的酶学特性。因此研究显示发酵过程中酵母的 选择与葡萄酒、果酒、蒸馏酒、清酒的风味组成和质量密切相关。【4 ，卜j 因此，黄酒酵母的选育工作对黄酒生产具有举足轻重的地位，而研究和认识黄酒酵 母的酿造特性对于丰富黄酒的酿造科学与理论，使人们能够筛选优良的菌株用于工业生 产，提高黄酒的产率和质量；同时还能起到指导黄酒的生产的目的。但是目前我国黄酒 科研投入少，技术力量薄弱，在黄酒酵母研究方面虽然取得一定的成绩，但尚缺乏系统 l 江南大学硕士学位论文 深入的研究，至今尚未形成一套科学行之有效的筛选体系，在酵母耐受性能尤其是酒精 耐受性能方面也鲜有报道。因此本文以工业黄酒酿造酵母菌株为研究对象，以清酒酵母 和青岛葡萄酒酵母为对照菌株，通过系统研究这些菌株的酿造性能，探讨优良黄酒酵母 的判别条件，建立起合理的筛选体系；通过研究细胞生理结构组成及其变化规律探讨其 高浓度酒精的发酵性能和耐受性的生理机制，了解黄酒的发酵机理，达到指导的黄酒实 践生产的目的。 1 2 国内外研究进展 1 2 1 黄酒酵母研究进展 中国黄酒虽然历史悠久，但其酿造工艺具有高深的科学原理和技巧。新中国成立后， 我国黄酒行业主要在以下几个方面进行了技术改进和创新：采用大罐发酵；采用卧式、 立式蒸饭机，实现了蒸饭机械化；麦曲部分纯种化，制曲机械化；酒母纯种化，使黄酒 质量稳定：应用酶制剂，提高糖化力和液化力，减少曲用量，提高出酒率，节约粮食。 虽然黄酒技术创新取得了很大的成绩，但是关于黄酒酵母的研究进展相当缓慢，前 期主要集中在筛选用于新工艺( 即机械化) 黄酒的酵母，并成功分离出a s 2 1 3 9 2 、m - 8 2 、 a y 系列、苏6 5 2 、z 1 3 9 2 、衢绍1 号等优良黄酒酵母菌种【2 j ，其中衢绍l 号并被成功地研 制成黄酒活性干酵母，应用于黄酒生产。后期在运用新的筛选方法的同时，进一步研究 比较了不同黄酒酵母的基本发酵性能。如王梅【1 4 ，l5 】等人将t t c 运用到黄酒酵母的选育中 取得较好的效果，发现筛选出的酵母耐酒精能力强，生长旺盛，同步性好，发酵能力强， 接种后能较快进入主酵期；夏艳秋1 1 5 】等人，研究了植酸对黄酒酵母6 0 7 生长和发酵性能 的影响，发现其能加快发酵速度，提高酒精产率和耐酒精能力，改善黄酒理化指标；温 海祥【1 6 1 和刘磊【 l 等入首先从不同产地的黄酒酒药中筛选到不同的酵母菌株，接着研究其 发酵性能、耐受能力和凝聚力等特点，从中筛选出优良的菌株，并发现不同酵母菌株发 酵性能存在显著差异，细胞较小的菌株更符合黄酒的生产。毛青钟【l8 】等人研究了机械化 生产黄酒酵母菌性能，并从中筛选到具有良好发酵性能的菌株。 在应用酵母改良黄酒风味方面，多名学者初步尝试了运用生香酵母和黄酒酵母共同 发酵的方式来改善黄酒的风味。傅金泉【1 9 1 等人采用了添加生香酵母与黄酒酵母共酵的方 法，在适当添加的情况下，对改善单一黄酒酵母发酵风味，提高酒质有一定效果。但在 实验中也有因用量不当而影响酒精发酵效果，造成滔度下降和滔香不协调；张彭湃幽j 等人研究了产酯酵母在黄酒生产中增香降度的应用，并确定了发酵工艺，通过感官评定 和气相色谱检验，黄酒香气有明显提高，酒精度亦显著下降。 随着黄酒活性干酵母的研制成功，其被广泛地应用到各种不同工艺的黄酒的生产中 并却得了许多良好的效果。下表列举了不同时期国内学者应用黄酒活性干酵母的情况 1 2 1 - 2 7 1 。 2 第一章绪论 表1 1 黄酒活性干酵母应用情况 t a b l e1 1 a p p l i c a t i o no f c h i n e s er i c ew i n ed r yy e a s t 黄酒发酵要求酵母具备良好的耐受性能，而关于黄酒酵母耐受性的研究至今鲜有报 道。国内报道关于酵母的耐受性的报道主要集中在酒精酵母和葡萄酒酵母的各项耐受能 力上，而对其机理未进行深入的研究2 8 。3 0 1 ( 如表1 2 ) 。 表1 2国内酵母的耐受性的研究情况 t a b l e1 2 s t u d yo nt h es t r e s sr e s i s t a n c eo f s a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a ei nc h i n a 1 2 2 国外酿酒酵母研究进展 日本清酒和我国黄酒相似，均是采用边糖化边发酵的技术进行酿造，但与黄酒酵母 研究相比，日本学者对清酒酵母做了大量细致而深入的研究。 在清酒酵母的选育方面，日本学者采用传统抗性育种和基因工程的手段选育风味优 良的菌种。f u k u d a 3 1 】等人分离了几株新型的浅蓝菌素抗性的清酒酵母，发现这些突变株 表现出呼吸缺陷并且能够在比亲本株更高浓度的抗生素上生长，用这些突变株酿造清 酒，发现比亲本和用溴乙非啶突变的呼吸缺陷型菌株产生更少的琥珀酸酯，并且其产酸 亦下降，而低酸度是对于清酒风味是非常有利的。a s h i d a 3 2 】等人根据异戊醇代谢途径设 3 垩堕奎堂堡主堂垡丝苎 _ _ - - - _ _ _ _ _ - - _ - - _ _ _ _ _ _ - _ _ - _ - - _ 。_ _ _ i _ _ - - - 。- 。- 。- _ - - _ _ - 。_ - 。_ _ 。_ 。_ 。_ _ - 。_ _ - 。_ _ 。1 。_ 。一 计了一条筛选高产乙酸异戊酯的菌株，他们利用l 一亮氨酸的结构类似物 5 。5 。5 t r i f l u o r o d l 1 e u c i n e 筛选到解除因l 亮氨酸的积累而反馈抑制a - 异丙基苹果酸合 成酶活力的突变菌株，从而达到生成满足高品质清酒所需的乙酸异戊酯的数量。 磁t a m o t o 3 3 l 等人通过基因工程手段，将精氨酸酶基因相继破坏，培育出不产尿素的清酒 酵母。独立行政法人酒类综合研究所从发现清酒酵母酿造特性出发，研究其相关的遗传 基因，从中获得了清酒酵母高产泡沫的基因a w a l ，并发现在高浓度酒精条件下。能诱 导t d h i 基因的表达，同时发明了一种新的酒精耐性酵母的选育方法。 家藤治幸等人研究和总结了清酒酵母的酿造特性和营养特性，他们认为与葡萄酒和 啤酒酵母相比。清酒酵母具有乳酸耐受性、耐低温( 1 0 以下) 、高酒精耐性和发酵性能， 从遗传上比较，清酒酵母与其它酵母表现出糖摄取的强化，发酵力强化，脂肪酸摄取与 合成强化，细胞膜流动性好，细胞内p h 维持机能强化等特性。从营养特性上比较，清 酒酵母较其它酵母能积累更多的生理活性物质腺苷基蛋氨酸。 在其它酒方面主要以葡萄酒酵母为主。r e g o d 6 n 3 4 1 等人通过研究成功建立了一条简 单而高效的优良葡萄酒酵母筛选程序，并成功用于葡萄酒酵母的筛选，a n d r e a l 9 1 和 n d i p f 3 5 1 分别对筛选到的葡萄酒酵母进行研究，比较各酵母的酿造特性，筛选出优良的葡 萄酒酵母。 关于酵母对酒的风味的影响，多名研究者认为酵母对酒的风味有至关重要重要的影 响。p a t e l l 3 6 1 等人研究了不同酿酒酵母对g a m a y 、p e t i t e 和s y m p h o n y 葡萄酒中的挥发性组 分的影响，发现醇、酸和酯为主要挥发性成分，其中异戊醇在酒中含量最高，其次为p 一 苯乙醇，并发现不同酿酒酵母发酵酒中主要成分种类相同，但其含量在一定范围内变化。 西班牙学者r e g o d 6 nm a t e o s l l 0 1 研究了酿酒酵母对葡萄酒的影响，发现相同的结果，并同 时发现品质高的酒，其酵母不生成任何过量的成分，品质最差的酒，其酵母发酵生成大 量的乙醛和杂醇油。意大利学者c i 撕7 1 研究了不同酵母混合培养对葡萄酒发酵和风味 的影响，发现混合培养时发酵速率明显较纯种培养小，并且酒的风味比纯种发酵要好。 意大利学者r o m a n o 1 4 1 等人研究酵母在葡萄滔风味形成方面的功能，发现酿滔和非酿滔 酵母对葡萄酒风味有重要影响；f u n d i r a 8 】等人研究了酵母对m a r u l a 水果酒及其蒸馏酒的 影响，通过分析比较酒中挥发性酸、酯和高级醇发现不同酵母所得酒差异显著：r o j a s 幽1 和p l a t a l 3 9 j 分别研究了非酿酒酵母和酿酒酵母合成乙酸酯的能力，发现生成量与酵母的醇 乙酰基转移酶和酯酶活力有关，并且发现非酿酒酵母酯合成能力较强。s m i t 4 0 等人通过 在酵母中表达各种酚酸脱羧酶的基因来提高葡萄酒中挥发性酚类化合物的浓度。 在葡萄酒酵母的耐受性能方面研究较深入，z u z u a r r e g u i 4 q 等人在实验室条件下研究 了酵母的发酵习性与其耐受性的联系，从而为从酵母耐受能力角度出发建立筛选酵母的 标准提供了可能。c a r r a s c 0 1 4 2 1 等人对多株商业化的葡萄酒酵母进行耐受性能分析，发现 所有菌株对胁迫条件都有一定的耐受性，但不同菌株对单一胁迫条件表现出不同的耐受 性能。同时还对与多个胁迫条件耐受性有关的基因( 丘妒j 2 和脚j d 2 ) 表达情况进行了分 析，发现不同菌株表达情况各不相同，在胁迫条件下诱导的耐受性表现和基因的表达不 存在明显的关系，但是然而在热冲击条件下信使r n a 转录水平的增加显示在所有酵母中 4 第一苹绪论 由胁迫引起的基因表达的调控与酵母自身的分子机制有关。 1 2 3 酵母耐酒精能力与其细胞脂质脂肪酸组成的联系研究 1 2 3 1 酵母的酒精耐性评价 酒精是酵母菌发酵糖的重要产物，但是当乙醇积累到一定浓度时，便对酵母细胞产 生有毒效应。然而，不同酵母菌株对一定浓度的乙醇有不同的耐受性，而且在不同培养 条件下和生长在不同的培养基中同一菌株对一定浓度的乙醇也有不同的耐受性。在外源 性酒精或酵母自身发酵产生酒精过程中，酵母的酒精抑制作用非常复杂，主要表现为生 长速率、存活性和发酵速率受到抑制【4 3 j ，但不同酵母其效果差异显著。酒精对细胞生长 和存活性的抑制作用随着酒精浓度的增加而增大的，而高发酵能力只被高酒精浓度所抑 制。也就是说，作为酒精耐性的评价方法，酵母的增殖速度、生存率、发酵性能成为研 究评价焦点。 根据细胞在外加酒精的培养基中生长时受到的抑制来定义，酵母的增殖速度在3 个 评价项目中是最明显的，因此该方法最广泛使用，但该方法主要问题是所使用的培养基 会影响酒精耐性。测定不同时间的酵母乙醇缓冲液中生存率，该方法似乎可用于原本增 殖率不同的酵母菌株间的乙醇耐性的测定。另一种方法是把在无酒精存在时的发酵速率 与高酒精浓度时的发酵速率相比，这个方法的问题是酒精耐性不是用酒精浓度来表示 的。还有就是把酒精耐性与发酵产生的酒精的量作一等式i 删。 综上所述，酵母酒精耐性的评价方法有多种，不同研究者采用的方法也不同。至今 还未有统一的评价方法。酵母本身产生的乙醇被认为比外部添加的乙醇更具有毒性，现 在采用的方法，基本上是外部添加酒精的测定方法，这些评价法对实际发酵过程中酵母 酒精耐性的评价具有局限性。因此，作为实际发酵过程中酵母酒精耐性的评价方法，测 定发酵过程后期的酒精最大生成量来评价酵母的酒精耐性被认为是最贴切和最真实的。 虽然这种方法不能测定酒精对酵母的增殖率、生存率的影响，但是简单，正在世界上被 广泛用于评价各种实际发酵现场中酵母的酒精耐性。该方法将成为最有效的评价方法。 1 2 3 2 酵母细胞脂质脂肪酸组成与其耐酒精发酵能力和耐酒精能力的关系的研究进展 在酿酒或酒精发酵工业中，酵母的一个主要功能便是利用可发酵性糖类生成最主要 的代谢副产物一乙醇，但当乙醇在培养基中积累到一定浓度时，便会对酵母细胞会产生 毒害效应，而细胞膜则是酒精影响细胞的最主要目标。疏水基相互作用是维持细胞膜稳 定的主要作用力，酒精对细胞膜的冲击主要是攻击细胞膜组分中长链烃基通过疏水基相 互作用形成的膜疏水核心，即酒精分子介入细胞膜疏水核心后引起该区域的极性增强， 从而削弱细胞膜疏水核心对极性分子自由通过的渗透屏障，动摇细胞膜的完整性，导致 细胞膜渗透屏障下降，引起细胞内物质泄漏【4 ”。然而一些酵母菌株对高浓度的乙醇表现 出很好的抗性【4 6 】，并且同一菌株在不同培养条件下亦表现出不同的乙醇抗性1 4 7 】。许多研 究显示细胞脂质脂肪酸组成与其酒精耐受性能和发酵性能密切相关 4 5 , 4 8 - 5 4 ，研究发现细 胞膜含有更多的长链脂肪酸可以增加疏水区的表面积和范德化相互作用力，降低膜疏水 区的极性，从而恢复细胞膜的渗透性功能。据报道长链脂肪酸还可以增加疏水区的厚度， 江南大学硕士学位论文 阻止乙醇进入疏水区。一些研究发现。生长于酒精环境中的酵母细胞，其细胞脂质中单 不饱和脂肪酸含量明显增加【5 5 5 6 1 。女i o d u m c m 等人利用3 7 热冲击处理或1 0 ( v m 乙醇 冲击处理酿造酵母菌，发现细胞的c 1 8 ：l 和c 1 6 = l 脂肪酸增加，而c 1 6 ：o 脂肪酸在下降，同时 这些酵母菌可产生11 ( v v ) 的乙醇。在培养基中加入一定量的脂肪酸，特别是不饱和脂 肪酸，这些脂肪酸可以被酵母细胞所吸收，融合到细胞质膜和线粒体膜中，结果发现这 些酵母细胞在酒精发酵过程中耐酒精能力有很大提高5 0 l ；这些不饱和脂肪酸很容易被 酵母吸收，进入到细胞膜和线粒体膜中，从而增加细胞膜不饱和指数，并由此提高膜的 流动性【4 9 1 。因此，增加细胞膜不饱和脂肪酸含量和提高细胞膜的流动性是增强酵母菌耐 酒精能力和酒精产量的关键例。 然而也有一些研究得出截然不同的结果，s w a n 等人f 5 7 1 研究发现膜脂肪酸、膜流 动性和酵母菌耐酒精能力之间并没有明显的联系；a g u i l e r a 等人【5 聊通过比较酵母菌乙醇 敏感突变株和野生型菌株在脂肪酸组成变化发现两者无明显的变化；知n e b o r g 等人【5 4 j 的研究同样发现酵母菌耐酒精能力与膜不饱和脂肪酸含量未存在任何相关性；c a s t i l l o 4 8 1 在比较不同耐酒精能力的菌体在酒精条件下脂质脂肪酸组成时发现，不饱和脂肪酸含量 低的菌体耐酒精能力反而更强。胡纯铿f 5 9 】等人细胞膜富含棕榈酸的菌体具有较强的耐酒 精能力。同时他们还发现饱和脂肪酸( s f a ) 与不饱和脂肪酸( u f a ) n - j 提高自絮凝颗粒酵母 同一菌株耐酒精能力的新实验现象【舢j 。 酒精抑制是酒精发酵过程中限制发酵速率和酒精生成浓度的首要因素，而改变细胞 脂肪酸组成是提高酵母酒精发酵速率和产量的重要措施之一，然而就脂质脂肪酸组成与 酵母酒精发酵能力的关系来自不同的研究得出截然不同的结论。w a t s o n 6 q 指出不饱和脂 肪酸对于高酒精产量是必需的，j a n s s e n s 等【6 2 】人研究发现不饱和脂肪酸的增加能显著提 高酵母的发酵速率。然而m a r m a z z u 等 6 3 】人研究却发现不饱和脂肪酸含量与酵母酒精发酵 速率和产量无必然的联系。 综上表明，酵母菌的耐酒精机理与影响酒精发酵的因素颇为复杂，不同菌株的作用 机制可能各不相同。 1 2 4 化合物的分析 对黄酒( 发酵液或反应液) 中的化合物成分进行分析研究，首先应对其中的化合物进 行浓缩预处理，然后进行定性定量分析。 常见的浓缩预处理的方法有；蒸馏法、液液萃取法、超临界液体萃取法、固相萃 取法、顶空技术法、固相微萃取法等。然而这些方法中，除了固相微萃取法外，其他方 法都不同程度的存在某些缺点。或花费太高，或样品量过多、耗时过多，或使用的是对 人体有害的昂贵有机溶剂，并可能在浓缩过程中丢失一些要测定的香气物质。 固相微萃取法是二十世纪九十年代以来出现的一项新的样品处理方法，它克服了 上诉预处理方法的几乎所有缺点，无需有机溶剂、分析样品量少、操作简单、快速、费 用低，集采样、萃取、浓缩、进样子一体，能够尽可能减少被分析的香气物质的损失， 并能与气相色谱、液相色谱直接联用等优点 叫。 6 第一章绪论 1 2 5 本课题研究思路与内容 本论文的主要任务是研究工业黄酒酵母的酿造特性，为建立起黄酒酵母的筛选标准 奠定基础，同时从细胞生理组成( 脂质脂肪酸组成) 及变化规律的角度阐明黄酒酵母耐酒 精和高浓度酒精发酵性能的影响因素。 1 首先从实验室已有菌种出发并结合分离筛选，以葡萄酒酵母和清酒酵母为对照， 研究黄酒酵母的发酵特性，期望找出黄酒酵母菌株间的差异，建立起黄酒酵母的特征指 标。 2 以清酒酵母为对照，研究黄酒酵母的耐受性( 包括高浓度酒精、高浓度糖、高浓 度离子、高浓乳酸、高温、低温、低p h 值、营养饥饿) ，并与发酵特性和生理特性相结 合，建立起合适的黄酒酵母筛选指标体系。 3 以黄酒酵母的耐酒精和产高浓度酒精的特性为出发点，研究其细胞脂质脂肪酸 与其酒精发酵能力和耐酒精能力的联系。 7 江南大学硕士学位论文 2 1 前言 第二章黄酒酿造酵母发酵性能的比较研究 黄酒是中国历史最悠久的传统酿造酒。黄酒的酿造是一种受多种因素影响的微生物 发酵过程，曲是主要的糖化剂，酵母是主要发酵剂。在黄酒的生产中，酵母菌能利用分 解糖，产生酒精，其发酵性能的优劣直接影响到黄酒的生产和出酒率。优良的黄酒酵母 菌应具备发酵力强，繁殖快，耐高浓度酒精，致死温度高，对杂菌污染的抵抗能力强等 特点。 本章从两种不同类型的酒药中筛选得到两株优势黄酒酵母，结合实验室现有的菌 株，以清酒酵母k 7 和青岛葡萄酒酵母为对照，研究比较了我国主要黄酒酵母菌的发酵 性能( 主要包括细胞形态与大小、培养特征、发酵力、致死温度、凝聚性、泡沫特性、 凝聚力、酿造特性、发酵酒常规理化参数、尿素含量等指标) ，研究黄酒生产用酵母菌 的各项性能，期望从中发现黄酒酵母菌不同菌株间发酵性能的差异，以利于酵母优良菌 株的筛选。 2 2 材料与方法 2 2 1 实验材料 2 2 1 1 菌株 酵母1 ；酵母2 ；酵母3 ；酵母4 ；清酒酵母k - 7 ( 简称k 7 ) ；青岛葡萄酒酵母( 简称 青葡) 2 。2 1 2 培养基 富集培养基：y p d 培养基( 含有5 0m g l 氨苄青霉素) 。 y p d 培养基：l 酵母浸粉，2 葡萄糖，2 蛋白胨，p h 自然，1 2 1 灭菌2 0m i n 。 2 2 1 3 主要试剂与材料 酵母抽提物 蛋白胨，鱼粉 糯米 甲醛溶液 氢氧化钠 尿素 磷酸 二乙酰一肟( d a m ) 硫代氨基脲( t s c ) 硫酸铜 8 o x o i d 公司 国药集团化学药品有限公司 市售 国药集团化学药品有限公司 国药集团化学药品有限公司 国药集团化学药品有限公司 国药集团化学药品有限公司 国药集团化学药品有限公司 国药集团化学药品有限公司 国药集团化学药品有限公司 第二章黄洒酿造酵母发酵性能的比较研究 酒石酸钾钠 亚铁氰化钾 盐酸 甲基红 葡萄糖 氨苄青霉素 酒药 2 2 1 4 主要仪器 u v 2 1 0 2 紫外可见光分光光度计 移液枪 3 2 0 p h 计 s p x 2 5 0 b 型生化培养箱 低温高速离心机 恒温回转式空气摇床 光学显微镜 电子天平 h s w 2 4 型电热恒温水浴锅 无菌超净台 2 2 2 实验方法 国药集团化学药品有限公司 国药集团化学药品有限公司 国药集团化学药品有限公司 国药集团化学药品有限公司 国药集团化学药品有限公司 北京索莱宝科技有限公司 黄酒厂提供 上海尤尼科公司 d r o g a n 公司 m e t t l e r - t o l e d o 公司 上海跃进医疗仪器厂 日本日立公司 上海欣蕊自动化设备有限公司 j o n e c 公司 m e t t l e r - t o l e d o 公司 上海一恒科技有限公司 苏净集团安泰公司 2 2 2 1 活化酵母的制备 接1 环生长良好的斜面酵母至1 0 0m ly p d 培养基中，3 0o c ，1 5 0r m i n ，摇床培养 2 4h ，无菌条件下5 0 0 0r m i n 离心1 0m i n 收集菌体，无菌去离子水洗涤菌体两次，重新 悬浮菌体于无菌去离子水中，血球计数板计数。 2 2 2 2 麦汁的制备 采用浸出糖化法：称取一定质量经过粉碎的麦芽，加入4 倍体积的水，在5 5 - 6 0 水浴锅中保温糖化，间歇不断搅拌，定时碘试直至不变色为止，纱布挤压过滤，除去残 渣，煮沸后再用脱脂棉过滤，得澄清的麦芽汁，加蒸馏水稀释到适当糖浓度。 2 2 2 3 酵母菌株的分离筛选 分别称取不同来源的酒药( 用于生产干型酒的酒药和用于甜型酒的