遗传变异与食管癌和小细胞肺癌易感性及临床疗效的全基因组关联的研究论文.pdf

北京协和医学院 中国医学科学院 博士学位论文 遗传变异与食管癌和小细胞肺癌易感性及临床疗效的全基因组 关联研究 姓名 吴晨 申请学位级别 博士 专业 肿瘤学 基础 指导教师 林东昕 201105 j 匕塞垃塑医堂院生国医堂型堂院境 堂位论塞 摘要 研究生 吴晨导师 林东昕教授 中国医学科学院 北京协和医学院肿瘤医院肿瘤研究所 近年来发展的全基因组关联研究 g w a s 方法已帮助生物医学研究者发现了许多 与复杂性疾病或表型相关的基因或遗传位点 我们运用这一强有力的方法 研究我国常 见肿瘤食管鳞癌易患性及患者生存和小细胞肺癌铂类药疗效及预后相关的遗传因素 研究均采用发现和验证两阶段设计 探讨食管癌遗传易感因素采用病例 对照研究 策略 我们首先运用s n p 芯片对2 0 3 1 个食管癌患者和2 0 4 4 个对照外周血基因组d n a 进行全基因组分析 然后对发现的相关s n p 在4 个独立样本 共含3 9 8 6 个食管癌患者 和4 1 5 7 个对照 中进行验证 探讨食管癌患者生存相关的遗传因素只在有生存资料的 病例中进行 发现阶段包括8 0 0 例患者 验证阶段包括5 3 9 个患者 探讨小细胞肺癌铂 类药疗效及预后的发现阶段含2 4 5 个患者 疗效验证阶段含1 8 3 例患者 而预后验证阶 段含3 0 5 例患者 全基因组关联和生存分析采用目前标准通用的l o g i s t i c 和c o x 多因素 回归模型等统计学方法 我们还运用一系列生化实验进行遗传变异的功能分析 我们发现位于5 q 1 1 6 p 2 1 1 0 q 2 3 1 2 q 2 4 和2 1 q 2 2 的7 个s n p 与食管癌易感性相 关俨7 4 8 x 1 0 d 2 2 4 4 x 1 0 0 1 其中位于1 2 q 2 4 的3 个s n p 与生活方式有显著的交互作 用 携带危险基因型个体如吸烟和饮酒 发生食管痛的风险显著增加 这些遗传变异与 食管癌风险存在累积关联作用 携带危险基因型越多发生食管癌风险越大 p t m d 7 9 2 x 1 0 5 6 携带6 个危险基因型的人发生食管癌风险比携带 1 个危险基因型的 人高4 6 0 倍 9 5 c i 2 7 3 7 7 4 p 9 1 5 x 1 0 固 我们发现位于1 8 q 1 2s l c 3 9 a 6 的 r s l 0 5 0 6 3 1 和r s 7 2 4 2 4 8 1 与食管癌患者生存相关 c o x 多因素回归分析表明 r s l 0 5 0 6 3 1 c t 和t t 基因型的死亡风险分别是c c 基因型的1 2 8 倍 9 5 c i 1 0 8 一1 5 1 p o 0 0 4 0 和 2 4 7 倍 9 5 c i 1 7 5 3 4 9 p i 9 5 l o 而r s 7 2 4 2 4 8 1a g 和a a 基因型的死亡风险分 别是g g 基因型的1 2 4 倍 9 5 c i 1 0 5 一1 4 7 p o o l o o 和1 5 1 倍 9 5 c i 1 2 7 1 7 9 p i 9 8 x 1 0 巧 生化实验表明s l c 3 9 a 6 在食管癌组织中高表达 r s 7 2 4 2 4 8 1 g a 变异破 坏了s l c 3 9 a 65 u t r 与转录抑制因子结合而使s l c 3 9 a 6 高表达 我们发现一组2 0 个s n p 与小细胞肺癌铂类药疗效个体差异相关 o r 2 3 6 4 3 8 该结果在验证阶段得到证实 其中1 4 个s n p 分别位于2 2 p 1 1 2 3 的b t b d 3 6 q 2 4 3 的 4 j 丘塞垃塑医堂医生国医堂叠堂陆攫圭堂僮论塞 s t x b p 5 和2 0 p 1 2 2 的b c r 基因 此外 我们发现位于1 1 q 2 2y a p l 启动子区的r s l 8 2 0 4 5 3 t g 和1l q 2 2 3d y n c 2 h 1 下游的r s 7 1 6 2 7 4a gs n p 与经铂类药治疗的小细胞肺癌患者 生存相关 r s l 8 2 0 4 5 3t g 和g g 基因型的死亡风险比分别是t t 基因型的1 4 9 倍 9 5 c i 1 1 9 1 8 5 p 0 0 0 0 4 1 6 5 倍 9 5 c i 1 3 6 2 0 1 p 4 7 6 x 1 0 7 r s l 8 2 0 4 5 3a g 和g g 基因 型的死亡风险比分别是a a 基因型的1 8 3 倍 9 5 c i 1 4 7 2 2 9 8 7 4 x 1 0 培 和2 9 6 倍 9 5 c i 1 9 0 4 6 2 p i 5 9 x l f f 6 功能实验结果显示 y a p l 基因启动子区r s l 8 2 0 4 5 3 t gs n p 形成一个核蛋白结合位点 从而影响y a p l 基因表达 上述结果表明 食管癌发生发展可能涉及多基因遗传变异以及基因 环境的交互作 用 一些基因的遗传变异是影响小细胞肺癌铂类药疗效个体差异的重要因素 遗传变异 还与食管癌或小细胞肺癌患者生存个体差异相关 我们的研究结果对深入理解食管癌和 小细胞肺癌的发生发展 个体化防治以及预后判断有重要理论意义和潜在的应用价值 关键词 食管癌 小细胞肺癌 易感性 化疗 疗效 生存时间 单核苷酸多态 全基因组关联研究 a b s t r a c t p h d c a n d i d a t e c h e nw um e n t o r p r o f e s s o rd o n g x i nl i n c a n c e ri n s t i t u t e h o s p i t a l c h i n e s ea c a d e m yo fm e d i c a ls c i e n c e s a n dp e k i n gu n i o nm e d i c a lc o l l e g e g e n o m e w i d ea s s o c i a t i o ns t u d i e sd e v e l o p e di nt h er e c e n ty e a r sh a v ea s s i s t e db i o m e d i c a l m s e a r c h e r st oi d e n t i f yan u m b e ro fg e n e so rg e n e t i cl o c it h a ta r ea s s o c i a t e d 析mc o m p l e x d i s e a s e so rp h e n o t y p e s i nt h ep r e s e n ts t u d y w ee m p l o y e dt h i sp o w e r f u lm e t h o d o l o g yt o e x a m i n e g e n e t i c v a r i a n t sf o r s u s c e p t i b i l i t y t oa n dc l i n i c a lo u t c o m e so fe s o p h a g e a l s q u a m o u s c e l lc a r c i n o m a e s c c a n ds m a l l c e l ll u n gc a n c e r a t w o s t a g ea n a l y s i s d i s c o v e r ys t a g ea n dr e p l i c a t i o ns t a g e w a sd e s i g n e df o rt h i ss t u d y t oi d e n t i f yg e n e t i cs u s c e p t i b i l i t yl o c if o re s c c w ec o n d u c t e dag e n o m e w i d ea s s o c i a t i o n s t u d yo n2 0 31e s c cc a s e sa n d2 0 4 4c o n t r o l su s i n g6 6 6 14 1a u t o s o m a ls i n g l en u c l e o t i d e p o l y m o 删s m s s n p s p r o m i s i n ga s s o c i a t i o n so fs n p sf o u n di nt h ed i s c o v e r ys t a g ew e r e e v a l u a t e di na d d i t i o n a l3 9 8 6e s c cc a s e sa n d4 15 7c o n t r o l sf r o mn o r t h e r n s o u t h e r n e a s t e r n a n dc e n t r a lp a r t so fc h i n a w ea l s oc o n d u c t e dat w o s t a g ea n a l y s i st oi d e n t i f yp r o g n o s t i cl o c i a s s o c i a t e d i mo v e r a l ls u r v i v a lo fe s c cp a t i e n t s t h ed i s c o v e r ys t a g ec o n s i s t e do f8 0 0 p a t i e n t sa n dt h er e p l i c a t i o ns t a g ec o n s i s t e do f5 3 9p a t i e n t s g e n o m e w i d es c a no f 4 4 0 0 9 3 s n p sw a sc o n d u c t e dt oi d e n t i f yv a r i a n t sa s s o c i a t e d 析t hr e s p o n s et of i r s t l i n ec a r b o p l a t i no r c i s p l a t i np l u se t o p o s i d ec h e m o t h e r a p ya n dp a t i e n t s o v e r a l ls u r v i v a li n2 4 5p a t i e n t s 析n l s m a l l c e l ll u n gc a n c e ra n dt h er e s u l t sw e r er e p l i c a t e di na n o t h e rs e to f18 3p a t i e n t sf o r r e s p o n s ea n d3 0 5f o rs u r v i v a l p l i n kw a su s e dt oe x a m i n eg e n o m e w i d ea s s o c i a t i o n so f e s c cr i s ka n dc o xm o d e lw a su s e dt oa n a l y z eg e n o m e w i d ea s s o c i a t i o n so fo v e r a l ls u r v i v a l as e r i e so fb i o c h e m i c a la s s a y sw a sc o n d u c t e dt oi n v e s t i g a t et h ef u n c t i o no fa s s o c i a t e ds n p s w ei d e n t i f i e ds e v e ns u s c e p t i b i l i t yl o c if o re s c co nc h r o m o s o m e s5 q l l 6 p 2 1 1 0 q 2 3 12 q 2 4a n d21q 2 2 俨7 4 8 x10 1 2t op 2 4 4 x10 3 1 a m o n gt h e m 3v a r i a n t si nh i 曲l i n k a g e d i s e q u i l i b r i u mo n12 q 2 4c o n f e rt h e i rr i s k st oe s c ci nag e n e l i f e s t y l ei n t e r a c t i o nm a n n e r 衍n lm o r ep r o n o u n c e dr i s ke n h a n c e m e n ti nt o b a c c os m o k e r sa n da l c o h o ld r i n k e r s f u r t h e r m o r e t h e s ev a r i a n t sh a dac u m u l a t i v ea s s o c i a t i o nw i t he s c cr i s k 尸函a 7 9 2 x1 0 5 0 i n d i v i d u a l s c a r r y i n g6h a z a r dg e n o t y p e sh a d4 6 0 f o l d 9 5 c o n f i d e n ti n t e r v a l c i 2 7 3 7 7 4 i n c r e a s e dr i s kf o rd e v e l o p i n ge s c cc o m p a r e dw i t ht h o s ec a r r y i n g lh a z a r d g e n o t y p e w ea l s oi d e n t i f i e dr s l 0 5 0 6 3 1a n dr s 7 2 4 1 4 8 1s n p sl o c a t e di n t h es l c 3 9 a 6g e n eo n 6 c h r o 脚 0 s o n l e18 q 1 2w e r es i g n i f i c a n t l ya s s o c i a t e dw i t ho v e r a l ls u r v i v a li np a t i e n t s 析t he s c c 1 1 1 eh a z a r dr a t i o r c o m p m e dw i t hc o xm o d e lf o rp a t i e n t sw i t ht h er s10 5 0 6 31c to rt t g e n o t y p ew a s1 2 8 9 5 c i 1 0 8 1 5 l p o 0 0 4 0 o r2 4 7 9 5 c i 1 7 5 3 4 9 p 1 9 5 x 1 0 6 c o m p a r e dw i t l lt h ec cg e n o t y p e f o rr s 7 2 4 14 81 t h eh r sf o rt h ea ga n da a g e n o t y p e sw e r e 1 2 4 9 5 c i 1 0 5 1 4 7 p 0 010 0 a n d1 51 9 5 c i 1 2 7 1 7 9 p 1 9 8 x 10 c o m p a r e d w i t ht h eg g g e n o t y p e r s 7 2 4 2 4 8 1w a sl o c a t e di nt h e5 u t ra n db i o c h e m i c a la s s e ss h o w e d t h a tt h er s 7 2 414 81a gc h a n g ec r e a t e san u c l e a rp r o t e i n b i n d i n gs i t ea n dr e s u l t si n d o w n r e g u l a t i o no f s l c 3 9 a 6e x p r e s s i o n b ys e ta s s o c i a t i o na n a l y s i s 2 0s n p sw e r ef o u n dt ob ea s s o c i a t e d 谢t hr e s p o n s et o p l a t i n u m b a s e dc h e m o t h e r a p yi np a t i e n t sw i ms m a l l c e l ll u n gc a n c e r 析t 1 1t h eo d d sr a t i o s o r s r a n g i n gf r o m2 3 6 9 5 c i 1 5 6 3 5 7 t o4 3 8 9 5 c i 2 1 2 9 2 9 a n dt h e s er e s u l t s w e r ec o n f i r m e di nt h er e p l i c a t i o ns t a g e zt r a n s f o r m p o 0 4 3 m o s to ft h e s es n p s 1 4 2 0 w e r ec l u s t e r e do nc 1 1 r o m o s o m e s2 2 pl1 2 3 6 q 2 4 3 a n d2 0 p 12 2 c o n t a i n i n gt h eb t b d 3 s t x b p 5a n db c rg e n e s w ef o u n dt h a tr s l8 2 0 4 5 3w i t h i nt h ep r o m o t e rr e g i o no fy a p lo n 11q 2 2a n dr s 716 2 7 4i nt h ed o w n s t r e a mr e g i o no fd y n c 2 h io n11q 2 2 3w e r ea s s o c i a t e dw i t h s u r v i v a lo fs m a l l c e l ll u n gc a n c e rp a t i e n t st r e a t e dw i t hp l a t i n u m b a s e dr e g i m e n n 圮h rf o r p a t i e n t s 谢廿lt h er s l 8 2 0 4 5 3t go rg og e n o t y p ew a s1 4 9 9 5 c i 1 1 9 1 8 5 p 0 0 0 0 4 o r 1 6 5 9 5 c i 1 3 6 2 0 1 p 4 7 6 x 1 0 叫 c o m p a r e d i t l lm et tg e n o t y p e a n df o rp a t i e n t sw i t h t h er s 7 1 6 2 7 4a go rg g g e n o t y p ew a s1 8 3 9 5 c i 1 4 7 2 2 9 p 8 7 4 x1 0 啼 o r2 9 6 9 5 c i 1 9 0 4 6 2 p 1 5 9 x 1 0 由 c o m p a r e d 诵t i lt h ea ag e n o t y p e f u n c t i o n a la n a l y s i ss h o w e d t h a tt h er s l8 2 0 4 5 3t gc h a n g ec r e a t e sat r a n s c r i p t i o n a li n h i b i t o rb i n d i n gs i t ei nt h ey a p l p r o m o t e rr e g i o na n dr e s u l t si nd o w n r e g u l a t i o no fy a p le x p r e s s i o n i nc o n c l u s i o n t h e s ef i n d i n g sh i g h l i g h tt h ei n v o l v e m e n to fm u l t i p l eg e n e t i cl o c ia n d g e n e e n v i r o n m e n ti n t e r a c t i o ni nt h ed e v e l o p m e n to fe s o p h a g e a lc a n c e r g e n e t i cv a r i a t i o n si n s o 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d e 二甲基亚砜 e d t a e t h y l e n ed i a m i n et e t r a a c e t i ca c i d 乙二胺四乙酸 e m s a e l e c t r o p h o r e t i cm o b i l i t ys h i f ta s s a y 电泳迁移率变动实验 e s c c e s o p h a g e a ls q u a m o u s c e l lc a r c i n o m a 食管鳞状细胞癌 g a p d h g l y c e r a l d e h y d e s 一3 p h o s p h a t ed e h y d r o g e n a s e 3 磷酸甘油醛脱氢酶 g w a s g e n o m e w i d ea s s o c i a t i o ns t u d y 全基因组关联研究 h r h a z a r dr a t i o 风险比值比 h t s n p h a l p o t y p e t a g g i n gs n p 单体型标签s n p o o d d sr a t i o 比值比 p b s p h o s p h a t eb u f f e r e ds a l i n e 磷酸缓冲盐溶液 r t p c r r e v e r s et r a n s c r i p t i o n p c r 逆转录p c r s n p s i n g l en u c l e o t i d ep o l y m o r p h i s m 单核苷酸多态 3 第1 部分 遗传变异与食管癌易感性及患者 预后的全基因组关联研究 g e n o m e w i d ea s s o c i a t i o ns t u d i e so fg e n e t i cv a r i a n t sf o r s u s c e p t i b i l i t yt oa n dc f i n i c a lo u t c o m e so fe s o p h a g e a l s q u a m o u s c e l lc a r c i n o m a 3 j 匕塞协塑医堂院虫国匡堂叠堂陆簋 堂位j 盆窑 1 j 日 舌 食管鳞状细胞癌 简称食管癌 是全世界十大恶性肿瘤之一 且具有特定区域高发 的特点 特别是中国的一些地区发病率远远高于全国平均水平 虽然目前食管癌的确切 病因及发病机制仍不清楚 但以往的研究报道显示吸烟 过度饮酒 微量营养元素缺乏 以及食物中的某些致癌物质都可能引起这一恶性肿瘤 然而 即使暴露于相同环境因素 的人群也只有一小部分个体罹患食管癌 提示食管癌是由环境因素和遗传因素交互作用 引起的 我们实验室和其他研究者以前用候选基因方法 发现了一些食管癌易感基因或 变异位点 1 4 1 近年来 全基因组关联研究在鉴定复杂性疾病易感基因方面取得了令人 瞩目的进展 在本项研究之前 日本学者曾报道他们在日本人群中进行的食管癌全基因 组关联研究 5 o 该报道显示 酒精和致癌物代谢酶基因a d h l b 和a l d h 2 的两个功能 s n p 与患食管癌的风险密切相关 然而 该研究在发现阶段的实验中用的样本量非常小 只有1 8 8 个食管癌患者和9 3 8 个对照 样本量小的研究因统计学力度不足难以发现作用 较小的易感位点 此外 肿瘤是一种复杂性疾病 食管癌的发生发展可能涉及多种基因 的参与 因此 必须用更大样本量 统计效能更高的研究 才能更深入更全面地发现和 阐明与食管癌发病相关的遗传因素 食管癌的治疗方法主要是手术切除 化疗和放疗 然而即便是相同病理类型和分期 的患者接受相同方案的治疗 其近期疗效和远期疗效 生存时间 都存在巨大的差异 此种差异与多种因素有关 但许多研究已经证明个体的遗传因素可能起重要的作用 然 而 目前并不知道是哪些遗传因素决定食管癌患者的预后和生存时间 迄今尚未见有探 讨遗传因素与食管癌患者预后和生存时间的全基因组关联研究报道 揭示食管癌的遗传易感因素对阐明其发病的内在机制 并通过基因一环境交互分析 揭示与其相关的危险环境因素 对食管癌的个体化预防 预测和早期诊断具有极其重要 的意义 阐明肿瘤病人预后相关的遗传因素 值此建立生物标志 对临床个体化治疗决 策的制定也是具有重要的理论和实际意义 基于上述科学问题和食管癌防治的实际需求 我们运用大样本量的病例和对照进行 食管癌的全基因组关联研究 以寻找中国人群食管癌的遗传易感位点以及与食管癌患者 预后相关的遗传变异 我们发现5 个染色体区域的7 个食管癌的易感位点 其中3 个与 吸烟和饮酒有交互作用 一个染色体区域的2 个s n p 与食管癌患者生存时间相关 9 研究设计及研究对象 材料与方法 遗传变异与食管癌易感性的全基因组关联分析 本研究采用两个阶段设计 第一阶段为发现阶段 d i s c o v e r ys t a g e 第二阶段为验证 阶段 v a l i d a t i o ns t a g e 两个阶段的研究对象为互不相关的独立样本 发现阶段运用全基 因组关联策略 研究对象为2 0 4 3 个食管癌病例和2 0 6 3 个正常对照 全部来自北京及 其周边地区 验证阶段的研究对象共3 9 8 6 个食管癌病例和4 1 5 7 个正常对照 分别来 自华北 北京及其周边地区 华南 广东省 华中 河南省安阳市 以及华东 江苏 省 华北地区的食管癌病例 发现阶段的2 0 4 3 例和验证阶段第一组的1 0 0 0 例 于2 0 0 0 年至2 0 0 9 年在位于北京的中国医学科学院肿瘤医院收集 总应答率为9 5 6 4 5 0 个正 常对照 发现阶段的2 0 6 3 人和第一验证组的1 0 0 0 人 为相同时期在北京地区进行社 区营养调查表明无肿瘤病史的人 其性别和年龄与病例匹配 华南地区 第二验证组 的1 0 3 4 个食管癌病人为2 0 0 5 年至2 0 0 7 年在中山大学肿瘤防治中心 广州市 诊治的 患者 募集应答率为9 6 与之匹配的1 1 1 0 个正常对照来自广州市多个大型综合性医 院的体检中心 华中地区 第三验证组 的1 0 0 0 个食管癌患者于2 0 0 5 年至2 0 0 9 年在 河南省安阳市肿瘤医院募集 应答率9 6 与之匹配的1 0 0 0 个对照于相同时间从8 0 0 0 名参加河南省非传染性疾病筛查项目的人群中随机选取 华东地区 第网验证组 的9 5 2 例患者为2 0 0 2 年至2 0 0 8 年在江苏省肿瘤医院 南京医科大学附属第一医院和南京胸科 医院诊治的食管癌患者 募集率为9 1 与之匹配的1 0 4 7 个对照于相同时间 从3 0 0 0 0 名参加江苏省社区非传染性疾病筛查项目的人群中随机选取 除上述人群外 我们还在 江苏省募集了另外2 2 9 0 个病例和2 0 0 8 个对照 用于不同基因型分析的验证 病例为 2 0 0 8 年至2 0 1 0 年在苏州大学第一和第二附属医院 苏州市 南通大学第三附属医院 无 锡市 和淮安第一医院 淮安市 诊治的食管癌患者 募集应答率为9 5 与之匹配的 对照与第四验证组一样 来自3 0 0 0 0 名参加江苏省社区非传染性疾病筛查项目的人群 所有病例均为食管鳞状细胞癌 其诊断是按照世界卫生组织颁布的标准由至少两位病理 科医生根据组织病理学或细胞学检查而确认 患者的籍贯 民族以及其他相关医学资料 如性别 年龄 吸烟状态 饮酒状态以及肿瘤分期等均从患者的病历记录中获得 全部 对照均经过基本体检确认没有肿瘤病史和体征 对照与病例根据性别 年龄和居住地区 1 0 进行频数匹配 平均每天吸烟少于一支或总吸烟时间少于一年的人定义为飞吸烟者 否 则即定义为吸烟者 每周饮酒至少两次且连续超过一年的人定义为饮酒者 否则即为非 饮酒者 发现阶段和验证阶段的研究对象的基本资料见表1 1 遗传变异与食管癌患者生存的全基因组关联分析 在上述易感性全基因组关联研究中 共有1 3 4 6 个食管癌患者具有生存时间的随访 资料 其中 8 0 0 个病例为2 0 0 0 年至2 0 0 9 年中国医学科学院肿瘤医院食管癌患者 5 3 9 个病例为2 0 0 2 年至2 0 0 8 年江苏省省肿瘤医院 南京医科大学附属第一医院 南京胸科 医院 苏州大学第一和第二附属医院 南通大学第三附属医院和淮安第一医院患者 患 者的死因及生存时间的随访通过以下几种方式获得 患者的入院记录 患者家属的确认 以及与当地派出所户籍部门的电话确认 这些患者的末次随访日期为2 0 0 9 年6 月3 0 日 至末次血液标本收集均经研究对象知情同意 本研究经中国医学科学院肿瘤研究所 北 京大学 中山大学肿瘤防治中心 南京医科大学以及苏州大学伦理委员会审批 随访日 期仍生存的患者定义为截尾值 具有生存随访资料的患者的基本资料见表1 2 本研究设计的具体流程图见图1 1 病例 1 0 0 0 1 0 3 4 1 1 3 0 0 9 5 2 g w a s 一扩 独立验证 对照 转化研究 5 3 9 例独立样本验证 图1 1 遗传变异与中国人群食管癌易感性及患者预后的全基因组关联研究流程 囹 一相一 存 少巫巫 一现一 i 一 表1 1 遗传变异与食管癌易感性研究之对象的基本资料 g w a s 第l 验证组 北京 第2 验证组 广东 第3 验证组 河南 第4 验证组 江苏 额外 验证组 病例对照病例对照病例对照病例对照病例对照病例对照 鱼三兰q 箜2鱼三兰q 鲤2 垒三 q q q 2鱼三 竺些坐f 翌三 q 兰盟也三 虫垒三 q q q 2延三 q q q 2延竺曼兰2垒三 q z 2鱼三至三竺q 2 望三2 q q 墨2 年龄平均数5 9 86 1 35 8 85 9 66 1 56 0 55 8 45 0 7 6 0 36 0 46 0 35 9 6 标准差 9 8 8 6 9 3 9 8 8 2 8 2 9 8 o o 3 8 2 8 2 9 5 9 1 性别 男性 女性 吸烟状态 非吸烟者 吸烟者 饮酒状态 非饮酒者 饮酒者 1 6 3 7 4 0 6 7 l l 1 3 3 2 8 9 0 1 1 5 3 1 7 0 0 3 6 3 9 0 4 1 1 5 9 1 1 5 0 9 1 3 8 1 3 1 8 7 4 1 4 5 8 6 5 0 8 4 9 2 8 4 1 1 5 9 4 9 l 5 0 9 5 5 6 4 4 4 8 3 0 2 0 4 4 0 9 6 2 5 6 2 2 4 1 2 8 9 5 2 1 5 4 6 3 6 4 7 5 2 5 5 8 5 6 0 9 3 9 1 5 4 9 4 5 l 8 3 3 1 6 7 6 0 8 3 9 2 5 5 0 4 5 0 7 6 3 2 3 7 7 0 1 2 5 l 4 2 l 5 3 l 4 5 9 4 9 3 7 7 1 2 7 6 5 0 3 5 4 4 4 8 6 5 6 1 1 7 8 3 5 0 7 1 1 3 7 1 1 5 3 1 3 5 9 9 3 l 1 5 7 0 4 3 8 9 4 6 1 0 6 2 9 6 2 1 0 4 6 表1 2 遗传变异与食管癌患者生存时间关联研究之对象的基本资料 l o g r a n k 检验之尸值 1 3 二 基因组d n a 标本制备及基因型分析 我们抽取研究对象5i n l 外周静脉血 分离淋巴细胞 用f l e x ig e n ed n a 抽提试剂 盒 q i a g e n 提取全基因组d n a 全基因组关联分析 2 0 4 3 病例和2 0 6 3 对照 的基 因分型用a f f y m e t r i xg e n e c h i ph u m a nm a p p i n g6 0s e t a f f y m e t r i x s a n t ac l a r a c a l i f o r n i a u s a 验证阶段 第1 4 验证组 的基因型用m a s s a r r a y 时间飞行质谱系统 s e q u e n o m 分析 m a s s a r r a y 系统的工作原理是利用杂交探针和p c r 产物结合后进行延伸反应时 不同等位基因延伸长度不同 通过质谱飞行时间不同鉴别探针延伸长度来确定不同的基 因型 新发现位点基因型的进一步验证用t a q m a n 基因分型平台 a b i7 9 0 0 h t r e a lt i m e p c rs y s t e m a p p l i e db i o s y s t e m s 同时 我们用s e q u e n o m 和t a q m a n 基因分型平台交 叉分析了部分研究对象的基因型 进行两种方法一致性比较比较 遗传变异与食管癌患 者生存研究 1 3 4 6 个食管癌患者 的基因型分析均用a f f y m e t r i xg e n e c h i ph u m a n m a p p i n g 6 0s e t 进行 三 全基因组关联研究中基因型分析的质量控制 食管癌易感性的关联研究 我们运用p l i n k 软件 v 1 0 6 对每个研究对象的全基因组9 0 6 7 0 3 个s n p 原始分 型数据进行系统的质量控制 我们首先检查基因型分析成功率 c a l lr a t e 情况 发现有 一例标本的基因分型成功率 5 样本中未成功分型的1 5 6 5 3 个s n p i i i 次要等位基因频率 l 的1 9 2 0 6 3 个s n p i v 在人群巾的分布频率不 符合h a r d y w e i n b e r g 平衡定律 p 1 0 x l o 6 的2 9 9 7 个s n p 我们对所有标本都进行 了两两间的i d e n t i t y b y s t a t e i b s l 七较分析 以排除重复标本 标本被污染或者具有一 二级亲缘关系 结果显示 共有6 0 个样本可能存在亲缘关系 因此我们剔除了其中一 半 n 3 0 样本 此外 我们运用e i g e n s t r a t 软件包中的主成份分析方法 p r i n c i p l e c o m p o n e n ta n a l y s i s b a s e dm e t h o d 进行人群分层分析 计算出的主成份运用r 软件绘制 成图 我们分析了经上述一系列质控后的4 0 7 5 个样本以及2 0 6 个h a p m a p 计划中无亲 缘关系的样本 5 7y r i 6 0c e u 4 4j p t 和4 5c 耶 以剔除潜在的具有明显人群分 层的样本 如多维空间图 图1 2 所示 本研究全部研究对象均为亚洲人群 经过上述 一系列质量控制 共有2 0 3 1 个食管癌病例 2 0 4 4 个对照 6 6 6 1 4 1 个s n p 进入发现阶 1 4 段的最后统计学分析 在验证阶段 我们运用s e q u e n o m 平台 对发现阶段鉴定出来与 食管癌相关达全基因组关联意义 p 10 7 的2 9 个s n p 进行基因型分析 其质量控制 如下 a 在基因分型过程中 我们将病例和对照d n a 标本随机混杂分布于3 8 4 孔板 中 实验采用双盲方法即操作人员不知道样本是病例还是对照 b 在每张3 8 4 孔板中 包括已知基因型的d n a 标本和不加d n a 的阴性对照 c 随机挑选l o n 4 0 0 经 发现阶段芯片分析的标本进行s e q u e n o m 重复分型 结果表明这两种平台实验的一致率 高达9 9 6 我们对验证阶段的基因型分析数据进行了与芯片分析相似的质量控制 剔 除不合格标本后有3 9 8 6 食管癌病例和4 1 5 7 对照进入最后关联分析 本研究新发现3 个与食管癌易感性相关的s n p 见结果一节相关内容 为了证明这3 个位点确实与食 管癌相关 我们进一步采用t a q m a n 基因分型平台 a b ih 7 9 0 0 系统 对s e q u e n o m 分 析结果进行验证 此外 我们还随机选取验证阶段4 个独立人群的3 8 0 个样本 进行两 种基因型分析方法比较 结果一致率为9 9 4 食管癌患者生存的关联研究 我们同样运用p l i n k 软件 v 1 0 6 对具有生存随访资料的1 3 4 6 食管癌患者全基 因组9 0 6 7 0 3 个s n p 芯片数据进行系统的质量控制 标准与易感性关联研究相同 结果 我们剔除了一个基因分型成功率 5 样本中未成功分型的1 4 8 1 4 个s n p i i i 次要等位基因频率 l 的2 0 2 6 9 7 个s n p i v 在人群中分布频率不符 合h a r d y w e i n b e r g 平衡定律 尸 1 0 x 1 0 击 的2 4 0 3 个s n p 同样 我们对所有样本进 行了两两i b s 比较 结果有1 2 个标本不符合标准因此6 个样本被剔除 e i g e n s t r a t 软件包的主成份分析表明所有食管癌患者均来源于中国汉族人群 经过上述一系列质量 控制 共有1 3 3 9 个研究对象 6 6 9 8 0 2 个s n p 进入最后的生存关联分析 四 统计学分析 食管癌易感性关联研究的统计学分析 我们运用p l i n k 软件 v 1 0 6 的l o g i s t i c 回归模型中的c o c h r a m a r m i t a g e 趋势检 验方法计算发现阶段的中与食管癌易感性关联的位点 并校正性别 年龄 吸烟和饮酒 状态以及用e i g e n s t r a t 计算的3 个主成份 显示全基因组s n p 与食管癌关联 o g l o p 值的 曼哈顿图 由h a p l o v i e w 软件 v 4 4 绘制 我们运用r 软件产生q u a n t i l e q u a n t i l e 图以评估f 观测值与预测值之差异 即评估全基因组数据的整体意义和人群分层对结果 的潜在影响 膨胀因子扣实际矛值中9 0 最小力预测x 2 值中9 0 最小矛 我们运用与 发现阶段相同的趋势检验进行验证结果的统计学分析 由于验证阶段只有2 9 个s n p 无法计算人群分层中的主成份 所以在混杂因素校正时主成份数值设定为零而不带入计 算 验证阶段计算的所有p 值均未经多重检验校正 趋势检验的比值比 o d d sr a t i o o r 值除非特别指明 均指次要等位基因的o r 值 同一染色体区域多个位点与食管癌易感 性关联的独立性以条件l o g i s t i c 回归模型分析 填补 i m p u t a t i o n 和连锁分析 本研究共发现5 个有与食管癌易感性关联的染色体区域 为了了解这些区域的其他 s n p 是否也存在关联 我们用m a c h 软件对芯片未直接分型的s n p 进行填补 计算的 参考