（生物化学与分子生物学专业论文）中国青岛文昌鱼巨噬细胞迁移抑制因子的研究.pdf

中国青岛文吕鱼巨噬细胞迁移抑制因子的研究 中国青岛文昌鱼巨噬细胞迁移抑制因子的研究 专业：生物化学与分子生物学 硕士生：桂晶春 指导老师：徐安龙 摘要 本文综合应用现代分子生物学方法与技术，从核酸水平和蛋白质水平，对我国海洋 珍稀物种青岛文昌鱼巨噬细胞迁移抑制因子( b b t - m i f ) 进行较为系统的研究。以期阐 明巨噬细胞迁移抑制因子( m i f ) 在免疫系统进化过程中和其它生命活动中的重要性和 特殊性，为进一步认识巨噬细胞迁移抑制因子的分子进化和适应性免疫起源提供直接的 实验证据支持。 通过对青岛文晶鱼卵巢c d n a 表达文库的序列测定和生物信息学分析，获得了两个 编码文昌鱼巨噬细胞迁移抑制因子的全长c d n a 序列。这两个全长c d n a 序列尽管都编 码巨噬细胞迁移抑制因子，但是其c d n a 序列长度却相差甚远。为探究该基因在文昌鱼 基因组中的存在方式和结构形式，对文昌鱼基因组进行了s o u t h e r nb l o t 和p c r 扩增、 测序分析。实验结果证明m i f 在文昌鱼基因组中以多拷贝的形式存在，m i f 基因中含两 个内含予，不同拷贝之间的内含子序列不同。目前关于m i f 基因的报道中，人们发现仅 在低等无脊椎动物中存在多拷贝的形式，在哺乳动物及其他脊椎动物中都是以单拷贝的 形式存在。鉴于m i f 在天然免疫系统中的重要作用，作为从无脊椎动物到脊椎动物过渡 类型的文昌鱼，其m i f 的存在形式对认识免疫系统的进化具有重要参考价值。 以b b t m i f 的全长c d n a 中的特异序列为引物，不同组织部位( 消化道、鳃、精 巢、卵巢，脊索，肌肉) 的总c d n a 一链为模板，做r t - p c r 反应检测m i f 的转录模式。 r t - p c r 结果显示m i f 在卵巢和脊索中高表达，僵是在精巢中末检测到m 球的转录。 m i f 在卵巢和脊索中的高表达可能与这些组织部位的免疫调节和控制细胞的生长发育 有关，但是精巢中为何不表达m i f 的原因有待进一步探索。 以p e t 2 1 b 做原核表达载体，成功实现了b b t m i f i l 在大肠杆菌b l 2 1 ( d e 3 ) 中 的高表达。进一步通过阴离子亲和层析、疏水层析、分子筛层析等纯化方法获得了高纯 中国青岛文吕鱼巨噬细胞迁移抑制训子的研究 度的b b t - m i f - i i 成熟重组蛋白。对重组蛋白b b t m i f i i 进行酶学活性检测发现， b b t m i f - i i 有较强的拓扑异构酶活性和氧化还原酶活性。与哺乳动物m i f 的氧化还原酶 活性相反，文昌鱼m i f 不能希j 用g s h 做还原剂还原胰岛素，却能利用d t t 做还原剂将 胰岛素还原。尽管目前还不完全清楚m i f 生理条件下的活性底物，哺乳动物m i f 和文 昌鱼m i f 在体外氧化还原酶活性测定中对还原剂选择性的差异可能也反应了二者在生 理条件下功能上的差异。 总之，对文昌鱼m i f 的序列分析及基因结构、转录模式和酶学活性的研究，为进一 步研究其结构与功能关系及免疫调节机制进化打下了基础。实验结果充分显示了m i f 在 生物进化过程中的重要性、特殊性和活跃性，为我们迸一步认识免疫系统的进化，尤其 是在从无脊椎动物到脊椎动物这一具有重大意义的转变过程中免疫系统的进化提供了 新的视野。 关键词 青岛文昌鱼：巨噬细胞迁移抑制因子：基因结构：转录模式；酶学活性 i i ! 里要些兰墨鱼曼堕塑些堑整塑型望王塑型塞 s t u d y o n m a c r o p h a g em i g r a t i o ni n h i b i t o r yf a c t o rf r o mc h i n e s e a m p h i o x u s ，b r a n c h i o s t o m ab e l c h e dt s i n g t a u n e s e m a j o r ：b i o c h e m i s t r y a n dm o l e c u l a r b i o l o g y n a m e ：j i n g c h u n d u s u p e r v i s o r ：a n l o n gx u a b s t r a c t a c o m p r e h e n s i v es t u d y w a sc a r r i e do u to nt h e m a c r o p h a g em i g r a t i o ni n h i b i t o r yf a c t o ro f c h i n e s ea m p h i o x u s ，b r a n c h i o s t o m ab e l c h e r it s i n g t a u n e s e ，a tt h el e v e lo fd n aa n dp r o t e i n ， u s i n gm e t h o d s o fm o l e c u l a rb i o l o g y t h ea i mi st ou n d e r s t a n dt h ei m p o r t a n c ea n ds p e c i a l i t y o fm i fd u r i n gt h ec o u r s eo fi m m u n es y s t e me v o l u t i o na n do t h e rb i o l o g i c a la c t i v i t y t h e r e s u l t sp r o v i d ed i r e c tp r o o ff o rf u r t h e ru n d e r s t a n d i n gt h em o l e c u l a re v o l u t i o no fm i fa n dt h e o r i g i no f i n n a t ea n d a d a p t i v ei m m u n i t y t w of u l ll e n g t he d n a s e q u e n c e se n c o d i n gm a c r o p h a g em i g r a t i o ni n h i b i t o r yf a c t o rw a s o b t a i n e df r o me d n ae x p r e s s i o nl i b r a r yo fc h i n e s ea m p h i o x u so v a r yb ys e q u e n c i n ga n d b i o i n f o r m a t i o na n a l y s i s t h o u g ht h et w oc d n a s e q u e n c e s b o t he n c o d et h em i f , t h e l e n g t ho f t h et w oe d n as e q u e n c e si s v e r yd i f f e r e n te a c ho t h e r i no r d e rt od e t e r m i n et h eg e n o m i c o r g a n i z a t i o no fm i f i nc h i n e s e a m p h i o x u sg e n o m e ，s o u t h e r nb l o t t i n ga n dp c ra m p l i f i c a t i o n w e r ep e r f o r m e d ，a tt h es a m et i m e ，t h ep c r p r o d u c t sw e r es e q u e n c e dt oc o m p l e t i o n t h e r e s u l t ss h o w e dt h a tm u l t i c o p ym 1 fw a s p r e s e n ti nt h ec h i n e s e 锄p h i o x u sg e n o m e a n dt h e r e a r et w oi n t r o n si nm i f g e n e t h ep r e s e n ts t u d yr e v e a l st h a tm i f i sp r e s e n ti nm u l t i c o p yp e r h a p l o i dg e n o m e i nl o w i n v e r t e b r a t e ，o n l ys i n g l e c o p yp e rh a p l o i dg e n o m e i nm a m m a l i a na n d o t h e rv e r t e b r a t e c o n s i d e r i n gt h ei m p o r t a n tr o l eo fm i fi nn a t i v ei m m u n e s y s t e ma n ds p e c i a l e v o l u t i o n a r yp o s i t i o no fc h i n e s ea m p h i o x u sa t t h et r a n s i t i o n a l s t a g ef r o mi n v e r t e b r a t e t o v e r t e b r a t e ，m i fh a si m p o r t a n t v a l u et ou n d e r s t a n dt h ee v o l u t i o no fi m m u n e s y s t e m t o i n v e s t i g a t et h et r a n s c r i p t i o np a t t e r no f b b t - m i f ，w ep e r f o r m e d r t p c r u s i n g v a r i o u s 1 1 1 中国青岛文昌鱼目噬绌胞迁移抑制闻了的研究 e d n at e m p l a t e sa n d s p e c i a lp r i m e r s t h e r e s u l t ss h o wt h a tt h e r ea r e h i g h l e v e lo f t r a n s c r i p t i o ni no v a r ya n dn o t o c h o r d ，b u tn ot r a n s c r i p t i o ni ns p e r m a r y t h eh i g ht r a n s c r i p t i o n o fb b t m i fi no v a r ya n dn o t o c h o r dm i g h tb er e l a t e dt ot h ei m m u n e r e g u l a t i o n ，a n dg r o w t h a n d d e v e l o p m e n t o fc e l l si nt h e s eo r g a n s t h er e a s o no ft h ef a i l e dt r a n s c r i p t i o no fb b t - m i f i n s p e r m a r y r e m a i n st ob es t u d i e d b b t - m i f - 1 1w a ss u c c e s s f u l l ye x p r e s s e di ne , c o l l b l 2 1 ( d e 3 ) u s i n gt h ep r o e u k a r y o t i c e x p r e s s i o n v e c t o r p e t 2 1 b t h ep u r i f i e d b b t - m i f 1 1w a so b t a i n e d b y a n i o n e x c h a n g e c h r o m a t o g r a p h y ，h y d r o p h o b i cc h r o m a t o g r a p h ya n d g 一5 0e t a 1 t h eb b t m i f - 1 1w a ss h o w nt o h a v et h ea c t i v i t yo ft a u t o m e r a s ea n dr e d o x i tf a i l e dt ou t i l i z eg s ha sr e d u c t a n tt oc a t a l y z e r e d o xr e a c t i o ni n v i t r o ，d i f f e r e n t f r o mm i fi n m a m m a l i a n t h o u g ht h en a t i v ec e l l u l a r s u b s t r a t e si sn o tk n o w n t h ed i f f e r e n c eo fr e d u c t a n tm i g h tr e f l e c tt h ef u n c t i o n a ld i f f e r e n c eo f m a m m a l i a nm i fa n d a m p h i o x u s m i f nv i v o i nc o n c l u s i o n ，t h es t u d yo ns e q u e n c ea n a l y s i s ，g e n o m i co r g a n i z a t i o n ，t r a n s c r i p t i o n p a t t e r n a n d e n z y m a t i ca c t i v i t y w o u l df a c i l i t a t et h ef u r t h e r i n v e s t i g a t i o n o ft h e s t r u c t u r e f u n c t i o nr e l a t i o n s h i po ft h i sm o l e c u l ea n di t sr o l eo fi m m u n ee v o l u t i o n a l lr e s u l t s i n d i c a t et h a tm i f m a y b ear a t h e rs t i r r i n ga n di m p o r t a n tm o l e c u l ei nt h ec o u r s eo fb i o l o g i c a l e v o l u t i o n ，e s p e c i a l l y a tt h et r a n s i t i o no fi n v e r t e b r a t e v e r t e b r a t e k e y w o r d s b r a n c h i o s t o m ab e l c h e r it s i n g t a u n e s e ；m a c r o p h a g em i g r a t i o ni n h i b i t o r yf a c t o r ；g e n e o r g a n i z a t i o n ；t r a n s c r i p t i o np r o f i l e ；e n z y m a t i ca c t i v i t y i v 中国青岛文晶鱼巨噬细胞迁移抑制因子的研究 1 1 背景知识介绍 第一章绪论 文昌鱼是世界珍稀海洋动物，被国家列为二级保护动物。文昌鱼并非真正意义 上的鱼，它是一种进化上介于无脊椎动物和脊椎动物之间的脊索动物门头索动物亚 门的代表动物。头索动物是一类不善于运动的海栖动物，经常隐藏在沙里，但它们 的分布却很广泛，在世界各地的海滨，特别是北纬4 8 。至南纬4 0 。之间的地带，差 不多都可以找到。一种动物不善于运动却能广泛分布，必须要经历漫长的岁月才行。 由此可知，头索动物应当是一个古老的类群。该类动物有贯穿全身的脊索，且脊索 延伸到神经管前面，故称头索动物，又因其没有明显脑部结构，所以被归为无头类。 文昌鱼鱼肉红色，全身呈晶莹，半透明状，身体细长象一把外科手术刀，所以在西 方有被称为两尖鱼或海矛。从形态解剖及胚胎发育上讲，其生理构造甚为奇特，它 和一般鱼不同，没有鱼类常有的鳍，它的鳍只有一层皮膜，虽然也用鳃呼吸，但是 鳃却被皮肤和肌肉包裹起来，形成了特殊的围鳃腔。它也没有鳞，没有分化的头、 眼、耳、鼻等感觉器官，没有专门的消化系统，只有一个能跳动的、内有无色血液 的腹血管和一条承接口腔及肛门的直肠。文昌鱼的脊索、神经管、咽鳃、中胚层、 体腔等的形成过程都类似脊椎动物，而一些内脏如肾脏、生殖腺等的结构情况，则 象无脊椎动物，明显属于从低等动物进化到高等动物的过渡类型，是动物进化史的 活化石，在动物进化树上占据着极其重要的地位。正如卡尔达尔文在他的物种 起源中所说“文昌鱼的发现使人们看到了5 亿年前脊椎动物的模样”1 1 t 2 1 。 近1 0 0 多年来，文昌鱼作为研究对象曾经数次受到动物学界的青睐或冷落。大 约1 0 年前，随着分子生物学技术应用于文昌鱼研究，又激发了动物学家对文昌鱼 的研究兴趣，再一次出现对文昌鱼研究的高潮，并且一直持续至今。分子生物学研 究结果表明，文昌鱼样生物可能是环节动物样动物和最早的脊椎动物之间的的进化 中间体。目前，文昌鱼研究在被忽视一段时间之后，又在分子生物学时代再露头角， 重新占据脊椎动物起源和进化研究中心舞台的位置，成为研究脊椎动物起源和进化 中国青岛文昌鱼巨噬细胞迁移抑制冈予的研究 的模式动物。文昌鱼不仅没有失去它的科学价值，而且从分子水平更有力地确认它 的重要科学价值【3 j 。 巨噬细胞迁移抑制因子( m a c r o p h a g em i g r a t i o ni n h i b i t o r yf a c t o r ，m i f ) 最初于上世纪六十年代从t 淋巴细胞培养基上清液中分离获得，并显示出抑制巨噬 细胞随意迁移的活性，其名字也由此而来【4 ，”。目前比较一致的观点认为：m i f 的功 能与巨噬细胞的噬菌作用及迟发性超敏反应有关，参与非特异性免疫和特异性免疫 调节【6 】。近三十年内，对m i f 的研究因为其在细胞中的分泌量低及不能将所观察 到的免疫活性定位到分子水平等原因而受到限制。人和鼠m z f 的c d n a 编码序列分 别于1 9 8 9 年和1 9 9 5 年被首次克隆获得【2 4 ，2 5 1 。c d n a 编码序列的克隆使得大规模重 组表达蛋白成为可能，大量蛋白的获得为其功能活性研究及空间结构的确定提供了 物质基础。目前m i f 的结构特征已经通过结晶分析，核磁共振波谱学及各种生物化 学的方法确定 2 6 - z 8 1 。值得一提的是m i f 的确切结构特征还未被解决。比如：还不清 楚在生理条件下，m i f 是否形成三聚体，目前已经报道的四种晶体结构中哪一种是 其生理状态下的存在形式及其相关的寡聚状态。事实上，相关研究表明m i f 更有可 能以二聚体或单体的形式发挥功能【2 9 ，3 0 1 。 m i f 具有相当多不同于其它细胞因子的特征，比如m i f 是一个多效性的淋巴细 胞及巨噬细胞因子，同时还是一种内分泌因子【1 0 1 1 ，3 1 ，3 2 1 。尤其令人感兴趣的是，m i f 具有至少两种明显的催化活性互变异构酶和氧化还原酶活性【3 ”5 1 。相应地，m i f 又被称为“具酶特性的细胞因子或细胞因子酶”。m i f 的氧化还原酶活性令人联想起 硫氧还蛋白家族，因此，m i f 又被称为“氧化还原因子”。然而，这些已报道的酶活 性与其生理功能相关性有待近一步探索。m i f 不同于其他细胞因子的地方还在于它 的表达模式。通常，细胞因子是在被外源性或内源性刺激诱导的环境下表达，m i f 却组成型表达于一系列免疫及非免疫细胞，其组织分布非常广泛。实验结果证实m i f 从事先已经形成的胞内储备库中分泌到循环系统发挥功能【1 0 ，3 6 3 7 1 。m i f 的主要作用 包括调节巨噬细胞功能，淋巴细胞免疫和内分泌功能，更是糖( 肾上腺) 皮质激素的 拮抗因子，一般情况下，糖皮质激素( 。肾上腺激素) 作为免疫抑制及抗炎症反应药物 使用【i i , 她3 8 - 3 9 1 。m i f 的另一特殊性在于其n 一端没有信号肽及定位内质网的内部信号 序列，却能被许多免疫细胞及非免疫细胞分泌【3 6 1 。据此推论m i f 依靠一种特殊的非 信号肽途径被分泌，然而确切的分泌机制还有待进步研究。 2 中国青岛文昌鱼巨噬细胞迁移抑制因子的研究 因为m i f 的广泛调节功能，m i f 是许多免疫及炎症疾病( 败血性休克，类风湿 性关节炎，迟发性超敏反应炎症性肺部疾病，癌症) 的重要调节因子【1 0 - 2 3 , 4 0 - 4 8 1 。近 来由于m i f 单克隆抗体在对败血症，类风湿性关节炎及肿瘤发生的前期诊断中的成 功应用，以m i f 作为目标的治疗策略已受到越来越多的关注【4 0 , 4 1 , 4 6 , 4 9 】。表卜l 总结 了与m i f 有重要关联的疾病【5 0 1 ，并且尽可能的将这些疾病与m i f 的免疫生物活性及 其作用机理对应起来( 详情见表1 ) 。尤其值得一提的是m i f 主要参与肿瘤发生的早 期阶段和促进血管发生，其在肿瘤晚期的作用并不明确。几种肿瘤模型的研究结果 表明中和m i f 有着较好的抑瘤作用，显示了m i f 抗体可能作为一种肿瘤治疗工具。 表1 - 1m i f 作用机制、生物学功能及与疾病相关性 3 中国青岛文昌鱼巨噬细胞迁移抑s j j l 夭i 子的研究 说明：f ：代表上调或诱导：l ：代表下调或抑制；( ) 表示那些作用或作用之间的相互关系并非恒 定的，而是随环境变化的或者是推测来的，而不是假说。 与已广泛获得的关于m i f 的生物学功能相比较而言，有关m i f 的作用机理却知 之甚少。目前的研究结果并不能在分子水平上完全解释m i f 的作用机理与它在数种 疾病中的作用之间的关系。然而，根据现有数据可以推测某些分子与m i f 的活性相 关。这些蛋白或者与m i f 相互作用，其活性能被m i f 的催化活性调节，或者其转录 水平被m i f 调节，它们包括：j a b l c s n 5 ，p 5 3 ，e r k l 2 m a p k ，其它激酶，抗氧化蛋 白p a g 和l p s 信号传导途径成分的t l r 4 【5 4 1 。目前，数种原因都说明m i f 在各种 生理和病理条件下的作用途径不能仅用一种分子调节途径来解释。例如，许多受体 包括假受体都可以同时与好几种细胞因子结合，另外，m i f 具有好几种不同于其它 典型细胞因子的特性，这些都无一例外地说明了m i f 是一个具有多种功能的进化上 保守的蛋白陬5 5 , 5 6 1 。 一般情况下，细胞因子需要通过位于目标细胞膜表面的受体发挥调节功能作用 的，细胞因子受体通常在相应的细胞因子克隆后的几年之内被确定。就人m i f 来说， 其e d n a 序列在1 9 8 9 年克隆获得1 2 4 】，但关于相应受体的研究进展却相当缓慢。由于 m i f 是败血性休克症的重要调节因子，j b e r n h a g e n 等人试图从败血症病人的尿样 中分离m i f 受体，但是未达到预期目的【5 0 l 。近两年来随着对m i f 认识的加深及现代 分子生物学技术方法的发展，关于m i f 作用机理的研究有了长足进步1 5 7 4 0 ，主要表 现在以下两个方面：b e r n h a g e nj 于2 0 0 0 年在n a t u r e 上报道他们通过酵母双杂交 的方法找到一个m i f 的细胞内受体一j a b l ，该蛋白能够结合转录增强因子c j u n 激活域，进而调节下游重要功能基因的表达，涉及到细胞的发育及凋亡f 5 4 1 。b u c a l a r 于2 0 0 3 年在j o u r n a lo fe x p e r i m e n t a lm e d i c i n e 上报道他们通过表达克隆和 功能分析的方法确定了m i f 的膜受体c d 7 4 ，一种典型的i i 型跨膜蛋白【6 1 1 。综上 所述，m i f 在非特异性免疫，特异性免疫和许多生理病理过程中都发挥重要功能， 4 中国青岛文昌鱼巨噬细胞迁移抑制因子的珂f 宛 这也是m i f 一直是研究热点的重要原因。 1 2 研究策略与研究意义 本实验室首先通过对青岛文昌鱼( b r a n c h i o s t o m ab e l c h e r it s i n g t a u e n s e ) 卵巢 e d n a 文库进行大规模测序，并对测序结果进行系统生物信息学分析的方法，获得了 两个编码青岛文昌鱼巨噬细胞迁移抑制因子的c d n a 序列( g e n e b a n ka c c e s s i o n n u m b e rb b t - m i f i ：a y 5 6 3 0 9 3 ；b b t - m i f i i ：a y 5 6 3 0 9 4 ) ，其编码的氨基酸残基在一级 结构和二级结构上与人和鼠的相应基因有很高的相似性，比如其n 一端同样没有信号 肽及定位内质网的内部信号序列，一级结构相似性达到4 0 ，二级结构分析表明文 昌鱼m i f 与人和鼠m i f 一样，存在两个c 1 一螺旋和四个t 3 一片层结构。图1 - 1 和图 1 2 分别给出了b b t - m i f i 和b b t - m i f i i 的c d n a 序列和其编码的氨基酸残基序列 及相应的功能保守位点。同时发现尽管它们编码同一个目的蛋白，其e d n a 序列的 非编码区域却存在较大差异：b b t - m i f i 由5 3 4 个碱基对组成，其中5 端非编码 区由7 9 个碱基对组成，3 端非编码区由1 0 4 个碱基对组成；劢t - m i f i i 由1 0 7 0 个碱基对组成，其中5 端非编码区由1 0 5 个碱基对组成，3 端非编码区由6 1 4 个碱基对组成。这一差异很快引起了我们的兴趣：这两个编码同一个目的蛋白的 e d n a 序列究竟是来自于文昌鱼基因组中的单拷贝基因，仅仅是由于不同的转录和剪 切方式造成了它们之间的这种差异，还是来自文昌鱼基因组中的多拷贝m i f 基因。 带着这一疑惑我们对文昌鱼的m i f 基因拷贝数和基因结构现象进行了分析。为了考 察m i f 基因的表达分布情况，我们对来自文昌鱼不同组织器官的样品进行了r t p c r 分析，结果同样说明了m i f 基因的特殊性。为了进一步研究文昌鱼m i f 基因的生物 功能活性，我们通过原核表达的方式获得了m i f 蛋白，并对m i f 的酶学活性进行了 检测，发现m i f 具有较强的氧化还原酶活性和拓扑异构酶活性，其中m i f 的氧化还 原酶活性具有一定的底物特异性。目前的实验结果充分说明了m i f 在生物进化过程 中的重要性、特殊性和活跃性，为进一步研究其结构与功能关系打下了基础，为我 们进一步认识免疫系统的进化，尤其是在从无脊椎动物到脊椎动物这一具有重大意 义的转变过程中的免疫系统的进化提供了新的视野。 5 中国青岛文晶鱼巨噬细胞迁移抑制嗣子的研究 本研究的科学意义体现在： ( 1 ) 进一步认识文昌鱼作为一种研究脊椎动物进化的模式生物提供更直接的分子依 据。 ( 2 ) 为进一步认识免疫系统的进化提供新的视野及观点。 ( 3 ) 为进一步认识巨噬细胞迁移抑制因子( m i f ) 的重要性，活跃性，复杂性提供直 接的实验依据。 ( 4 ) 青岛文昌鱼巨噬细胞迁移抑制因子是一个新的基因，且与已知的巨噬细胞迁移 抑制因子相比具有自己的特点，如能阐明其功能即可申请功能基因专利，获得自 己的专利保护权。 本论文的技术路线： t w oc d n ac l o n i n go fm i ff r o m t h e s a m p h i o x u s a n a l y s i s 上 s o u t h e r nb l o t t i n g r t p c r g e n eo r g a n i z a t i o na n a l y s i s 6 p r o t e i ne x p r e s s i o n p u r i f i c a t i o na n da c t i v i t y a n a l y s i s 8；i上e n 呈； c 明 ! 里重壁兰曼鱼旦堕塑塑兰垡塑型望三塑婴塞 b n c n e t c b t g c t g n c n c t t c n c t t t g t c t t g t c c c b t t n e t t t t c g t c b c t t t t c c c t c g t t r t 日b n a n t n n g t t n c7 8 cr t gc c ! t c at t tg t tc t g t a ga c ga a cc t gg c cc g ca c tg c ca t cc c ga a gg a ct t t 1 3 6 h 团s fulkthlnrs日ipkdf c t ga c gg a ga c tf c ca a gc t ag t gg c cg a ti i t ac f gg g ga r ac c tg a ag g gt a tg t c 1 9 3 ltetsklvdil g 圈p ecv t g cg t gt g cg t gg a ag c ag a cg t cc t ga t ga c c cvcveroul*t 2 s i t g tc t ca t cg r cc t ca t ga g ca t cg g cr a gc t gg g ac t gg a gg a ga a ca a ga c tc a c3 盯 匿逐鍪受圈l h s 团g klcleehkth a c gg c gg c aa t ct g cg a cc a c g t ca a g a a ac r cc t gg g ca t ac c tg g c g a ca g gc t g3 6 1 1 tnaic0hukkhlgipgdrl t r tg t ta r ct t cc r cg a cg c tg c ca g cc a gg r tg t tg g ca g gg a ca g ca c ga c ct t c轮 囤u 圆f hdanr q dqgrdsttf g c ac g tt g an e c t e _ c n c c n c t c t t t 髓c c n n c t e c c b b n t t c b c n c c e e e c t n n c t c t e b 曲1 n t t n t n1 1 9 3 ar e e c t c n t s c c t t c t c t e c l b t c n b e c a o t 日t b c c n t g g t a t a n n n n n n n n 日r n n n n n n n n n n n 自a n a n n n5 6 3 图1 - 1 励卜m i f i 的c d n a 序列和其编码的氨基酸残基序列及相应的功能保守位点。 f i g 1 1n u c l e o t i d ea n d d e d u c e da m i n oa c i ds e q u e n c e so f b b t - m i f - i a s t e r i s k si n d i c a t e t h ef i r s t5 a n d3 i n f r a m es t o pc o d o n s ；t h ea c t i v es i t e s d o m a i na r es h o w ni nb o l d 7 中国青岛文昌鱼巨噬细胞迁移抑制因子的研究 b 曲肭6 曲m 们讳仆们盯m 蚰盯盯盯帖他盯觚警明盯雠能吐丌盯北曲n “盯n 盯7 7 c t t t t c c c t c b t t n n n n n t a a a c t t g c ca t gc c t h 囹 t c tt t tg t tc t gn n ga c ga r ct t i gg c c c g c1 4 1 sfulkthlrr o c tg c cr t tc c cr a gg f i ct t tc t gg c gg a g saipkdflte a c tt c ra r gc t ag t cg c cc a ta t ac t g1 9 b tsklundil g g gn r 日c c tg g gb c et g tg t ct g tg t rt g tg t gg a gg c gg a cg t cc t ca t gg c ct r t2 9 5 b 落i pegcucucuendvlht 豳 g g cg g gt c ag r cg c gc c ct g ct g tc t ca t cg a cc t ca t ga g cr t c g g gg a gc t ag g r3 1 2 觏i 湾鹭鬻翳翳醚：渊黧渗誊渗涮j 蘩蠢溪豢薹瀵o lhs 国g klg c t gg a gb n ba r cr a ga c gc r co c gg c gg c ra t ct g cg r cc a cg t cg a ga r rc r cc t g3 6 9 leehkthtnicdhukkhl g g cf i t rc c tg c cg a cr g g gipg1 0r c t gt a tg t t 冉冉et t cc r cg r c l 囹u 圈f hd g c tc c aa g gc 譬g 卉tg t c4 2 6 日arqdu g c cr g gg r cg g cg c ga c ct t cg c rc g tt c a 日e e t c n c e c c n c 由c t t t c c g n c 日矗e t e c 冉8 b n b t t c b4 9 3 grdbttfna - c n c c 冉g c c n n 冉c t c b e e g n t 白t t n t r c b c c c 冉t b c c t n c t c t c c t b i c n g b c r b t n t b g c n t b e t n t r g t n t g n c t gs 7 5 t g n c n t t c c n b t t c r t b c a c a c 龠e t g t g r 自c o b b t g c o c n t c t n t t c e b n t t t n t 冉t t t g b t n b t t c 冉g t 自6 h 7 r c t t c t c n t t t t c t t b t b c c n a 矗t b n n n g n c c n t b n 日c n n n t r 冉t c t t c n c 矗n n c b t 日n t c 舟t t c t c t t g g a r g r a7 2 4 r t t a c r r c t c t t e b r t 冉c c n t t t g 冉n t c c n e t r n n t b b t c c n g c a n c n t r t c r r n n b n t t t r a t b 日c n n n c c t t r8 9 1 t e r r t t t t e c 舟t t c 行g t n r 冉n 矗c c 冉r t t g e n t e 0 r c t t t g g r g c t 冉c t c a e 蠢行r t a c 冉r r t r t 冉c 冉b t g r g r r t t8 7 8 t t c n t c t t c n c n t b 日一n g b 冉g t c n c r n 冉t c t t b g 矗t t g n n c e c n t g t t t c r 冉r g 冉t g c c c t 冉t t b c n c c n b c 日t t c9 5 5 b b b a n c n c g t c c t t t b t g c t 鲫i 盯t g b b 日c a t t t c t e t b t t l g t t t b t t t 8 t t b t c t t b 丌t g t b c t t a t t g 曲t c t1 帕2 t b t b ，口刚趣冉c n i c n c 冉冉t a 囊a n n e t a t t g 戽冉t e c t e e a n q 冉r 拜舟触鱼r 冉a a a a 冉冉冉翻拍n 冉冉靠a a 冉 1 0 9 9 图1 - 2b b t - m i f - i i 的c d n a 序列和其编码的氨基酸残基序列及相应的功能保守 位点。 f i g 1 - 2n u c l e o t i d ea n d d e d u c e da m i n oa c i ds e q u e n c e so f b b t - m i f - i ie d n a a s t e r i s k s i n d i c a t et h ef i r s t5 a n d3 i n f l a m es t o pc o d o n s ；t h ep o l y a d e n y l a t i o ns i g n a li s u n d e r l i n e d ；t h ea c t i v es i t e s d o m a i na r es h o w n i nb o l d 8 中国青岛史昌鱼巨噬细胞迁移抑制因子的研究 第二章青岛文昌鱼巨噬细胞迁移抑制因子的 基因拷贝数和基因结构分析 2 1 材料 2 1 1 组织样品 青岛文昌鱼成体( b r a n c h i o s t o m a b e l c h e r it s i n g t a u e n s e ) 于2 0 0 3 年4 月采自 山东省青岛市沙子口水域。 2 1 2 基因组提取用试剂 抽提缓冲液：l o m m o l lt r i s h c l ，0 1 m o l le d t a ，2 0 u g m l 胰r n a 酶，0 5 s d s ，p h 8 0 ： l o m o l l ( n h 。) a c ：3 8 5 9 ( n h 。) a c 定容至5 0 m l 并过滤除菌； 蛋白酶k ；0 5m o l lt r i s - h c l ( p h 8 o ) 平衡的酚；氯仿；异戊醇；无水乙醇 2 1 3s o u t h e r n 杂交试剂 工具酶：印吐p s t l , n c o l , m s p l , a n d e c o r v , 购自n e b 公司； 5 0 x t a e ( 1 l ) ：2 4 2 9t r i s 碱，5 7 1 m l 冰乙酸，l o o m l 0 5 m o l le d t ap h 8 0 2 0 x s s c ( i l ) ：1 7 5 3 9 氯化钠，8 8 2 9 柠檬酸钠，p h 7 2 ； 1 mn a o h ( 1 l ) ：4 0 9n a o h 定容至i l ； 1 0 s d s ( 1 l ) ：1 0 0 9 电泳级s d s ，加热助溶后调p h 至7 2 ； 杂交液：5 x s s c ： 2 0 m m o l l 磷酸缓冲液p h 7 o ： 5 x d e n h a r d t 溶液： 1 0 9 6 硫酸葡聚糖； l o o u g m l 变性的鲑精d n a 片段： 9 中国青岛文昌鱼巨堪细胞迁移抑制因子的研究 c t 一”p - d c t p 同位素购自北京亚辉生物医学公司； 同位素标记试剂盒购自p r o m e g a 公司； 杂交用尼龙膜h y b o n d n + 购自a m e r s h a m 公司 2 1 4p c r 扩增测序用试剂 引物1 5 - c t t g t c c c g t t a g t i t r c g 一3 ： 引物2 5 - g c a t g r g c c t a t a a t a t c c c 一3 ； 狈0 序用引物：t 7 ：5 - t a a t a c g a c t c a c t a t a g g - 3 ； s p 6 ：5 婀n 嫣g t g a c 氏双觚嫣a a 3 ； p r i m e r l ：5 - a g c c g g g a t i t g a a c t c 一3 ： p r i m e r 2 ：5 一c a c