（营养与食品卫生学专业论文）磺胺类兽药残留化学发光免疫检测方法的研究.pdf

天津科技大学 学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的论文是本人在导师的指导下独立进行研究所取得的研究 成果。除文中特别加以标注引用的内容外，本论文不包括任何其他个人或集体已经发 表或撰写的成果内容。对本文研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方 式标明。本人完全意识到本声明的法律后果由本人承担。 作者签名：刍k 灸纬 日期：槲年歹月汐b 专利权声明 本人郑重声明：所呈交的论文涉及的创造性发明的专利权及使用权完全归天津科 技大学所有。本人完全意识到本声明的法律后果由本人承担。 作者签名：参隧编 日期：见炒孑年j 月功日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留并 向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授 权天津科技大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以 采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。 保密 1 ( 请在方框内打t ”) ，在 年解密后适用本授权书。 本学位论文属于 不保密 讶( 请在方框内打“妒) 。 作者签名：l i 塾岛 日期：孙汐年；月留日 导师签名： - 1 、7 1日期：刎陟年；月多f 日 够欠 摘要 本论文对磺胺类兽药残留的化学发光免疫检测方法进行了深入系统的研究。通过 免疫兔子获得抗磺胺类药物多克隆抗体。全面优化了检测方法中的各个参数，包括抗 体包被量、酶标抗原的浓度、酶标抗原稀释液的种类及发光底物的浓度，建立了磺胺 类药物的化学发光酶联免疫检测方法，并对方法的性能指标进行了系统评价。 该化学发光免疫检测方法的特异性通过十六种磺胺类药物的竞争反应进行了测 定。与传统的显色酶联免疫吸附测定方法相比，灵敏度普遍有所提高，有的要提高2 3 倍。十六种磺胺的最低检测限范围在0 1 3 1 0 “g l 。 选取了鸡肉和猪肉作为主要检测样品，通过磷酸盐缓冲液简单稀释即可消除样品 的基质影响。实验选取了磺胺异嗯唑、磺胺噻唑、磺胺甲氧嘧啶、磺胺甲氧哒嗪和磺 胺吡啶五种磺胺药物进行了添加回收实验。结果表明用磷酸盐缓冲液作为提取溶剂的 平均回收率为6 2 1 1 1 0 3 ，且变异系数普遍在1 5 以下。 通过高效液相色谱检测方法对已建立的化学发光免疫检测方法进行了确证。并将 两种方法的检测结果进行线性回归分析，其中鸡肉和猪肉样品的相关系数r 2 分别为 0 9 5 4 6 和0 9 3 7 9 ，说明该检测方法的准确性较好。本实验还对猪肉样品添加回收测定 结果与显色酶联免疫吸附测定的结果进行了比较，相关系数为0 9 4 8 1 ，表明两种免疫 检测方法一致性较好。论文还对发光底物的进行了探索，研究出了底物新配方。虽然 其稳定性仅为7 天左右，但可为进一步研究发光底物提供参考。 该化学发光免疫检测方法可以满足美国和欧盟对磺胺类药物最高残留限量1 0 0 g l 的检测标准，并为进一步研究其他农兽药的化学发光免疫检测奠定基础。 关键词：磺胺类药物；化学发光；免疫检测；残留 a b s t r a c t a ne n z y m e 1 i n k e di m m u n o s o r b e n ta s s a y ( e l i s a ) b a s e do np o l y c l o n a la n t i b o d yw i t h e n h a n c e dc h e m i l u m i n e s c e n t ( e c l ) d e t e c t i o no fs u l f o n a m i d e si nf o o ds a m p l e sh a db e e n d e v e l o p e d t h ea n t i s u l f o n a m i d e sp o l y c l o n ea n t i b o d i e sw e r ep r o d u c e d i nr a b b i t s as e r i e s o fp a r a m e t e r so ft h i sm e t h o dw e r eo p t i m i z e di nt h i ss t u d y ，i n c l u d i n gt h ec o n c e n t r a t i o no f c o a t e da n t i b o d y ，c o n c e n t r a t i o no fe n z y m ec o n j u g a t ea n dd i l u e n to fe n z y m ec o n j u g a t e a n d t h ep e r f o r m a n c eo ft h ed e v e l o p e dm e t h o dh a da l s ob e e ne v a l u a t e ds y s t e m i c a l l y t h es p e c i f i c i t yo ft h ee c l - e l i s aw a se v a l u a t e db yd e t e r m i n i n gt h ec r o s s r e a c t i v i t y 、析也s i x t e e ns u l f o n a m i d e s e c l e l i s aw a sa b o u t2 - 3t i m e sm o r es e n s i t i v ec o m p a r e dt o c o l o r i m e t r i ce l i s a t h el i m i t so fd e t e c t i o n so ft h e s es i x t e e ns u l f o n a m i d e sw e r e0 1 0 1 0 p g l t h eb u f f e ro fp h o s p h a t eb u f f e r e ds a l i n e ( p b s ) w a su s e dt od i l u t et h ee x t r a c tt o r e m o v a lt h em a t r i xe f f e c t s t h i se c l e l i s ap r e s e n t e dh e r es u c c e s s f u l l yd e t e r m i n e df i v e k i n d so fs u l f o n a m i d e s ( s u l f i s o z o l e ，s u l f a t h i a z o l e ，s u l f a m e t e r ，s u l f a m e t h o x y p y r i d a z i n ea n d s u l f a p y r i d i n e ) i nc h i c k e nm u s c l ea n dp i gm u s c l es a m p l e s t h er e c o v e r i e sw e r e6 2 1 1 10 3 a n dm o s to ft h ec o e f f i c i e n t so fv a r i a t i o nw e r eu n d e r15 t h ea c c u r a c ya n dp r e c i s i o no fe c l e l i s aw a sv a l i d a t e db yt h ei n s t r u m e n t a lm e t h o d o fh p l c t h ec o r r e l a t i o nc o e f f i c i e n t s 噼) o ft h ee c l e l i s aa n dh p l cd a t aw e r e0 9 5 4 6 i nc h i c k e nm u s c l ea n do 9 3 7 9i np i gm u s c l e n l ec o n s i s t e n c yo fe c l e l i s aa n d c o l o r i m e t r i ce l i s aw a sa c c e p t a b l e a n dt h er 2w a s0 9 4 81 f u r t h e r m o r e ，t h es u b s t r a t eo f c h e m i l u m i n e s c e n tw a sg r o p e dt oi m p r o v et h es t a b i l i t yo ft h ee x p e r i m e n t t h o u g ht h e s t a b i l i t yo fn e ws u b s t r a t ec o u l ds u s t a i na b o u ts e v e nd a y s ，t h er e s u l tc o u l ds u p p l yr e f e r e n c e s t ot h ef u t u r es t u d y t h ed e v e l o p e de c l e l i s ac o u l ds a t i s f yt h em a x i m u mr e s i d u el i m i t ( 10 0 g l ) o ft h e u s aa n de u r o p e a nu n i o n , w h i c hp r o v i d eab a s ef o rs t u d yt h ed e t e r m i n a t i o nm e t h o d so f o t h e rp e s t i c i d e sa n da n i m a lm e d i c i n e k e yw o r d s ：s u l f o n a m i d e s ，c h e m i l u m i n e s c e n t ，i m m u n o a s s a y ，r e s i d u e s 1 前言1 1 1 兽药残留概述l 1 1 1 兽药残留1 1 1 2 兽药残留的危害1 1 1 3 控制动物源性食品中兽药残留措施2 1 2 磺胺类药物概述3 1 2 1 磺胺类药物简介3 1 2 2 磺胺类药物的抗菌作用机制5 1 2 3 磺胺类药物在兽医临床上的应用6 1 2 4 磺胺类药物的毒性作用8 1 2 5 磺胺类药物对食品的污染及残留限量9 1 2 6 磺胺类药物的常用分析方法简介l o 1 3 化学发光免疫检测技术”1 3 1 3 1 化学发光基本原理1 3 1 3 2 化学发光酶免疫测定1 4 1 4 论文研究的目的及意义1 5 1 5 研究内容1 5 2 材料与方法1 6 2 1 实验材料1 6 2 1 1 主要药品和试剂”1 6 2 1 2 仪器及材料1 7 2 1 3 常用溶液的配制1 8 2 2 实验方法“18 2 2 1 抗体的制备1 8 2 2 2 抗体的纯化1 8 2 2 3 抗体浓度的测定1 9 2 2 4 直接竞争酶联免疫测定( e l i s a ) 方法操作步骤1 9 2 2 5 增强化学发光酶免疫分析( e c l e l i s a ) 检测方法的建立2 0 2 2 6 方法特异性的测定2 1 2 2 7 实际样品的处理方法一2 1 2 2 8e c l e l i s a 检测方法性能指标的评价2 1 2 2 9e c l e l i s a 方法的确证实验”2 2 2 2 1 0 发光底物的探索2 3 3 结果与讨论一2 4 3 1 抗磺胺类药物抗体和酶标抗原的制备2 4 3 2 抗磺胺类药物抗体的纯化2 4 3 3 增强化学发光酶免疫分析( e c l e l i s a ) 各参数的优化2 5 3 3 1 包被抗体浓度的优化2 5 3 3 2 酶标抗原稀释倍数的确定2 5 3 3 3 酶标抗原稀释液的确定2 6 3 3 4 发光底物的优化：- l 2 7 3 4 方法特异性2 7 3 5 样品基质影响的消除3 0 3 6 磺胺类药物e c l e l i s a 检测方法性能指标的评价”3 3 3 6 1 五种磺胺药物检测限及灵敏度3 3 3 6 2e c l e l i s a 检测方法的准确度。3 4 3 6 3 精密度3 5 3 7 高效液相色谱方法确证。3 6 3 7 1 猪肉和鸡肉样品处理方法”3 6 3 7 2h p l c 与e c l e l i s a 法检测结果的相关性3 7 3 8e c l - e l i s a 与显色e l i s a 回收率测定结果的比较3 9 3 9 发光底物的探索4 0 4 结论4 1 5 展望”4 2 6 参考文献- ”4 3 7 论文发表情况5 3 8 致谢5 4 1 1 兽药残留概述 1 1 1 兽药残留 f a o w h o 联合组织的食品中兽药残留立法委员会把兽药残留定义为：兽药残留 是指动物产品的任何可食部分所含的母体化合物及或其代谢物，以及与兽药有关的杂 质的残留。所以兽药残留既包括原药，也包括药物在动物体内的代谢产物【l j 。另外， 药物或其代谢产物与内源大分子共价结合产物称为结合残留【2 】。动物组织中存在共价 结合物( 结合残留) 则表明药物对靶动物具有潜在毒性作用。主要残留兽药有抗生素 类、磺胺药类、呋喃药类、抗球虫药、激素药类和驱虫药类p 4 j 。 兽药残留产生的途径包括在防治畜禽疾病过程中不严格遵守兽药的使用对象、使 用期限、使用剂量以及休药期等规定，长期或超标准使用、滥用药物导致残留兽药； 在饲喂畜禽过程中滥用兽药及其他违禁药品，尤其是一些抗生素类及激素作为畜禽饲 料添加剂以达到既能预防和治疗许多病原微生物感染引起的疾病，又能促进动物生长 的目的而导致兽药残留；另外部分动物性产品经营者在加工贮藏过程中，非法使用添 加剂和抗生素，以达到灭菌的目的则也可导致兽药残创孓引。 动物源性食品中的兽药残留的种类主要有抗生素类药物残留，包括氯霉素类、四 环素类、大环内酯类等；动物激素类药物的残留，如乙烯雌酚、雌二醇、丙酸睾丸酮 等。另外还有其他药物，如兴奋剂、安定类、杀虫剂类等。近年来，非法使用p 受体 兴奋剂盐酸克仑特罗( 瘦肉精) 已成为引起国内外重大食品安全问题的主要根源。 1 9 9 8 年香港特区政府发布食品销售禁令，禁止销售内地猪肝、猪肺、猪肠，其原因就 是这些制品中含有过量的盐酸克仑特罗【9 】：2 0 0 1 年我国浙江、广东、陕西等省发生了 多起“瘦肉精”猪肉食物中毒i l 州。 1 1 2 兽药残留的危害 1 1 2 1 毒性作用 人长期摄入含兽药残留的动物性食品后，可造成药物蓄积，当达到一定浓度后， 就会对人体产生毒性作用。如磺胺药物可引起泌尿系统损害，特别是在体内形成的乙 酰化磺胺在酸性尿中溶解度很低，可在肾小管、肾盂、输尿管等出析出结晶，损害肾 脏。由于兽药残留浓度一般很低，加上人们食用数量有限，急性中毒事件的发生相对 很少，但少量药物如盐酸克伦特罗残留可引起人急性中毒。 1 1 2 2 过敏反应 过敏反应是一种急性反应。一些抗菌药物如青霉素、链霉素、磺胺类药物、四环 素及某些氨基糖苷类抗生素能使部分人发生过敏反应，过敏反应症状多种多样，轻者 表现为麻疹、发热、关节肿痛及蜂窝织炎等。严重时可出现过敏性休克危及生命，非 士一 塑 前 燮 1 前言 过敏体质者长期食用含以上残留食品者可产生菌株耐药作用。 1 1 2 3 细菌耐药性 经常食用低剂量药物残留的食品可使细菌产生耐药性。动物在经常反复摄入某一 种抗菌药物后，体内将有一部分敏感菌株逐渐产生耐药性，成为耐药菌株。这些耐药 菌株可通过动物性食品进入人体，当人产生这些耐药菌株引起的感染性疾病时，就会 给临床治疗带来一定的困难，甚至延误正常的治疗过程。1 9 9 7 年1 0 月w h o 在德国 召开了“首次抗生素应用于食品动物后对人类治疗影响”的国际研讨会，与会专家一 致认为食品动物长期低剂量使用抗生素会增加耐药菌，并且细菌的耐药基因可以在人 群中细菌、动物群中细菌和生态系统中细菌间互相传递，由此可导致致病菌( 沙门氏 菌、肠球菌、大肠杆菌等) 产生耐药性而引起人类和动物感染性治疗的失败【1 1 】。 1 1 2 4 致畸、致癌、致突变作用 药物及环境中的化学药品可引起基因突变或染色体畸变而造成对人体的潜在危 害。如苯并咪唑类抗蠕虫药，通过抑制细胞活性，可杀灭蠕虫及虫卵，有广泛的抗蠕 虫作用。然而，其抑制细胞活性的作用具有潜在的致突变性和致癌性。当人们长期食 用含三致作用药物残留的动物性食品时，这些残留物便会对人体产生有害作用，或在 人体中蓄积，最终产生致癌、致畸、致突变作用。兽药中的一些致畸物质在极低剂量 就具有效应，在胚胎发育的关键阶段甚至短暂接触致畸物质就有可能导致影响胎儿一 生的畸形。近年来人群中肿瘤发生率不断上升，人们怀疑与环境及动物性食品中药物 残留有关。雌激素、硝基呋哺类、砷制剂等都已被证明有致癌作用，许多国家已禁止 在食品动物饲养中使用这些药物。 1 1 2 5 激素作用 2 0 世纪7 0 年代以前，许多国家均将雌激素或同化激素用作畜、禽的促生长剂【1 2 ， 乃j 。但目前我国畜禽、水产养殖非法使用这类药的情况时有所闻，如果吃了含有这类 药物的产品，则可能干扰人的激素功能，影响生育能力，导致儿童的性早熟等【悼阍。 1 1 2 6 对环境的生态毒理性 由于药物具有生物效应，因此药物在环境中的含量及其对周围的生态环境、生物 具有潜在毒性，即生态毒理性。w o l l e n b e r g e r 等( 2 0 0 0 ) 1 7 】报道畜禽常用抗菌药甲硝 唑、喹乙醇、奈啶酸、土霉素和泰乐菌素对甲壳细水蚤的作用，测定了上述药物对其 的急性毒性和最大无作用浓度，发现喹乙醇对甲壳细水蚤的急性毒性最强。其作为渔 场的饲料添加剂，对水环境有潜在的不良作用，如阿维菌素类，在体内代谢较少，大 部分以原形从体内排出，进入环境后，仍具有杀虫活性，对土壤线虫、环境昆虫生态 均造成一定的影响。 1 1 3 控制动物源性食品中兽药残留措施 ( 1 ) 国家应加快兽药残留的立法，健全监控体系，饲养场应建立使用的兽药清单。 ( 2 ) 企业要大力发展绿色畜牧业，建立生物安全体系，通过检验或检查，使自己 天津科技大学硕士学位论文 确信进厂的肉品药物残留不超过最高限量，不含有禁用物质或制品。 ( 3 ) 开发新型兽药和饲料添加剂，寻找可以替代抗生素且无残留不产生抗药性的 制剂【1 8 - 2 1 1 。 1 2 磺胺类药物概述 1 2 1 磺胺类药物简介 1 9 3 2 年德国化学家k l a r e r 和m i e t z s c h 首先合成了含有磺胺基团的红色偶氮染料 百浪多息( p r o n t o s i l ) ，1 9 3 5 年德国的d o m g a k 报道了它对小白鼠溶血性链球菌感染 有很强的治疗作用，成为医学上应用磺胺类药物的开创者，并因此获得了诺贝尔医学 奖，当时亦有人证明它对人体的葡萄球菌感染有疗效，同年法国t r 6 f o u 芒l s ，n i t t i ，b e v e t 和f o u r n e a u 等人在研究这类偶氮化合物的抗菌作用时，发现有效的化合物都含有对氨 苯磺胺基团，随后英国学者c o l e b r o o k 和k a e n m y 等人在1 9 3 6 年证明了百浪多息中有 效的抗菌成分是对氨苯磺胺，以后由此衍生出一系列化合物，统称为磺胺类药物 ( s u l f o n a m i d e s ) 2 2 - 2 4 】。 磺胺类药物发展经历了6 0 多年的历史，先后合成这类药物约8 5 0 0 种，而临床上 常用的不过2 0 多种。虽然2 0 世纪4 0 年代后，各类抗生素的不断发现和发展，在临 床上逐渐取代了磺胺类药物，但磺胺类药物仍具有其独特的优点：抗菌谱较广、性质 稳定、使用方便、价格低廉、不消耗粮食、国内能大量生产等。特别是甲氧苄啶和二 甲氧苄啶等抗茵增效剂的发现，使磺胺药与抗茵增效剂联合使用后，抗菌谱扩大，抗 茵活性大大增强，从抑菌作用变为杀菌作用。因此，磺胺类药物至今仍为畜禽抗感染 治疗中的重要药物之一田j 。 磺胺类药物的基本结构为对氨苯磺酰胺，简称磺胺的衍生物，具有芳氨基和磺酰 胺基，多为两性化合物，药物具有一定酸性。理化性状一般为白色或淡黄色结晶性粉 末，难溶于水( 磺胺醋酰除外) ，较易溶于稀碱【2 5 】。图1 1 列出了常用的磺胺类药物 的化学结构式。 l 前言 4 i h 2 n 飘- l l f o n a m i d eb a c k bo n e r o i | 一h c c h 3 s u l f a n i l a m i d e ( s a n )s u l f a c e t a m i d e ( s a mo rs a t ) 磺胺磺胺醋酰 s u l f a t h i a z o l e ( s t z ) 磺胺噻唑 s u l f a m e t h o x a z o l e ( s m x ) 磺胺甲嗯唑 o l f c s u l f a b e n z a m i d e ( s b a ) 磺胺苯酰 s u l f i s o z o l e ( s i z e ) 磺胺异嗯唑 s u l f a t r o x a z o l e ( s t 磺胺曲沙唑 c h 3 s u l f a m e r a z i n e ( s m r ) 磺胺甲基嘧啶 4 r n h 2 s u l f a g u a n i d i n e ( s g ) 磺胺脒 s u l f i s o x a z o l e ( s i x ) 磺胺二甲基异噫唑 s u l f a d i a z i n e ( s d z ) 磺胺嘧啶 s u l f a m e t h a z i n e ( s m z ) o rs u l f a d i m i d i n e ( s d d ) 磺胺二甲嘧啶 一 ，l 一 磺胺索嘧啶 磺胺甲氧哒嗪 磺胺对甲氧嘧啶 s u i f a m o n o m e 廿l o x m e ( s m m x ) s u l f a d o x i n e ( s d ) s u l f a d i m e t h o x i n e ( s d m x ) 磺胺间甲氧嘧啶 磺胺多辛 磺胺地索辛 s u l f a p y r i d i n e ( s p ) 磺胺吡啶 s u l f a q u i n o x a l i n e ( s q ) 磺胺喹噫啉 s u lf a c h l o r o p y r a z i n e ( s c p a ) s u l f a p h e n a z o l e ( s p a ) 磺胺苯吡唑 彳s y 洲3 s u l f a m e t h i z o l e ( s m t ) 磺胺氯哒嗪 磺胺甲嗯唑 图1 1 磺胺类药物的分子结构 f i g 1 1s t r u c t u r e so fs u l f o n a m i d e s 1 2 2 磺胺类药物的抗菌作用机制 磺胺类药物的抗菌作用机制是磺胺药物中能分解出对氨基苯磺酰胺，其分子的查 小和形状与组成叶酸中的对氨基苯甲酸( p a b a ) 相近，化学性质也类似。由于细菌 1 前言 对二者缺乏选择性，大量的对氨基苯磺胺通过与对氨基苯甲酸竞争二氢叶酸合成酶， 妨碍敏感菌叶酸合成而发挥抑菌作用，从而可抑制大多数革兰氏阳性菌和某些阴性 菌。对磺胺药敏感的细菌不能直接利用外源性叶酸，在其生长繁殖过程中，必须利用 p a b a 、二氢喋啶，在二氢叶酸合成酶的催化下，合成二氢叶酸，再经二氢叶酸还原 酶的作用，形成四氢叶酸。四氢叶酸是形成嘌呤和嘧啶必需的一碳基团转移酶的辅酶， 嘌呤和嘧啶是合成核酸的必需原料，而核酸是细菌繁殖的物质基础。磺胺可与p a b a 竞争二氢叶酸合成酶，妨碍二氢叶酸合成；或者形成以对氨基苯磺酰胺代替p a b a 的 伪叶酸，最终使叶酸合成受阻，从而影响细菌的生长繁殖，产生抑菌作用。磺胺对已 合成的叶酸无影响，故作用发生较慢。能利用外源性叶酸的细菌，对磺胺药则不敏感。 畜禽细胞能直接利用叶酸，故不易受磺胺药阻断叶酸合成的危害。磺胺药只有在机体 防御机能健全的条件下，才能取得理想的抗感染效果。此外，由于p a b a 与二氢叶 酸合成酶的亲和力较磺胺药强，所以磺胺药的浓度必须大大高于p a b a ，才能有效抑 制细菌。脓液和坏死组织中含有大量的p a b a ，能减弱磺胺药的作用【2 5 2 7 】。 1 2 3 磺胺类药物在兽医临床上的应用 磺胺类药物对大多数革兰氏阳性和阴性细菌都有抑制作用，按对其敏感程度可分 为： ( 1 ) 高度敏感菌：链球菌、肺炎球菌、沙门氏菌、化脓棒状杆菌、大杨肝菌等； ( 2 ) 次敏感菌：葡萄球菌、变形杆菌、巴氏杆菌、产气荚膜梭菌、肺炎杆菌、炭 疽杆菌、马鼻疽杆菌、李氏杆菌等。 磺胺药对放线菌和衣原体( 如砂眼) 也有抑制作用；有些磺胺药对某些原虫也有 抑制作用，如磺胺喹嗯啉、磺胺二甲氧嘧啶用于球虫病；碘胺嘧啶、磺胺间甲氧嘧啶 用于弓形虫病等；但对螺旋体、结核杆菌、立克次氏体等完全无效。因此，磺胺类药 物被广泛应用于预防和治疗人类及动物的细菌性感染疾病【2 5 , 2 8 , 2 9 】。l o n g 等人【3 川研究 认为其可能具有促进生长作用，故在食源性动物的饲养中，磺胺类药物不仅作为兽药 被广泛用于兽医临床对细菌感染性疾病的防治，有时也被用作饲料添加剂或饮水剂， 以小剂量的方式，连续或间断式的通过饲料或饮水进入动物体内，主要用于防治动物 的细菌和球虫感染1 2 5 ，2 6 j 。 磺胺类药物根据其在兽医临床上的应用情况可分为三类： ( 1 ) 用于全身感染的磺胺药。本类药物口服后均可吸收，但其血药浓度持续时间 不同。按其消除半衰期可分为短效磺胺( 消除半衰期6h ) 、中效磺胺( 消除半衰期 1 2h ) 、长效磺胺( 消除半衰期超过2 4h ) 三类。目前应用较多的是磺胺嘧啶钠、磺 胺甲基嘧啶、磺胺二甲基嘧啶、磺胺二甲氧嘧啶等。磺胺嘧啶有较强的抑菌作用，用 于治疗敏感菌的全身感染，与血浆蛋白结合率低，故能进入脑脊液中达到较高的血药 浓度，对溶血性链球菌、肺炎双球菌、脑膜炎双球菌、沙门氏菌、大肠杆菌等的作用 较强，是脑部细菌感染的首选药品，也可应用于病毒性脑炎并发细菌感染。磺胺二甲 一一 天津科技大学硕士学位论文 嘧啶抗菌作用及疗效较磺胺嘧啶稍弱，但对球虫有抑制作用，用于巴氏杆菌病、乳腺 炎、子宫炎、呼吸道及消化道感染，亦用以防治兔禽球虫病和禽霍乱、伤寒、副伤寒 和传染性鼻炎。磺胺噻唑抗菌作用比磺胺嘧啶强，用于敏感菌所致的肺炎、出血性败 血病、子宫内膜炎及鸡霍乱、雏白痢等。磺胺甲基异噫唑( 新诺明) 抗菌谱与磺胺嘧 啶相近，但抗菌作用较强，主要用于呼吸道感染和泌尿道感染。磺胺间甲氧嘧啶( 制 菌磺、磺胺6 甲氧嘧啶) 是体内外抗菌作用最强的磺胺药，对球虫和弓形虫也有显著 作用，用于各种敏感菌所致的畜禽呼吸道、胃肠道、泌尿道等感染及球虫病等，对猪 弓形虫病、猪水肿病、家禽球虫病较为有效，对猪萎缩性鼻炎也有一定效果，其钠盐 水溶液局部灌注可治疗乳腺炎。磺胺对甲氧嘧啶( 磺胺5 甲氧嘧啶，消炎磺) 对革兰 氏阳性和阴性菌，如化脓性链球菌、沙门氏菌和肺炎杆菌等均有良好抗菌作用，对尿 路感染疗效显著，对生殖、呼吸系统及皮肤感染也有效，可添加于饲料内防治畜禽肠 道感染、球虫病及其他细菌性疾病。磺胺邻二甲氧嘧啶( 周效磺胺) 临床主要用于溶 血性链球菌、肺炎双球菌、脑膜炎双球菌、沙门氏菌、大肠杆菌等的感染性疾病，用 于轻度或中度的呼吸道、泌尿道感染，对鸡球虫病和猪弓形虫病也有疗效。 ( 2 ) 肠道磺胺药。本类药物口服后吸收很少，主要在肠道中起制菌作用。磺胺脒 ( 磺胺胍) 最早用于肠道感染的磺胺药，可用于肠炎和菌痢的防治。琥磺噻唑用于治 疗肠炎和菌痢，亦可预防肠道手术前后的感染。酞磺噻唑同琥磺噻唑，但抗菌作用比 琥磺噻唑强2 一倍。酞磺醋酰( 息拉米) 溶解度较大，可渗入肠粘膜内，对志贺氏菌 特别有效，用于肠道感染及防止肠道手术前后的细菌感染。 ( 3 ) 外用磺胺。磺胺醋酰钠用于结膜炎、角膜炎及其他眼部感染。磺胺嘧啶银( 烧 伤宁) 对所有致病菌和真菌包括绿脓杆菌、大肠杆菌等都有抑菌效果，并有收敛作用， 使创面干燥、结痂和早期愈合，用于预防烧伤后感染，对已发生的感染则疗效较差。 甲磺灭脓( 磺胺米隆) 对多种革兰氏阳性及阴性菌有效，对绿脓杆菌作用较强，且不 受对氨苯甲酸、脓液、坏死组织等影响，能迅速渗入创面及焦痂，适用于烧伤或大面 积创伤后的绿脓杆菌等感染【2 毛扎强j 。 球虫病是寄生于禽、畜肠或胆管上皮细胞内的一种原虫病，对雏鸡和仔兔的危害 性最为严重，造成巨大的经济损失。磺胺喹嗯啉为磺胺药中专供抗球虫病用的药物， 至今仍广泛应用，对鸡巨型艾美耳球虫、布氏艾美耳球虫和堆型艾美耳球虫作用最强， 主用于治疗鸡、火鸡球虫病，对家兔、羔羊、犊牛球虫病也有治疗效果。磺胺氯吡嗪 为磺胺类抗球虫药，国外多用于球虫暴发时治疗用，其作用特点与磺胺喹嗯啉相同， 但具有更强的抗菌作用，因此对鸡霍乱、伤寒亦有一定疗效，对鸡球虫病有明显治疗 作用【2 5 1 。 磺胺类药物对水产养殖中的细菌性竖鳞病、烂鳃病、弧菌病、疥疮、赤鳍病、肠 炎、鞭毛虫病有良好的防治效果，已在水产养殖中广泛应用。磺胺甲基嘧啶钠为中效 磺胺药，抗菌作用极强，但毒副作用大，血浓度维持时间短，吸收快，排泄慢，少量 用药即能维持其血浓度，用于虹鳟、香鱼的鞭毛虫病、鱼类弧菌病、点状气单孢菌引 1 前言 起的肠炎、疖疮、打印病等。磺胺2 ，6 - - - 甲氧嘧啶及其钠盐为长效磺胺药物，对革 兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌有显著的抑制作用，治疗球虫病也有很好的效果，可用于 防治烂腮病、白皮病、赤皮病、白头白嘴病、竖鳞病、疖疮病等。磺胺6 甲氧嘧啶及 其钠盐( 制菌磺) 是磺胺类中最强的一种抗菌药，可治疗烂腮病、疖疮病、白皮病、 白头白嘴病等，还可防治鳗鲡赤鳍病和弧菌病【3 3 1 。 1 2 4 磺胺类药物的毒性作用 磺胺类药物应用较广，具有一定疗效的就有几十种。通过任何途径摄入都会在人 体内蓄积，这类药物具有显著的毒性副作用。据估计大约有5 接受磺胺类药物治疗 的病人会产生副作用 3 4 , 3 5 】。近年来，磺胺类药物在动物性食品中的残留超标现象相当 严重，食用磺胺类药物残留超过限量的动物性食品，对人可产生各种毒性作用，甚至 造成器质性损伤，也可引发过敏反应【3 6 】。 1 2 4 1 损害泌尿系统 ( 1 ) 磺胺结晶导致肾损伤：磺胺主要由肾脏经肾小球过滤而排出，如尿中浓度过 高，p h 值呈酸性( 5 5 ) ，尿量又少则形成结晶，而产生局部刺激和梗塞性损害。临 床上出现血尿，尿中可检出磺胺结晶，肾绞痛，少尿或无尿，严重时可发生急性肾功 能衰竭，此类型常见于溶解度较低的磺胺噻唑、磺胺嘧啶等药物。 ( 2 ) 过敏性肾损伤：由于磺胺药与血浆蛋白结合而引起半抗原作用，引起过敏反 应，主要引起间质性肾炎，偶有引发肾病综合症者。临床上多有发热、皮疹、蛋白尿、 镜下血尿、高血压、水肿、血中嗜酸、细胞增多、尿中有嗜酸细胞或管型。 ( 3 ) 血红蛋白尿导致肾损伤：磺胺类药物可引起溶血贫血，主要见于先天性6 磷 酸葡萄糖脱氢酶缺乏的患者，尤其是新生儿和小儿多见，服药后可发生血红蛋白尿， 血红蛋白可直接损伤肾小管上皮细胞或由于血红蛋白管型阻塞管腔致损害，重者致急 性肾功能衰竭p 。 1 2 4 2 过敏反应 磺胺类药物具有抗原性，刺激机体内抗体的形成，造成过敏反应。磺胺药引起过 敏反应比较常见，经常食用含低剂量磺胺类药物的食品能使易感的个体出现过敏反 应，尤以长效磺胺多见。过敏反应在多发生服药后5 1 0 天，主要表现为皮疹、光敏 性皮炎、药热及血清病样反应等症状，一旦发生剥脱性皮炎、结节性多发性动脉炎及 多形性红斑，可因多器官衰竭而死亡【3 6 3 引。 1 2 4 3 抑制造血系统 长期摄入含磺胺药的动物性食品，可抑制骨髓的白细胞生长，引起白细胞减少症， 粒细胞减少症、血小板减少症、再生障碍性贫血、溶血性贫血等1 3 们。 1 2 4 4 导致细菌产生抗药性 细菌对磺胺类药物易产生耐药性，尤以葡萄球菌最易产生，大肠杆菌，链球菌等 次之。产生的原因可能是细菌改变了代谢途径，如产生了较多的p a b a ，或二氢叶酸 天津科技大学硕士学位论文 合成酶结构改变，或者直接利用外源性叶酸。各磺胺药之间可产生程度不同的交叉耐 药性，但与其他抗菌药之间无交叉耐药现象。所以人食用污染的动物性食品后，人体 对其有高度敏感性，并且因耐药菌株的出现，从而失去了治疗人类疾病的价值【3 9 4 0 1 。 1 2 4 5 磺胺类药物毒副作用的临床报道 张青等人【4 l 】报道磺胺甲基异嗯唑可致角膜上皮剥脱。复方磺胺甲嗯唑可致严重 1 ：3 、鼻变态反应【4 2 】。王佩珠等人报道口服复方磺胺甲嗯唑出现喉水肿、双眼后葡萄膜 炎、急性播散性脑脊髓炎、过敏性休克、会阴部过敏、急性过敏性结膜炎等不良反应 【4 3 】。有资料表明，磺胺二甲嘧啶等一些磺胺类药物在连续给药中能够诱发啮齿动物甲 状腺增生及甲状腺滤细胞腺癌，具有潜在的致癌性4 5 1 。实验发现，在胎儿器官形成 期和哺乳期接触磺胺二甲嘧啶使子代大鼠呈现先天性甲状腺功能低下的表现，即体重 降低，神经系统发育滞后，同时学习记忆功能减退1 4 6 】。 1 2 5 磺胺类药物对食品的污染及残留限量 1 2 5 1 磺胺类药物对食品的污染 使用过磺胺类药物的动物，如果不遵守适当的休药期，其肌肉组织、蛋和奶中就 会被残留的磺胺类药物污染【4 7 柳】。动物使用了磺胺药后，磺胺类药物大部分以原形从 体内排出，当动物接触排泄在垫草、污水、粪土中低浓度的磺胺类药物后，可导致动 物再污染，引起动物体内磺胺类药物残留。通过不同给药途径进入动物体内的各种磺 胺类药物，经过机体的吸收、分布和代谢转化，在一定时间内，大部分以原形的形式 随粪便、尿液等排出体外，还有一部分以原形或降解产物的形式残留于肉、蛋和奶中。 短期大剂量或长期小剂量给药，很容易造成磺胺类药物在动物各组织中蓄积。当饲料 或饮水被磺胺类药物污染后，也可导致动物性食品中磺胺类药物残留量严重超标【) 6 j 。 因不同磺胺药物的药物代谢动力学以及给药方式和剂型的不同，药物在不同组织中的 浓度差异较大，一般来说磺胺药在代谢器官和血液中浓度最高，脂肪和肌肉中的含量 较低，乳中的残留量与血清中的相似【5 0 】，药物残留还可沉积于鸡蛋内【5 1 1 。磺胺类药物 残留问题的出现已有近3 0 年时间，并且在近1 5 2 0 年内磺胺类药物残留超标现象比其 他任何兽药残留都严重。很多研究表明猪肉及其制品中磺胺药物超标现象时有发生， 其残留主要发生在猪肉中，其次是小牛肉和禽肉中的残留。特别是致癌性的磺胺二甲 基嘧啶残留给人类的健康带来了威胁。另外，磺胺类药物和一些抗菌增效剂合用后形 成的增效磺胺，使用后在动物组织中的残留量比相应的磺胺药大，降低了动物性食品 的安全性【5 2 , 3 6 。侯为道等【5 3 】考察了成都地区动物性食品中兽药残留水平，发现兽药污 染问题较为严重，尤以四环素类、磺胺类药物残留水平较高，磺胺二甲嘧啶、磺胺喹 嗯啉阳性检出率分别高达2 2 1 2 和2 0 3 5 ，阳性超标率分别为4 4 0 0 和3 4 7 8 。 1 2 5 2 动物源性食品中磺胺类药物的最高残留限量 长期食用有这些药物残留的动物性食品可能有害健康，引起慢性中毒。因此，各 国政府对磺胺类药物在动物性食品中使用严格规定了最高残留限量( m a x i m u mr e s i d u e 1 前言 l i m i t ，m r l ) 。英、美等【5 2 ，5 4 】国家对磺胺类药物在肉类食品中的允许残留量限制为 1 0 0g g k g ，乳品为0 - - - 1 0 0 “g k g ，三甲氧苄氨嘧啶和二甲氧甲基苄氨嘧啶在乳品中的 允许残留量为1 0 0p g k g 。欧盟第6 7 5 9 2 号令【5 2 ，5 4 】中规定了，在肉类及牛奶中磺胺的 最大残留总量不得超过1 0 0 “g k g ，在肾脏、肝脏及鸡蛋中分别不得超过6 0 0 , g k g ， 3 0 0 , g k g 和2 0 0 , g k g 。我国1 9 9 4 年农业部发布动物性食品中兽药的最高残留量( 试 行) 1 5 2 , 5 4 1 中规定：磺胺类总计在牛、羊山羊、猪、家禽肝、肾和脂肪中m r l 为3 0 0 p g k g ，牛、羊、猪肌肉中为3 0 0i _ t g k g ，牛、羊乳中为5 0 “g k g ；磺胺二甲嘧啶在牛、 羊山羊、猪、家禽肌肉中m r l 为1 0 0 , g k g ，肝、肾和脂肪中为1 0 0p g k g ，牛和羊 乳中为2 5p g k g 。日本要求的最高残留限量m 】分别为：磺胺甲基嘧啶2 0p g k g ；磺胺 二甲嘧啶1 0g g k g ；磺胺一6 一甲氧嘧啶3 0g g k g ；磺胺二甲氧嘧啶4 0i _ t g k g ；磺胺间甲 氧嘧啶3 0g g k g ；磺胺嚼喹酸5 0g g k g ；磺胺乙胺嘧啶5 0p g k g ；磺胺间二甲氧嘧啶 在牛肉、猪肉、鸡肉、鳗鱼中不得检出；磺胺二甲嘧啶在牛肉、猪肉中不得检出；磺 胺喹嗯啉在鸡肉中不得检出，并且具有逐步严格控制的发展趋势。 根据农业部无公害食品行动计划和动物源性食品药物残留监控计划的有关部署， 从2 0 0 5 年起，农业部将把畜产品中磺胺类药物的残留情况作为继盐酸克伦特罗( 瘦肉 精) 之后的又一个重点予以监控。为此，将相应的增加检测数量和畜产品的检测种类， 同时对检测出的阳性样品将全部进行跟踪处理。 1 2 6 磺胺类药物的常用分析方法简介 目前，针对磺胺类兽药残留的检测方法有微生物抑菌法、薄层色谱法( t l c ) 、 高效液相色谱法( h p l c ) 、气相色谱法( g c ) 、酶联免疫吸附法( e l i s a ) 和毛细管