（微生物学专业论文）巴西固氮螺菌与吲哚乙酸（iaa）合成有关基因的克隆及功能分析.pdf

摘要 巴西固氨螺菌( a z o s p i r i l l u mb r a s i l e n s e ) 是一种能够促进草类和谷物生长的，具有固氮能力 的根际促生长细菌。a b r a s i l e n s ey u 6 2 从北京郊区的玉米根际分离获得，在添加了色氨酸的培养 基中能够合成超过5 0 m , n a 的吲哚3 一乙酸( 1 a a ) 。为了更清楚的了解d b r a s i l e n s e 产i a a 的合成 机理，我们通过t n 5 转座子诱变的方法获得t s , o o o 多株具有卡那抗性的接合突变株，将这5 。0 0 0 多株突变株分别接种在m a z 培养基中摇瓶培养，用比色法和h p l c 方法测定菌液中的i a a 含 量，得到了5 个i a a 产量降低的突变株。以转座子内的l x a b 基因为探针进行s o u t h e r n 杂交，结 果每个突变株都只有一条杂交带，证明这5 个突变株都是t n 5 单拷贝插入的突变体 测序及同源性比较表明，在这5 个i a a 产量降低的突变株中，被插入失活的基因分别为编码 g n t r 家族的转录调节因子的a t r a 基因、编码a b c 型f 一转移系统中的离子结合蛋白的丘叫基 因、编码外膜蛋白的o m a ：l 基因，编码醛脱氢酶的a l d a 基因及编码邻氨基苯甲酸合成酶组分i 的 t r p e 基因。互补实验表明携带a t r a 、且叫和o m a a 基因的广宿主载体可以不同程度的恢复相应突 变株的i a a 产量。另外还克隆了a t r a 下游的a t r b 和a t r c 基因，它们分别编码磷酸转移酶和氨基 转移酶a t r a 、a r t b 和a r t c 共同组成了一个基因簇，推测此基因簇参与催化吲哚丙酮酸途径中 由色氨酸脱氨基生成吲哚丙酮酸的酶促反应。 通过同源重组的方法分别获得了a r t b 和a r t c 基因的卡那霉素抗性基因插入突变株，分析突 变株的i a a 产量发现，a t r b 基因失活后，1 a a 产量不变；当a t r c 基因失活后，i a a 产量比a t r a 基因突变株的产量还要低。此结果表明，a t r c 基因参与了i a a 合成。用原子吸收测定f 叫突变 体和野生型培养液中的铁离子浓度表明，加d 基因的编码产物与铁离子转运相关，同时表明f c ” 对i a a 的合成有较大影响。通过测定o m a a 突变体和野生型胞内的i a a 浓度，发现突变株的胞 内i a a 含量与野生型菌株胞内的i a a 含量无显著差别，此结果表明，o m a a 基因对i a a 产量的 影响可能并非是因为破坏了i a a 的分泌通道。a p e 基因的突变导致了1 a a 产量的下降，并且可 以通过在培养基中添加邻氨基苯甲酸恢复。与w b r a s i l e n s es p 7 不同，y u 6 2 中的t r p e 基因无形 成色氨酸衰减子的前导序列，且不与t r p g 基因融台，推测在d b r a s i l e n s e 中可能存在两个拷贝的 t r p e 基因。 通过p c r 扩增的方法克隆了爿b r a s i l e n s ey u 6 2 编码吲哚丙酮酸脱羧酶( i p d c ) 的i p d c 基 因，并将其克隆在广宿主载体p 1 a f r 3 上，获得了咖d c 多拷贝的菌株。比较野生型及多拷贝菌 株的i a a 产量，二者没有明显差别。 关键词：吲哚3 ，乙酸( i 从) 合成，i a a 突变株， 巴西固氮螺菌，t n 5 a b s t r a c t a z o s p i r i l l u mb r a s i l e n s ei san i t r o g e n - f i x i n gm i c r o o r g a n i s mt h a th a sap o t e n t i a lu s ea sa ni n o c u l a n t f o rp r o m o t i n gp l a n tg r o w t hi ng r a s sa n dc e r e a l s a b r a s i l e n s ey u 6 2w h i c hw a si s o l a t e df r o mt h e r h i z o s p h e r eo fm a i z ei nb e i j i n g , c h i n a ，i sa b l et op r o d u c em o r et h a n5 印咖li a ai n t ot h em e d i u m s u p p l e m e n t e dw i t he x o g e n o u s1 碲t ob r i n g e l l o r ei n f o r m a t i o na b o u ts y n t h e s i sa n dr e g u l a t i o no f i n d o l e 一3 一a c e t i ca c i d ( t a a ) f i o ma b r a s i l e n s e at n 5 - i n s e r t i o nl i b r a r yo fa b r a s i l e n s ey n 6 2w a s c o n s t r u c t e da n ds u b j e c t e dt o s c r e e n i n g f o ri a ap r o d u c i n gm u t a n t s m o r et h a n5 , 0 0 0k m 。 t r a n s c o n j u g a n t so b t a i n e dw e l cs c r e e n e df o rm u t a n t so fi a ap r o d u c t i o n 5m u t a n t ss h o w i n gd e c r e a s e d i a ap r o d u c t i o nw e i es e l e c t e db ye o l o r i m e t d ca s s a y sa n di - w l cm e t h o d s o u t h e r nb l o ta n a l y s i sw i t h t n 5f r a g m e n ta sap r o b es h o w e dt h a te a c hm u t a n tc o n t a i n e do n l yo n eh y b r i d i z i n gb a n d ，w h i c hs u g g e s t s t h e ya r e 枷s i n g l et r a n s p o s o ni n s e r t i o nm u t a n t s t h ef i v et n s - i n s e r t e dg e n e sf r o mt h e s em u t a n t sw e l a gd o n e da n dt h ed n as e q u e n c e sf l a n k i n gt n 5 w e r ed e t e r m i n e d t h e s eg e n e si n c l u d ea t r ae n c o d i n gg n t r - f a m i l yt r a n s c r i p t i o n a l r e g u l a t o r , 丘叫 e n c o d i n gi r o nb i n d i n gp r o t e i nc o m p o n e n to fa b e t y p ef e 3 + t r a n s p o r ts y s t e m ，o m a ae n c o d i n go u t e r m e m b r a n ep r o t e i n ，a l d ae n c o d i n ga l d e h y d ed e h y d r o g e n a s ea n dt r p ee n c o d i n ga n t h r a n i l a t es y n t h a s e c o m p o n e n ti c o m p l e m e n t a t i o nt e s t ss h o w e dt h a ta t r a , j 醐a n do m u dw e r ea b l et or e s t o l et h el 诅 p r o d u c t i o no ft h e i rm u t a n t s ，r e s p e c t i v e l y a tt h es a m et i m e ，a t r be n c o d i n gp h o s p b o t r a n s f c r a s ea n da t r c e n c o d i n g4 - a m i n o b u t y r a t ea m i n o t r a n s f e r a s ew e r ec l o n e d ，a n da t r a ，a r t ba n da r t cw e r ec l u s t e r e di na c l u s t e r a t r ba n da t r cm u t a n t sw e r ec o n s t r u c t e db yi n s e r t i o no fi r ac a s s e f i e s ，r e s p e c t i v e l y t h er e s u l t s s h o w e dt h a tt h ei a al e v e ls e c r e t e db ya t r cm n t a n tw e r ed e c r e a s e dw h e nc o m p a r e dt ot h a to fw i l dt y p e s t r a i n ，w h i l et h ea m o u n to fi a ap r o d u c e db ya t r bm u t a n tw a ss a m ea st h a to ft h ew i l dt y p es t r a i n t h e d a t as u g g e s tt h a ta t r ci nt h ea t r a b cc l u s t e rw a si n v o l v e di ni a as y n t h e s i s c o m p a r i s o no fi c e ” c o n c e n t r a t i o n si nc u l t u r es u p e m a t a n t so ft h ew i l d - t y p es t r a i n ，t h e 矗叫m u t a n ta n dt h ec o m p l e m e n t e d s t r a i nr e v e a l e dt h a tt h ei r o n u l 】t a k ea b i l i t yo ft h e f t 叫m u t a n tw a su i g m yr e d u c e d t h i sr e s u l ta l s op o i n t s t ot h en e c e s s i t yo fi r o na s am e t a li o ni ni a as y n t h e s i s s t a t i s t i c a la n a l y s i ss h o w e dn os i g n i f i c a n t d i f f e r e n c ei nt h el 从a c c u m u l a t e di nc e l l sb e t w e e nt h eo r a a am u t a n ta n dt h ew i l d - t y p es t r a i n ， s u g g e s t i n gt h eo m a ar m # tn o ta f f e c ti a as e c r e t i o nb u ti n v o l v ei ni a ap r o d u c t i o ni no t h e ru l l l q m w n m a n n e r s m u t a t i o no fr r p eg e n el e dt od e c r e a s e di a ap i o t l l l c t i o na n dt h e1 a ap r o d u c t i o nc o u l db e r e s t o r e db ya d d i n ga n t h r a n i l a t ei n t ot h em e d i u m d i f f e r e n tw i t ha b r a s i l e n ss p 7 ，t h et r p ei sn o tf u s e d t o g e t h e rw i t ht r p ga n dn ot r p lw a sf o u n du p s t r e a mt h et r p es e q u e n c ei ny u 6 2 i ts u g g e s t st h a tt h e r e m a yb et w oc o p i e so ft r p eg e n e se x i s ti n a b r a s i l e n s e t h ee 田cg e n e ，e n c o d i n gl p y ad e c a r b o x y l a s eo p d c ) o f t h el p y a p a t h w a y , w a sc l o n e db yp c r a n dc l o n e di n t ot h eb r o a d - h o s t - r a n g ev e c t o rp l a f r 3 ，t h e nt h e 枷把m u l t i - c o p ys t r a i no f a b r a s i l e n s e y u 6 2w a so b t a i n e d c o m p a r i s o no ft h ei a ap r o d u c t i o nb e t w e e nw i l dt y p ea n d p a cm u l t i c o p ys t r a i n s h o w e dt h a tn oo b v i o u sd i f f e r e n c ew a se x i s t e d k e y w o r d s ：i n d o l e - 3 a c e t i ca c i d ( t a a ) s y n t h e s i s ；i a am u t a n t s ；a z o s p i r i l l u mb r a s i l e n s e ；t n 5 h 缩略词 吲哚一3 一乙酸 吲哚一3 一乙酰胺 吲哚丙酮酸脱羧酶 吲哚丙酮酸 吲哚一3 一乙醛 色胺 色氨酸侧链氧化酶 吲哚一3 一乙腈 色氨酸 邻氨基苯甲酸 邻氨基苯甲酸合成酶组分i 主要外膜蛋白 地高辛 高压液相色谱 根际促生长细菌 读码框 卡那霉素 氨苄青霉素 四环素 萘啶酮酸 v m 圳 眦 蹦 眦 圳 啪 哪 眦 m 脚 啪 眦 嗍 啉 如 k 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成 果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发 表或撰写过的研究成果，也不包含为获得中国农业大学或其它教育机构的学位或证书 而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明 确的说明并表示了谢意。 研究生签名时间：年月日 关于论文使用授权的说明 本人完全了解中国农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留 送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复 制手段保存、汇编学位论文。同意中国农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、 传播学位论文的全部或部分内容。 像密的学位论文在解密后应遵守此协议) 一龆私魁帆小船 名：辨 帆年月r 拍 中国农业大学博士学位论文 第一章绪论 1 1植物根际细菌产吲哚3 乙酸( i a a ) 研究进展 早在1 7 5 8 年，人们在植物环割试验中，观察到在切口上部，经细胞分裂，会逐渐膨大长出 愈伤组织，进而又逐渐长出根来据此推测在植物体中一定存在某种可促进形成各种器官的化学 信使。到1 8 7 0 年，人们在植物根的向地性弯曲中观察到，当根置于水平方向时，园重力影响而 产生向地性弯曲生长，弯曲的部位是伸长区，而对重力感受的部位却是在根尖。因此，就提出可 能有一种从根尖向伸长区传导的化学物质，由于化学物质运输方向不对称，使根的伸长区上下两 侧发生不均匀生长而弯曲。1 8 8 0 年达尔文父子在研究植物向光性运动时，发现植物幼苗暴露在 单侧光下时，植物感光部位在茎尖，而向光弯曲部位在伸长区。他们也提出，可能有某种化学物 质在单侧光的影响下，从幼苗尖端不均匀的传递下去，从而使下部伸长区发生向光弯曲。随着科 学技术的发展，物理化学分析仪器的不断问世，在达尔文父子观察的基础上，经过一系列实验， 到1 9 3 4 年发现了第一类植物激紊一吲哚3 乙酸( i a a ) 。 h n - ) c 峄0 0 h 洲2 c o o h 1 a at n d o l ea c e t i ca d dn a a n a i p h t h a i e r * 自 c i j 3 ) c h 声。h c l t 2 c 叱 2 ，4 一d2 j 4i b a | n d o l eb u l y r i ca c i d d i c h i o r o p h e n o x y a c e t i ca c i d 2 c c 2 c o o k + k 1 b ap o t a s s i u m s a l t o li n d o l e b u t y r i c a c i d 圈1 - 1 一些天然的和台成的生长素 f i g 1 - 1 s o m en a t u r a la n d 踟山c t i ca u x i n s 中国农业大学博士学位论文 绪论 植物激素为一类在极低浓度时就可以影响植物生理过程的有机物质。因为植物激素的浓度对 植物的生长至关重要，其浓度的极小变化就可以导致植物生长发育的明显差异。近几十年来越来 越多的实验证据证明，植物根际细菌合成并分泌植物激素，对植物的生长和发育起着重要的作用。 1 9 7 9 年，科学家提 幽z o s p i r i l l u mb r a s i l e n s e 可以合成生长素i a a ( t i e n e t 以1 9 7 9 ) ( 图1 1 为几 种常见的植物生长素) ，因为接种，哇b r a s i l e n s e 促进植物根毛和侧根形成实验可以用添加生长素 来模拟。此后的研究又发现，l a a 的合成能力广泛存在于土壤细菌及与植物相作用的细菌中，超 过8 0 的分离自植物根际的细菌可以合成i a a ( p a t t e na n dg f i c k1 9 9 6 ) ，如a g r o b a c t e r i u m r u m e 盘c i e r ，a g r o b a c t e r i u mr h 瑟o g e n e s ，e r w i n i ah e r b i c o l a ，和p s e u d o m o n a ss y r i n g a e 的两个致病 亚种( s a v a s t a n o i 和s y r i n g a e ) 等植物病源菌，另如包括a z o s p i r i l l u m ，p s e u d o m o n a s ， x a n t h o m o n a $ r h i z o b i u m 等苗属以及a l c a l i g e n e s 扣e c a l i o ，e n t e r o b a c t e rc l o a c a e ，a c e t o b a c t e r d i a z o t r o p h i c u s 和b r a d y r h i z o b i u m j a p o n i c u m 等在内的根际促生长细菌( p g p r ) 。在这些产i a a 的 细菌中，存在着不止一条的l a a 合成途径，以l a a 合成的中闻体命名，可分为吲哚乙酰胺途径、 吲哚丙酮酸途径、色氨酸侧链途径、色胺途径和吲哚乙膊途径等5 种1 a a 的生物合成途径，而且 在一种细菌中可能存在着不止一条的i a a 合成途径。 1 1 1细菌合成i a a 的生物途径 1 1 1 1 吲哚乙酰胺途径 在此途径种，i a a 合成前体色氨酸首先被色氨酸单加氧酶转化为吲哚一3 - 乙酰胺，而后吲哚 乙酰胺水锯酶将哼l 噪乙酰胺转化为1 a a ( 圈1 - 2 ) 。 2 t u d z l c - 3 - 嘲k 诋d 旺 m 固1 - 2 由吲哚乙酰胺逢径c a - b ) ，吲绛丙酮酸造径( e - f - d ) 和色氨酸倒链途径( c - d ) 台成l a a f i g 1 - 2 p m h w a y si nt h eb a c t e r i a lb i o s y n t h e s i so fi a d o l e 3 a c e t i c ( i m ) ：i a d o l e - 3 一a c e t a m i d ep a l h w a y ( a - b i n d o l e - 3 - p y r u v i ca c i dp a t h w a y ( e - f - d ) ，a n dt r y p t o p h t ns i d ec h a i no x i d a s cp a t h w a y ( c 。d ) 中国农业大学博士学位论文绪论 a t r y p t o p h a nm o n o o x y g e n a s e ；b ，i n d o l e a c e l a m i d e i n d o l e - 3 - a c e t a l d e h y d eo x i d c ；e 。i r y p t o p h a nt r a n s f c r a s e ； h y d r o l a s e ；c ，t r y p t o p h a n s i d ec h a i n j d a ：d f ，i n d o l c - 3 p y r u v a t ed c f b o x y l a ” 几十年以前科学家就发现，一些与植物相作用的细菌分泌的i a a 增加的话，会诱导植物体 上长出一些瘤状的突起。如p s e u d o m o n a ss y r i n g a ep v s a v a s t a n o i ，可以侵入到夹竹桃、橄榄和女 贞等植物的组织中，利用包括色氨酸在内的植物组织的营养成分，合成并分泌具有生物活性的化 合物如i a a ，从而诱导植物组织增生( m a r l o w ea n dk o s u g e1 9 7 2 ) 。分离自夹竹桃的rs y r m g a ep v s a v a s t a n o i 细胞内有一个5 2 k b 的质粒，此质粒对细菌i a a 的合成和宿主植物菌瘿的形成都是必 需的( c o m a ia n dk o s u g c1 9 8 0 ) 。k u o 和k o s u g e 等( 1 9 7 0 ) 通过前体色氨酸放射性标记的方法 发现只s y r i n g a ep v s a v a s t a n o i 主要通过吲哚乙酰胺途径合成i a a 。通过限制性酶切5 2 k b 质粒并 转入大肠杆菌中表达，用s a l k o w s k i 比色、薄层层折( t l c ) 和色氨酸单加氧酶酶活测定等方法 获得了产吲哚乙酰胺的克隆，从此克隆中分离得到了色氨酸单加氧酶基因( i a a m ) ( c o m a ia n d k o s u g e1 9 8 2 ) 。纯化的色氨酸单加氧酶不太稳定，分子量6 2 k d a ，包含一个具有催化活性的黄素 腺嘌呤二核苷酸( f a d ) 作为辅酶( h u t c h e s o na n dk o s u g e1 9 8 5 ) ，其底物特异性不强，除催化色 氨酸氧化脱羧为吲哚乙酰胺外，还可以以一些毒性的甲基化或卤代的色氨酸化合物为底物，因此 产i a a 的菌株通常对这些有毒性的色氨酸结构类似物具有抗性，而不产i a a 的菌株则对这些结 构类似物敏感0 r a m a d ae ta 1 1 9 8 5 ) 。将转座因子插入到i a a m 中发现不仅色氨酸单加氧酶活性缺 失，而且吲哚乙酰胺水解酶活性也同时失去，d n a 分析发现缸n 肼基因和编码吲哚乙酰胺水解酶 的i a a h 基因是共转录的，启动予位于i a a m 的上游( c o m a ia n dk o s u g e1 9 8 3 ) 。i a a m 启动子- l a c z 的融合表达表明ps y r i n g a ep v s a v a s t a n o i 的i a a 合成为依赖于外源色氨酸前体的组成型表达 ( g a f f n e ye t 以1 9 9 0 ) ( 图1 3 ) ，但由于色氨酸单加氧酶的k m 值较高，当色氨酸水平有限时，色 氨酸通常被优先用于蛋白质合成( g a f f a e ye t 以1 9 9 0 ) 。 a g r o b a c t e r i u mt u r n e r a c i e n s 能引起许多双子叶植物冠瘿病( 亦称根癌病) 害，其致病原因是由 于细菌染色体外的遗传物质，即t i 质粒中的一个片段转移到植物细胞并整合到植物染色体组中， 并可稳定存在( 图1 _ 4 ) 。致病基因随着染色体的复制而表达。所转移和整合的d n a ( t - d n a ) ， 含有编码合成两种植物激素一一生长素和细胞分裂紊，以及一类群氨基酸衍生物一一冠瘿碱 ( 0 p i n e ) 的基因。植物激素i a a 合成相关的基因稳定地整合到宿主植物的基因组上表达。导致了 植物肿瘤的发生( l i u e la l1 9 8 2 ) 。t - d n a 诱交实验表明两个基因( t m s - 1 和t i n s - 2 ) 参与了i a a 的 合成( i n z ee ta 1 1 9 8 4 ；k l e ee t 以1 9 8 4 ；s c h r o d e re ta 1 1 9 8 4 ) ，t i n s - 2 基因在大肠杆菌中过量表达得 到了一个4 9 k d 的蛋白，此蛋白可以转化吲哚3 - 乙酰胺为i a a ( t h o m a s h o w e t a l1 9 8 4 ；s c h r o d e r e ta 1 1 9 8 4 ) 。而且只有感染冠嫠病的宿主细胞可以水解吲哚乙酰胺为i a a ，而没有感染的细胞则 没有这种能力( s c h r o d e r e t a l1 9 8 0 。由此确定觚s 2 的作用为编码吲哚乙酰胺水解酶。为了研究 t i n s - 1 在i a a 合成中的作用，构建了由栅c 启动子控制的棚s j 和l a c z 基因融合的表达载体， 此载体转入大肠杆菌中表达后，将无细胞的提取物与色氨酸i “q 共同培养，可以将色氨酸【“q 转 化为吲哚3 一乙酰胺，将此产物加入到t i n s 2 在大肠杆菌中的表达的无细胞提取物中，吲哚一3 - 乙酰 胺被转化为i a a 。通过生化分析，v a no n c k e l e n 等( 1 9 8 6 ) 确定t i n s - 1 为编码色氨酸单加氧酶的 基因，催化色氨酸合成吲哚乙酰胺，而后由t i n s - 2 编码的吲哚乙酰胺水解酶将吲哚乙酰胺转化为 3 中国农业大学博士学位论文 绪论 认a 。 n ：i： p i t i $ i i nl i e nt p i l l t $ ml - i i p s a v , 9 0 3 p s _ v ，啦 - t 槲一叶i m m 雌- 棚 ，_ - l 一l ，枷 睢w 鞠h 棚m 埘 3 9 0 7 5 t 5 0 1 0i o 2 01 5 m 图1 - 3 妇口操纵子结构( a ) 与曲州启动子1 a c z 的融台表达 f i i - 3 f r a m e o f i a a o p e r o n a n de x p r e s s i o n o f i a a m p r o m o t e r - a c z 只s y r i n g a e p v s a v a s t a n o i 的i a a m 基因与a t u m e f a c i e n s 的t m s j 基因具有5 4 的同源性， 而a a h 基因和t m s - 2 基因的同源性为3 8 ( k l e e 酣a 1 1 9 8 4 ；g i e l e ne ta 1 1 9 8 4 ；y a m a d ae t 以 1 9 8 5 ；f o l l i n e t a l 1 9 8 5 ) 。i a a m 的读码框编码一个5 5 7 个氨基酸构成的蛋白，分子量为6 1 ，7 8 3 d a ， 这和在s d s - 聚丙烯酰胺纯化得到的估计分子囊为6 2 ，0 0 0 d a 的色氨酸单加氧酶酶一致 ( h u t c h e s o na n dk o s u g e1 9 8 5 ) 。舰l - j 读码框编码一个7 5 5 个氨基酸的蛋白，分子量为8 3 , 7 6 9 d a ( k l e ee t a l 1 9 8 4 ) 。t m s - 1 读码框比i a a m 读码框长，可能反应了植物基因组功能的需要。i a a h 的读码框编码4 5 5 个氨基酸的蛋白，分子量为4 8 ，5 1 5 d a ；觚s 2 的读码框编码4 7 3 个氨基酸的蛋 自，分子量为4 9 , 5 8 8 d a ( y a m a d a 甜a l1 9 8 5 ) 对t m s j 和i a a m 所编码的蛋白质序列做比对分析 发现，t m s j 所编码的的蛋白的2 3 9 - 2 6 4 位氨基酸和m a m 所编码的蛋白的4 2 6 6 位氨基酸与 p s e u d o m o n a s 皿w c 的对羟基苯甲酸羟化酶上的2 4 个氨基酸高度同源，只f l , o r e s c e l 口的这 一段序列此前已鉴定为f a d 中腺嘌岭的结合位点( k l e ee t a l 1 9 8 4 ) ，因此y a m a d a 等提出w a s - i 和i a a m 所编码蛋白上包含f a d 辅酶的结合位点这与h u t c h e s o n 和k o s u g , - ( 1 9 8 5 ) 用吸收光谱 和荧光发射分析已纯化的p s y r i n g a e p v 衄n 讲的色氨酸单加氧酶，得出的f a d 是色氨酸单 加氧酶的辅酶的结论一致 4 中国农业大学博士学位论文 图1 - 4 a g r o b a c t e r i u m 咖咖c i e n s 中t - d n a 由1 i 质粒转移至植物细胞 f i g 1 - 4 t - d n a u a n s f c r r i n g f r o m t i p l a s m i d o f a g r o b a c t e r i u m t u r n 咖c i e n s i o p l a n t c e l l s 与ps y r i n g a ep v s a v a s f a n o i 不同，a t u r n p 向c i e n s 的单顺反予基因适合在植物细胞中表达， t m s j 和t i n s - 2 基因分别位于互补的两条d n a 链上。中间以一段短的基因间的启动子区域相隔 ( c o s t a c u r t aa n dv a n d e r l e y d e n1 9 9 5 ) 。调节序列与真核表达信号相似：3 和5 端外侧具有植物 基因特有的t a t a 框、c a a t 框和多聚腺苷酸信号，转录被r n a 聚合酶启动，具体的转录区 域被植物的反式作用因子识别，其组织特异性和调节机制都与植物的基因相似( g a u d i ne ta l , 1 9 9 4 ) 。a t u r n e f a c i e n s 中，除了觚s j 和t m s 2 外，在t - d n a 上还有另外一套与m s j 和t i n s 一2 具有弱同源性的i a a 台成基因( t b - i a a ) ，t b - m a 基因和m 相比，其基因功能相似，并且可 以互补突变的t m s 基因。但是t b - a a 基因所合成的i a a 水平不足于诱导根癌，这可能与转录水 平的减弱或者酶被修饰有关( h u s se ta 1 1 9 8 9 ) 。 a g r o b a c t e r i u mr h i z o g e n e s 是双子叶植物发根病( 毛状根病) 的病原体，其合成i a a 的基因 ( a u x ) 位于r i 质粒上的t - d n a 区，通过整合到宿主的基因组上表达( c o s t a c u r t aa n dv a n d e r l e y d e n 1 9 9 5 ) 。n 基因与觚s 基因相似，a l o ( - i 与t m s - 1 具有6 0 同源性，a u x - 2 与t i n s - 2 的同源性 为7 1 。而且a l x 基因的调节信号也与栅s 基因相似( g a u d i n 甜a 1 1 9 9 4 ) 。另外，a r h i z o g e n e s 的 t - d n a 上还有一套独特的，d f 基因( c o s t a c u r t aa n d v a n d e d e y d e n l 9 9 5 ) ，m f 基因向宿主植物传递 一种类似于激素水平提高的表型特征，可以增加植物细胞对生长素的敏感程度，此效果源于r o l b 编码的b 一葡萄糖苷酶，此酶可以水解失活的i a a 葡糖苷结合体为有活性的，游离的i a a 。 5 中国农业大学博士学位论文缝诠 ps y r i n g a ep v s y r i n g a e 的i a a 合成途径与只s y r i n g a ep v s a v a s t a n o i 相似，也是通过吲哚- 3 乙酰胺途径，但卫s y r i n g a ep v s y r i n g a e 合成i a a 的基因位于染色体上，而不是在质粒上，而且 合成h 、a 用途还不十分清楚( f e t te ta 1 1 9 8 7 ) 。与只s y r m g a ep v s a v a s t a n o i 不同，只s y r i n g a ep v s y r i n g a e 侵染菜豆时，并不诱导植物形成菌瘿，而是围绕亮黄色的坏死组织形成环状、褐色的坏 死病区( m a z z o l aa n dw h i t e1 9 9 4 ) ，这种症抗与所分泌的高水平的i a a 有关。以卫s y r i n g a ep v s a v a s t a n o i 的i a a m 和i a a h 基因为探针，克隆了只s y r i n g a ep v s y n g a e 的i a a 合成的相关基因 ( w h i t ea n dz i e g l e r1 9 9 1 ) ，尽管两个亚种的i a a m 和i a a t t 基因编码的氨基酸序列具有9 0 的同 源性，但是西个基因上下游韵侧翼序列却明显不同( m a z z o l a 和w h i t e1 9 9 4 ) ，从翻译起点到其上 游2 0 0 b p 处的启动子区域同源性急剧下降，旦s y r i n g a ep v s a v a s t a n o i 中在转录起始位点和r o a m 基因之问的2 2 8 b p 的读码框没有在旦s y r i n g a ep v s y r i n g a e 的相应部位上发现，ps y r i n g a ep v s y n n g a e 中，i a a h 下游7 8 b p 处有一个只s y r i n g a ep v s a v a s t a n o i 没有的6 6 3 h p 的读码框，这个读 码框所编码的蛋白类似于羧化脱羧作用中的蛋白，m a z z o l a 和w h i l e ( 1 9 9 4 ) 猜想这个基因产 物可能参与到i a a 的进一步代谢或者是1 a a 的转运相关的非偶合离子泵的一部分。 并非所有的只s y r i n g a e 亚种都是通过吲哚乙酰胺途径合成i a a ，以p s y r i n g a e p c s a v a s t a n o i 的i a a m 和i a a h 基因为探针检测从番茄、谷物、小麦上分离的只s y r i n g a e 和两个只s y r i n g a ep v p s i 菌株，没有发现同源序列。其原因可能是由于这些菌株中的i a a m 和i a a h 基因与只s y r i n g a e p v s a v a s t a n o i 的i a a m 和i a a h 基因偏离到了一定程度，以至于没有可见的杂交信号，或者这些 菌株是通过其他途径合成i a a ( w h i t ea n dz i e g l e r1 9 9 1 ) 。 生化的证据，包括i a a 合成途径中问体的鉴定、加入中间体后i a a 产量都证实e r w i n i a h e r b i c o l a 中只有病原体菌株是通过吲哚乙酰胺途径合成i a a ( m a n u l i se ta 1 1 9 9 1 ) ，以只s y n g a e p v s a v a s t a n o i 的i a a m 和i a a h 基因为探针在eh e r b i c o l ap v g y p s o p h i l a e 的质粒上分离褥到了 i a a m 和i a a h 基因( c l a r ke ta 1 1 9 9 3 ) ，但i a a m 和i a a h 被插入失活后，突变体的i a a 产量 与野生型相比并无变化，因此除吲哚乙酰胺途径外应该还有其他的i a a 合成途径。 r h i z o b i u m 和b r a d y r h i z o b i u m 在豆科植物根部诱导结瘤( s e k i n ee ta 1 1 9 8 9 a ；c o s t a c u r t aa n d v a n d e f l e y d e n1 9 9 5 ) ，其现象与细菌侵入到植物根部皮层，通过释放生长素诱导其周围的细胞增生 类似( r a y e t a l 1 9 8 3 ) ，s e k i n e ( 1 9 8 8 ) 等认为b r a d y r h i z o b i u m j a p o n i c u m 和r h i z o b i u m f r e d i i 通 过吲哚乙酰胺途径合成i a a ，因为这些菌株可以将哼l 哚乙酰胺的结构类似物萘乙酰胺( n a m ) 转化为蔡乙酸( n a a ) ，表明了这些菌株可以合成哼i 哚乙酰胺水解酶。通过突变体互补的方法在 且j a p o n i c u m 中找到了b a r n 基因，序列分析表明此基因读码框可编码一个含有4 6 5 个氮基酸，分 子量5 0 ，2 6 6 d a 的蛋白( s e k i n e 盯a 1 1 9 8 9 b ) 。此基因( 特别是中间部分) 与ps y r i n g a e p v s a v a s t a n o i 的i a a h 基因和a t u m e f a c i c n s 的a r t s - 2 基因具有显著的同源性，而且在添加了色氮酸的培养基 中检测到了吲哚乙酰胺和i a a 但b a r n 基因的上下游并没有发现与m a m 或t i n s - 1 有同源性的序 列，其色氨酸单加氧酶酶的编码基因位置还没有找到。r h i z o b i u m 只有与宿主植物共生时可以合 成吲哚乙酰胺水解酶，但在自生时此功能被抑制因此想要检测到此酶很困难- 但兄 l e g u m i n o s a m 的一个变种的d n a 上有一段与且j a p o n i c u r a 的h a m 基因高度同源的序列。这表 明吲哚乙酰胺水解酶应该是存在的，但在自生状态下，只有在自发突变时才能检测到( c o s t a c u r t a 6 中国农业大学博士学位论文 a n dv a n d c d e y d e n1 9 9 5 ) 。宿主植物的黄酮类