（遗传学专业论文）plk1抑制剂阻止胰腺癌细胞增殖的分子机制.pdf

摘要 摘要 p l k l 是一种有丝分裂激酶，在细胞周期过程中起着很重要的作用，而且与 肿瘤发生有关，因此是癌症治疗的一个靶点。目前，有些p l k l 小分子抑制剂已 经进入临床试验阶段。在本项研究中，我们证实一种新型p l k l 抑制剂可以有效 地抑制p l k l 表达水平升高的胰腺癌细胞系的细胞增殖。分子模型分析显示这种 p l k l 抑制剂是通过与a t p 竞争性的结合来起作用。我们还发现这种抑制剂可以 导致细胞核形态出现异常，并诱导细胞凋亡。另外，将这种抑制剂与抗肿瘤药 物盐酸吉西他滨联合应用发现它们能够在很大范围内存在协同作用。而且，用 此抑制剂长期处理胰腺癌细胞会使细胞产生耐药性。这些结果提示了p l k l 可以 作为胰腺癌治疗的潜在靶点，而且联合用药治疗可能也是一种有效的治疗策略。 另外，我们的结果还表明，在用p l k l 抑制剂治疗胰腺癌的过程中，可能会出现 耐药性。 关键词：p l k l 抑制剂；胰腺癌；细胞凋亡：耐药性 a b s t r a c t a b s t r a c t p l k l ，硒am i t o t i ck i n a s e ，p l a y sa ni m p o r t a n tr o l ed u r i n gt h ec e l lc y c l ea n di s a s s o c i a t e dw i t ht u m o r i g e n e s i s t h e r e f o r e ，p l k lh a sb e e nc o n s i d e r e da sap o t e n t i a l t a r g e ti nc a n c e rt h e r a p y s e v e r a ls m a l l m o l e c u l ei n h i b i t o r so fp l k la r ec u r r e n t l y u n d e r g o i n gc l i n i c a le v a l u a t i o n i nt h i ss t u d y , w er e p o r tt h a tan o v e lp l k li n h i b i t o r e f f e c t i v e l ys u p p r e s s e st h ep r o l i f e r a t i o no fp a n c r e a t i cc a n c e rc e l ll i n e sw i t hp l k l o v e r e x p r e s s i o n m o l e c u l a rm o d e l i n ga n a l y s i ss h o w st l l a tt h ep l k li n h i b i t o r c o m p e t i t i v e l yb i n d st ot h ea t p - b i n d i n gs i t e o u rs t u d i e sf u r t h e rs h o wt h a tt h ep l k l i n h i b i t o rr e s u l t si na b n o r m a ln u c l e a rm o r p h o l o g ya n di n d u c e sa p o p t o s i s i na d d i t i o n , t h i si n h i b i t o ra c t s s y n e r g i s t i c a l l y t oal a r g ee x t e n tw i t ht h ea n f i t u m o r d r u g g e m c i t a b i n eh y d r o c h l o r i d e m o r e o v e r , p a n c r e a t i cc a n c e rc e l l sa c q u i r er e s i s t a n c et o t h ep l k li n h i b i t o ru p o nl o n g t i m ed r u gt r e a t m e n t t h e s er e s u l t ss u g g e s tt h a tp l k li s ap o t e n t i a lt h e r a p e u t i ct a r g e tf o rp a n c r e a t i cc a n c e l t r e a t m e n t ，a n dc o m b i n e dd r u g t r e a t m e n tm i g h tb ea ne f f e c t i v es t r a t e g y i na d d i t i o n , o u rd a t ai n d i c a t et h a td r u g r e s i s t a n c em a yo c c u rd u r i n gp a n c r e a t i cc a n c e rt h e r a p yw i t hp l k li n h i b i t o r s k e yw o r d s ：p l k li n h i b i t o r ；p a n c r e a t i cc a n c e r ；a p o p t o s i s ；d r u gr e s i s t a n c e i i 南开大学学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师指导下，进行研究 工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本学位论文的研 究成果不包含任何他人创作的、已公开发表或者没有公开发表的作品 的内容。对本论文所涉及的研究工作做出贡献的其他个人和集体，均 已在文中以明确方式标明。本学位论文原创性声明的法律责任由本人 承担。 学位论文作者签名：缎 叫年，月衫e l 南开大学学位论文版权使用授权书 本人完全了解南开大学关于收集、保存、使用学位论文的规定， 同意如下各项内容：按照学校要求提交学位论文的印刷本和电子版 本；学校有权保存学位论文的印刷本和电子版，并采用影印、缩印、 扫描、数字化或其它手段保存论文；学校有权提供目录检索以及提供 本学位论文全文或者部分的阅览服务；学校有权按有关规定向国家有 关部门或者机构送交论文的复印件和电子版；在不以赢利为目的的前 提下，学校可以适当复制论文的部分或全部内容用于学术活动。 学位论文作者签名：烂 私衫年月日 经指导教师同意，本学位论文属于保密，在年解密后适用本授 权书。 指导教师签名：学位论文作者签名： 解密时间：年月日 各密级的最长保密年限及书写格式规定如下： 第一章引言 第一章引言 所有真核生物的基因组稳定性都依赖于细胞有丝分裂和减数分裂过程中染 色体准确无误的分离。而在整个细胞周期过程中，有丝分裂期以及随后的胞质 分裂期无疑是最引人注目的一个时期。这一阶段伴随着细胞结构的完全重组， 包括以微管为基础的有丝分裂纺锤体的装配和以肌动球蛋白为基础的收缩环的 形成。细胞分裂期各种事件在时间和空间上的安排需要非常细致的调节。染色 体分离时出现错误将会导致非常严重的后果，事实上，染色体分离不平衡是许 多自然流产、出生缺陷和癌症发生的根本原因。 可逆的磷酸化是调节细胞分裂非常重要的一种分子机制。很多蛋白都在细 胞周期调控方面起着非常重要的作用，如果对这些蛋白的磷酸化调节失去控制 将会导致异常的细胞分裂等严重的问题。到目前为止已经发现了一系列对细胞 周期调控非常重要的蛋白激酶家族，其中就包括p l k 激酶这种作用非常显著的 丝氨酸苏氨酸蛋白激酶。 1 1 1p l k 激酶的进化 第一节p l k 激酶 第一个确定的p l k 激酶家族成员是在黑腹果蝇中发现的p o l o 激酶【1 】，而 p l k 激酶正是与p o l o 激酶有功能和序列上的相似性而得名。果蝇、出芽酵母和 裂殖酵母都只包括一种p l k 激酶家族成员( 分别是p o l o 、c d c 5 和p 1 0 1 ) ，而人 类、小鼠、爪蟾和线虫都包括三种p l k 激酶家族成员，分别用p l k l p l x l p l c l 、 p l k 2 p l x 2 p 1 c 2 ( 最初命名为s n k ) 、p l 硒p l x 3 p l c 3 ( 最初命名为f n k 或者p r k ) 来表示。在细菌、古细菌和植物中还没有发现与p l k 激酶同源的蛋白。 通过对人类、小鼠、爪蟾的三种p l k 激酶序列的种系发生学分析，发现这 三个物种的同一种p l k 成员似乎在种间是直系同源的，而同一个物种内的三个 p l k 成员之间似乎是旁系同源的，由此可以确定p l k 激酶从一种增加至三种一 定是一个早期的进化事件【2 】。 第一章日i 言 随着研究的进展，第四种p l k 激酶家族成员( 命名为p l k 4 或者s a k ) 也 己经在人类和小鼠中发现并加以研究，而在爪蟾和果蝇中获得了它的序列信息 1 3 1 。 112p l k 激酶的结构 除了p l k 4 所有p l k 激酶都有相似且保守的结构，包括位于n 端的一个 经典的丝氨酸苏氨酸激酶结构域，和一个位于c 端的含有两个标志性的p o l o - b o x 的结构域( 见图11 ) 。p l k 4 的n 端激酶结构域与其它p l k 成员非常相似，而 它的c 端是与其它成员最大的不同，因为它的c 端结构域只包含一个p o l o - b o x 这个p o l o b o x 可眺介导p l k 4 在体外以及在体内过表达时的二聚化。 k 1 “a * d 0 啪m 。! 1 il ”l ”l “i ”3 9 8 2t 2 1 0r 3 3 7 w 4 1 4 h 5 3 8 k 5 4 0 _ j i一 a 肚b i l n 9t a o o pd 女“n w s p h d 删q i * b d o i n 8 23 h k i l l t 2 3 9 图l1 人类p l k 家族成员的结构示意图5 l p l k 的激酶结构域在所有p l k 家族成员中高度的保守，而且与a u r o r a 激酶 和钙钙调素依赖蛋白激酶的檄酶结构域有很高的相似度。相比之下，包含 2 点 第一章引言 p o l o b o x 的c 端结构域则保守性很低，只有大约7 0 个氨基酸组成结构域的核心， 还不到整个c 端结构域的一半。由于整个c 端区域作为一个整体发挥作用，因 此被称为p o l o - b o x 结构域( p b d ) 。 p l k 激酶的结构中包括了很多重要的基序和氨基酸位点。以p l k l 为例， 它的n 端激酶结构域包含了很多在丝氨酸苏氨酸蛋白激酶中不变的氨基酸残基 7 】，其中包括位于a t p 结合结构域的共有基序g l y x g l y xxa l a ，这不同于 蛋白激酶中经典的共有基序g l y x 。g l y xxg l y 7 1 。p l k l 序列中第8 2 位的赖氨 酸是一个与激酶活性相关的重要位点，它突变成甲硫氨酸将导致活性丧失【8 】；而 第2 1 0 位的苏氨酸突变成天冬氨酸使得p l k l 处于过度活化的状态【8 】，这与第1 3 7 位的丝氨酸的作用比较类似【9 】。另外，p l k l 的p b d 包含一个磷酸肽结合基序， 它可以与具有磷酸化苏氨酸或者丝氨酸的磷酸肽相互作用【1 0 1 1 1 ，其中关键的氨 基酸残基包括第4 1 4 位的色氨酬1 2 】、第5 3 8 位的组氨酸和第5 4 0 位的赖氨酸【1 3 】。 1 1 3p l k 激酶的合成与降解 对p l k 激酶合成与降解的调节是细胞控制p l k 激酶功能的一种策略。这种 调控机制分别在转录水平和蛋白水平上起作用。对p l k 激酶的转录调节了解得 最清楚的例子可能是裂殖酵母的p l o l 。p l o l 磷酸化进而激活叉头家族转录因子 f k h 2 ，f k h 2 的激活将导致一些与有丝分裂和分隔作用的调控相关的基因表达， 其中就包括p l o l 基因本身【14 1 。因此，p l o l 似乎是控制细胞分裂相关基因表达的 正反馈循环的一部分。由于在许多真核生物中，叉头家族转录因子和p l k 激酶 都在有丝分裂调控过程中起作用，这一机制很可能在其它生物中也被很好地保 留了下来【15 1 。 退出有丝分裂之后，p l k 激酶通过泛素蛋白酶体途径降解，这种调控机制 以分裂后期促进复合物循环体( a p c c ) 这种泛素连接酶为中心。a p c c 发挥 作用要与特异的辅助因子结合，包括c d c 2 0 和c d h l ，而a p c c 本身受到纺锤体 检验点的调节。c d e 2 0 和c d h l 除了赋予a p c c 一定程度的底物特异性之外，还 能对a p c c 的活性进行短暂的调节【1 6 j 。a p c c c d e 2 0 复合物促进有丝分裂从中 期向后期的转变，而且在分裂后期的早些时候继续起作用，而a p c c c d h l 复合 物在有丝分裂的末尾和随后的g l 期起作用。在所有生物中，p l k 激酶似乎都受 到蛋白降解的调节。在酿酒酵母中，c d e 5 的降解与a p c c c d h l 复合物有关， 3 第一章引言 而且依赖于n 端的一个毁坏信号 1 7 ，1 引。但是这一信号在多细胞动物中并不保守， 例如，人类的p l k l 降解依赖于催化结构域和调节结构域中间区域的一个毁坏基 序【l 圳。在缺乏c d h l 的非洲爪蟾早期胚胎的细胞周期中p l x l 非常稳定，这也说 明了a p c c c d h l 复合物在p l k 激酶降解中的关键作用 2 0 1 。以上的实例也表明 了虽然p l k 激酶是高度保守的细胞分裂调节因子，但是在不同生物中它们的精 确调节是与具体的发育背景相适应的。 1 1 4p l k 激酶的活性调节 对p l k 激酶磷酸化的调节是细胞控制p l k 激酶功能的另一种策略，这种磷 酸化修饰对p l k 激酶的活性来说是必需的。在p l k 激酶的激酶结构域中存在一 些保守的丝氨酸和苏氨酸残基，其中就包括p l k l 中的第2 1 0 位苏氨酸和第1 3 7 位丝氨酸，与之对应的在p l x l 中是第2 0 1 位苏氨酸和第1 2 8 位丝氨酸。对 t 2 1 0 2 0 1 和s 1 3 7 1 2 8 这两个位点的研究发现，把它们突变成天冬氨酸来模拟磷 酸化修饰的状态将导致p l k l 和p l x l 的活化，同时也会引起有丝分裂中的一些 变化 9 , 2 1 , 2 2 】。 在爪蟾卵提取物系统中引入p l x l 的t 2 0 1 d 突变体将导致进入有丝分裂时加 快c d c 2 5 c 的活化和退出有丝分裂时延缓c d c 2 5 c 的失活。另外，在分裂后期会 出现c y c l i nb 2 降解的延迟，随之导致延缓c d k l 激酶活性的丧失【2 2 1 。而在h e l a 细胞中过表达p l k l 的t 2 1 0 d 突变体使得处在g 2 m 期的细胞比例增加，但与过 表达野生型或无活性p l k l 时相比增加得不明显【9 】。在晚些时候，过表达野生型 或无活性p l k l 的细胞将会推迟退出有丝分裂，导致最终没有经历胞质分裂的情 况下退出有丝分裂【2 3 1 。但是在h e l a 细胞中过表达p l k l 的s 1 3 7 d 突变体不是 将细胞阻断在g e m 期而是g l s 期，而过表达s 1 3 7 d t 2 1 0 d 双突变体也显示出 了g l s 期阻断【9 1 。将相应的p l x l 的s 1 2 8 d t 2 0 1 d 双突变体注射到爪蟾胚胎中将 阻碍卵裂的进行【2 2 】。 t 2 1 0 2 0 1 位于p l k 激酶结构域中的活化环内，通过对体内免疫沉淀得到的 p l k 激酶磷酸化位点定位，发现这个苏氨酸确实是p l k l 和p l x l 在体内被磷酸 化修饰的一个位点 9 , 2 4 1 。这种通过活化环内磷酸化的激活机制在许多种蛋白激酶 中都很常见【2 5 1 ，说明这是一种比较保守的机制。与t 2 1 0 2 0 1 相比，s 1 3 7 1 2 8 没 有位于活化环内，而且到目前为止还没有直接的证据表明这一位点是体内的磷 4 第一章引言 酸化位点，很多实验结果暗示了在体内这个位点的磷酸化不是必需的，即使发 生也只是有丝分裂期的一个短暂事件【9 2 2 。 目前至少发现了两种蛋白被认为是t 2 1 0 2 0 1 磷酸化的上游激酶，分别是爪 蟾的p l k l ( 1 ( 在人类中相应的蛋白是s l k 或者s t k l 0 ) 和p k a 。p l l ( 1 ( 1 和p k a 都 可以在体外磷酸化t 2 0 1 使p l x l 激活【2 4 ，2 6 1 。而人类的s l k 和s t k l 0 可以在体外 磷酸化p l k l 的t 2 1 0 ，并且可以在体内刺激p l k l 的活化【2 7 2 8 1 。然而这些激酶 在体内生理状态下是否可以磷酸化p l k 激酶尚不清楚，而且可能存在其它的上 游调控激酶。 1 1 5p l k 激酶的作用 1 1 5 1 p l k l 在有丝分裂过程中的作用 p l k l 在细胞周期中所发挥的作用与它的表达、活性和定位在细胞周期过程 中所受到的动态性调节有密切的关系。p l k l 的表达水平从s 期的末尾开始上升， 到有丝分裂期达到峰值，并且有丝分裂期也是p l k l 活性最高的时期【2 9 3 1 】，p l k l 也主要在细胞增殖较快的组织中表达【3 2 】，而p l k l 被a p c c 降解开始于有丝分 裂的末尾并持续整个g l 蝌1 8 】。p l k l 的定位也是非常动态的：在g 2 期p l k l 定 位在细胞质和细胞核中并且特异的与中心体结合 2 9 , 3 3 】；在有丝分裂早期，p l k l 存在于中心体和动粒上【2 9 ，3 4 1 ，并且持续到p l k l 被降解；另外，在有丝分裂晚 些时候会有一部分p l k l 转移到中间带和中体上【2 9 ，3 4 1 。p l k l 定位上的多样性也 反映出它会在细胞周期过程中发挥很多种功能，下面将会详细阐述。 1 1 5 1 1 进入有丝分裂 p l k l 的主要功能之一就是促进细胞进入有丝分裂。所有的细胞周期进程都 需要特异的c d k 的活性来介导，而c d k 的活化都需要与相应的c y c l i n 结合。细 胞周期由g 2 期向m 期的转变就要完全依赖于c y c l i nb c d k l 复合物的激活。在 g 2 期，c y c l i nb 增强的启动子活性以及增加的m r n a 稳定性导致产生了足够大 量的c y c l i nb 蛋白 3 5 - 3 7 1 。这些新合成的c y c l i nb 可以结合在非活化的c d k l 上， 但是还不能形成细胞核内活化的c y c l i nb c d k l 复合物，因为这一复合物受到不 同信号通路的调节来保持非活化的状态。 首先，w e e l 和m y t l 可以在c d k l 的a t p 结合位点t 1 4 和y 1 5 使其磷酸化 5 第一章引言 【3 8 ，3 9 j 。这些位点的磷酸化阻止c d k l 与a t p 的结合，从而保持c y c l i nb c d k l 复 合物没有催化活性。其次，c y c l i nb c d k l 复合物还受到亚细胞定位的调节。与 似乎一直处在细胞核内的c y c l i n a 不同，c y c l i n b 在细胞间期主要位于细胞质中 。事实上，在g 2 期c y c l i nb 一直在细胞核内外穿梭，但由于在这个时期出核 作用要明显强于入核作用，使得大量的蛋白仍然存在于细胞质中 4 1 1 。c y c l i nb 具 有两个控制核质穿梭的结构域，使得这种运输过程更加容易进行：一个是核定 位信号，它能将c y c l i nb c d k l 复合物靶定在细胞核口；j 4 2 , 4 3 】；另一个是细胞质滞 留信号，它含有一个核输出信号，确保在有丝分裂开始之前c y c l i nb c d k l 复合 物的细胞质定位【4 l 4 4 ，4 5 1 。 进入有丝分裂需要c y c l i nb c d k l 的完全活化，这依赖于c d k l 活化环上t 1 6 1 的磷酸化以及t 1 4 、y 1 5 的去磷酸化。由c d k 7 、c y c l i nh 和m a t l 组成的复合 物负责将t 1 6 1 位点磷酸化，从而增强c y c l i nb c d k l 复合物的激酶活性【4 6 书】。 而t 1 4 和y 1 5 两个位点的去磷酸化则由c d c 2 5 磷酸酶家族的所有成员来完成 5 0 - 5 2 。在g 2 m 期转变过程中，c d c 2 5 b 对c d l ( 1 的去磷酸化开启了细胞质c y c l i n b c d k l 的活化1 5 3 15 4 。随后，c y c l i nb c d k l 通过两种正向增强途径来有效的促进 自身完全快速的激活：c y c l i nb c d k l 磷酸化激活c d c 2 5 c 从而进一步促进c d k l 的去磷酸化【5 纠；c y c l i nb c d k l 磷酸化w e e l 促进其降解从而降低c d k l 在y 1 5 位点上的磷酸化水平【5 6 1 。另外，进入有丝分裂还伴随着c y c l i nb c d k l 在细胞核 内的快速积累，阻止c y c l i nb 入核会阻碍进入有丝分裂，说明了这一复合物核 定位的重要性1 57 | 。 p l k l 在一些方面调节c y c l i nb c d k l 的活性。在爪蟾中p l x l 可以直接磷酸 化激活c d c 2 5 c 5 8 ，减少p l x l 会防止c d c 2 5 c 过度磷酸化并推迟c y c l i nb c d k l 的激活【5 9 】。有研究表明，人类p l k l 的p b d 可以与磷酸化的c d c 2 5 c 结合【l o 】， 而且p l k l 除了磷酸化激活c d c 2 5 c 以外还能介导其细胞核运输，6 1 】。在另一方 面，p l k l 可以直接磷酸化w e e l ，促进其降解从而降低c d k l 的磷酸化水平【5 6 | 。 这一研究显示w e e l 是先被c y c l i nb c d k l 磷酸化，然后才被p l k l 识别并进一 步磷酸化，之后通过s c f 1 3 - t r c p 导致降解【56 1 。这些发现暗示了有丝分裂调节因 子先被c d k 磷酸化再被p l k l 识别的模式是p l k l 起作用的通用模式【l 引。 除了调节c y c l i nb c d k l 的活性，p l k l 还可以调节这一复合物的亚细胞定 位。起初认为，p l k l 可以使c y c l i nb 核输出信号内的s 1 4 7 位点磷酸化【6 2 | ，这 一位点的磷酸化将导致c y c l i nb c d k l 在细胞核内滞留。随后发现，p l k l 只是 6 第一章引言 将c y c l i nb 核输出信号外的s 1 3 3 ( 而不是$ 1 4 7 ) 位点磷酸化，在中心体上激活 c y c l i nb c d k l 并促进其向细胞核内运输【6 3 朋】。另外，去除这些磷酸化位点并不 能阻止c y c l i nb c d k l 向核内运输，这也表明存在多种调控因子共同对它的核定 位进行控制。 1 1 5 1 2g ：m 期检验点 当处在g 2 期的细胞d n a 受到损伤的时候，g 2 期d n a 损伤检验点就会抑 制c y c l i nb c d k l 的活性，阻止细胞进入有丝分裂而阻断在g 2 期【6 5 1 。d n a 损伤 导致检验点激酶a t m 和a t r 激活，这些激酶随后会把信号传递到一系列检验 点介质，比如p 5 3 、c h k l 、c h k 2 、组蛋白h 2 a x 以及d n a 修复机制的一些组分 脚j 。检验点通路的激活将会导致c d c 2 5 家族所有成员失活，相反却会增强w e e l 的功能，使得c d k l 的y 1 5 位点磷酸化，最终导致c y c l i nb c d k l 复合物失活。 由于p l k l 在c y c l i nb c d k l 复合物的激活过程中起到了非常重要的作用， 它也成为g 2 期d n a 损伤检验点的直接靶点【删。在一系列d n a 损伤试剂的作用 下，p l k l 的催化活性受到抑制，而且这种抑制作用依赖于有功能的a t m 或者 a t r 【6 川，而表达组成型活化的p l k l 突变体将使细胞通过被d n a 损伤阻断的 g 2 期1 6 0 。使用p l k l 的s i r n a 的实验发现，p l k l 介导的w b e l 降解对d n a 损 伤恢复之后进入有丝分裂是非常重要的【6 8 】。而p l k l 的其它靶点有些也与d n a 损伤检验点相关，比如p 5 3 6 9 】。p l k l 能与p 5 3 结合，抑制它的反式激活活性以 及促凋亡功能【7 0 】。p l k l 也可以与c h k 2 相互作用并使其磷酸化【7 1 1 ，但是在g 2 m 期d n a 发生损伤之后，它们之间的相互作用就会消失【7 2 1 。p l k l 另一个与d n a 损伤检验点相关的底物是乳腺癌易感蛋白b r c a 2 ，它对d n a 双链断裂修复非 常重要【7 3 7 4 。因此，在d n a 损伤的作用下，p l k l 的活性受到抑制，就会引起 p 5 3 的活化以及对c h k 2 和b r c a 2 功能的调节，而当d n a 损伤恢复之后p l k l 又可以抑制这三种蛋白。 在g 2 m 期转变过程中并不是只有d n a 损伤才能激活检验点的功能，所有 的压力都会产生检验点信号，抑制c y c l i nb c d k l 的活化。比如微管动态性改变 的时候，泛素连接酶c h f r 就会被激活并推迟进入有丝分裂【7 5 1 。有趣的是，这种 所谓的分裂前期检验点的激活会导致p l k l 通过c h f r 的泛素化降解【7 6 1 ，从而抑 制c d k l 的活性。更多的结果证实了这种检验点需要蛋白泛素化，但是又与蛋白 酶体降解无关【77 1 。事实上，有些研究者并没有在分裂前期检验点激活之后观察 7 第一章引言 到p l k i 的降解1 7 7 】。因此，关于这种检验点在细胞周期进程中的作用仍然存在 大量的疑问。 1 1 5 1 3 中心体成熟和两极纺锤体形成 在许多种生物中p l k 激酶功能的丧失都会造成有丝分裂纺锤体严重的缺陷 7 8 - 8 2 , 在果蝇中，p o l o 激酶突变会产生很高比例的单极纺锤体，或者其中一极 出现异常的两极纺锤体【8 1 1 。与之相似，在人类细胞中p l k l 的活性降低也会导 致单极纺锤体的形成【8 2 8 3 】。这种异常不是由于阻碍了中心体的复制，而是中心 体成熟和分离受到影响造成的结果。在p l k l 缺陷的细胞中中心体功能的许多方 面似乎都受到了影响。有报导称p l k l 通过将y 微管蛋白募集到中心体上来调节 纺锤体的形态【8 3 】。虽然p l k l 可以与y 微管蛋白直接结合【8 4 1 ，但是对中心体上 微管蛋白成核作用的调节可能与多种p l k l 相互作用蛋白有关。n i p 和 o p l 8 s t a t h m i n 都能与p l k l 直接相互作用，而且它们是微管成核的负调节因子【8 5 ， 酌j 。另外，n l p 和s t a t h m i n 都可以被p l k l 磷酸化，而且对于n l p 来讲，这种磷 酸化导致它从中心体上解离从而允许微管蛋白成核【8 6 】。p l k 激酶还可以调节微 管稳定蛋白，包括a s p 和t c t p 9 7 ，8 8 1 。在果蝇中，中心体的星体形成能力和适当 的纺锤体建立都需要p o l o 激酶介导的a s p 蛋白磷酸化【9 7 1 。p l k l 是否也能调节 a s p 在人类中的同源蛋白还不清楚。研究发现去除t c t p 上p l k l 的磷酸化位点 将导致产生多核化细胞，由此看出t c t p 可能在胞质分裂中起作用【8 8 】。然而， 在有丝分裂中期向后期的转变过程中t c t p 从有丝分裂纺锤体上解离下来，而 p l k l 从分裂中期开始定位在动粒上，这暗示了只有在微管连接在动粒上的时候 p l k l 才能将微管上的t c t p 磷酸化，起到稳定微管的作用【8 8 母们。 大部分的研究发现p l k l 功能受到影响导致纺锤体形态异常，阻断有丝分裂 【8 0 8 2 ，8 3 ，9 1 弼】，而且这些现象与用m o n a s t r o l 处理细胞的结果非常相似( m o n a s t r o l 通过抑制中心体分离导致单极纺锤体的形成) 8 2 1 。尽管不能形成两极纺锤体， p l k l 功能缺陷或m o n a s t r o l 处理的细胞纺锤体检验点失活仍然能使细胞退出有 丝分裂，而且中体和分裂沟的形成都没有受到影响【8 2 1 。这些都暗示了干扰p l k l 功能之后最主要的影响就是中心体异常，而其它的表型都是纺锤体功能受损之 后产生的一系列后果，另外，这些现象也说明在正常细胞进入有丝分裂过程中 p l k l 的作用比较有限。 1 1 5 1 4 染色体排列和纺锤体检验点 8 第一章引言 当p l k l 在细胞内的活性和定位出现异常的时候，染色体在赤道板上的集合 将会出现缺附蚓。也有研究认为p l k l 可以通过产生张力稳定微管和动粒之间 的相互作用 8 2 9 5 ，9 6 1 ，最近的研究也为这一过程提供了一种分子机制。当动粒上 缺乏张力时，有活性的p l k l 可以在动粒上产生一个相关信号，即3 f 3 2 磷酸化 表位【9 5 1 。此外，p l k l 可以募集像h e c l n d c 8 0 等关键的动粒蛋白 9 5 】，而它们可 以介导微管与动粒的连接【97 1 。因此，p l k l 可能在动粒与相应微管之间的张力和 连接方面起到多种作用。随后又发现p l k l 的s i r n a 可以部分降低一些动粒蛋 白之间的联系，像m a d 2 、c e n p 。e 和c d c 2 0 这些对检验点信号非常重要的蛋白【9 5 】。 然而在p l k l 缺失的细胞中纺锤体检验点依然有活性，可能是因为在这些细胞中 与检验点相关的这些蛋白依然定位在动粒上【6 7 9 5 ，9 6 1 。有趣的是，最近发现p l k l 可以在没有张力的情况下富集在动粒上，而且在爪蟾中，p l x l 与动粒的结合依 赖于检验点激酶x m p s l 的活性【9 5 ，9 8 1 。因此p l k l 可能与张力信号有关，而且在 适当的连接和张力作用下，可能会有部分p l k l 从动粒上解离下来。这样将会稳 定微管和动粒之间的连接作用，而且由于检验点蛋白的共同解离，将会导致纺 锤体检验点的沉默。 1 1 5 1 5a p c c 活化 p l k l 在有丝分裂中期向后期的转变过程中起到非常重要的作用，其中就包 括对a p c c 活性的调节。a p c c 最初活化依赖于与辅助因子c d c 2 0 的结合，之 后可以将一些含有d b o x 的蛋白通过泛素化途径降解，比如c y c l i nb 和s c c u d n 。 一旦a p c c c d c 2 0 复合物开启了退出有丝分裂的进程，c d c 2 0 将被c d l l l 取代， 识别含有d - b o x 或者k e n - b o x 的蛋白并使其泛素化降解，其中包括c d c 2 0 本身、 a u r o r a 激酶和p l k l 等【l8 1 9 1 。为了防止a p c c 过早活化，c d c 2 0 最初结合在其 它蛋白上以保持a p c c 的无活性状态，而p l k l 可以通过调节c d c 2 0 的释放来 实现激活a p c c 的功能。 一方面，早期分裂抑制蛋白e m i l 可以结合c d c 2 0 以抑制a p c c 的激活， 而p l k l 可以引起e m i l 的降解。这一过程首先需要c y c l i nb c d k l 复合物将e m i l 磷酸化，然后p l k l 识别这种被磷酸化的e m i l 并将其进一步磷酸化，之后e m i l 通过s c f p t r c p 导致降解眇】。另一方面，在染色体精确排列在赤道板上之前， 纺锤体检验点的激活会阻止有丝分裂向分裂后期进行，而活化的纺锤体检验点 蛋白m a d 2 和b u b r l 都可以与c d c 2 0 结合，阻止a p c c 的活化。前面已经提到 9 第一章引言 p l k l 与纺锤体检验点有关，而且p l k l 缺失的细胞会由于纺锤体检验点的激活 而被阻断在有丝分裂的前中期，而m a d 2 或者b u b r l 与p l k l 共同缺失的细胞 不会被阻断在这一时期【8 2 1 ，说明p l k l 对于纺锤体检验点抑制a p c c 活性这一 点具有拮抗作用。通过这些方面可以看出，p l k l 在a p c c 的活化过程中扮演 着非常重要的角色。 1 1 5 1 6 胞质分裂 在有丝分裂末期p l k l 会定位在中间带和中体上，这也暗示了p l k l 有可能 与胞质分裂有关。第一个证据就是发现了驱动蛋白样蛋白c h 0 1 m k l p l 在体外 是p l k l 的一种底物，而c h 0 1 m k l p l 在体外可以使微管成束和反向平行移动 【3 。在果蝇中，p o l o 激酶可以与c h 0 1 的同源蛋白p a v a r o t t i 相互作用，而这种 蛋白与胞质分裂有判1 0 0 。但是，将p l k l 的抗体注射到h e l a 细胞内并没有观 察到胞质分裂异常【8 3 1 。另一方面，p l k l 的过表达确实导致了多核化细胞的产生 l z 3 | ，说明p l k l 准确的表达水平对于胞质分裂的正常进行非常重要。当过表达 p l k l 的显性抑制突变体时，纺锤体装配检验点失活，胞质分裂不能正常完成【9 3 1 。 在p l k l 缺失的细胞中，如果将纺锤体检验点主要蛋白也缺失，细胞就可以进行 胞质分裂【8 2 1 。从这些结果来看，p l k l 可能对细胞进入胞质分裂并不重要，但是 这个结论还需要进一步验证。 p l k i 还可以使其它一些胞质分裂相关蛋白磷酸化，比如n u d c 。n u d c 缺失 使细胞产生多核化，或者细胞之间仍然通过中体连接【l0 1 】。n u d c 在p l k l 磷酸化 位点上的突变也会造成胞质分裂出现缺陷，暗示了p l k l 磷酸化n u d c 对胞质分 裂正常进行很重要【l0 1 】。m k l p 2 是定位在中体上的驱动蛋白，p l k l 介导的m k l p 2 磷酸化也与胞质分裂有关【l0 2 1 。向细胞内注射阻碍p l k l 磷酸化m k l p 2 的抗体会 产生双核细胞，表明p l k l 磷酸化m k l p 2 对胞质分裂也是必需削1 0 2 1 。近来发现 r h o 交换因子e c t 2 也是p l k l 的一种底物，而且与胞质分裂相判1 0 3 】。 p l k l 在有丝分裂期的另一个功能是通过磷酸化高尔基体相关蛋白 g r a s p 6 5 使得高尔基体断裂【1 0 4 ，1 0 5 1 。有趣的是，一些在有丝分裂期从高尔基体 上解离下来的蛋白与胞质分裂的调控有关。n i r 2 与膜运输和细胞骨架改造的调 控有关，它在间期细胞中主要定位在高尔基体上，而在胞质分裂过程中转移到 分裂沟和中体上【l 州。n i r 2 可能对胞质分裂很重要，因为过表达它的缺失突变体 将导致多核化细胞的产生。p l k l 和c d k l 都可以磷酸化n i r 2 ，而且过表达不能 1 0 第一章引言 与p l k l 相互作用的n i t 2 突变体会影响胞质分裂的完成【1 0 6 】，暗示了p l k l 可以 通过高尔基体相关蛋白来调节胞质分裂。 1 1 5 2p l k 2 的作用 p l k 2 虽然与p l k l 有很高的同源性，但是它的组织分布以及功能都和p l k l 有很大的不同。p l k 2 在很多组织中都有表达，但是p l k l 只有在增殖的组织中 才有表达。另外，p l k l 在g 2 l v l 期起作用，而p l k 2 在g l 期调节细胞增殖中期 到很重要的作用【1 0 7 】。用有丝分裂原处理n i h3 t 3 细胞1 小时内，p l k 2 的m r n a 水平就会显著提高【1 0 刀。 p l k 2 主要在g 1 期和s 期早期起作用，这一时段也是p l k 2m r n a 和蛋白 水平最高的时候【1 0 7 】。p l k 2 的过表达或缺失会分别导致中心体数目的增加或减 少，表明p l k 2 在s 期中心粒复制中起作用【1 0 8 1 。在阻断在s 期的c h o 和u 2 0 s 细胞中，过表达p l k 2 的激酶活性缺失突变体会阻止中心粒复制。p l k l 和p l k 2 在细胞周期中的不同时期调节中心体功能，p l k 2 在s 期调节中心粒复制，而 p l k l 在之后的g 2 期晚期确保中心体的成熟。p l k 2 可能在d n a 损伤检验点中 起作用，因为d n a 损伤试剂会诱导p l k 2m r n a 的表达 1 0 9 】，而p l k l 的表达 水平会在d n a 损伤时下降【7 0 】，暗示着p l k l 和p l k 2 可能在d n a 损伤应答中 起着相反的功能。 一些证据显示p l k 2 是一种非必需基因。p l k 2 以的胚胎可以存活 1 10 1 ，而且 缺失p l k 2 的h e l a 和u 2 0 s 细胞可以顺利通过细胞周期【1 0 9 】，暗示p l k 2 在中心 粒复制不是必需的。但是p l k 2 士的胚胎生长和骨骼发育都有所延缓，而且培养 的p l k 2 斗胚胎成纤维细胞明显比正常细胞生长缓慢们，说明p l k 2 在细胞周期 进程中确实有作用。 1 1 5 3p l k 3 的作用 与p l k 2 相似，p l k 3 也在很多组织中都有表达，而且在加入有丝分裂原很 短时间内p l k 3 的m r n a 水平就会显著提高【1 1 1 】。但是不同于p l k 2 ，p l k 3 的蛋 白水平在细胞周期中保持相对恒定1 3 引。p l k 3 有很多生物学功能似乎都与p l k l 相反，比如，鼠p l k l 的过表达导致致癌转化 n2 1 ，而过表达人p l k 3 会抑制细 胞生长诱导凋亡【1 1 3 1 。在d n a 损伤应答中也是如此，p l k 3 会在表达水平不变的 情况下活性迅速上升6 9 1 。p l k 3 会在d n a 损伤或者纺锤体损伤的情况下被磷酸 第一章引言 化激活，但是在正常有丝分裂中不会被激活【3 4 1 。在d n a 损伤之后，检验点激酶 a t m 会特异的上调p l k 3 的激酶活性【3 4 1 ，而且c h k 2 与p l k 3 的相互作用也会增 强并激活p l k 3 1 1 引。 p l k 3 与p l k l 有共同的磷酸化底物，但是磷酸化位点不同。比如在d n a 损伤应答中，p l k l 与p 5 3 结合，抑制它的反式激活活性以及促凋亡功能【7 0 1 ，而 p l k 3 通过磷酸化p 5 3 的$ 2 0 位点促进p 5 3 的功能，导致细胞周期阻断以及细胞 凋亡【6 引。另一个p l k 3 与p l k l 的共同底物是c d c 2 5 c 。p l k l 磷酸化c d c 2 5 c 的 $ 1 9 8 位点，使其活化并向核内运制6 1 】。而p l k 3 对c d c 2 5 c 的磷酸化位点及功 能还存在争论：一种研究发现p l k 3 在体外主要在s 19 1 位点磷酸化c d c 2 5 c ，对 s 1 9 8 的作用很小，而且这些位点的磷酸化导致c d c 2 5 c 在核内积累 1 1 习；另一种 研究发现$ 2 1 6 是p l k 3 在体外磷酸化c d c 2 5 c 的主要位点【1 16 1 ，而这个位点的磷 酸化导致c d c 2 5 c 在胞质定位并抑制其功能。p l k 3 在体内如何磷酸化c d c 2 5 c 并影响其定位还需要进一步验证，但是在d n a 损伤导致分裂阻断的细胞中发现， c d c 2 5 c 没有活性而p l k 3 的活性上调，所以p l k 3 很可能将c d c 2 5 c 滞留在细 胞质中抑制其活性。 1 1 5 4p l k 4 的作用 鼠p l k 4 的m r n a 水平在g 1 期晚期开始升高，在s 期和有丝分裂期持续上 升，在下一周期的g l 期早期下斛1 1 。而p l k 4 的蛋白表达和激酶活性是否具有 相似的调节机制还不清楚。与p l k l 相似，p l k 4 对于细胞存活是必需的。在c h o 细胞中表达鼠p l k 4 的反义片段会抑制细胞生长【3 】，而在h e