（发酵工程专业论文）乳蛋白水解物对益生菌增殖作用及存活力的影响.pdf

中文摘要 摘要 研究已经证实，发酵乳中益生菌只有达到一定的数量才具有改善宿主健康的作用，因 此对含益生菌的发酵乳制品而言，保持产品中益生菌一定的生物量及生存能力，对该类产 品发挥应有的生物学功效是至关重要的研究课题，也是微生态制剂研究丌发的重点内容。 本文选用嗜酸乳杆菌( l a c t o b a c i l l u sa c i d o p h i l u s1 1 8 5 4 ) 和嗜酸乳杆菌与嗜热链球菌 ( s t r e p t o c o c c u st h e r m o p h i l u s6 0 3 8 ) 的混合菌对牛乳进行发酵，系统研究了乳源蛋白水解产 物对发酵牛奶中的嗜酸乳杆菌和混合菌种的细胞增殖数量和存活能力的影响。本研究首先 利用酶法水解乳源蛋白，制成不同水解度的酶解产物，作为益尘菌促进细胞增殖和提高制 品的益生菌生存能力的促进剂。接着研究优化和确定了嗜酸乳杆菌和混合菌种发酵酸乳的 最佳发酵条件：然后添加促进剂于1 l 的牛奶培养基中，当p h 值达到4 5 时，终止发酵， 获得发酵乳产品；最后利用活菌平板计数的方法，考察了所制备的盏生菌促进剂对菌种的 促进增殖作用和提高含益生菌发酵乳产品于4 c 保存3 5 天后的生存能力。实验结果表明： 三种乳源蛋白水解的最佳条件分别为：酪蛋白为底物碱性蛋白酶最佳水解条件为：加酶 量o 5 m l ，底物浓度8 ，水解时间5 4 0 0 s ，温度6 0 ，最大水解度为1 2 6 。乳清蛋白 为底物碱性蛋白酶最佳水解条件为：加酶量o 5 m l ，底物浓度8 ，水解时问5 4 0 0 s ，温度 6 0 ，最大水解度为6 8 7 。酪蛋白为底物胰蛋白酶最佳水解条件为：加酶量5 m l ，底 物浓度8 ，水解时间7 2 0 0 s ，温度5 0 ，最大水解度为1 4 9 。这三种乳源蛋白水解的产 物中，酪蛋白胰蛋白酶水解1 0 0 0 s ，水解度为6 2 时的水解产物对益生菌的增殖及存活能 力的影响效果都是最佳的，使用此条件下的水解产物发酵酸乳，可使活菌数达到 7 6 1 0 3 c f u m l ，是对照发酵乳的1 3 倍。在4 c 保存3 5 天后，活菌数仍能达到4 7 x 1 0 8 c f u m l ， 是对照发酵乳的3 2 倍，效果是十分明显的。实验得出嗜酸乳杆菌和嗜热链球菌混合菌种 发酵最佳条件为：菌种配比为嗜酸乳杆菌：嗜热链球菌= 2 ：l ，接种量为6 ，发酵温度为 4 1 。添加酪蛋白胰蛋白酶水解1 0 0 0 s ，水解度为6 2 时的水解产物后，混合菌发酵乳在 m r s 和m 1 7 培养基中平板计数与对照差异不大，分别为5 1 1 0 8 c f u m l 和9 o x l 0 8 c f u m l ， 但在4 c 保存3 5 天后，分别为1 2 9 x 1 0 8 c f u m l 和5 9 5 x 1 0 8 c f u m l ，达到对照的2 倍和2 3 倍。 关键词：益生菌，水解产物， 存活力 英文摘要 t ot h ef e r m e n t e dm i l k sc o n t a i n i n gp r o b i o t i c s ，k e e p i n gt h ec e l lc o u n t sa n ds t a b i l i t yo f p r o b i o t i e b a c t e r i ai sm o s ti m p o r t a n tf o re x e r t i n gf u n c t i o n a le f f i c a c y i nt h ep r e s e n tw o r k , t h ee f f e c to f m i l k p r o t e i nh y d r o l y s a t e so np r o b i o t i ec e l lc o u n t sa n di t ss t a b i l i t yd u r i n gf i v ew e e k ss t o r a g ew a s s t u d i e d p r o b i o t i cb a c t e r i a , l a c t o b a c i l l u sa c i d o p h i l l u s1 18 5 4w a su s e d 硒p u r ec u l t u r eo ri n m i x e dc u l t u r ew i t hs t r e p t o c o c c u st h e r m o p h i l u s6 0 3 8 p r o t e o l y t i ce n z y m e ，a l c a l a s en o v oa n d t r y p s i nw a su s e dt oh y d r o l y z ec a s e i n f i r s t h y d r o l y z em i l kp r o t e i n sw i t ht w oe n z y m e sf o r d i f f e r e n tt i m e ，t h em i l kp r o t e i n s h y d r o l y s a t e sh a v ed i f f e r e n td e g r e e so fh y d r o l y s i s ，t ot h e g r o w t ho f 工a c i d o p h i l u s1 1 8 5 4w e r ei n v e s t i g a t e db ya d d i n gh y d r o l y s a t e st om i l ka ta c o n c e n t r a t i o nr a n g i n gf r o m0 1t o4 9 l t h e nk e e pt h ec u l t u r ea t3 7 cu n t i lp h4 5 t h eg r o w t ho f p r o b i o t i cb a c t e r i aw a se s t i m a t e du s i n gc o l o n yp l a t ec o u n t s t h eo p t i m a lo fc o n d i t i o nt op e r f o r m e n z y m a t i cm i l kp r o t e i n sh y d r o l y s i sa l e ( l ) c a s e i nh y d r o l y z ew i t ha l c a l a s e ，am a x i m u md e g r e eo f h y d r o l y s i sc o u l db eo b t a i n e dw h e nt h ea m o u n to fe n z y m ea l c a l a s ea d d e dw a so 5 m l t h e c o n c e n t r a t i o no fs u b s t r a t e sw a s8 ，t h et i m eo fo v e r a l lp r o t e o l y t i cr e a c t i o nw a s5 4 0 0 s ，a n dt h e r e a c t i o nt e m p e r a t u r ew a s6 0 c t h ef i n a ld e g r e eo fh y d r o l y s i sa tt h ee n do f5 4 0 0 sr e a c t i o nw a s 1 2 6 蓬) w h e yh y d r o l y z ew i t ha l c a l a s e am a x i m u md e g r e eo fh y d r o l y s i sc o u l db eo b t a i n e d w h e nt h ea m o u n to fe n z y m ea l c a l a s ea d d e dw a s0 5 m l ，t h ec o n c e n t r a t i o no fs u b s t r a t e sw a s8 ， t h et i m eo fo v e r a l lp r o t e o l y t i cr e a c t i o nw a s5 4 0 0 s a n dt h er e a c t i o nt e m p e r a t u r ew a s6 0 t h e f i n a ld e g r e eo fh y d r o l y s i sa tt h ee n do f5 4 0 0 sr e a c t i o nw a s6 8 7 c a s e i nh y d r o l y z ew i t h t r y p s i n am a x i m u md e g r e eo f h y d r o l y s i sc o u l db eo b t a i n e dw h e nt h ea m o u n to f e n z y m ea l c a l a s e a d d e dw a s0 5 m l ，t h ec o n c e n t r a t i o no fs u b s t r a t e sw a s8 ，t h et i m eo fo v e r a l lp r o t e o l y t i c r e a c t i o nw a s7 2 0 0 s ，a n dt h er e a c t i o nt e m p e r a t u r ew a s5 0 c t h ef i n a ld e g r e eo f h y d r o l y s i sa tt h e e n do f7 2 0 0 sr e a c t i o nw a s1 4 9 0 , 6 a m o n gt h et h r e em i l kp r o t e i nh y d r o l y s a t e s ，t h eb e s tt ot h e g r o w t ho fp r o b i o t i ci sc a s e i nh y d r o l y z ew i t ht r y p s i n 、v i t l lad e g r e eo fh y d r o l y s i si s6 2 a n d a d d e da tl e v e lo fl g l w h e ni ta d d e di nm i l kw i t hp r o b i o t i cl a c t o b a c i l l u sa c i d o p h i l l u s1 1 8 5 4 ， t h ec e l lc o u n ti sa b o u t7 6 x 1 0 5 c f u m l ，i s1 3t i m e so f c o n t r 0 1 a f t e raf i v ew e e k ss t o r a g ea t4 ， t h ec e l lc o u n ti sa b o u t4 7 10 8 c f u m l i s3 2t i m e so fc o n t r 0 1 1 r i 壕o p t i m a lc o n d i t i o no fm i l k f e r m e n t e dw i t hs t r e p t o c o c c u st h e r m o p h i l u s6 0 3 8a n dl a c t o b a c i l l u sa c i d o p h i l l u si 18 5 4m i x e d t o g e t h e ri s 1 ：2i n o c u l u mr a t i o ，t h ef e r m e n t i o nt e m p e r a t u r ei s4 1 ，w i t h6 f e r m e n ts t a r t e r w h e n a d d e dt h ec a s e i nh y d r o l y s a t ew i t ha ad e g r e eo fh y d r o l y s i si s6 2 a n da d d e da tl e v e lo fl g l i n t ot h em i x e dc u l t u r e ，f e r m e n t e dt op h4 5 ，a f t e raf i v ew e e k ss t o r a g ea t4 c ，t h ec e l lc o u n ti n m r sa n dm 1 7c u l t u r ea r e1 2 9 x 1 0 8 c f u m la n d5 9 5 x 1 0 8 c f u m l ，i s2a n d2 3t i m e so fc o n t r o l r e s p e c t i v e l y 英文摘要 t h i sr e s u l ts h o w st h a tt h ea d d i t i o no f c a s e i nh y d r o l y s a t e sh a sap o s i t i v ee f f e c to nt h ep r o b i o t i c c e l lc o u n ta n dm i c r o b i o l o g i c a ls t a b i l i t yo ff e r m e n t e dm i l k sc o n t a i n i n gp r o b i o t i cb a c t e r i aw h e n c o n t r o l l e dw i s e l y t h er e s e a r c hw o r kh a s i ni m p o r t a n tt h e o r e t i c a la n dp r a c t i c a lv a l u eb yh e l p i n g d a i r yi n d u s t r ym e e ti n t e r n a t i o n a ls t a n d a r d so f p m b i o t i cp r o d u c t s k e y w o r d s ：p r o b i o t i c s ，h y d r o l y s a t e ，s t a b i l i t y 第一章前言 第一章前言 1 1 课题研究背景 1 1 1 益生菌的概念 益生菌( p r o b i o t i c ) 又称微生态调节剂、生态制品、活菌制剂，是指能够促进肠内菌群生 态平衡。对宿主起有益作用的活的微生物制剂。益生菌至少应包括两个性质：一是此微生物 是活的；二是能够引出另外的营养学益处【“。1 9 6 5 年，l i l l ys t i l l w e l l 把益尘菌描述为一种微 生物产尘的可以刺激其它微生物生长的物质，是与抗生素作用相反的物质。1 9 7 4 年p a r k 定 义为益生菌是有利于肠道平衡的有机物质，这一定义将抗生素也包括在内。1 9 8 9 年f u l l e r 把益生菌定义为能够促进肠内菌群生态平衡，对宿主起有益作用的活微生物制剂，这是目 前人们最常用的定义。1 9 9 4 年有人对益生菌的定义又作了修订：“益生菌是含活菌和死菌包 括其组分和产物的细菌制品，经口或其它粘膜途径投入，旨在改善粘膜表面微生物或酶的 平衡或者刺激特异性或非特异性免疫机制”。目前在世界范围内，学者们对其定义还存在着 争议【舶。与益生菌相近的术语包括微生态制剂、微生物生长促进剂，直接饲喂微生物等。 有人认为益生菌可以是单一菌株，也可以是多种菌株的发酵产物。目前普遍认为作为益生 菌的细菌应该具备以下条件：( 1 ) 对宿主有益；( 2 ) 无毒性作用和无致病作用；( 3 ) 能在消化 道存活；( 4 ) 能适应胃酸和胆盐：( 5 ) 能在消化道表面定殖；( 6 ) 能够产生有用的酶类和代谢 物：( 7 ) 在加工和贮存过程中能保持活性；( 8 ) 具有良好的感官特性【3 】。 1 1 2 益生菌的功能 1 1 2 1 粘附特性 益生菌粘附到肠道表面，然后定居在人的胃肠道，被认为是益生菌发挥作用的重要条 件。粘附的益生菌可在肠道停留更多的时间，这样可以有更好的代谢和免疫调节作用。粘 附的益生菌与粘膜表面发生相互作用，可以有效地刺激免疫反应。粘附也可以起竞争排斥 作用，把病原菌从肠道上皮排除出去。体外实验证明，粘附的嗜酸乳酸杆菌可以有效的抑 制病原菌在肠道的粘附和生长【4 1 。 1 1 2 2 免疫调节特性 益生菌的粘附作用可激起免疫反应。人体实验表明，不同的益生菌对宿主的免疫调节 作用是不同的。鼠李糖乳杆菌g g 和乳双歧杆菌b b 1 2 提取物在体外实验中可抑制淋巴细胞 的繁殖。对于因为食物过敏而患有过敏性湿疹的儿章，服用这两株菌后，可以明显的缓解 l 第一章前言 临床症状。在牛奶过敏者中，鼠李糖乳杆菌g g 可减轻牛奶引起的过敏反应。另外，在患有 节段性回肠炎的病人中，鼠李糖乳杆菌g g 可刺激i g a 免疫反应：在患有轮状病毒腹泻的儿 章中，也有很好的免疫调节和治疗作用 4 6 l 。 1 1 2 3 拮抗特性 益生菌通过产生抗微生物物质或竞争性排除作用来对病原菌产生拮抗作用。大量的研 究放在细菌素上。虽然益生菌可产生细菌素，但细菌素在体内抑制病原菌的作用很限制， 因为细菌素仅抑制相似的种，如其它乳酸杆菌或产孢子的杆菌或梭菌。另外，低分子量的 代谢物( 如过氧化氢、乳酸和醋酸、其它芳香化合物) 和次级代谢物可以对很多有害微生物 如沙门氏菌、大肠杆菌、梭菌和螺旋茵产生抑制。鼠李糖乳杆菌g g 在体外产生低分子量的 抗微生物物质( 可能是短链脂肪酸，但不是乳酸和醋酸) ，对厌氧性生物如梭菌、拟杆菌、 双歧杆菌、肠杆菌、假单胞菌、葡萄球菌和链球菌都有很好的抑制作用，但对其它乳杆菌 无抑制作用。在体外，嗜酸乳酸杆菌可降低金黄色葡萄球菌、单核细胞增生李斯特氏菌、 鼠伤寒沙门氏菌、弗氏志贺氏菌、大肠埃系氏菌、肺炎克雷伯氏菌、蜡状芽孢杆菌、绿脓 假单胞菌和肠杆菌的生存能力。有报道指出，嗜酸乳酸杆菌l a l 可产生一种非细菌素的抗 微生物物质( 未确定，但不是乳酸) ，在人体外和体内都可抑制大量的革兰氏阴性和革兰氏 阳性细菌如幽门螺杆菌、金黄色葡萄球菌的生长，但不对乳酸杆菌和双歧杆菌产生抑制i ，】。 1 1 2 4 抗诱变和防癌特性 食品中或胃肠道中的细菌的抗诱变和防癌特性已经研究了好多年，其防癌特性被认为 有以下几种类型：结合和降解前致癌物质、产生抗诱变化合物、在肠道中调节前致癌物酶、 通过免疫反应机制抑制肿瘤。在体外着重研究了从发酵乳制品和发酵非乳制品中分离出的 乳酸菌株( l a c t o b a c i l l u s ，l a c t o c o c e u s ，l e u c o n o s t o e ，e n t e r o c o c c u s ，p e d i o c o c c u s ) 的抗诱变( 主 要是结合诱变剂) 和防癌特性。然而，抗诱变特性决不是乳酸菌的典型特性，这一特性许多 革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌都有，因为很多细菌( 包括酵母) 在体外都能结合诱变剂。而 且，死的细菌细胞也能结合诱变剂和致癌物质。人体实验中，益生菌可降低排泄诱变和排 泄酶活性，与诱变剂和致癌物的活性有关。排泄的酶包括硝基还原酶和b 一葡萄搪苷酸酶， 都能在结肠中将前致癌物转为致癌物。人体实验表明，嗜酸乳酸杆菌n c f b l 7 4 8 、干酪乳 杆菌s h i r o t a 、加氏乳杆菌a d h 都可以降低b - 葡萄糖苷酸酶、硝基还原酶的活性l o j 。 1 1 3 益生菌的临床应用 2 第一章前言 1 1 3 1 延缓衰老 儿童和成年人的排泄物中细菌是不同的，儿章中有更多的双歧杆菌和兼性厌氧菌，成 年人中有更多的畸形菌体。胃肠炎等疾病可改变细菌的生物化学性质和形状。经过抗生素 治疗，畸形的微生物在儿童中也会提高很多。食用益生菌食品，可以使肠道的菌群恢复平 衡，并能帮助控制抗生素治疗的负面影响p 1 。 随着健康保健、生活水平的提高，很多人能活到高龄。但是衰老的一个最重要的变化 是萎缩性胃炎和不能分泌胃酸。这种疾病几乎影响了三分之一的老年人，直到最近人们才 发现大多数情况是因为感染了幽门螺杆菌1 7 1 。萎缩性胃炎病人缺少胃酸，可以导致小肠道 细菌的过量生长，而影响大量微量营养素的吸收。乳糖消化不良也是老年人常见症状。所 以，食用益生菌对老年人是非常有益的，可以延缓衰老。 1 1 3 2 治疗胃肠道紊乱 大量的临床试验使用益生素作为功能组分预防和治疗不同类型的胃肠道感染。早期的 研究结果并不一致，可能是因为使用的制剂类型、方法、发酵乳品中使用的菌株不同。在 肠道感染研究中使用了多株嗜酸乳杆菌。嗜酸乳杆菌n c f b l 7 4 8 、嗜酸乳杆菌l a l ( 最近鉴 定为l j o h n s o n i i ) 、l g o 以及干酪乳杆菌s h i r o t a 、l a c t o b a c i l l u s j o h n s o n i i 、l g g 可以在人 体的胃肠道中定植【8 】；与乳品工业中经常使用的发酵剂菌株乳杆菌或链球菌相比，更强烈 地粘附在人肠道细胞和口腔细胞。当摄入l g g 菌，无论摄入冻干粉或含该菌的发酵乳， 其在粪便中的菌数都可以达到1 0 6 c f u g 佗l 。g g 菌产生大量的抗菌物质，有大范围的抑菌谱。 意大利的几项研究试验了含有粪肠球菌( e n t e r o c o c c u s f a e c i u m ) 菌株6 8 ( s f 6 8 ) 的制品， 可以治疗急性胃肠炎和肠道紊乱。粪肠球菌是在健康成年人的粪便中发现的一种肠球菌。 粪肠球菌6 8 有几个优点使之更加适合做益生素。该菌代时很短( 2 0 m i n ) ，在酸性p h 值比 嗜酸乳杆菌更为稳定，产生的细菌素对有些肠道性病原菌有抑制作用【9 1 。 a 溃疡人们发现，患有溃疡的病人很少吃发酵的奶制品和蔬菜，而是食用了大量的奶、 肉和面包。所以，多食用发酵奶制品可降低溃疡的发病，而多喝奶可以提高溃疡的发病率。 有研究证明，细菌数为1 0 9 的嗜酸乳杆菌和两歧双歧杆菌可治疗胃炎和十二指肠炎 9 1 。 b 腹泻益生菌对细菌腹泻的作用主要是产生了抗微生物物质。从而抑制了大肠杆菌的 肠毒素的产生。g a l l a h e r e ta 1 研究了双歧杆菌的特性和在奶制品中的稳定性，并且证明了 双歧杆菌和嗜酸乳酸杆菌在降低人肠胃胀气和调节艰难梭菌腹泻的作用1 1 0 】。 第一章前言 c 食品过敏一些研究表明，益生菌能激起病人对萎缩性皮炎和食品过敏的内源阻碍机 制，从而能减轻肠道发炎，可作为控制食品过敏的有效- r 乒1 , 1 1 0 l 。 d 幽门螺杆菌感染如果胃肠道中缺少乳酸杆菌，病原菌幽门螺杆菌就会出现。研究也 表明，双歧杆菌数量降低，肠细菌的数量就会迅速上升。儿章中因幽门螺丰下菌感染引起的 胃与十二指肠炎，用含乳酸丰t 菌和双歧杆菌的益生菌治疗是非常有效的。乳酸杆菌和双歧 杆菌可防止幽门螺杆菌感染的主要原因是产生了大量的乳酸，从而抑制了幽门螺杆菌的生 长【l o l 。 e 乳糖不耐性添加乳酸杆菌可以增加乳酸发酵，从而可减轻乳糖不耐性的症状。机理是 乳酸杆菌和双歧杆菌都能分泌一种可消化乳糖的酶1 1o 】。 f 便秘便秘是食用西餐的人群经常出现的一种症状，老年人也会出现。利用嗜酸乳杆 菌n f c b l 7 4 8 、干酪乳杆菌s h i r o t a 、乳杆菌g g 减轻便秘。值得注意的是乳制品，如干酪也 可以影响胃肠的蠕动以及便秘。另外乳杆菌g g 制备的酸奶对粪便的含水量以及粪便的硬度 有影响嘲。同时，粪便的p h 值以及粪便中的氨浓度也降低。l a c t u l o s e 和l a c t i t o l 也可以部 分促进乳酸菌减轻便秘的作用【l i l 。 1 1 3 3 治疗癌症 人类肿瘤的产生在很大比例上是由饮食习惯引起的。发酵奶中的乳酸杆菌是有抗诱变 和防癌作用的。如干酪乳杆菌s h i r o t a 被证明对一些癌症病人有效，它能降低表面膀胱癌的 复发，并且能延长生命和延长子宫颈癌复发的白j 隔时问【1 2 l 。然而，虽然有证据表明益生菌 在体外和动物实验中有抗诱变和防癌作用，但是益生菌在人体内防癌的机理仍然有很大争 议。 目前用于益生菌制品的菌株见下表1 8 1 ： 第一章前言 表1 1 用于益生菌制品的菌株 1 1 4 益生菌安全性 早在数个世纪以前的古秀膳和埃及，人们普遍认为微生物在肠道会对机体产生负面影 响，当时内科医生常常用去除结肠的方法来消除所谓“有害菌”对机体的影响，这一观点一 直持续到1 9 世纪。直n 2 0 世纪初，俄国学者m e t c h n i k o 跟出相反的论点，认为食人乳酸菌 能对机体产生有利影响，成为益生菌理论的创始人，为以后乳酸菌发酵物的大量使用奠定 了基础。双歧杆菌、乳酸杆菌一直被认为是安全的，关于其有害的报道很少。但随着科学 的不断发展，对益生菌安全性的认识也在发生变化。近年发现，乳酸辛t 菌、明串株菌、片 球菌、肠球菌和双歧杆菌经常能够从许多感染的病变组织中分离出来。这些报道引起了人 们对益生菌安全性的重新认识。但目胁还没有直接的证据表明感染部位的益生菌诱发了组 织感染。感染部位出现益生菌是排斥该感染组织其他病原还是协同其他病原的感染现在还 不清楚。值得一提的是菌株传递到达组织并不一定产生致病性，一些有益菌在对机体起币 面作用的同时。会传递到组织，但不表现致病性( y a m a z a k i ，1 9 9 1 ) 1 2 2 1 。由于这一结果是通 过无菌健康的试验动物获得的，对于普通动物感染状况下，那种被认为安全的益生菌的传 递到底意味什么，还有待于进一步的研究。相信这一研究对益生菌安全性的定位有重要的 意义。 第一章前言 ( 1 ) 安全性的评价益生菌安全性评价一般包括病原性、毒性，代谢活性及菌株内在特性 作为指标。通过体外研究、动物试验和人临床研究来评价菌株的安全性，现在多采用无特 定病原和无菌动物采研究菌株的病原性及毒性。y a m a z a k i ( 1 9 9 1 ) 将长乳杆菌b b 5 3 6 d 服无 菌小鼠，在l 2 周后发现该菌已经由肠壁传递到肝、肾等组织，但并没有导致这些组织衰 竭和小鼠死亡，并且4 周后这些菌在组织中消失。同时用大肠杆菌攻击无菌小鼠，几周后 发现大肠杆菌传递到很多组织，小鼠死亡。当用大肠杆菌和长乳杆菌联合攻击小鼠时，小 鼠并未死亡，说明长乳杆菌对大肠杆菌有一定的抑制作用，用这个试验模型可以进行益生 菌病原性检测阱1 。关于益生菌代谢活性安全性研究主要集中在它们是否产生氨、胺、吲哚、 苯酚、致癌亚胆酸及降解黏膜的酶类上( c h e a h ，1 9 9 0 ) 。细胞凝集活性是从细菌表面特性方 面来评价安全性的1 个指标，h a r r y ( 1 9 9 3 ) 报道，各种微生物的凝集反应强度不同，与它们 表面蛋白的结构和性质有关。这些蛋白很可能与机体的组织细胞或血细胞结合，而对机体 产生毒害作用。所以通过凝集反应可以反应细菌细胞特性。同时，所选用的益生菌株应该 没有抗药性，研究结果表明很多自然性有益菌，如乳酸杆菌、肠球菌和双歧杆菌的一些菌 株，都有产生抗药性甚至复合抗药性的报道( m a s k e l l ，1 9 9 2 ) i b l 。为了避免源于益生菌剂的 菌株抗药性在机体中的传递及对内源性菌产生不良的诱导，所用益尘菌株应该没有抗药 性。 1 1 5 嗜酸乳杆菌及应用状况 嗜酸乳杆菌( l a c t o b a c i l l u sa c i d o p h i l u s ) 是人体肠道中的重要微生物，与人体的健康息息 相关。当其达到一定数量时，它能改善调节人体肠道微生物菌群的平衡、增强机体的免疫 力、降低胆固醇水平、缓解乳糖不耐症以及抑制肿瘤细胞形成等等，即起到健康促进效果 ( p r o b i o t i ce f f e c t s ) 。含有嗜酸乳杆菌的乳制品，被誉为“2 l 世纪的食品”【2 1 。 嗜酸乳卡t 菌存在于人类和一些动物的小肠内，它在代谢过程中能产生乳酸，过氧化氢， 乳酸杀菌素，和类细菌素，从而抑制肠道内有害菌的生长，调整胃肠环境同时嗜酸乳杆菌 还有防治结肠癌和降低体r h n b _ 固醇含量的作用。由于嗜酸乳杆菌优良的保健功能及耐酸和 耐胆汁特点，因而被称为第三代乳酸发酵剂，发展前景十分广阔。 a c i d o p h i l u s 为g + 菌，形态呈细长杆状，最适生长温度为3 5 3 8 ，2 0 以下不生长， 耐热性差。最适p h 为5 5 6 0 ，耐酸性强，能在其它乳酸菌不能生长的环境中生长繁殖。 能利用葡萄塘、果糖、乳糖、蔗糖进行同型发酵，发酵产生d l 型乳酸：蛋白质分解力弱。 广泛存在于人及一些动物的肠道中。是有益微生物菌群，对维持胃肠道的生理功能有重要 6 第一章前言 作用。嗜酸乳杆菌的健康促进作用主要包括：抑制病原微生物在宿主肠道中的存活和生长。 起到屏障作用；减轻和抑制肠道腹泻：增强机体免疫功能；降低胆固醇水平；抑制肿瘤细 胞的形成等。嗜酸乳杆菌在乳中可以分解2 0 5 0 的乳糖，生成乳酸。乳酸不仅具有柔 和的酸味，而且可以抑制肠道内杂菌的生长，以达到调节肠道菌群的作用。而乳糖的部分发 酵可以缓解乳糖不耐症。 ( 注：没有能力消化乳糖被称为乳糖不消化症或乳糖不耐症) 嗜酸乳杆菌在维护肠道微生物生态平衡中起着重要的作用，研究证明，摄入嗜酸乳杆 菌对人体健康有益。嗜酸乳杆菌具有多种生理功能，如：在小肠内可作为乳糖酶源，促进 小肠对乳耱的消化吸收，减少乳糖进入大肠；分泌蛋白酶，促进蛋白质消化吸收：产生乳 酸、醋酸等有机酸，抑制腐败微生物的繁殖；降低p h 值，促进肠道蠕动，利于排泄肠道 内有害物质及感染的病菌，并有利于钙和铁的吸收；产生过氧化氢、嗜酸乳菌素、柔酸乳 菌素及乳酸杀菌素等抗菌物质，有利于防止肠道被病源菌感染。j a c k 等人的研究表明，嗜 酸乳杆菌产生的乳酸杀菌素在p h 为5 0 7 8 范围内是一种广谱抗菌素，对肠杆菌、假单 胞菌、变形杆菌、分枝杆菌片、沙门氏菌、葡萄球菌、乳杆菌、芽胞杆菌和链球菌等都有 一定的抑制作用。 由于嗜酸乳杆菌的生产特性较差，用嗜酸乳杆菌生产发酵乳，因它在乳中生长慢( 产 酸速度低) 而发酵时日j 长，且产品酸涩，风味差，口感不好，保存期短，因而限制了这种 酸奶的发展。因此利用嗜酸乳杆菌和其他乳酸菌的微生态关系可以克服这种缺陷，利用杆 菌和球菌之间相互促进的共生作用，将嗜酸乳杆菌和嗜热链球菌( s t r e p t o c o c c u s t h e r m o p h i l u ) 混合培养以达到更好的效果。( 嗜酸乳杆菌最适温度为3 7 * ( 2 ，嗜热链球菌最 适温度为4 1 5 0 ) 。 1 1 6 益生菌增殖底物( 增效剂) 的研究现状 从实践的角度说，对益生菌增殖最好的方法是联合使用益尘菌及天然来源增效剂。 目i j i 已被研究的增效底物包括：益生素，蛋白质或肽类，不饱和脂肪酸等。 ( 1 ) 益尘素 益生素是一类不被消化的食物成分，可以选择性的被定植在肠道中的一种或几种有益 生菌发酵利用，它们都可以刺激或激活肠动力，以促进机体健康。其标准是：不被宿主胃 肠道消化或吸收；只能被一种或有限几种肠道菌利用；能改善肠道菌群组成，增进宿 主健康：诱导肠腔内系统性免疫，改善宿主体质。属于益生素的有低聚糖类，如低聚果 糖( f r u c t o o l i g o s a c c h a r i d e ，f o s ) 、低聚木糖( x y l o o l i g o s a c c h a r i d e ，x o s ) 、低聚半乳 第一章前言 糖( g a l a c t o - o l i g o s a c c h a r i d e ，g o s ) 、低聚异麦芽糖等；微藻类如螺旋藻、节旋藻等，还 有一些天然植物，包括蔬菜、中草药、野生植物等【2 4 i 。 益生素可促进体内双歧杆菌等有益菌的代谢和增殖。i t o 等( 1 9 9 0 ) 报道：f o s 与t o s ( 乳糖，t r a n g a l a c t o o l i g o s a c c h a d d e ，t o s ) 可促进人体内双歧杆菌和乳酸杆菌的增殖而 抑制病菌源菌，如大肠杆菌、梭状芽孢杆菌和沙门氏菌的生长。螺旋藻等一些微藻类益生 菜素进入机体后可被选择性吸收，增加双歧杆菌数，减少病原菌数p 1 。 o n d o n k o r 等人( 2 0 0 5 ) 把玉米淀粉和菊粉分别按0 5 、1 o 、1 5 ( w v ) 的量添 加到由la c i d o p h i l u sl a f t il 1 0 ，l a c t o b a c i l l u sc a s e il a f t il 2 6 ，厶d e l b r u e c k i i s s p b u l g a r i c u s l b l 4 6 6 和s t r e p t o c o c c u s t h e r m o p h i l ws t l 3 4 2 四种菌共同发酵的酸奶中，并在4 c 2 8 天保存的过程中检测益生菌细胞数量、益生菌代谢及蛋白水解活性、酸奶粘度等指标。结 果表明，添加菊粉的酸奶中益生菌的数量一直保持在8 0l o gc f u g 以上，玉米淀粉添加量在 一个较低的浓度( o 5 1 o ) 时益生菌的产生丙酸能力及蛋白水解能力都有所增强，且酸 奶中游离氨基酸的含量增加。添加了玉米淀粉或菊粉的益生菌酸奶的粘度都有所增加。 ( 2 ) 蛋白质或肽类 c j a n e r 等人( 2 0 0 3 ) 用实验证实【1 6 1 ，从牛奶或从山羊和绵羊奶中共同提取的酪蛋白 巨肽( c a s e i n o m a c r o p e p t i d e ，c m p ) 和乳清蛋白的浓缩物( w h e yp r o t e i nc o n c e n t r a t e ，w p c ) ， 可以促进牛奶中b i f i d o b a c t e r i u ml a c t i s 的生长。向牛奶t 9 ：j l l 2 , 2 c m p 经过3 7 c ，2 4 h 培养， 活菌数比不加c m p 高一个数量级( 1 0 8 c f u m l ) ：而加入2 w p c 相同条件培养2 4 h ，活菌数 可达1 0 9 c f u m l 。 。 i s o d i n i 等人( 2 0 0 2 ) 通过分别向l a c t o b a c i l l u sa c i d o p h i l u sl a 5 和l r h a m n o s u sl r 3 5 的 牛奶培养基中添加两种乳蛋白浓缩物和两种酪蛋白水解物的实验，得出两种酪蛋白水解物 对这两株益生菌在牛奶培养基中生长都有促进作用，而且在冷藏五星期后，活菌数量还保 持在1 0 f u m l 以i - i 8 1 。 m n o l i v e i r a 等人( 2 0 0 1 ) 通过向含l a c t o b a c i l l u sa c i d o p h i l u s ( l a 5 ) 和l a c t o b a c i l l u sr h a m n o s u sf l c 3 5 ) 混合菌种的培养基中分别添加乳清蛋白水解物、酪蛋白水 解物及乳蛋白，得出这三种添加剂都可以使发酵时间缩短，尤其是酪蛋白水解物，比使用 其它添加剂的发酵时间缩短5 5 ，而且所有添加剂发酵的酸乳都含1 0 7 c f u m l 以1 - 益生菌数 【l9 l 。 第一章前言 a l u c a s 等人( 2 0 0 4 ) 用三种酪蛋白水解物和三种乳清蛋白水解物作为l a c t o b a c i l l u s a c i d o p h i l u sl a - 5 和s t r e p t o c o c c u st h e r m o p h f f u ss t - 7 混合菌种的发酵促进剂，分别添加到含 有这两株菌的牛奶培养基中，结果显示加入乳蛋白水解产物可明显缩短发酵时间，而且在 贮藏的过程中菌种呈现出较高的存活率1 2 0 l 。 ( 3 ) 不饱和脂肪酸 p a s ie 1 a n k a 柚p 勰等人( 2 0 0 0 ) 实验证实2 。1 ，1 , - l i n o l e n i ca c i d ( 丫亚麻油酸) i f l a r a c h i d o n i e a c i d ( 花生四烯酸) 在低浓度( 5 “g m l ) 时可促进c a s e is h i r o t a 的生长。 u n d a s ( 2 0 0 2 ) 实验证实【2 3 1 ，母乳中富含长链多不饱和脂肪酸( i o n g c h a i np o l y u n s a t u r a t e d f a t t ya c i d s ，l c p u f a s ) ，它们具有免疫调节功能。益生菌和l c p u f a s 可以调节t h e l p1 和2 的反 应，起到抗生素的作用，可以减轻由过敏引起的炎症反应。l c p u f a s 促进益生菌粘附到肠 道黏膜上，从而增强了益生菌促进健康的作用。 ( 4 ) 其它 嗜酸乳杆菌是一种兼性厌氧菌，在氧气含量较低时易生长。抗坏血酸( v c ) 可以作为 除氧剂，被允许加入到果汁和其它产品中【2 4 i 。研究表明，氧气含量低时，嗜酸乳杆菌的生 物量增加。 嗜酸乳杆菌代谢产酸速率低，主要是由于其厌氧的糖代谢酶系、氧化还原电势和微量 元素所致，在发酵液中添加降低氧化还原电势物质以及生长促进物质可促进嗜酸乳杆菌生 长。半胱氨酸是一种含硫氨基酸，它在提供氨基的同时也降低了氧化还原电位。嗜酸乳杆 菌在添自f i 2 5 0 或5 0 0 m g l 半胱氨酸的酸奶中的数量高于不加或添办t 1 5 0 m g l 的酸奶中的数量 1 3 0 】。 在乳酸菌中，酸奶细菌具有很商的乳糖分解酶活性，乳糖分解酶或b 一半乳糖苷酶是一 种胞内酶，通过超声波可使b 半乳糖苷酶的活性提高几倍，释放出的p 半乳糖苷酶能部分 降解牛乳中的乳糖，其降解产物如葡萄糖、半乳糖等能够被生长缓慢的菌体，如嗜酸乳杆 菌和双歧杆菌利用。但是，酸奶细菌在裂解的同时也降低了其自身的数量。在利用破裂的 酸奶细菌和完整的嗜酸乳丰t 菌和双歧杆菌的细胞制备的酸奶中，益生菌的数量明显提高。 经6 周贮存后，其活菌数依然高于所要求的1 0 6 c 削m l l l 1 9 1 。 1 1 7 乳蛋白3 ”的作用及利用情况 乳蛋白、乳糖和乳脂构成乳的主要组分，其中乳蛋白是乳中最重要的成分。乳中蛋白 9 第一章前言 质的种类多，含量丰富，分布广泛。乳蛋白主要有酪蛋l 刍( c a s e i n ，c n ) 和乳清 白( w h e y p f o t e i n ) 两大类，此外还有含量相对较少的乳脂肪球膜蛋白( m i l kf a tg l o b u l em e m b r a n e p r o t e i n ，m f g m p ) ( 1 ) 酪蛋白 c n 是乳腺上皮细胞合成的，是乳中特有的一组磷蛋白，含有大量的磷和钙。c n 以磷酸酯 键与丝氨酸的羟基结合，c n 中还含有少量已糖、氨基糖和唾液酸等残基。常乳中，c n 在牛 乳中占总蛋白的8 0 ，在猪乳中可能超过6 0 。乳中c n 分为0 l s c n 、p c n 、t c n 和1 c c n 四种类型，其中y c n 实际上是p c n 的酶解产物 3 2 1 。 c n 是一种有很强相互作用的蛋白质，在乳中有缔合现象。c n 在2 0 c 、p h 4 6 时从脱脂 乳中沉淀析出。c n 含有几乎全部必需氨基酸，是新生幼仔最具营养价值的蛋白质。其次， c n 能增加新生幼仔对钙磷的吸收。c n 在新生幼仔胃肠道蛋白酶作用后，可释放多种生物 活性肽。这些活性肽对幼仔的消化、营养和免疫等发挥调节作用，如牛b c a s o m o r p h i n 和 免疫调节肽。昏c n 还可以刺激新生幼仔胃肠内有益菌落的生长，例如人乳中bc n 可以刺 激婴儿胃肠内双歧杆菌的生长 3 3 l 。 ( 2 ) 乳清蛋白 乳清蛋白是乳去除c n 后，分离出来的乳清中所含的蛋白质。它是一些小的、紧密的球 状蛋白，其独特的氨基酸序列和三维结构赋予它广泛的功能特性。乳清蛋自不仅易于被消 化吸收，而且其必需氨基酸组成完全符合或超出f a o w h o 的要求。乳清蛋白的功能性成 分为p 乳球蛋白占4 8 ，a - 乳白蛋白占1 9 左右，牛乳血清白蛋白占5 ，免疫球蛋白占8 ， 其他的乳铁蛋白。乳过氧化酶，生长因子和许多生物活性因子及酶。这些物质均具有一定 的生物活性，其中增强人体免疫力、促进双歧卡下菌生长、降低癌症发病率等功能现已被证 实。乳清蛋白中还富含半胱氨酸和蛋氨酸，这种含硫氨基酸对人体是非常重要的，它具有 抗肌体氧化作用，并具有在细胞分裂时能稳定d n a 的功能【3 4 】。 乳清蛋白具有胶凝性、乳化性、持水性、替