TMA的原理及应用.ppt

tma的原理及应用 中国医学科学院输血研究所刘鱼 人员培训 方法原理核酸扩增检测的关键环节仪器设备的使用 维护和校准结果的分析 报告及进一步处理质控的分析知其然又知其所以然 优点 检测病毒专一性强 不会出现假阳性缺点 敏感性差 操作时间长 操作复杂 必须在特定的p3实验室中才能进行 且费用较高 有些病毒还没找到合适的培养体系 病毒 anti hiv 1 2anti hcvhiv 1p24hbsag 核酸检测 nat 优点 操作简便 成本低缺点 漏检原因 窗口期病毒变异免疫沉寂 hiv 1hcvhbv 血清学检测 病毒分离培养 病毒感染的检测方法 血清学检测和核酸检测的窗口期比较 窗口期 从感染病毒开始 直至用某种检测方法能够检测到该病原存在为止的这一段时间病毒 核酸 抗原 抗体 10 20 30 40 50 60 70 80 90 0 viralrna agorablevel hiv 1rna abtohiv 1 10 20 30 40 50 60 70 80 90 0 dayspostinfection viralrnaorablevel hcvrna abtohcv p24ag 5 检测窗口期windowperiod 6 全球血液nat检测应用情况 country technology pool idt germany德国 1997年起部分 1999年 月起 全部 netherlands荷兰 1997年起 u k 英国 2000年起 switzerland瑞士japan日本 1997年 月起对原料浆 1999年初起献血者 canada加拿大usa美国 1999年3月起 newzealand新西兰australia澳大利亚singapore新加坡portugal葡萄牙france法国 2000年起 spain西班牙italy意大利hongkong香港台湾 准备中 韩国 2005年1月起 pcrpcrpcrpcrpcrpcrtma pcrtmatmatmatmatma pcrtma pcrtma pcrtmatma pcrtma pcr poolpoolpoolpoolpoolpoolpool idtidtpool idtidtidtpool idtpoolpoolpoolpoolpool 7 美国nat检测结果 natyieldinusa 人份或 人份混合1999 03 2002 03 susanetal nengjmed2004 351 760 768 8 澳大利亚nat检测结果 natyieldinaustralia 5个nat检测点 2个单人份检测 3个24人份检测tma2000年6月7日 2004年11月14日 9 中欧nat检测结果 natyieldincentraleurope rothwk weberm buhrs etal yieldofhcvandhiv 1natafterscreeningof3 6millionblooddonationincentraleurope transfusion 2002 42 862 868 人份混合hcvpcr cobasamplicon rochehivpcr anin housepcr 10 日本nat检测结果 natyieldinjapan 2000 2 1 2002 12 31 jvirolmethods 2003 112 145 151 multiplexhbv hcv hiv 1reagent 50人份 11 法国nat检测结果 natyieldinfrance 2001 7 2003 12 eurosurveill 2005feb1 10 2 epubaheadofprint tma 8或16人份 12 新加坡nat检测结果 natyieldinsingapore 1个nat检测点 单人份检测tma2000年10月 2004年10月 13 韩国nat检测结果 natyieldinkorea 2004年6月14 12月3日 前期评估单采献浆者 24599献血者 15597tmahcvnat阳性 1 40196 hivnat阳性 1 401962005年1月1日起 全面开展 r n makroo n choudhury etal indianjmedres127 february2008 pp140 147huashan fu rongren jing xingwang etal transfusion 2007 47 2011 2016 calculatedrisk 1 000 000rbcunitstransfusedinu s m busch 2001 数据总结 nat检测的必要性 大大降低输血传播传染病的风险检测技术 荧光定量pcr技术 tma检测模式 mp idt我国国情 核酸检测基本原理 核酸检测 一系列直接检测病原体核酸的技术的总称 对靶核酸直接扩增或对其附带的信号扩增 使看不见的极微量的核酸变成直观的光电或可视信号 dna atcgrna aucg杂交或扩增 caagtu pcr 聚合酶链式反应 lamp 环介导等温扩增技术 lcr 连接酶链式反应 sda 链替代扩增 nasba 依赖核酸序列的扩增 tma 转录介导的扩增技术 bdna 多分枝dna杂交信号放大技术 invader 侵染检测技术 核酸提取 靶核酸的直接扩增 信号放大扩增 检测 检测 lamp pcr lcr sda nasba tma bdna 杂交捕获 invader 基因信息流动方向 dna dna 复制 rna 转录 蛋白质 翻译 逆转录 pcr tma pcr原理 dna dna 复制 tma技术的发展历史 tas transcription basedamplificationsystem 转录依赖的扩增系统 1989 kwoh tma的原理 transcription mediatedamplification转录介导的扩增技术模拟dna转录成mrna的自然过程dna模板在反应中作为中介利用2个引物和2种酶 rna聚合酶和逆转录酶 rna聚合酶与dna模板的启动子序列结合等温扩增 41 5 dna rna 蛋白质 转录 翻译 逆转录 tma的反应体系 两种酶 mmlv逆转录酶 t7rna聚合酶两条引物 引物a 带t7rna启动子 引物bdntp ntp tma的原理 t7启动子 非循环相 循环相 逆转录 tma技术和nasba技术比较 tmammlv money鼠白血病病毒逆转录酶 逆转录 rnaseht7rna聚合酶温度 41 5 nasbaamvrt 鸟类成髓细胞性白血病病毒逆转录酶 rnaseht7rna聚合酶温度 41 tma的应用 1 临床检测检测尿液 阴道分泌物及血液中的沙眼衣原体和奈瑟氏淋球菌结核分枝杆菌hiv 1和hcv2 血液筛查hiv 1 hcv二联检测hiv 1 hbv hcv三联检测wnv 西尼罗河病毒 标本 应用举例 检测流程 hiv 1 hbv hcv三联检测 阳性 阴性 dhiv 1分析 dhbv分析 dhcv分析 procleixultrioassay 三个主要步骤 step1 核酸提取 targetcapture tc step2 核酸直接扩增 tma step3 检测 hpadka hiv 1 hcv 与捕获探针杂交 磁珠 与磁珠黏附 释放rna dna addicrna procleixultrioassaystep1 specifictargetcapture 溶解病毒包膜 蛋白质 释放病毒基因组rna dna 与捕获探针杂交 黏附于磁珠不需要单独的提取 纯化和浓缩 m1013 0 hbv procleixultrioassaystep1 targetcapture wash 去除血浆成分和非特异性的dna rna 保留待扩增的dna rna procleixultrioassaystep2 transcription mediatedamplification ic hiv 1 hbv hcv procleixultrioassaystep3 chemiluminescentdetection hiv 1 hcv ic glow glow flash adddetectionreagents hybridizeaelabelprobes hydrolyzeaeunhybridizedprobes rna扩增子 hbv 检测发光 杂交保护 双动力学检测 glow procleixultrioassaystep3 detection dualkineticassay dka 0 2 000 4 000 6 000 8 000 10 000 12 000 0 0 5 1 1 5 2 relativelightunit time seconds procleixhbvdiscriminatoryassaystep3 chemiluminescentdetection hiv 1 hcv ic measurelightemission flash hbv glow adddetectionreagents hybridizeaelabelprobes hydrolyzeaeunhybridizedprobes rna扩增子 procleixhiv 1discriminatoryassaystep3 chemiluminescentdetection hiv 1 hcv ic measurelightemission glow flash hbv adddetectionreagents hybridizeaelabelprobes hydrolyzeaeunhybridizedprobes rna扩增子 procleixhcvdiscriminatoryassaystep3 chemiluminescentd