（纺织工程专业论文）柞蚕丝素壳聚糖共混材料的制备及理化性能的研究[纺织工程专业优秀论文].pdf

柞蚕丝素壳聚糖共混材料的制各及理化性能研究中文摘要 柞蚕丝素壳聚糖共混材料的制备及理化性能研究 中文摘要 本文用再生柞蚕丝素与壳聚糖共混制各柞蚕丝素壳聚糖膜和多孔材料，对制备 条件与材料理化性能之间的关系进行较系统的研究，试图为生物医学领域提供一种新 材料，为后续的应用研究提供材料制备基础。 流延法制备柞蚕丝素壳聚糖膜共混膜，采用1 乙基- 3 ( 3 - - - 甲基氨丙基) 碳化二 亚胺( e d c ) n 羟基丁二酰亚胺( n h s ) 吗啉一乙磺酸( m e s ) 作为交联剂，用x 一 射线衍射、傅立时变换红外光谱和热分析等手段研究了共混膜的聚集态结构，对共混 膜的水溶性、拉伸断裂强度、断裂伸长率、杨氏模量和电学性能等物理性能进行了测 试和分析。结果表明：未经交联的柞蚕丝素壳聚糖膜共混膜的聚集态结构以无定形 和q 螺旋为主。耒交联的柞蚕丝素壳聚糖共混膜的断裂强度、断裂伸长、介电常数 和热水溶失率随着壳聚糖所占比例的增大呈增大的趋势，杨氏模量有减小趋势。经 e d c ns m e s 交联后共混膜的热水溶失率明显减小，说明交联效果显著。与未交联 的柞蚕丝素壳聚糖膜共混膜相比，经交联后膜的断裂伸长率和介电常数增大，拉伸 断裂强度和杨氏模量减小。柞蚕丝素壳聚糖共混膜能较好地支持l 9 2 9 细胞的生长。 冷冻干燥法制各柞蚕丝素壳聚糖共混多孔材料，用x 射线衍射、傅立叶变换红 外光谱和热分析研究了共混多孔材料的聚集态结构，并对交联共混多孔材料的孔结 构、水溶性等理化性能进行了测试和分析。结果表明：未交联的柞蚕丝紊壳聚糖共 混多孔材料的聚集态结构以无定形结构为主，e d c 对柞蚕丝素壳聚糖共混多孔材料 也有明显的交联效果。经交联的柞蚕丝素壳聚糖共混多孔材料，其孔隙率和孔径随 着壳聚糖所占比例的增大和冷冻温度的降低而减小。通过改变工艺条件可以制各出 平均孔径为1 3 4 5 2 7 岬、孔隙率为7 1 9 1 的柞蚕丝素壳聚糖多孔材料。 关键词：柞蚕丝素；壳聚糖：共混膜；多孔材料；e d c 作者：赵婷 指导老师：李明忠 p r e p a r a t i o na n dp h y s i c - c h e m i c a lp r o p e r t i e so f a ps i l kf i b r o i n c h i t o s a nb l e n dm a t e r i a l a b s u a c t p r e p a r a t i o na n dp h y s i c - c h e m i c a lp r o p e r t i e so f a n t h e r a e a p e r n y is i l kf i b r o i n c h i t o s a nb l e n dm a t e r i a l a b s t r a c t t h eb l e n df i l ma n dp o r o u sm a t e r i a lo fa n t h e r a e ap e r n y is i l kf i b r o i n ( a ps f ) c h i t o s a n ( c s ) w e r ep r e p a r e db yb l e n d i n gr e g e n e r a t e da n t h e r a e ap e r n y is i l kf i b r o i n s o l u t i o na n dc h i t o s a ns o l u t i o n t h i sp a p e rt a k e sas y s t e m i cr e s e a r c ho nt h er e l a t i o n s h i p b e t w e e np r e p a r a t i o nc o n d i t i o n sa n dp h y s i c - c h e m i c a lp r o p e r t i e s ，t r y i n gt op r o v i d ean e w m a t e r i a lf o rb i o m e d i c a lf i e l da n dap r e p a r a t i o nf o u n d a t i o nf o rf o l l o w - u ps t u d yo ft h e a p p l i c a t i o n t h ea ps f c sb l e n df i l m sw e r ep r e p a r e db yc a s t i n ga ps f c sm i x t u r es o l u t i o no n a p o l y e t h y l e n ep l a t e ，a n d w e r ec r o s s l i n k e d b y1 - e t h y l - 3 - ( 3 - d i m e t h y l a m i n o p r o p y l ) c a r b o d i i m i d e h y d r o c h l o r i d e ( e d c ) n - h y d r o x y s u c c i n i m i d e ( n h s ) 2 - m o r p h o l i n o e t h a n e s u l f o n i ca c i d ( m e s ) t h ec o n f o r m a t i o n a ls t r u c t u r eo fb l e n df i l m sw a s c h a r a c t e r i z e db yx r d ，f t - - i ra n dd t gt h ew a t e rs o l u b i l i t y , b r o k e nt e n s i l es t r e n g t h ， b r o k e ne l o n g a t i o n ，y o u n g sm o d u l u sa n dd i e l e c t r i cf u n c t i o nm e a s u r e m e n to fb l e n df i l m s w e r et e s t e da n da n a l y z e d r e s u l t si n d i c a t e dt h a tt h e r ew e r em a i n l yr a n d o mc o i li nt h e u n c r o s s q i n k e db l e n df i l m s t h eb r o k e nt e n s i l es t r e n g t h ，b r o k e ne l o n g a t i o n ，w a t e rs o l u b i l i t y a n dd i e l e c t r i cp e r m i t t i v i t yo ft h eu n c r o s s - l i n k e db l e n df i l i i l sh a da ni n c r e a s i n gt r e n dw i t h t h ei n c r e a s i n go fc sp r o p o r t i o nw h i l et h ey o u n g sm o d u l u sh a dad e c r e a s i n gt r e n d t h e w a t e rs o l u b i l i t yo fb l e n df i l m sd e c r e a s e do b v i o u s l ya f t e rc r o s s q i n k e db ye d c n h s v l e s w h i c hi n d i c a t e da s i g n i f i c a n tc r o s s - l i n k i n ge f f e c t c o m p a r i n gw i t ht h et m c r o s s q i n k e db l e n d f i l m s ，t h eb r o k e ne l o n g a t i o na n dd i e l e c t r i cp e r m i t t i v i t yo fb l e n df i l m si n c r e a s e do b v i o u s l y w h i l eb r o k e nt e n s i l es t r e n g t ha n dy o u n g sm o d u l u sd e c r e a s e d t h ea ps f c sb l e n df i l m s c a ns u p p o r tt h ea d h e s i o na n dg r o w t ho fl 9 2 9f i b r o b l a s t i cc e l l s a p s f c sb l e n d p o r o u s m a t e r i a l sw e r e p r e p a r e db yf r e e z e - d r y i n g t h e c o n f o r m a t i o n a ls t r u c t u r eo fb l e n dp o r o u sm a t e r i a l sw a sc h a r a c t e r i z e db yx r d ，f t - ra n d p r e p a r a t i o na n dp h y s i c - c h e m i c a lp r o p e r t i e so f a 。ps i l kh b r o i ni c h i t o s a nb l e n dm a t e r i a l a b s t r a c t d t gt h ep h y s i c - c h e m i c a lp r o p e r t i e ss u c ha sw a t e rs o l u b i l i t ya n dp o r es t r u c t u r ew e r e t e s t e da n da n a l y z e d t h er e s u l t ss h o w e dt h a tt h ec o n f o r m a t i o n a ls t r u c t u r eo fu n c r o s s - l i n k e d a ps f c sb l e n dp o r o u sm a t e r i a l sw a sm a i n l ya m o r p h o u ss t r u c t u r e e d ca l s oh a da n o t a b l ec r o s s q i n k i n ge f f e c tt ot h ea ps f c sb l e n dp o r o u sm a t e r i a l s n ep o r ed i a m e t e r a n dt h ep o r o s i t yr e d u c e dw i t ht h ei n c r e a s i n go fc sp r o p o r t i o na n dt h ef a l l i n go ff r e e z i n g t e m p e r a t u r e b yc h a n g i n gt h et e c h n i c a lc o n d i t i o n ，t h ea ps f c sb l e n dp o r o u sm a t e r i a l s c a nb ep r e p a r e dw i t ht h ea v e r a g ep o r ed i a m e t e rf r o m13 4 1 a mt o5 2 7 9 r a , t h ep o r o s i t yf r o m 7 1 t o9 】 k e yw o r d s ：a n t h e r a e ap e r n y is i l kf i b r o i n ；c h i t o s a n ；b l e n df i l m ；p o r o u sm a t e r i a l ；e d c w r i t t e nb y l i n gz h a o s u p e r v i s e db ym i n g z h o n gl i 苏州大学学位论文独创性声明及使用授权声明 学位论文独创性声明 本人郑重声明：所提交的学位论文是本人在导师的指导下，独立 进行研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文 不含其他个人或集体己经发表或撰写过的研究成果，也不含为获得苏 州大学或其它教育机构的学位证书而使用过的材料。对本文的研究作 出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人承担本 声明的法律责任。 研究生签名：姆日期：删，妇 学位论文使用授权声明 苏州大学、中国科学技术信息研究所、国家图书馆、清华大学论 文合作部、中国社科院文献信息情报中心有权保留本人所送交学位论 文的复印件和电子文档，可以采用影印j 缩印或其他复制手段保存论 文。本人电子文档的内容和纸质论文的内容相一致。除在保密期内的 保密论文外，允许论文被查阅和借阅，可以公布( 包括刊登) 论文的 研究生签名：转日 期：2 骂琶鲤应日 导师签名：奎煎墨日期：丝2 奎鱼! ! ) 日 柞蚕丝素壳聚糖共混材料的制各及理化性能研究第一章引言 第一章引言 1 1 柞蚕丝素蛋白的结构及生物学性能 1 1 1 柞蚕丝素蛋白的结构及理化性能 我国是蚕丝生产大国，蚕生丝产量已占世界总产量的一半以上【1 】对蚕丝蛋白材 料进行深入的研究无论从基础科学还是从应用科学来看都具有重要意义1 2 。丝素是一 种源于蚕丝的天然高分子材料。中国柞蚕是野蚕中最常见的品种，我国柞蚕茧的年产 量达3 - - - 4 万吨，占世界总产量的9 0 【3 1 。柞蚕丝中丝素约占8 4 - 8 5 ，丝胶约占1 2 1 5 。丝胶以无定形颗粒状态包覆于丝素外围具有保护丝素和胶着茧丝的作用1 4 。柞蚕 丝的吸湿性、干湿态强力、耐酸碱性和伸长率都优于桑蚕丝网。 柞蚕丝素是柞蚕五龄后期合成并分泌的一种蛋白。h i d e k is e z u t s u 和k e n # y u k u h i r 0 1 6 报道了根据基因序列推测得到的柞蚕丝素蛋白的氨基酸序列，是由2 6 3 9 个氨 基酸残基( 2 1 6k d a ) 组成，具体包含7 4 个强碱性氨基酸( 赖氨酸、精氨酸) ，1 3 5 个强 酸性氨基酸( 天门冬氨酸、谷氨酸) ，1 2 1 9 个疏水性氨基酸( 丙氨酸、异亮氨酸、亮氨 酸、苯丙氨酸、色氨酸、缬氨酸) 、4 6 0 个极性氨基酸( 天门冬酰胺、半胱氨酸、谷氨 酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸) 。 柞蚕丝素h 链头部t ( n - 末端) 为1 5 5 个残基的氨基酸序列，最头部为1 4 个氨基 酸残基编码序列( m r v i a f v i l c c a l q ) 。头部的保守氨基末端序列将可能成为探索丝 素蛋白分泌的重要信号肽。在组成柞蚕丝素的所有氨基酸中，丙氨酸、甘氨酸和丝氨 酸是组成柞蚕丝素蛋白的三种主要氨基酸，分别占4 3 0 8 、2 7 2 8 和1 1 2 5 。但是 在头部这三种氨基酸的含量不是很丰富，因此头部区域的疏水性与其他区域显示出不 同的特性。除了头部1 5 5 个氨基酸，柞蚕丝素内部含有8 0 个富含丙氨酸的基序，这 部分是亲水区域( 非聚丙氨酸序列) 与疏水区域( 聚丙氨酸序列) 交替排列。柞蚕丝 素蛋白内部由高度的重复序列组成，在1 5 6 - - 2 5 5 5 氨基酸之间，共有7 8 个重复，丰 富的丙氨酸序列心l a ) n - 易形成q 螺旋结构 7 1 。家蚕丝素的结晶区中主要含有重复序列 - ( g i y - x ) n - ，其x 为丙氨酸、丝氨酸或酪氨酸；而柞蚕丝素结晶区中含有大量的( a l a ) n 一 重复序列。组成非晶区的大部分是较大侧链和极性的氨基酸残基，这在柞蚕丝素蛋白 的非晶区更为突出。结晶区与非晶区氨基酸组成和结构的差异使得家蚕和柞蚕丝纤维 的理化性质有较显著差异【7 1 。柞蚕丝素中酸性氨基酸( 天门冬氨酸和谷氨酸) 和碱性 柞蚕丝素壳聚糖共混材料的制备及理化性能研究第一章引言 氨基酸( 赖氨酸、组氨酸和精氨酸) 残基的含量较高，同时柞蚕丝素蛋白中含有大量 带有极性和侧基可电离的氨基酸残基，这些都是化学反应的潜在反应点，因此柞蚕丝 素的化学活性较强【纠o 】。由其氨基酸序列可见，其中含有较多的r g d ( a r g - g l y - a s p ， 精氨酸- 甘氨酸- 天门冬氨酸) 三肽序列，这与哺乳动物细胞有特异相互作用，有利于 其用作生物医学材料时细胞在材料上的黏附和生长，这也是其具备优良的生物学性能 的重要的结构原因之一1 1 1 】。 天然柞蚕丝素蛋白溶液是在吐丝前一天的柞蚕熟蚕的绢丝腺中获得的，它的分子 量为2 1 6k d a 1 2 1 。溶液状态下的天然柞蚕丝素蛋白的结构为a 镖旋和无规卷曲1 1 3 - 1 5 ， 将天然丝素蛋白溶液在室温下干燥，丝素的分子构象主要为a 螺旋和无规卷曲，经热 或者甲醇等有机溶剂处理之后，分子构象由a 螺旋转变为p 新叠结构1 1 6 - 2 2 。 m a g o s h i 和n a k a m u r a e l 9 】贝0 研究发现当干燥温度高于5 0 时，干燥的柞蚕丝素蛋 白膜的结构发生q 螺旋向p 哳叠的转变。h i r a b a y a s h i 等人【1 6 】报道，从中国柞蚕中提取 的天然丝素蛋白溶液在5 6 干燥可结晶形成d 靳叠结构。t u s u k a d a 2 0 1 发现了柞蚕丝 素蛋白膜的分子构象还取决于干燥速率等环境因素的影响，干燥速率越慢，丝素蛋白 就越容易形成b 折叠结构。 m a g o s h i 等【2 3 】研究了天然柞蚕丝素膜的热学行为，膜在2 2 0 下加热处理后，其 分子构象转变成了p 靳叠结构，m 和d s c 的分析表明它是a - g 累, 旋向p 哳叠和无规卷 曲向p 靳叠两种转变机理的共同作用。这一结果由n a g u r a 等唧进一步证实。f r e d d i 等 z q 用2 0 0 - 2 5 0 范围内的温度对柞蚕丝素膜进行热处理，研究其结构的变化。在 高于玻璃化温度( 约1 9 0 ) 处理后柞蚕丝素膜发生了a 螺旋向p 哳叠结构的转变， 当处理温度达到2 0 0 以上时，呈现d 哳叠分子构象，这归因于a 螺旋结构分子链的 重新排列。温度越高，无规区域的结晶作用将成为主导因素，使得丝素分子链排列更 加规整。 天然柞蚕丝素膜的分子构象中富含q 螺旋和无规卷曲，经有机溶剂处理后发生的 分子构象转变与溶剂的浓度和处理时间有密切关系，用浓度为5 0 的甲醇水溶液浸泡 5 分钟，就转变成为富含无规卷曲和p 晰叠的结构，a 螺旋结构含量减少。在浸泡初 期，柞蚕丝素膜的内部d 姑晶结构并不是很完善，然而，当浸泡时间超过1 0 分钟之 后结晶结构变得更完善，这是因为无规结构的减少而使得b - 钴晶结构变得规整排列 豳。t s u k a d a 和f r e d d i 等i 婀的研究表明天然柞蚕丝素膜经浓度为2 0 ，4 0 和6 0 的 甲醇水溶液浸泡时间3 0 分钟后，丝素膜的分子构象发生转变，形成b 哳叠结构。通 2 柞蚕丝素壳聚糖共混材料的制各及理化性能研究第一章引言 过红外和拉曼光谱分析表明，a 螺旋向d 哳叠转变和无规卷曲向b 哳叠结构转变，这 两种转变是同时发生的。 从柞蚕熟蚕体内后部绢丝腺收集的丝素蛋白只能满足实验室少量制备的需要，不 能满足大规模生产的要求，所以需要采用化学溶解的方法将柞蚕丝素纤维溶解、纯化 后获得再生柞蚕丝素蛋白水溶液。h a e y o n gk w e o n l 2 7 发现柞蚕丝素最佳的溶解条件是 用熔融的浓度为7 m 的硝酸钙在l o o 下溶解3 h ，经过检测发现在此溶解条件下得到 的再生柞蚕丝素蛋白的分子量为1 4 k d a 以上，其分子结构主要有无规卷曲、a 螺旋和 d 哳叠三种结构。 m i n g z h o n gl i 等1 2 8 】将脱胶后的柞蚕丝素纤维用硫氰酸锂溶解，发现浓度为1 0 m 的 硫氰酸锂溶液在4 0 的温度下，经过1 小时也可将柞蚕丝素纤维全部溶解。柞蚕丝 素纤维在分别用硝酸钙和硫氰酸锂溶解的过程中，柞蚕丝素蛋白发生了一定程度的降 解。溶液中的再生柞蚕丝素蛋白的分子构象为a - t 累, 旋和无规卷曲共存，与丝素纤维的 p 哳叠结构显著不同田- 2 a 。 柞蚕丝素纤维经化学溶解后，纯化得到再生丝素蛋白溶液。w e it a o 【2 9 】等人研究 发现再生柞蚕丝素溶液的分子构象主要是a _ 螺旋和无规卷曲，并含有少量的p 一折叠 结构，其在溶胶一凝胶过程中，柞蚕丝素的分子构象由无规卷曲向p 一折叠转变。 t s u k a d a l 3 0 】研究了再生柞蚕丝素膜的物理化学性能及其热性能，并与家蚕丝素进 行比较。研究表明，再生柞蚕丝素膜比家蚕丝素膜的热稳定性较强，玻璃态转变温度 升高，但是分子形态和结晶结构没有太大的区别。同时m a s u h i r ot s u k a d a 等【3 l 】对比研 究了天然和再生柞蚕丝素膜的理化性质和热力学行为。天然丝素膜的热转变温度始于 1 9 0 ，而再生丝素膜的始于2 1 4 ，表明再生丝素膜比天然丝素膜显示了更高的热 稳定性，玻璃化转变温度也较高。而这两种膜的分子构象和结晶结构并没有太大差别。 k w e o n 3 2 】等人研究了热处理对再生柞蚕丝素膜结构和分子构象的影响。研究表明热处 理的时间和温度对再生柞蚕丝素膜的分子构象有很大的影响，2 3 0 时分子构象发生 转变，并且该转变随着温度和时间的增加而增强，热处理可以使无规卷曲转化成p 哳 叠构象，但是a 螺旋结构却未发生改变。 t s u k a d a t 3 3 】等人在2 0 时，用不同浓度的甲醇水溶液处理再生柞蚕丝素膜，研究 了甲醇水溶液的浓度和处理时间对再生柞蚕丝素膜结构的影响。结果表明，未经过甲 醇水溶液处理的柞蚕丝素膜呈仅螺旋分子构象，但在2 0 - 6 0 甲醇水溶液中处理3 0 r a i n 后，丝素膜呈b 一折叠结晶结构。其后t s u k a d a 蚓又研究了甲醇对丝素膜的结构和分 3 柞蚕丝索壳聚糖共混材料的制各及理化性能研究第一章引言 子构象的动态力学和热力学性能，结果表明甲醇处理后丝素膜p 一折叠结晶结构，膜的 热和力学稳定性增强。h a e y o n gk w e o n 3 5 】也研究了甲醇水溶液对再生柞蚕丝素膜结晶 性能的热分析，结果表明其分子构象的转变依赖于甲醇的浓度和处理时间，经4 0 - - 6 0 甲醇溶液处理5 m i n 后分子构象由无规卷曲向p 一折叠转变。经浓度为8 0 的甲醇 水溶液浸泡后，再生柞蚕丝素膜的热力学行为和动态热机械性能以及膜的构象发生了 很大变化，处理3 0 m i n 后膜的分子构象与未处理膜完全不同，当处理时间达至u 6 0 m i n 时 丝素膜完成了向p 哳叠结构的转变，其结晶度达到7 6 ，时间继续延长这种结构转变 不会继续。 m i n g z h o n gl i 等【3 6 】对硫氰酸锂溶解的再生柞蚕丝素膜用浓度为4 0 和6 0 的乙 醇溶液处理，再生柞蚕丝素膜的分子构象主要为q 螺旋和无规卷曲了向b 哳叠结构的 转变，耐水性明显提高，然而当浓度增大到8 0 和1 0 0 之后，丝素膜的分子构象变 化不明显。 李明忠【如用聚乙烯醇一对苯二甲酸作为交联剂对柞蚕丝素膜进行化学交联，研究 结果表明，经聚乙烯醇一对苯二甲酸交联剂处理后再生柞蚕丝素膜仍然是无规卷曲和 n 螺旋结构，其抗水性能提高，当交联度达g u 2 0 时膜表现出高抗水性能和显著的韧 性。 m i n g z h o n gl i t 3 8 1 等用再生柞蚕丝素溶液制各了一种经聚乙二醇一二缩水甘油醚化 学交联的丝素膜，这种膜的结构为无规卷曲和a 螺旋，具有很强的耐水性，机械性能 也得到改善。这种方法有别于用有机溶剂处理后形成p 一折叠结构而引起的耐水性提 高。 1 1 2 柞蚕丝素蛋白材料的生物相容性 生物医用材料是一类与生命系统相作用，用以诊断、治疗、修复和替代人体病变 或损伤的组织、器官，或增进其功能的材料。当今的前沿研究领域是组织工程材料和 组织诱导材料，其主要特征是在分子水平上模拟特定细胞和基因特异性反应，使材料 具有主动诱导、激发人体组织和器官的再生修复能力，能参与人体物质交换并产生相 互结合。 理想的组织工程支架材料或组织诱导材料至少应具备以下几个条件：( 1 ) 有良好 的生物相容性，其本身及降解产物对细胞和机体无毒性，不会或较少引起炎症和免疫 排斥反应；( 2 ) 良好的表面相容性，即材料表面具有足够的细胞吸附能力，有利于细 胞的粘附、分化和增殖；( 3 ) 三维多孔结构，孔的尺寸应能允许细胞的生存，且孔与 4 柞蚕丝素壳聚糖共混材料的制各及理化性能研究 第一章引言 孔之间相互贯通以利于细胞营养物质和代谢产物的输送；( 4 ) 有一定的力学强度，以 支持新生组织的生长，并能被生物降解。此外，制作支架的原料来源充足，易于加工 成型并重复制作【3 9 。4 1 1 。 以往国内外已对家蚕丝素材料的生物学性能进行了较全面的研究，家蚕丝素蛋白 是性能优良的生物材料1 4 2 。再生的家蚕丝素材料具备良好的透氧性【4 3 1 、药物渗透性删， 无毒性、无刺激性，良好的生物相容性。国内外许多研究已经从生物整体、细胞、分 子生物学三个水平上证明了丝素蛋白的这些特性。家蚕丝素纤维已临床用作手术缝合 线达数十年。近年来，将家蚕丝素材料用于药物控制释放载体、抗凝血材料、功能性 细胞培养基质、生物传感器、人工韧带、人工肌腱、隐形眼镜、人工皮肤及人工骨等 的应用研究报道很多【4 5 5 7 】。 现有的蚕丝蛋白用于生物材料领域的研究和应用中，基本上都是以家蚕丝素为原 料。而作为世界稀有、我国特有的柞蚕丝素蛋白却基本未涉及。与家蚕丝素相比，柞 蚕丝素蛋白对细胞的亲和性要更强【5 叼。通过用哺乳动物细胞在丝素膜上的粘附增殖实 验和比较，细胞在柞蚕丝素膜上的粘附和增殖率远高于家蚕丝素膜”- 删，显示了柞蚕 丝素蛋白优良的生物学性能。如果能用柞蚕丝素蛋白制备生物医用材料，则有可能在 保持家蚕丝素蛋白材料良好生物相容性的同时，具备更加出色的生物学性能。因此以 柞蚕丝素蛋白为原料，有可能为组织工程等领域提供一类高性能、低成本、具有我国 特色的生物活性材料。柞蚕丝素蛋白材料的研究与开发具有重要的科学意义，也具有 广泛和现实的应用前景。 s o f i a t 6 i 】等研究了体外细胞培养实验，结果表明，蚕丝纤维材料能支持类成骨细胞 的黏附和生长，当材料用r g d 共价修饰时，能更进一步增强细胞活性，促进类成骨细 胞的矿质化，增强体外骨形成的诱导。 美国马萨诸塞州t u f t s 大学的d a v i dk a p l a n 研究组【6 2 】在家蚕丝素膜上进行成骨细 胞的培养结果表明，接枝了三肽精氨酸一乙氨酸天门冬氨酸( r g d ) 和上皮细胞 生长因子后，家蚕丝素膜对细胞的粘附数量显著增多，细胞在家蚕丝素膜上的增殖速 度大幅度提高。 日本通产省工业技术院物质工学工业技术研究所m i n o u r a 研究组 6 3 】，分别从成熟 的家蚕及柞蚕( 中国种) 体内的后部丝腺分离出天然液状丝素蛋白，分别制成家蚕和 柞蚕丝素膜，在其上培养鼠胚成纤维细胞l - 9 2 9 的结果表明，细胞在柞蚕丝素膜上的粘 附率和增殖率，比在家蚕丝素膜上高的多，并且细胞是扁平伸展的，可以清楚的看到 柞蚕丝素壳聚糖共混材料的制各及理化性能研究第一章引言 丝足，说明细胞紧紧地吸附在材料的表面。其主要原因是：柞蚕丝素一级结构中比家 蚕丝素蛋白含有较多的细胞特异性粘附序列r g d 。 m i n g z h o n gl i 6 4 等用再生柞蚕丝素溶液( 硫氰酸锂溶解) ，通过冷冻干燥方式制 备了多孔三维支架材料，形成的多孔结构，有利于细胞的长入。他们发现多孔支架材 料的孔隙率取决于溶液浓度，其孔径大小可通过改变冷冻速率以及冰晶的尺寸来控制。 通过调整最佳工艺制得的生物材料具有非常好的生物相容性和生物活性。 q i a nf a n g 6 5 】等人作了柞蚕丝素蛋白作为组织工程腱支架( 体外和体内) 的可行性 研究报道。研究发现，柞蚕丝素蛋白材料能够促进肌腱细胞的黏附和繁殖；在体内， 当材料植入裸鼠跟骨腱缺损部位1 6 周后，新生肌腱基本愈合了缺损，内部形成均匀定 向的胶原纤维束，表明柞蚕丝素能诱导新肌腱生成。免疫组织化学的结果呈现出，在 再生的腱组织内主要是i 型胶原。并且再生腱组织的最大承受负荷可以达到正常腱组 织的5 5 4 6 。 上述研究均表明以柞蚕丝素蛋白为原料，有可能为组织工程等领域提供一类高性 能、低成本、具有我国特色的生物活性材料。柞蚕丝素蛋白材料的研究与开发具有重 要的科学意义，也具有广泛和现实的应用前景。 1 2 壳聚糖的结构及应用 1 2 1 壳聚糖的结构和性能 壳聚糖是由虾、蟹等甲壳类动物的壳中提取的甲壳素经浓碱处理脱去乙酰基而得 到的，学名为b 一( 1 4 ) 一2 - 氨基- 2 - 脱氧- d - 葡萄糖，又称可溶性甲壳素，呈白色或灰白 色无定形、半透明、略有珍珠光泽，是仅次于纤维的第二大生物多糖。壳聚糖的结构 类似于糖胺聚糖，在体内可被降解为氨基葡萄糖，被人体吸收，是一种天然的阳离子 型聚合物。 图1 - 1 甲壳素的分子结构 6 柞蚕丝素壳聚糖共混材科的制各及理化性能研究第一章引言 h n h 2 o o o c c h 3 图l - 2 壳聚糖的分子结构 o h 壳聚糖的化学结构与纤维素相似，是由n 一乙酰一d 一葡萄糖胺与d 一葡萄糖胺通过 d 一( 1 4 ) 糖苷键连接而成的线性长链高聚物分子。壳聚糖溶于酸后，这种长链聚合物含 有氨基葡萄糖所携带的带正电荷的氨基和氨基葡萄糖与乙酰基氨基葡萄糖都拥有的带 负电荷的羟基，可以形成各种分子内和分子间的氢键，正是这些氢键的存在和分子的 规整性，使壳聚糖分子容易形成结晶区。当环境p h j , 于其离子解离常数( 6 5 ) 时，奇m 2 质子化形成一n i l 3 + 使分子带正电。壳聚糖不溶于水和碱溶液、稀硫酸、磷酸等，只可 溶于稀盐酸、硝酸等无机酸和部分有机酸，壳聚糖较差的水溶性和溶液所具有的高粘 性的原因之一是由于其分子的晶体结构以及氨基和羟基之间存在较强的氢键造成的。 壳聚糖晶体中，其结构单元是由二个单糖( n - 乙酰氨基葡萄糖或氨基葡萄糖) 通过 o ( 3 ) 一0 ( 5 ) 之间的氢键连接而成的壳二糖。 已有研究表明，在壳聚糖晶体中，根据其是否含水，可分为水合型壳聚糖( h y d r a t e d c r y s t a l ) 6 6 1 和无水型壳聚糖( a n h y d r o u sc r y s t a l ) 1 6 7 1 ；而在壳聚糖溶液中，根据壳聚糖 分子中重复单元长度的不同，可分为t ) ，p e i 型【6 8 和t y p e ii 型【6 明两种。研究证实【6 8 】，水合 型壳聚糖具有复杂的双螺旋结构，当水合型壳聚糖在水中加热至2 0 0 时，水合型壳 聚糖就会变成无水型壳聚糖，壳聚糖的这个变化过程是不可逆的。当脱水现象出现时， 壳聚糖两分子链之间的氢键断裂，两聚合链连接成网状结构。 在溶液中，壳聚糖盐的t y p e i 型结构非常类似于水合壳聚糖，是以壳二糖为单元的 双螺旋结构，l e r t w o r as i r i r i k u l i 郇】认为，在酸性溶液中，由于壳聚糖中氢键被破坏，两 聚合分子链各自以相反方向旋转，重新排列形成一z 型网状结构。t y p e l i 型壳聚糖每个 链上有八个单糖，根据聚合链上重复单元糖的不同，t y p e l i 型t 7 0 】壳聚糖又分为2 种： t y p e l i a 和t y p e l i b 。t y p e l i a 是以壳四糖为基本单元的2 倍螺旋结构，而t y p e l i b 是以壳二 糖为基本单元的4 倍螺旋结构，与t y p e l i a 型壳聚糖不同的是聚合分子链中基本单元的 不同。不同的酸溶解壳聚糖，所得壳聚糖的结构有所不同，不同的酸溶解壳聚糖的结 7 柞蚕丝紊壳聚糖共混材料的制各及理化性能研究第一章引言 构如表1 - 1 。 表卜1 壳聚糖在不同酸溶液中的构象 类型 壳聚糖构象 溶解用酸 t y p e i双螺旋结构h b r , m ，h n 0 3 ，h a 0 4 ，乳酸，顺丁烯二酸，水杨酸 h n 0 3 ，h 2 s 0 4 ，h c i ，h f , h 1 0 4 ，h 3 p 0 4 ，乳酸，琥珀酸， t y p e i i a 双螺旋结构 蚁酸乙酸，丙酸，酪酸 t y p e l t o 4 1 螺旋结构m 由于壳聚糖分子中存在羟基和氨基，其中c ( 6 ) 旬h 为一级羟基，从空间构象上 来说，可以较为自由地旋转，位阻小；c ( 3 ) - o h 为二级羟基，不能自由旋转，空间 位阻大。另一方面，氨基活性又比一级羟基活性大一些，因此在壳聚糖的糖残基上， 活性：氨基 c ( 6 ) - o h c ( 3 ) 旬h 。因此壳聚糖容易进行酰基化、羧基化、醚化、 n ：烷基化、酯化和水解等反应，增强其水溶性。 r o b e r tj o e ls a m u e l s p l l 测得壳聚糖分子量及脱乙酰度分别对晶体大小、壳 聚糖膜的形态结构产生影响。并且壳聚糖具有与纤维素相类似的性质，这为壳聚糖的 应用拓宽了方向。 2 2 壳聚糖的生物相容性及应用 壳聚糖具有良好的生物相容性及较强的抗菌活性 7 2 - 7 4 ，研究表明壳聚糖可被包括 溶菌酶在内的多种特异或者非特异性酶降解为氨基葡萄糖而被吸收。并且具有生物相 容性、止血、抗感染、可塑性及黏附性等诸多优点，是性能优良的生物医用材料。由 于其价廉易得，无毒无气味，具有可吸收性，易于加工和良好的生物特性，在生物医 用材料领域得到广泛应用。 已有人研究用壳聚糖制造免疫促进剂、抗肿瘤剂、药物缓释胶囊、降胆固醇剂、 凝血剂等。把壳聚糖进行深加工纺制成薄膜或纤维，进而加工成外科用可吸收的手术 缝合线、人造皮肤等医用材料则是近十多年来有关科学家们研究的重要课题。用甲壳 素与壳聚糖甲酰化和乙酰化的混合物制成的纤维，可用于外科手术的缝合线，由于壳 聚糖具有生物降解功能，因而无需拆线，并且该缝合线的抗张强度和保持率均优于同 为可吸收生物材料的聚乙交酯类缝合线，是一个很有发展前景的天然医用缝合线。可 以通过对壳聚糖的化学修饰如乙酰化等增强纤维性能，或与其他物质如丝胶蛋白共混 制成功能性纤维，以此改善天然材料在体内环境中抗张强度损耗快的缺陷，同时也避 8 柞蚕丝素壳聚糖共混材料的制各及理化性能研究第一章引言 免了较大的组织反应。 s u n d a r a m j a nv m a d i h a l l y l 7 5 1 从组织工程构造的角度考虑，通过冷冻干燥方式制备 了壳聚糖多孔支架材料。并提出这可能为多糖类物质制备生物材料提供了研究基础。 用壳聚糖制备的生物材料会具备较好的物理机械性能和良好的吸水性，其良好的可塑 性，尤其易于形成多孔结构，有利于细胞的长入。与上皮细胞、成纤维细胞、肝细胞、 软骨细胞及神经细胞等都有较好的相容性。但单一的壳聚糖材料的生物降解速率往往 过慢，难以与组织再生的速率相匹配。 k w u n c h i to u n g b h 0 1 7 6 1 等通过壳聚糖海绵材料达到了药物的缓慢释放。h i r a k u o n i s h i 7 q 等报道，壳聚糖作为药物载体在小鼠体内生物降解性好、不会在体内沉积、 能够通过尿完全排除。因为阳离子聚合物具有络合d n a 的作用，s i m o nc w r i c h a r d s o n 硼等利用低分子量的壳聚糖与d n a 进行络合，能够有效防止核酸酶的降 解。证明壳聚糖无毒不溶于血，不会在体内沉积，可以作为潜在的合成基因递药系统 的组成部分。 韩 s e o l 等u g 发现，植入壳聚糖海绵支架的大鼠颅骨成骨细胞其数目和钙沉积量 随时间而不断增加，碱性磷酸酶的活性也有提高。l a 坷i 等【8 0 j 在体外研究中发现，壳聚 糖可促进成骨细胞增生和表达i 型胶原。说明壳聚糖作为支架材料不仅可以支持成骨 细胞生长，还能促进其功能表达，具有良好的生物相容性。 共混，是提高高分子材料性能的有效方法之一。将壳聚糖与其它聚合物共混，不 仅不影响其所特有的优异性能，而且能得到单一壳聚糖所没有的综合性能。共混的方 法有：机械共混、溶液共混和乳液共混等，使用较多的是溶液共混法。目前，在壳聚 糖与蛋白质进行复合的研究中，与胶原、明胶和丝素蛋白复合的研究较为活跃。 y i c h u ny e 8 1 】等的研究证实，胶原壳聚糖在乙酸溶液中，任意比例都能很好地混 合。壳聚糖大分子链是纤维刚性结构，含有大量的氨基和羟基，使之具有很强的吸附 作用，容易与含两性基团的胶原蛋白分子产生分子间的静电吸引作用，形成聚电解质 配合物网络。y jy i n 8 2 】等人测试了壳聚糖和明胶聚电解质络合物的性质，发现壳聚糖 的加入能提高络合物的弹力强度，对其机械性能有很好的改观。y a hh u a n g 躬】等研究 了壳聚糖一明胶支架材料的降解性能，观察到明胶的加入促进了壳聚糖的降解。而壳聚 糖弥补了明胶抗潮湿性差，易变形，易破碎等弱点。 x h w a n g 州等用e d c 、n h s 、m e s 交联制成了胶原壳聚糖基质，血小板沉积和 肝细胞培养实验都表现了突出的血液和细胞相容性，为肝脏的再生提供培养环境。 9 柞蚕丝素壳聚糖共混材料的制各及理化性能研究 第一章引言 y u f e n gz h a i l g 晒】等为了探讨壳聚糖胶原在牙周组织工程中的应用，用冷冻干燥法制得 多孔壳聚糖胶原支架材料，并且搭载了人体转化生长因子甲1 ，将人体牙周膜细胞接 种于其中，观察到搭载了生长因子的材料其上细胞增殖的现象特明显。c h u n - m e i d i n g 8 6 】等在建立胶原壳聚糖支架的基础上，通过流动灌溉法在支架上接种人体真皮成 纤维细胞。这样可以均匀播种细胞，促进细胞的粘附和生长。这为建造体外培养真皮 的生物反应器系统提供了帮助。 i ns h um a o 盯】等发现壳聚糖与明胶混合后，能加大 l 9 2 9 细胞在膜表面的吸附，促进细胞的增殖，降低了细胞的死亡率。而这可能是明胶 的高电荷密度屏蔽了壳聚糖正电荷的结果。为了改善软骨缺陷，提高其损伤的自我修 复能力。t i n gg u o 髓】将编码转化生长因子书1 的d n a 质粒嵌入到壳聚糖明胶三维支架 材料中，可以观察到转化生长因子吊1 能在3 周内缓慢稳定释放，在进行与软骨细胞的 体外培养时，发现其具有促进软骨细胞增殖、分化及分泌特异性基质的功能。 c h u n - h u id u 8 9 】研究丝素( s f ) 壳聚糖( c s ) 共混膜，发现s f 和c s 相容性很好， 并且随着c s 含量的增加，膜的膨润性增加( 特别是壳聚糖含量在7 0 时达到最大) ， 对k + 的渗透性也增大。 g o b i n a n d r e as 【卿用s f c s 支架来修复荷兰猪由于腹壁肌筋膜的缺陷而导致的腹 疝。对照组采用生物可降解h a d m ( 人类无细胞皮肤基质) 和不能降解的聚丙烯网， 发现细胞能够在s f c s 三维支架上生长成组织，且表现出良好的机械性能。n a k a m u r a 等【9 l 】用s f c s 共混膜培养出人血清蛋白细胞( h l 2 6 0 ，巨噬细胞) 。通过实验观察到 随着c s 浓度的降低，共混膜上巨噬细胞附着率上升，并以纯丝素膜附着率最高，细 胞活性最高，l d h ( 其溶出量作为细胞膜障碍性指标) 溶出率最小。细胞试验结果进 一步表明，通过改变s f 和c s 的混合比，可以调控细胞的生长和活性。 l i ul i i n g 9 2 】制备了装载5 - 氟尿嘧啶的s f c s 磁性小球，研究它的药物缓释和磁 感应性能。结果表明s f c s 磁性小球对于5 - 氟尿嘧啶有缓释作用，并由于其有磁感应 性能，可以在区域内定位。x i nc h e n | 9 3 】用戊二醛交联s f c s 制备一种半渗透聚合网 络( s e m m p n ) ，发现s e m i - t p n 具有很好的p h 敏感性和离子敏感性，在不同p h 的 缓冲液和不同浓度的盐溶液中s e m i - d n 有可变的膨胀率，当交替的把它放进上述2 种溶液里，表现出可膨胀、可收缩的性能，可作为人工肌肉。 1 3 本文的研究目的和主要内容 细胞外基质是细胞生长的微环境，是由许多蛋白质和粘多糖通过化学或物理方式 结合形成的复杂网络结构。在脊椎动物以及人类的软骨组织以及真皮等结缔组织的细 1 0 柞蚕丝索壳聚糖共混材料的制各及理化性能研究 第一章引言 胞外基质中，除含有大量的蛋白质外，还含有大量的透明质酸、壳聚糖等粘多糖。蛋 白质和多糖在细胞外基质中分别发挥各自的生理作用