（遗传学专业论文）connxin31间隙连接通道功能调节研究.pdf

摘要 1 研究背景 1 1 间隙连接的功能及其调节 间隙连接蛋白( c o n n e x i n s ) 家族成员组装成细胞膜上介导小分 子物质( 分子量 1 0 0 0 d a ) 在相邻细胞之间被动扩散的间隙连接( g a p j u n c t i o n s ) 通道。多细胞生物通过间隙连接通讯( g a pj u n c t i o n i n t e r c e l l u l a rc o m m u n i c a t i o n ，g j i c ) 进行细胞间物质和信息交换， 使得细胞对环境刺激的反应协调一致；与此同时细胞之间的6 3 i c 也 随环境改变而变化。p h 值降低、细胞内钙离子浓度升高和存在跨通 道电压等刺激因素通过降低间隙连接通道的通透性，抑制g j i c ；而 多种与细胞内蛋白激酶激活相关的刺激因素可以通过改变细胞膜上 间隙连接通道的数量和通透性，上调或者下调g j i c 。 1 2c x 3 1 间隙连接的功能及其调节 c o n n e x i n 3 1 ( c x 3 1 ) 是间隙连接蛋白家族的一员。我们前期的研究 表明c x 3 1 是快速更新的动态分子；新合成的c x 3 1 通过内质网一高尔 基体分泌途径连续不断地运输到细胞膜组装成间隙连接通道，膜上原 有的c x 3 1 间隙连接通道则自细胞膜上除去并降解。人类c x 3 1 间隙连 接通道对于小分子缺乏选择性，不同分子量和电荷的染料小分子都可 以通过。同其它c o n n e x i n 相似，人类c x 3 1 通道在细胞内p h 值降低 或者跨通道电压存在的情况下关闭。s i m o n e 等报道小鼠c x 3 1 可以在 2 6 6 位丝氨酸残基磷酸化，将此氨基酸突变为不能磷酸化的氨基酸后， c x 3 1 降解速度加快，同时c x 3 1 通道通透性降低；但是没有直接证据 表明小鼠c x 3 1g j i c 受到蛋白激酶调节，而且人类c x 3 1 在2 6 6 位是 不能磷酸化的天冬酰胺。 2 研究目标 为了寻找可以调节人类c x 3 1g j i c 的刺激因素，我们选择了两个 广泛存在的蛋白激酶蛋白激酶a ( p k a ) 和蛋白激酶c ( p k c ) ，考 察了在p k a 和p k c 激活的条件下，c x 3 1g j i c 水平、c x 3 1 细胞内分布 以及细胞内c x 3 1 蛋白的总量，我们希望确定可以调节c x 3 1g j i c 的 蛋白激酶，并且在细胞和分子水平阐明其发挥作用的机制，从而找到 c x 3 1g j i c 动态调节的线索。 3 研究方法 为了考察p k a 和p k c 对c x 3 1 的g j i c 的调节作用，我们以稳定表 达c x 3 1 m y c 的h e l a 细胞为细胞模型，在p k a 和p k c 激活剂、抑制剂 处理细胞后，通过检测细胞间染料转移程度评价c x 3 1g j i c 水平。为 了分析p k a 和p k c 调节c x 3 1g j i c 的机制，我们通过免疫荧光染色计 数细胞问间隙连接斑以间接评价c x 3 1 通道数量；通过w e s t e r nb l o t 考察细胞内c x 3 1 稳态水平以分析c x 3 1 合成和降解的变化；通过阻断 蛋白质运输不同阶段以分析c x 3 1 运输的改变。 4 实验结果 我们发现，激活p k a3 个小时以后，c x 3 1 通道的染料转移水平 相比对照组提高2 倍以上，而激活p k c3 个小时以后c x 3 1 通道的染 料转移水平降低到对照组的1 3 。在p k a 激活3 个小时以后，细胞之 间可以通过荧光显微镜观察到的间隙连接斑数量增加了4 5 ，同时间 隙连接斑的长度也有增加。p k c 激活对间隙连接斑没有显著影响。无 论是p k a 还是p k c 激活，细胞内c x 3 1 水平都没有显著变化。进一步 对c x 3 1 细胞内运输的分析表明，阻断内质网高尔基体之间的运输或 者破坏t u b u li n 细胞骨架结构并不影响p k a 对c x 3 1 运输的促进作用， 而破坏a c t i n 细胞骨架结构会显著抑制p k a 的作用。 5 结论 以上结果表明，p k a 激活3 小时后，细胞内c x 3 1 合成和降解没 有显著变化；细胞内已经存在的位于高尔基体之后的c x 3 1 向细胞膜 上运输增加，或者组装成通道的过程加速，使细胞膜上的c x 3 1 间隙 连接通道的数量增加，从而导致细胞间染料转移水平增加；p k a 的作 用需要完整的a c t i n 细胞骨架结构。p k c 激活3 个小时后，细胞内c x 3 1 合成、降解没有显著变化，细胞膜上c x 3 1 通道的数量也没有显著变 化，细胞间染料转移水平降低可能与通道通透性降低有关。p k a 和p k c 激活3 个小时后，并没有发现可以由s d s - p a g e 分辨出的c x 3 1 磷酸化 状态改变。 我们以前的研究已经证明c x 3 1 的合成、运输、组装和降解是动 态的连续过程。通过本研究，我们发现，细胞内p k a 和p k c 可以调节 动态的c x 3 1 细胞内运输、在细胞膜上的组装以及通道的通透性从而 上调或者下调c x 3 1g j i c 。 关键词：间隙连接( g a pj u n c t i o n s ) ，间隙连接通讯( g j i c ) ， c o n n e x i n 3 1 。蛋白激酶a ，蛋白激酶c a b s t r a c t 1 b a c k g r o u n d 1 1f u n c t i o no fg a pj u n c t i o na n dr e g u l a t i o no fg a pj u n c t i o n a la c t i v i t y g a pj u n c t i o n sa r ec e l lm e m b r a n e - s p a n n i n gs t r u c t u r e sc o n s i s t i n go f c o n n e x i n s g a pj u n c t i o nc h a n n e l ss y n c h r o n i z ea c t i v i t i e so fa 脚a c e n tc e l l s b yr e g u l a t i n gt h ed i r e c te x c h a n g eo fs m a l lm o l e c u l e s ( m o l e c u l a rw e i g h t lk d a ) g a pj u n c t i o ni n t e r c e l l u l a rc o m m u n i c a t i o n ( g n c ) p l a y sak e y r o l ei n o r g a n h o m e o s t a s i so fm u l t i c e l l u l a ro r g ；a n i s m s g j i cw e m d i f f e r e n t i a l l yr e g u l a t e di nr e s p o n s et o v a r i o u sp h y s i o l o g i c a ls t i m u l i i n c l u d i n gw a n s j u n c t i o n a lv o l t a g ea n de v e n t sa c t i v a t i n gp r o t e i nk i n a s e s i n c o n w d s tt ot r a n s j u n c t i o n a lv o l t a g et h a td i r e c t l ym o d u l a t eg a pj u n c t i o n c h a n n e l sg a t i n g ，p r o t e i nk i n 砸圮sd i f f e r e n t i a l l yr e g u l a t eg j i ca tm u l t i p l e c o n t r o lp o i n t si n c l u d i n gg a pj u n c t i o nc h a n n e l se s t a b l i s h m e n ta n ds i n g l e 1 2f u n c t i o n a ls t u d i e so fc x 3 1g a pj u n c t i o n c o n n e x i n 3 1 ( c x 3 1 ) i so n eo ft h eh o m o l o g o u sp r o t e i n so ft h e c o n n e x i nf a m i l y h u m a nc x 31c h a n n e li sr e l a t i v en o n s e l e c t i v e ，a l l o w i n g p a s s a g eo fl a r g ei o n sw i t hb o t hp o s i t i v ea n dn e g a t i v ec h a r g e s l i k eo t h e r c o r m e x i nc h a n n e l s , c x 3 1g a pj u n c t i o nc h a n n e l sa l eg a t e db yv o l t a g e m o u s ec x 3 1w a sr e p o r t e dt ob ep h o s p h o r y l a t e da tt h es e r i n e 2 s 6r e s i d u e s a n dm u t a t i o no ft h es e r i n e 2 6 6t oa l a n i n er e s u l t si ni n c r e a s e dt u r n o v e ro f i v c x 31 l ，i o t e i na n dd e c r e a s e dg j i c n e v e r t h e l e s st h e r ew a sn od i r e c t e v i d e n c et h a tm o u s ec x 31g j i ci sm o d u l a t e db yp h o s p h o r y l a t i o ni nv i v o i na d d i t i o n 血e 2 6 6i ss u b s t i t u t e db ya l la s p a r a g i n er e s i d u ei nh u m a n c x 3 1 2 r e s e a r c hg o a l s t oe x p l o r et h em e c h a n i s mo fc x 31g j i c m o d u l a t i o n ，w ei n v e s t i g a t e t h ee f f e c to ft w ou b i q u i t o u sp r o e t e i nk i n a s e s ，p k aa n dp k c ，o nc h a n n e l f u n c t i o na n dc e l l u l a rb e h a v i o ro fc x 31 o u rg o a l sa r et od e t e r m i n e w h e t h e ra n dh o wp k aa n dp k cm o d u l a t ef o r m a t i o na n d a c t i v i t yo f c x 3 1 g a pj u n c t i o n t h er e s u l t sm a yc o n t r i b u t et o o u ru n d e r s t a n d i n go ft h e d y n a m i cr e g u l a t i o no f c x 3 1g j i c 4 m e t h o d e sa n dr e s u l t s t oe x a m i n et h ee f f e c t so fp k aa n dp k co nc x 31 g j i c ，w e e m p l o y e dh e l ac e l l ss t a b l ye x p r e s s i n gc x 31 m y c a sam o d e ls y s t e m ， m e a s u r e dc x 31m e d i a t e dd y et r a n s f e ra b i l i t ya f t e re x p o s i n gc e l l st o a c t i v a t o r sa n di n h i b i t o r so fp k aa n dp k c t h er e s u l t sr e v e a lt h a tt h e p k aa c t i v a t o r8 - b r - c a m pi n c r e a s ec a l c e i nc o u p l i n gr a t eb ym o r et h a n 2 - f o l dc o m p a r e dt ot h eu n t r e a t e dc o n t r o lw i t ha ne x p o s u r et i m eo f 3h o u r s c o n v e r s e l y , 3h o u r st r e a t m e n to ft h ep k ca c t i v a t o rp m ad r a m a t i c a l l y d e c r e a s e dd y et r a n s f e rr a t et oo n l y1 3 o ft h ev a l u eo fd m s ot r e a t e d c o n t r 0 1 i nc e l l st r e a t e dw i t h8 - b r - e a m p , n u m b e ro ff l u o r e s c e n tl a b e l e d g a pj u n c t i o np l a q u e si n c r e a s e db y4 5 c o m p a r e dw i 廿lt h eu n t r e a t e d v c o n t r 0 1 i na d d i t i o n , t h es i z eo ff l u o r e s c e n tl a b e l e dp l a q u e si so b v i o u s l y e n l a r g e d i nc o n t r a s tc e l l st r e a t e dw i t hp m as h o w e ds i g n i f i c a n t l yc h a n g e i nn e i t h e rn u m b e rn o rs i z eo ff l u o r e s c e n tc x 31p l a q u e s i m m u n o b l o t t i n g a n a l y s i ss h o w e dt h a tt r e a t m e n tw i t he i t h e r8 - b r - c a m po rp m a d i do n t c h a n g et o t a lc e l l u l a rl e v e la n dp h o s p h o r y l a t i o ns t a t u so fc x 3 1 b f aa n d n o c o d a z o l eh a dn oe f f e c to nt h es t i m u l a t e de f f e c t so f8 - b r - c a m p , h o w e v e r , c y t o dd r a m a t i c a l l yb l o c k e dt h ee f f e c t so f8 - b r - c a m p 5 c o n e l u s i o n s o u rd a t as u g g e s t st h a tp k aa n dp k c d i f f e r e n t i a l l ym o d u l a t ec x 3 1 g j i c 。a c t i v a t i o no fp k a l i k e l ya c c e l e r a t e dp o s t - g o l g it r a f f i c k i n go r f o l l o w i n gc h a n n e la s s e m b l yo ft h ep r e - e x i s t i n gc x 3 1b u tn o te r - g o l g i t r a n s p o r t a t i o n a c t i nc y t o s k e l e t o nw a sf o u n dt op l a yak e yr o l ei nt h i s p r o c e s s a c t i v a 虹o no fp k cs h o w e d1 1 0a f f e c to nn u m b e ro fc x 3 1 c h a n n e l s ，h o w e v e r , i tl i k e l yi n h i b i t sc x 3 1c h a n n e la c t i v i t y c x 31 g a p j u n c t i o n si sc o n t i n u a l l yf o r m e da n dr e m o v e d o u rf i n d i n g ss u g g e s tt h a l t h ed y n a m i cp r o c e s so fc x 31 g a pj u n c t i o nf o r m a t i o na n d c h a n n e lg a t i n g c a nb ed e l i c a t e l ym o d u l a t e db yi n t e r c e l l u l a rs i g n a l st h a ta c t i v a t i n gp k a o rp k c p a t h w a y k e y w o r d s ：g a p j t m e t i o n s , g h c ，c o n n e x i n 3 1 ，p k a , p k c y i 英文缩略词表 a m m o n i u mp e r s u l p h a t e 过硫酸铵 b r e f e l d i n a b o v i n es e r u m a l b u m i n 牛血清白蛋白 c o n n e x i n 间隙连接蛋白 c y t o c h a l a s i nd 细胞松弛素d l ，l - , h o c t a d e c y l 一3 ，3 ，3 3 - t e t r a m e t h y l i n d o c a r b o c y a n i n e p e r c h l o r a t e d u l b e c c o sm o d i f i e de a g l em e d i a d m e m 培养基 d i m e t h ys u l p h o x i d e 二甲基亚砜 e n d o p l a s m i ct e t i c u l u m 内质网 f e t a lb o v i n e 鲫m 胎牛血清 b i s i n d o l y l m a l e i m i d ei g a p j u n c t i o n a li n t e r c e l l u l a rc o m m u n i c a t i o n 间隙连接通讯 n - 2 - ( p - b r o m o c i n n a m y l a m i n o ) e t h y l - 5 - i s o q u i n o l i n e s u l f o n a m i d e n o c o d a z o l e p o l y a c r y l a m i d eg e le l e c t r o p h o r e s i s 聚丙烯酰胺凝胶电泳 p h o s p h a t e - b u f f e r e ds a l i n e 磷酸缓冲盐溶液 p r o t e i n k i n a s e a蛋白激酶a p r o t e i nk i n a s ec蛋白激酶c p h o r b o l1 2 - m y r i s t a t e l 3 a c e t a t e 佛波酯 p o l y v i n y l i d e n ed i f l u o r i d e 聚偏二氟乙烯 s o d i u md o d e c y ls u l f a t e 十二烷基硫酸钠 n n n n - t e t r a m e t h y l e n e d i a m i n e n ，n ，n ，n - 四甲基乙二胺 l r i s - h y d r o x y - m e t h y l a m i n o m e t h a n e 三羟甲基氨基甲烷 w h e a tg e r ma g g t u t i n i n ( a l e x af l u o r5 9 4c o n j u g a t e ) ( a l e x af l u o r5 9 4 标记的) 麦胚凝集素 w i l dt y p e 野生型 v l|藿|藿|一眦一一胁l|一一重|一一|姒眦一l|一；垩|一 原创性声明 本人声明，所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究 工作及取得的研究成果。尽我所知，除了论文中特别加以标注和致谢 的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不 包含为获得中南大学或其他单位的学位或证书而使用过的材料。与我 共同工作的同志对本研究所作的贡献均已在在论文中作了明确的说 明。 作者签名：红星幺 日期：丝2 年笸月业日 关于学位论文使用授权说明 本人了解中南大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校 有权保留学位论文，允许学位论文被查阅和借阅；学校可以公布学位 论文的全部或部分内容，可以采用复印、缩印或其它手段保存学位论 文；学校可根据国家或湖南省有关部门规定送交学位论文。 硕士学位论文前言 前言 在1 9 5 9 年，就有报道称：不能引发动作电位的阙下刺激也可以引发神经细胞 之间的电传递 1 1 。r o b e r t s o n 认为这可能与他发现的细胞表面的六角晶格结构有关 【2 】1 9 6 7 年，r e v e l 和k a r l l o v s k y 利用改进的胶质镧技术研究了小鼠心脏及肝脏细 胞膜上的六角晶格结构，首次发现这种细胞间连接呈现出2 r i m 的电子透明“间 隙”【3 】，因此r e v e l 将其命名为“间隙连接”( g a p j u n c t i o n ) t 4 】。 同时，r e v e l 和k s r n o v s k y 也发现，不同于起屏障作用的紧密连接( t i g h t j u n c t i o n ) ，间隙连接允许染料颗粒的扩散【3 】。1 9 6 9 年，p a y t o n 等人发现荧光染料可 以通过间隙通道。随后人们发现不仅一些离子，一些较大的分子也可以通过间隙通 道。这些研究进一步说明间隙连接可能是细胞间的通道结构。1 9 7 7 年m a k o w s k i ，l 等对小鼠肝脏纯化组织的x 射线衍射研究表明，间隙连接是由相对膜上的一对连接 子( c o n n e x o n ) 对接而成的腔隙直径大约2 r i m 的细胞问通道【5 】。 1 间隙连接的结构一间隙连接蛋白构成的细胞问通道。 自从间隙连接发现以后，g o o d e n o t l g h 等人就开始通过纯化组织中间隙连接的方 法来寻找组成间隙连接的蛋白质，并将它们发现的间隙连接的亚单位命名为 c o n n e x i n ，即间隙连接蛋白网。直到1 9 8 6 年，p a u l 和k u m a t 通过不同方法筛选c d n a 文库各自独立克隆了第一个c o n n e x i n 基因，大鼠c o n n e x i n 3 2 。此后。不断有新的 c o n n e x i n 基因在各种脊柱动物中被鉴定出来【7 ，8 】。目前，已经有2 1 个人类c o n n e x i n 基因和2 0 个小鼠c o n n e x i n 基因被鉴定出来( 见表1 1 ) 【9 】。 已发现的间隙连接蛋白均由四个跨膜的a - 螺旋区域、两个细胞外环和一个胞内 环组成，其n - 末端及d 末端皆在膜的细胞质侧【l o 】( 见图1 1c ) 。不同问隙连接蛋 白的跨膜区及胞外环高度保守，而胞内环和c - 末端存在明显的变异尤其是c 末 端在不同问隙连接蛋白中差异很大【l l 】。 间隙连接蛋白组装成间隙连接通道是一个动态的过程。在与其它膜蛋白相似， 间隙连接蛋白在核糖体上合成并被引导进入内质网，然后以囊泡运输的方式从内质 网向高尔基体运输。在内质g 1 2 1 或者高尔基体远侧 1 3 1 ，六个间隙连接蛋白亚单位 寡聚成为一个桶状的连接子( c o n n e x o n ) ( 见图i ib ) ，组装好的连接子由内质网经 高尔基体，或者直接由高尔基体向细胞膜运输。插入到细胞膜的连接子与相邻膜上 的连接子对接成为间隙连接通道( g a p j u n c t i o nc h a n n e l ) ( 见图1 1a ) 。每个连接子 硕士学位论文 前言 都是一个半通道( h e m i c h a n n e l ) 【1 1 】。间隙连接通道成群排列，形成间隙连接斑( g a p j u n c t i o n p l a q u e s ) 。每个间隙连接斑可包含少至数十个多至上万个数目不等的间隙连 接通道。间隙连接斑的维持是一个动态的，新的间隙连接通道不断移动到间隙连接 斑的边缘，而间隙连接斑中心的间隙连接则可以内化到一侧的细胞之中，然后通过 溶酶体途径或蛋白媒体途径降解【1 4 】。 表1 - 1 小鼠和人类基因组中的c o n n e x i n 基因家族成受( 在同一行中列出的基因为小鼠和人类 的同蒙基目，引自参考文献1 9 1 ) 示来自 于人类( h ) ，分子量为3 1 k d a 的c o n n o x i n ( c x ) 。根据序列的相似程度和胞内环长 度，可以将c o n n e x i n 家族分为o 、1 3 和y 等组。c o n n e x i n 基因也可以根据其分组 2 硕士学位论文 前言 和发现顺序命名例如g j b 3 ，就是间隙连接家族b 组，发现的第三个成员。 由于同一个细胞中可能同时表达多种c o n n e x i n ，c o r m e x i n 就有如下几种可能的 组装形式( 见图i - i d ) ：同种c o n n e x i n 组装成同源间隙连接子( h o m o m e r i c c o n n f f x o n ) ，不同c o n n e x i n 组装成异源间隙连接子( h e t e r o m e r i cc o n n e x o n ) ；同种 c o l m e x o n 组装成同型间隙连接( h o m o t y p i cc h a n n e l s ) ，不同c o 蚰懿组装成异型间 隙连接0 a e t e r o t y p i cc h a n n e l s ) 。然而，异源间隙连接子的组装也是有选择性的，并不 是所有c o n n e x i n 之间都能组装。一般来讲，只有在同一类别的c o n n e x i n 之间才有 可能组装成异源c o n n e x o n ，不同类别的c o n n e x i n 之间不能组装成异源 c o n n e x o n 1 5 。 田1 - 1 同咪连接通过的三i 嵫式田( 引自参考文献【1 1 1 ) 2 间隙连接的功能细胞问间隙连接通讯 与其它细胞问连接结构和细胞膜通道不同，间隙连接通道是可以直接联通相邻 细胞的水相通道。相对于其它通道，间隙连接通道的通透选择性比较低除n a + ， r 、c a 2 等无机离子外，c a m p 、i p 3 、a t p 等分子量小于i k d a 的信使分子和代谢 产物也都可以通过问隙连接通道被动扩散 1 6 - 1 9 2 0 - 2 4 1 。尽管间隙连接蛋白允许多 种小分子通过，但是每种c o r m e x i n 通道对所通过分子的性质，如分子大小、所带电 荷的性质及多少等等，都有不同的要求；同一种分子在不同c o n n e x i n 构成的间隙连 接通道中的通透能力也是有差异的。研究显示c x 3 2 通道通过信使分子i p 3 的效率 3 硕士学位论文前言 是c x 2 6 的四倍【2 5 】。s t e i n b e r g 等人比较了成骨细胞中c x 4 3 和c x 4 5 对染料分子 l u c i f e ry e l l o w 的通透性。他们发现l u c i f e ry e l l o w 能通过c x 4 3 通道，但是很难通过 c x 4 5 通道【2 6 】。v e e n s t r a 等人【2 7 】发现c x 4 5 通道具有对阳离子通过的特性。这些通 道能够通过2 ：7 - d i c h l o r o f l u o r e s c e i n ，但是不能通过6 - c a r b o x y t l u o r e s c e i n 。这两种示 踪分子有近似的大小，但是所带电荷相反【2 7 】。e l f g a n g 等人【2 8 】将不同小鼠c o n n e x i n 转染h e l a 细胞，然后分析它们对不同荧光染料的通透性，结果显示c o n n e x i n 通道 对通过的分子具有选择性。然而与s t e i n b e r g 等人观察的结果不同的是：c x 4 5 通道 能够通过l u c i f e ry e l l o w 。此外，c x 2 6 、o x 3 l 、c x 3 2 、c x 3 7 、c x 4 0 和c x 4 3 通道也 能通过l u c i f e r y e l l o w 。尽管p i ( 分子量4 1 4 d a ，所带电荷为+ 2 ) 和e b ( 分子量3 1 4 d e ， 所带电荷为+ 1 ) 能通过许多c o n n e x i n 通道，但是不能通过小鼠c x 3 1 或c x 3 2 通道。 d a p i ( 分子量2 7 9d a ，所带电荷为+ 1 ) 不能通过c x 3 1 或c x 4 3 通道。n e u r o b i o t i n 不能通过小鼠c x 3 1 通道【2 8 】。 表1 - 2c a n n e x i n 突变相关遗传性疾病以反虹j 基因藏除小赢的表型( 引白参考文献【2 9 1 ) c xh u m a nd i s o r d e rk n o c k o u tm o u s ep h e n o t y p e 2 6 d e a f n e s s ，r e c e s s i v e ，e 曲r y o n i cl e t h a l i q m i r e dp l a c e n t a lt r s p o r t r o s s n o n - s y 】a d r n a i c ( d 肿1 ) ： s y u c y t i o t r o p h o b l e n t ； h e a r i n gi m p a i r m n ti nc e n h l e a - s p e c i f i c 蚰 3 0 s k i nd i s e a s e ( p p 置 h e a r i n gi m p a i r m e n t v o h w i n k e ls y n d r o m e ) 3 0 3 d e a f n e s s ，d o m i r l t ， n o n - s y n d r o m i c ( d f n a 3 ) ： 3 1 s k i nd i s e a s e ( 皿do r t r a n s i e n tp l a c e n t a ld y s m a r p h o g e n e s i s c l o u s t o n ss y n d r o m e ) 3 2 s k i nd i s e a s e ( e i 【v ) h e p a t i ct u m o rs u s c e p t i b i l i t y ；r e d u c e ds y m p a t h e t i c g l u c o s ei o b i l i z a t i e n e n dp e r i p h e r a ln e r v ec e n d u c t i o nv e l o c i t y 3 6 d e a f n e s sl o s so fr e d 讲r f e s d o n s ei nr e t i n a ；a s y n e h r e n yo fb r a i n g a m m a0 s c i l l a t i o n s 3 7 s k i nd i s e a s e ( e k v ) ： f e m a l ei n f e r t i l i t y a r r e s t e do o c y t em a t u r a t i o n p e r i d h e r a ln e u r o p a t h y 4 0 c 眦p a r t i a lc o n d u c t a n c eb l o c k ( h e a r t ) ：i m p a i r e d v a s a d i l a t i o n 4 3 t r a n s i e n tc e n t r a lp o s t n a t a ll e t h a l a b n o r m a lh e a r td e v e l o p m e n t ：d e f e c t s d e m y e l i n a t i o n i no o c y t em a t u r a t i o n ： l e n sd e f e c t s ：d e f e c t si nh e m a t o p o i e s i s ；v a n t r i e u l a r a r r h y t h m i a ( c a r d i a ck o ) i n c r e a s e ds p r e a d i n gd e i a r e n s i o n ( a s t r o g l i a l 髓) 4 5 o c u l o d e n t o d i g i t a le m b r y o n i cl e t h a l d e f e c t i v ec a r d i o g e n e s i sa n d d y s p l a s i a ( 0 加d )v n s c u l o g e a e s i s 4 6 l e n sc a t a r a c t s ，d o m i n a n t ，l e n sc a t a r a c t ，n u c l e a r z o n u i ap u l v e r u l e n t 5 0 l e n sc a t a r a c t s p d o m i n a n t 。l e n sc a t a r a c t s ，d c m i n a n t ，z o n u l ap u l v e r u l e n ta n d z o n u l ap u l v e r u l e n t ：n u c l e a r ；m i c r o p h t h a l m i a 4 硕士学位论文 前言 在脊柱动物，除充分分化的横纹肌细胞、红细胞、血小板和精子外，间隙连接 蛋白广泛表达于各种组织细胞和个体发育的各个阶段 1 1 】相邻细胞通过间隙连接 通讯( g a p j u n c t i o ni n t e r c e l l u l a r c o m m u n i c a t i o n ，g j i c ) 直接交换离子、信使分子以及 代谢产物的活动使得多细胞生物可以对内环境和外环境的多种刺激因素做出协调 一致的反应，从而保证诸如心肌和平滑肌的收缩 3 0 ，3 1 1 、电突触上神经信号的传递 【3 2 ，3 3 、细胞生长和分化等生理进程的顺利进行。对c o n n e x i n 突变引起的遗传性 疾病的分析以及对c o n n e x i n 的基因敲除和转基因动物模型的分析为揭示各种 c o n n e x i n 的具体生物学功能研究提供了重要的参考。( 见表1 - 2 ) 除了可以形成间隙连接通道以外，c o n n e x i n 构成的半通道和不要依赖于通道的 c o n n e x i n 的生物学作用也开始受到关注。p a u l 等在1 9 9 1 年报道了蟾蜍卵细胞膜上 的c x 4 6 半通道可能可以开放，以后很多实验证明在细胞外c a 2 + 浓度降低的情况下， 间隙连接斑通道可能开放【3 4 】。开放的半通道可能介导细胞内n a d + 、a t p 的释放 【3 5 ，3 6 。1 9 9 5 年，m e s n i l 等报道了c x 2 6 可以不依赖于间隙连接通道的功能抑制 h e l a 细胞的增殖0 7 ，此后的研究表明，c o r m e x i n 调节细胞增殖、分化的作用可能 与间隙连接通道的功能无关【3 8 】。 图1 - 2 蛋白激酶褥控c x 4 3 同豫连饕通讯的藕翻蛋白囊酶通过改变c x 4 3 细簏内运输、细胞 膜上c x 4 3 通过的组蓑通道的通遣性和通道的内化除去调节g j i c 缸色表示抑甜作用绿色 表示促进作用( 引白参考文献1 3 9 1 ) 硕士学位论文前言 3 问隙连接通讯的调节 细胞在静息状态时，间隙连接通道通常保持开放状态【2 9 】，只有在细胞内p h 值降低、细胞内钙离子浓度提高、存在跨膜或者跨通道电压差等情况下，间隙连接 通道才会降低其通透性或者关闭【4 0 】。有研究认为p h 值和细胞内钙离子浓度要到 达生理条件下不会存在的阈值才能调控间隙连接通道，所以它们只是在病理条件降 低细胞间g j i c ，从而将病态细胞与正常细胞隔离开来；在表达不同c o n n e x i n 的多 种细胞中的研究表明，尽管不同细胞间p h 值和c a 2 + 离子浓度改变的阈值变化很大， 但是在很多细胞生理浓度范围内p h 值和c a 2 + 离子浓度改变已经被证实可以改变通 道通透性，这说明p h 值和细胞内钙离子浓度这些细胞内的化学因素在生理条件下 也参与隙连接通道通透性的调节| 4 0 】。 不同于细胞内p h 值、细胞内钙离子浓度提高、跨膜或者跨通道电压差等调节 因素直接通过改变通道通透性，许多研究证明细胞内多种蛋白激酶激活可以通过改 变c o n n e x i n 生物合成、运输、间隙连接通道组装和通道通透性等多个方面调节g j i c 。 3 9 ，4 1 】( 见图1 - 2 ) 已被证明与g j i c 调节有关的蛋白激酶包括：p i c a 、p k c 、p k g 、 c a 2 + - c d p k 、s r c 以及其它一些酪胺酸激酶 4 1 1 p i c a 和p k c 是广泛存在的丝氨酸、 苏氨酸蛋白激酶，它们已被证明在多种细胞中对g j i c 有相反的调节方式，我们主 要论述它们调节g j i c 的研究。 3 1p l ( a 对g j i c 的调节作用 早在1 9 7 4 年，就有c a m p 增强果蝇唾液腺细胞之间g j i c 的报道 4 2 】1 9 8 3 年，w i e n e r 和l e n w e n s t e i n 等发现缺乏p k a i 的c l i o 细胞( 中国仓鼠卵巢细胞) 染 料转移能力降低，把p k a 的催化亚基引入缺乏p k ai 的c h o 细胞可以增强突变细 胞的染料转移能力【4 3 】。这表明，p i c a 参与g j i c 的调节此后的众多研究在不同 模型系统内证实，细胞内的c a m p p k a 通路与g j i c 调控有关现有研究表明，激 活c a m p p k a 通路快速或者缓慢地增强g j i c ；但也有抑制g j i c 的报道。 激活c a m p p k a 通路后g j i c 的快速变化可以在l o 分钟以内发生。大鼠肝细 胞间隙连接通道总电导在l m m8 b r - c