（动物遗传育种与繁殖专业论文）猪骨骼肌发育相关新基因家族btgtob的克隆及功能研究.pdf

华中农业大学学位论文独创性声明及使犀删嬲 学位论文 是如需保密，解密时间 2 0 10 年7 月1 日 是否保密 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究 成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已 经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得华中农业大学或其他教育机构的学位 或证书而使用过的材料，指导教师对此进行了审定。与我一同工作的同志对本研究 所做的任何贡献均已在论文中做了明确的说明，并表示了谢意。 研究生签名： 时间：年月 日 学位论文使用授权书 本人完全了解“华中农业大学关于保存、使用学位论文的规定”，即学生必须 按照学校要求提交学位论文的印刷本和电子版本；学校有权保存提交论文的印刷版 和电子版，并提供目录检索和阅览服务，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保 存、汇编学位论文。本人同意华中农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、传 播学位论文的全部或部分内容。 注：保密学位论文在解密后适用于本授权书。 黼鲐 锄娩硼 跏期：年月日 撕期：川年6 月步日 注：请将本表直接装订在学位论文的扉页和目录之间 国家重点基础研究发展规划 ( 2 0 0 6 c b l 0 2 1 0 5 ) 国家自然科学基金( 3 0 6 7 1 1 3 8 ) 湖北省自然科学基金创新群体项目 ( 2 0 0 6 a b c 0 0 8 ) 资助项目 华中农业人学2 0 0 7 届博：l 二学位论文 目录 摘要1 a b s t r a c t 3 缩略词表6 1 文献综述7 1 1 猪基因组的研究现状8 1 2 基因分离的几种方法9 1 2 1 比较基因图谱在分离新基因中的应用9 1 2 2 表达序列标签( e s t ) 在分离新基因中的应用1 0 1 2 3 候选基因分析法克隆基因1 1 1 3 动物基因功能的研究方法1 1 1 3 1 基于m r n a 水平的基因表达研究方法1 2 1 3 2 测序技术与基因表达的研究1 2 1 3 3p c r 技术与基因表达的研究1 3 1 3 4 大规模杂交技术与基因表达的研究1 3 1 3 5 单核苷酸多态性1 4 1 3 6 基于突变体基础上的基因功能研究。1 5 1 3 7 基于蛋白质水平上的基因功能研究1 6 1 4 猪生产性状相关基因研究进展1 7 1 5 猪骨骼肌生长发育相关基因研究进展1 8 1 5 1 骨骼肌的发生、发育基本过程1 8 1 5 2 影响骨骼肌肌形成和发育的调控因子2 0 1 5 2 1 肌发生过程中特异的b h l h 转录因子2 1 1 5 2 2 成肌增强因子2 2 1 5 2 3 其它影响肌肉生长发育的因子2 3 1 6b t g 仰b 基因家族研究进展2 4 1 6 1b t g t o b 家族成员的发现2 4 1 6 2b t g 厂t o b 家族的结构2 4 1 6 3b t g t o b 家族蛋白的特异性降解2 5 猪骨骼肌发育相关新基因家族b t g t o b 的克隆及功能研究 1 6 4b t g 厂r o b 家族的生理功能2 6 1 6 4 1 与神经细胞的分化的关系2 6 1 6 4 2b t g l 与成肌细胞的关系2 6 1 6 4 3 抗增殖与肿瘤发生2 7 1 6 5b t g t o b 家族与其它因子的相互作用2 8 1 6 5 1b t g l 与p r m t l 的关系。2 8 1 6 5 2b t g 帆o b 家族与w n t 信号途径的关系2 8 1 6 5 3 b t g t o b 家族与p r b 的关系2 8 1 7 高等动物启动子研究进展2 9 1 7 1 启动子的结构3 0 1 7 1 1 原核生物启动子的结构模型。3 0 1 7 1 2 真核生物启动子的结构模型。3 0 1 7 2 启动子的分类3 1 1 7 2 1 组成型启动子的功能和结构特征3 1 1 7 2 2 组织特异型启动子的功能和结构3 1 1 7 2 3 诱导型启动子的功能和结构3 1 1 7 3 启动子克隆的意义3 2 1 7 4 启动子克隆的方法3 2 1 7 4 1 利用启动子探针质粒载体筛选启动子。3 3 1 7 4 2 利用p c r 技术克隆启动子3 3 1 7 5 启动子功能和结构研究的策略3 4 1 7 5 1 转染分析3 4 1 7 5 2 瞬间表达分析3 4 1 7 5 3 点突变分析。3 5 1 7 6 启动子研究存在的问题和展望3 5 2 研究目的与意义。3 6 3 材料与方法3 7 3 1 试验材料3 7 3 1 1 试验样品3 7 3 1 1 1 用于基因分离的d n a 样品3 7 n 华中农业人学2 0 0 7 届博j ：学位论文 3 1 1 2 用于基因遗传变异检测的猪d n a 样品3 7 3 1 1 3 用于标记性状关联分析的d n a 样品。3 7 3 1 1 4 用于新基因染色体定位的d n a 样品3 7 3 1 1 5 用于基因时空表达谱研究的组织样品3 8 3 1 2 菌株、载体、细胞和转染试剂盒3 8 3 1 2 1 菌株3 8 3 1 2 2 载体3 8 3 1 2 3 用于表达的真核细胞3 9 3 1 2 4 真核细胞转染用试剂盒3 9 3 1 3 主要培养基4 0 3 1 3 1 大肠杆菌培养基。4 0 3 1 3 2 哺乳动物细胞培养基及消化液4 0 3 1 4 主要仪器设备一4 1 3 1 5 主要试剂4 1 3 1 6 主要试剂的配制4 2 3 2 主要分子生物学软件和网站4 3 3 2 1 主要分子生物学软件4 3 3 2 2 主要生物学网站和数据库。4 3 3 3 试验方法4 3 3 3 1 基因片段的的分离4 3 3 3 1 1c d n a 的电子克隆4 3 3 3 1 2 序列的同源性分析与鉴定。4 4 3 3 1 3 引物设计4 4 3 3 1 4p c r 扩增条件4 4 3 3 2p c r 产物的纯化、克隆与测序4 6 3 3 3i m p r h 辐射杂种板定位4 7 3 3 3 1 定位引物设计4 7 3 3 3 2 定位引物扩增及其分型方法与数据分析。4 7 3 3 4 基因的表达与功能分析4 8 3 3 4 1 组织和细胞中总r n a 提取4 8 i l l 猪骨骼肌发育相关新基因家族b t g t o b 的克隆及功能研究 3 3 4 2 总r n a 完整性检测。4 8 3 3 4 3 总r n a 的d n a s e i 处理4 9 3 3 4 4 总r n a 的反转录4 9 3 3 4 5 引物设计4 9 3 3 4 6 扩增反应条件5 0 3 3 4 7 数据分析5 0 3 3 5 猪基因的分型与关联分析5 0 3 3 5 1p c r 扩增反应5 0 3 3 5 2 酶切条件5 1 3 3 5 3 基因分型。5 1 3 3 5 4 多态标记与性状的关联分析方法5 1 3 3 6b t g l 基因启动子片段的克隆、分析与荧光素酶报告基因表达载体的构 j 室51 3 3 6 1b t g l 基因启动子片段的克隆5 2 3 3 6 2 启动子的转录因子结合位点预测5 2 3 3 6 3 荧光素酶报告基因表达载体的构建。5 2 3 3 7 哺乳动物细胞培养、质粒转染与荧光测定5 3 3 3 7 1 复苏方法5 3 3 3 7 2 传代培养5 4 3 3 7 - 3 细胞诱导分化5 4 3 3 7 4 细胞冻存5 4 3 3 7 5 质粒转染5 5 3 3 7 6 双荧光素酶活性测定5 5 4 结果5 6 4 1 基因片段的分离、序列分析与鉴定结果5 6 4 1 1c d n a 的电子克隆结果5 6 4 1 2 猪基因的c d n a 及d n a 扩增结果5 6 4 1 3 扩增产物的序列分析与鉴定结果5 8 4 2 猪基因的氨基酸序列分析结果5 9 4 2 1b t g l 基因的氨基酸序列分析5 9 i v 华中农业人学2 0 0 7 届博l 学位论文 4 2 2b t g 2 基因的氨基酸序列分析6 1 4 2 3b t g 3 基因的氨基酸序列分析6 2 4 2 4三个基因的氨基酸序列比对结果6 4 4 3 基因在染色体上的定位6 5 4 3 1 基因的定位结果6 5 4 3 2 基因定位区域与对应染色体上的q t l 6 7 4 4 基因表达研究结果6 8 4 4 1 总r n a 的甲醛变性胶电泳检测结果。6 8 4 4 2c d n a 模板质量及引物扩增效果的检测6 9 4 4 3 猪b t g l ，b t g 2 和b t g 3 基因的组织表达一6 9 4 4 4 b t g l ，b t g 2 和b t g 3 在通城和长白猪胚胎不同时期肌肉中的表达 7 】【 4 4 5b t g l ，b t g 2 和b t g 3 基因在c 2 c 1 2 细胞分化不同时期的表达。7 3 4 4 5 1c 2 c 1 2 细胞在分化不同时期的形态。7 3 4 4 5 2b t g l ，b t g 2 和b t g 3 基因在c 2 c 1 2 细胞分化不同时期的表达7 4 4 5 新分离的基因s n p 检测及多态分布7 5 4 5 1b t g l 基因的s n p 检测与多态分布7 5 4 5 1 1b t g l 基因的s n p 检测。7 5 4 5 1 2p c r r f l p p s u l 多态性在各猪品种中的分布情况7 7 4 5 1 3p c r r f l p b s h l 2 3 6 1 多态性在各猪品种中的分布情况7 8 4 5 2b t g 2 基因s n p 检测及多态分布7 9 4 5 2 1b t g 2 基因的s n p 检测7 9 4 5 2 2p c r r f l p m v a l 多态性在各猪品种中的分布情况8 0 4 5 3b t g 3 基因多态分布8 2 4 5 3 1b t g 3 基因的s n p 检测8 2 4 5 3 2p c r r f l p m v a l 多态性在各猪品种中的分布情况8 3 4 6 不同基因多态性与性状的关联分析结果8 4 4 6 1b t g l 基因多态与性状关联8 4 4 6 2b t g 2 基因多态与性状关联8 5 4 6 3b t g 3 基因多态与性状关联8 5 v 猪骨骼肌发育相关新基因家族b t g t o b 的克隆及功能研究 4 7 b t g l 基因启动子区的克隆与功能分析8 6 4 7 1b t g l 基因启动子区的克隆8 6 4 7 2 启动子区转录因子结合位点预测8 7 4 7 3 五个启动子删除片段的荧光报告基因载体的构建8 7 5 讨论8 9 5 1 关于新基因的克隆8 9 5 2 关于基因m r n a 表达分析的方法8 9 5 3 关于启动子的克隆9 1 5 4 关于基因的染色体定位9 4 5 5 关于猪b t g 基因的组织表达谱9 5 5 6 关于猪b t g 基因的时空表达谱。9 5 5 7 关于b t g 基因对成肌细胞分化的作用9 7 5 8 关于b t g t o b 基因家族的结构和功能9 7 5 9 关于基因的s n p 与性状关联分析9 8 5 9 1 关于s n p 检测9 8 5 9 2 关于s n p 与生产性状的关联9 9 6 ，j 、结1 0 1 6 1 本研究的主要结果和结论1 0 1 6 2 本研究的特色和创新点1 0 2 6 3 本研究不足之处和进一步的工作1 0 3 参考文献1 0 4 在读期间发表或待发表的论文1 1 6 致谢1 1 7 附录11 9 v i 华中农业人学2 0 0 7 届博二f ：学位论文 摘要 提高猪生产性状一直以来都是育种学家们追求的目标之一。猪瘦肉产量和质 量主要取决于胚胎发育期肌纤维数量的增生和生后期肌纤维体积的膨大。猪肌肉 生长速度与胚胎期形成的肌纤维数目呈正相关，同时也受肌纤维中蛋白质的合成 和降解速度差异的影响，但胚胎肌发生时期形成的肌纤维数量是动物产肉量的重 要决定因素。另一方面，肌纤维的肥大又与肌肉应激或肉质下降等问题有关。因 此，如何最有效地平衡肌肉生长速度与肌肉品质需要我们对肌纤维的发育有一个 全面深入的了解。 本实验室在以通城和长白猪胚胎发育不同时期的骨骼肌构建的l o n g s a g e 文库中发现了一大批差异表达基因，本研究在此基础上，选取对早期肌纤维增殖 有显著影响的b t g t o b 基因家族，开展了5 个新基因的克隆、定位及其功能研 究工作，得到如下结果： 1 以l o n g s a g e 文库中差异表达标签( t a g s ) 为基础，结合生物信息学与实 验验证克隆获得了猪b t g l 、b t g 2 和b t g 3 基因包含完整c d s 的c d n a 序列以 及b t g 4 基因的部分d n a 序列和t o b 2 基因的靠近3 端部分c d n a 序列。 2 推导了猪b t g i 、b t g 2 和b 孔3 基因的氨基酸序列，并利用生物信息学 方法预测了它们的结构和功能，发现它们除具有b t g t o b 基因家族所共有的 b o x a 和b o x b 保守结构域外，还含有几个蛋白激酶的磷酸化位点。结合氨基酸 同源性，我们构建了该三个基因的系统进化树，结果表明，三个基因分别聚为三 个明显的分支，其中b t g l 和b t g 2 进化关系更近一些。 3 利用r h 克隆板对上述5 个基因进行了染色体定位，分别将b t g l 、b t g 2 、 b t g 3 、b t g 4 及t o b 2 基因定位在s s c 5 q 2 4 2 5 ，9 p 1 1 q l l ，1 3 q 4 7 ，9 p 2 1 和5 p 1 5 区域。 4 运用r p c r 方法检测了b 粥j ，b 兀泛和b r 订三个基因在成年长白和 通城猪心脏、胃、脾脏、肺、肾、肌肉中的表达情况。检测结果表明，b t g l 和 b t g 3 基因在表达模式上类似，都在长白猪心脏和骨骼肌中低表达，而在通城猪 高表达，在两个品种的胃、脾脏、肺和肾中表达都较高；b t g 2 基因在长白和通 城猪的心脏中高表达，骨骼肌中表达稍低。 5 运用实时定量p c r 方法，我们利用与半定量p c r 相同的反转录引物在 通城和长白猪胚胎发育3 3 天、6 5 天和9 0 天的背最长肌c d n a 中对三个基因的 表达情况作了检测。检测结果表明，b t g l 基因和b t g 3 基因在两个品种三个时 期的表达模式完全一样，它们在通城猪三个胚胎时期的表达量都远大于在长白猪 中的表达量( p 0 0 1 ) ，通城猪中的表达趋势是先下调再上调( p 0 0 5 ) ，在长白 猪骨骼肌发育相关新基因家族b t g 厂m b 的克隆及功能研究 猪三个胚胎时期的表达差异不显著；b t g 2 基因则在通城猪胚胎三个时期的表达 是先上调再下调( p o 0 5 ) ，在长白猪中的表达是先上调( p o 0 5 ) 。并且b t g 2 基因在3 3 天和9 0 天的表达 都是长白猪大于通城猪( p o 0 5 ) ，6 5 天时则在两个品种的表达没显著差异。 6 运用实时定量p c r 方法，检测了鼠源b t g l ，b t g 2 ，b t g 3 和m y o g e n i n 基因在c 2 c 1 2 细胞分化不同时期的表达，m y o g e n i n 基因用作成肌细胞分化的信 号分子。结果显示b t g l 和b t g 3 基因与m y o g e n i n 的表达趋势完全一致( p o 0 5 ) ， 而b t g 2 基因则在五个时期呈现波浪式表达( p o 0 5 ) 。 7 发现了猪b t g l 、b t g 2 和b t g 3 基因可用p c r - - r f l p 方法检测的4 个 s n p 位点，其中位于b t g l 基因3 u t r 区的两个s n p 位点和位于b t g 2 基因第 一外显子的一个s n p 位点都没有改变氨基酸，b t g 3 基因的s n p 位于第五外显 子，该位点碱基c 到t 的改变造成氨基酸由脯氨酸变为丝氨酸。 8 对上述四个s n p 位点在大白、长白、杜洛克、通城、二花脸、清平和江 西玉山猪中进行群体遗传学分析，分析结果表明四个s n p 位点在中外猪品种中 的分布存在显著差异。 9 在我室与通城县畜牧局合作组建的试验猪群体中，对四个s n p 与生产性 状进行了初步关联分析。结果显示，b t g l 基因3 u t r 区p s u i - r f l p 位点的基 因型与肩部膘厚、6 7 肋间膘厚、屠宰率以及肉色存在显著关联，该区 风j i l j 2 3 6 卜r f l p 位点的基因型与肉色及肌内脂肪含量存在显著关联；b t g 2 基因 第一外显子m 妇，- r f l p 多态性位点的基因型与肩部膘厚、肉色及肌肉剪切力存 在显著关联；b t g 3 基因第五外显子胁口，_ r f l p 多态性位点的基因型与肌肉剪切 力存在显著关联。 1 0 成功克隆了猪b t g l 基因上游约1 6k b 的启动子序列，并构建了4 个 p g l 3 报告基因载体并用生物信息学方法对它的结构和转录因子结合位点进行了 预测。发现了许多影响细胞周期和肌纤维发育的转录因子，如f o r e h e a d 基因家 族，a p 一1 样因子，s p l 样因子，m y o d ，p a x 家族等。对启动子的预测结果表 明，猪的b t g l 基因可能是对肌肉早期发育有重要影响的基因。 本研究初步结果表明，b t g 基因家族对骨骼肌早期发育有较明显的影响， 作为猪骨骼肌发育相关的候选基因对其功能进行深入研究，必将有助于丰富猪分 子育种材料并给猪肉生产带来实质性的帮助。 关键词：猪：骨骼肌；增殖：染色体定位；b t g t o b 家族；细胞分化；启动子克 隆：s n p ：性状关联 2 a b s t r a c t i m p r o v i n gp r o d u c t i o nt r a i t so fp i gi so n eo ft h eo b j e c t i v e sb r e e d e r sp u r s u i t i n g t h el e a ny i e l da n dq u a l i t yi sm a i n l yd e c i d e db yi n c r e a s i n gn u m b e r so ff i b r o b l a s ti n f e t a ld e v e l o p m e n ta n dp o s t n a t a lh y p e r t r o p h yo fm u s c l ef i b r e s p o s t n a t a lg r o w t hr a t ei s p o s i t i v e l yc o r r e l a t e dw i t hm u s c l ef i b e rn u m b e rf o r m i n gi nf e t a la n d i n f l u e n c e db yt h e b a l a n c eb e t w e e np r o t e i ns y n t h e s i sa n dd e g r a d a t i o no fm u s c l ep r o t e i n s h o w e v e r ，t h e m u s c l ef i b e rn u m b e r sf o r m i n gi ne m b r y om y o g e n e s i sa r et h ei m p o r t a n tk e y f a c t o r sf o r a n i m a lm e a tp r o d u c t i o n o nt h eo t h e rs i d e ，t h eh y p e r t r o p h yo fm u s c l ef i b r er e l a t e d w i t hm u s c l es t r e s sa n dm e a tq u a l i t yd e c r e a s i n g ，e t c t h e r e f o r e ，u n d e r s t a n d i n gt h e m u s c l ef i b e rd e v e l o p m e n ti si m p o r t a n tt oe f f i c i e n t l yb a l a n c i n gm u s c l eg r o w t hr a t ea n d m e a tq u a l i t y m a n yd i f f e r e n t i a l l ye x p r e s s e dg e n e sw e r ed e t e c t e d f r o ml o n g s a g em u s c l e c d n al i b r a r yc o n s t r u c t e dw i t ht h r e ef e t a ls t a g e so ft w os w i n eb r e e d s ( l a n d r a c ea n d c h i n e s et o n g c h e n g ) i no u rp r e v i o u ss t u d y w ec h o s eb t g t o bg e n ef a m i l yw h i c h s i g n i f i c a n t l yi n f l u e n c e de a r l y m u s c l ef i b e rp r o l i f e r a t i o nt od oc l o n i n g ，p h y s i c a l m a p p i n g a n df u n c t i o n a ls t u d y t h em a i nr e s u l t sa r ea sf o l l o w s ： 1 b a s e do nd i f f e r e n t i a l l ye x p r e s s e dt a g so fl o n g s a g em u s c l ee d n al i b r a r y ， c o m b i n i n gb i o i n f o r m a t i c sa n de x p e r i m e n t a lm e t h o d s ，f u l l l e n g t he d n a o ft h ep o r c i n e b t g l ，b t g 2a n db t g 3g e n e ，p a r t i a ld n as e q u e n c eo fb t g 4g e n ea n dp a r t i a l c d n an e a r3 - 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p c r b t g la n db t g 3g e n e sw e r ef o u n ds i m i l a ri ne x p r e s s i o np r o f i l ea n de x p r e s s e dl o wi n h e a r ta n dm u s c l ei nl a n d r a c ew h i l eh i g hi nt o n g c h e n gp i g s h o w e v e r , b t g 2g e n e e x p r e s s e dh i g hi nh e a r ta n dm u s c l ei nb o t hb r e e d s 5 t h eb t g l ，b t g 2a n db t g 3g e n ee x p r e s s i o ni nt h ef e t a ls k e l e t a lm u s c l ef r o m 3 3 d p c ( d a yp o s t c o n c e p t i o n ) ，6 5 d p ca n d9 0 d p co fi _ a n & a c ea n dt o n g c h e n gp i gw a s d e t e c t e dw i t hr e a l - t i m er t - p c rm e t h o d t h ee x p r e s s i o nt r e n do fb t g la n db t g 3 g e n ew e r ef o u n dt h es a m ea n de x p r e s s e dh i g h e ri nt o n g c h e n gp i gt h a nl a n d r a c e a m o n gt h r e ef e t a ls t a g e s t h e i re x p r e s s i o np e a k e da t3 3d p ca n ds i g n i f i c a n t l y d e c r e a s e da t6 5d p ca n da t9 0d p c ( p o 0 1 ) i nc h i n e s et o n g c h e n ga n dn os i g n i f i c a n t d i f f e r e n c ei nt h et h r e es t a g ei nl a n d r a c e p o r c i n eb t g 2w a se x p r e s s e da t3 3d p cw i t h ar e l a t i v e l yl o wl e v e lt h e ni n c r e a s e dt oap e a ka t6 5d p c ，a n dw a sd o w n - 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