（生物化学与分子生物学专业论文）鸡α干扰素chifnα的克隆和原核表达.pdf

山两医科大学硕士学位论文 鸡仅干扰素( c 1 1 i f n q ) 的克隆和原核表达 摘要 研究目的：构建鸡a 干扰素( c l l i f n a ) 的原核表达体系，优化表达条件。 研究方法：( 1 ) 从( k 心a i l i 【库中查找鸡a 干扰素( c h i f n a ) 基因并且获得其基因序列及蛋白 序列，用d n a m a i l 软件设计引物。( 2 ) 分离并培养鸡血淋巴细胞，从c o i a 刺激过8 1 0 小时的鸡血淋巴细胞中提取总r n a ，经逆转录一聚合酶链式反应( i m p c r ) 扩增出鸡q 干扰 素( c h i f n a ) 基因，经低熔点琼脂糖凝胶电泳后回收纯化，将纯化产物与载体p m d l 8 t 连 接，转化到e c o l id h 5 a 感受态细胞中，在氨苄阳性琼脂板上筛选阳性菌落。重组载体用 p c r 扩增法和两种限制性内切酶n d ei 和e c o ri 酶切进行鉴定，并进行序列测定，命名 为p m d l 8 t c h 。( 3 ) 将两种限制性内切酶n d ei 和e c o ri 酶切p m d l 8 t - c h 的产物回收 纯化后，与载体p e t 3 0 a 载体连接，转化到e c o l ib l 2 1 ( d e 3 ) 感受态细胞中，在卡那阳性琼 脂板上筛选阳性菌落，用p c r 扩增法和三种限制性内切酶n d ei 、e c o ri 和1 0i ( 基因 序列2 9 0 位的酶切位点) 酶切进行鉴定，并再次进行测序，命名为p e t 3 0 a - c h 。经p t g 诱导表达。“) 经s d s p a g e 凝胶电泳图条带分析，并结合湿菌重筛选出最优表达菌种，进 行培养温度，培养时间，表达温度，表达时间和诱导剂浓度方面表达，确定最优表达条件； ( 5 ) 超声破菌，分离得到包涵体，并进行洗涤纯化复性，b r a d f b r d 法测定蛋白含量。 研究结果：( 1 ) 成功培养出鸡血淋巴细胞，并成功提取到总r n a ，经p c r 扩增出鸡干扰 素( c l l i f n a ) 基因。( 2 ) 成功构建出p e t 3 0 a - c h 表达体系，在e c o l ib l 2 l ( d e 3 ) 中表达出鸡 a 干扰素( c h i f n q ) 蛋白，其分子量约为2 2 k d ，表达产物主要以包涵体形式存在。( 3 ) 通过 优化表达，结果在e c o l ib l 2 l ( d e 3 ) 中3 7 培养浓度达到o d 6 0 0 值为o 7 时加i p t g 至终 浓度为l i 啪。儿，再诱导3 h 表达，此时表达量达到最高，约占全菌蛋白的3 0 以上。( 4 ) 进一步纯化表达，用0 1 m o l lt r i s c l ( p h8 5 ) 含2m o l l 尿素洗涤效果最好，表达量约占全 菌蛋白的4 0 ，采取梯度稀释法复性得到鸡a 干扰素( c h i f n 蛋白，利用镍柱亲和层析柱 2 0 0i i 蚰o l l 咪唑洗脱获得纯化蛋白。 研究结论：应用基因工程技术，成功筛选出鸡a 干扰素( c h i f n a ) 基因，并构建了原核表达 载体p e t 3 0 a - c k a 。通过优化表达，得到鸡a 干扰素( c h i f n 仅) 蛋白的最优表达条件，能高 效表达此蛋白。鸡q 干扰素( c l d f n ) 具有良好的应用前景，通过对鸡q 干扰素( c h i f n 由 的研究，为新型光谱抗病毒生物制剂的研制和干扰素的大批量生产奠定了条件。 关键词：鸡q 干扰素( c h i f n a ) ；克隆表达；原核表达重组体 山西医科大学硕士学位论文 j j l 1 0 n l n ga n dd r o k a i y 0 n ce x d r e s s l o no lc n l c k e ni n t e r i e r o n qg e n e a b s t r a c t o b j 咖e ：h lo r d e rt 0c o n s 仇l c tp r o l 【a r 删ce x p r e s s i o ns y 毗mf o r 幽c k e ni f n 吨( c l l i f n q g e 舱a n dt 00 p t i i i l i z em ee x p r e s s i o nc o n d i t i o 璐 m e t h o d s ：1 f i n dt 1 1 ec l l i c k e n 硫e 彘r o n 吨( c u f n 吨) g e 舱a n do 比i i i ln l e i rg e 鹏q u e n c e 锄d p r o t e i i ls e q u e n c e 自的mt h eg k n b a i l l 【 s p e c i f i cp f i m e r sf o rp c r w e r ed e s i 驴e db yl l s i n gm e s o f i 、a r ed n a m 锄2 c l l i c k e ni n t e m r o nam a t u r ep r o t e i i lg e n cw 嬲c l o n e d 锄d 锄p l i f i e db y r e v e 雠仃a i l s c r i p t i o n 呻o l y m e r a s ec h a i nf e a c t i o n ( r t p c r ) 舶m 也et o t a li i l i i n ai i l 雠 1 ) r l i l p h o c y t eo fc l l i c k e nb l o o ds t i m u l a 锄埘lc o n af o r8 lo h o u r s p c rp 似l u c t i o nr e c l a j m e d 锄d 咖f i e di i ll o w m e l t i n gp o i n ta g a r o 如dc 0 衄e c t e d 谢t l lp l a s m i dp m d l8 - t ，m m e d p m d l8 - t c h i t 、淞讹i l s f - o m e di n t oe c o l id h 5 ac o i n p e t i e n tc e l l s 趾d r e e i n gp o s i t i v e c o l o n yi n 锄p i c i l l i np l a t e 趾d 酬谢e di i le m 了m e 吒u t t i n gb y 他矧c t i o n 饥d o m l c l e 缴sn d ei a n de c o ria n dp c ri i lt 1 1 es a m et 证l et 0 q u e n c e 3 p m d l 8 - t - c hw 勰e n z ) ，1 1 n e - c u n e d 锄d p 面f i e d ，舭p 川u c tc o i l i l e c t e d 诵mp e t 3 0 av e c t o r n 锄e dp e t 3 0 a - c 虹h 、糯眦l s f o n n e di n t 0 e c o l ib l 2 l ( d e 3 ) c o m p e t e n tc e l l sa n d r e e n i n gp o s i t i v ec o l o n yi i lk r 脚p l a t e ，e v a l u a t e db y 1 1 e s 仃i c t i o ne n z y m e sn d ei ，e c o ria i l dx l i oi 锄dp c r t h c 托c o m b i n a t i o nv e c t o r 、v 弱 e x p r e s s i n gw i t l li p t g4 n e 嗽伽b i n a t i o nv e c t o re x p r e s s i o nl e v e lw 硒d e t e c t e db ys d s p a g e a 1 1 dw a se x p r e s s e dh j 曲p e r f o 咖a i l c ci 1 1 仕屺e c o l ib l 2 l ( d e 3 ) 1 1 o u 曲i i l d u c t i o ne x p r e s s i o ni i l t e m p e r a m r e 锄dt i m e 锄di n d u c e r 、ed e t e 砌n e dao p t i m i 刎i o ne x p r e s s i o ns y s t e m 5 t h e i n c l u s i o nb o d yc o n t a i n j n gt a r g e tp r o t e i i lc h i f n a 、v 勰s e p a r a t e d 锄dw a s h e d 1 h ep r e l i m i m d r p u r i f i e dc 1 f n aw 舔d i s s o l v e d i i ld i f f e r e n tc o n c 伽t r a t i o nu r e a 锄dr e n 砷盯i 甜b y 伊a d i e n t d i l u t i o n r e s u l t s ：1 t o t a ll 斟a 、v 弱e x t r a c t e ds u c c e s s m l l y ，c h i c k e ni n t e r f e r o n a ( c h i f n 一) g e n ew 嬲 锄p l i f i e db yp c r 鲫c c e s s f h l l y 2 t h er e c o m b i n 锄tp l 嬲m i dp e t 3 0 a c h 、v 勰c 0 删眦e d s u c c e s s 伽锄dt l l et a l 苫e tp r o t e i nc h i f n ac a i le x p r e s s 勰i n c l u s i o nb o d yi l le c o l ib l 2 l ( d e 3 ) s d s p a g es h o w e d 地e x p r e s s e dc h i f n 吨p r o t e i nw 弱m a i l l l yi i l c l u s i o nb o d i e sa n dl 砌a m o l e c u l a rw e i 咖o f2 2l 3 t h cc l l i f n ae x p r e s s i o nl e v e lo fp r o t e i l lw 嬲l l i g l l l yi i le c o l i b l 2 1 ( d e 3 ) a n d t l l em o s to p t i m i z a t i o ne x p r e s s i o nc o n d i t i o ni st h a t3 7 c u l t i v a t e so d 6 0 0 诵m 0 7a n d1m m o 虮。i p t gi i l d u c e st oe x p r e s s e3 ha i l dt h ec l f n 吨p r o t e i i la c c o u n t e df o r3 0 o f w h o l eb a c t e 血p r o t e i l l 4 f u r t h e rp u r i f i c a t i o ne x p r e s s i o n ，u s i n gm e0 1m o l lt r i s c l ( p h8 5 ) c o n t a i n i n g2m o l lu r e at ow a s hm ei n c l u s i o nb o d i e s ，m ee x p r e s s i o nd e a lc o u l da c l l i e v e4 0 w 嬲hm eb e s t ，a c c o u n t i n gf o rb a c t e r i a lp r o t e i ne x p r e s s i o no fa _ b o u t4 0 c h j f n ap r o t e i l lu s i n g i l i c k e la m i l i 哆c h r o m a t o g r a p h yc o l u i i m 、历m2 0 0l l l i n o l li i i l i d a z o l ee l u t i o nc 孤o b t a i np u r i f i e d p r o t e i l l c 仙c i u s i 佃：n u 曲o ft h eg e n ee n g i n e e r i n g ，w eh a ds u c c e s s e dt 0s c r e e nt h ec h i f n ag e n ea i l d 山西医科大学硕士学位论文 c o i l s t m c 锄血er e c o m b i n 锄tp l 踟埘p e t 3 0 a - c 虹；t h r o u 曲恤鲫i n g - u p ，w ch a do b t a i n 龇 o p t i i n i z a t i o ns t r 血e c o l ib l 21 ( d e 3 ) a 1 1 d 纰o p t i n l i z a t i o ne x p r e e i o nc o n d i t i o n ，w m c hc 跚 e x p r e s s 1 er e c o m b i n a mc l l i f n ap r o t c i i ll l i g l l l y ；t kp 嘶t ) ，c h i f n 吨p m t e i i lh a db e e na t t a i n e d i i lu s i n gt h cu r 髓w a s l l i 】唱a n dp u f i 锣；t h ec l i f n 吨p r o t e i nh 嬲n 圮w e l la p p l i c a t i o np r o s p e c t 1 k 陀s u l t so fo l l r s t l l d yh a v ep r 0 v i d e dt l l er e l i a b l ee x p e r i m e n t a lm e t l l o d sf o re x l ) r e s s i o na i l d p 嘶f i c a t i o ni 1 1l a 唱es c a l e 雒、e l la l st h ef o u i l d a t i o nf o r 缸t h e rs t u d yo fi t s 锄_ t i v i m l 觚c t i o n 锄d m a yp a 、，en l ew a y f o r 如t u r ea n t i v i m l 印p l i c a t i o n k e y w o r d s ： c h i c k e ni n t e r f e r o n 吨；c l o n i n g 狮de x i m e s s i o n ；p r o l ( a 瞳州i ce x p 陀s s i o n 豫c o m b i n a n t i v 上- k 刖舌 早在2 0 世纪3 0 年代时，人们发现机体感染某一病毒后，会对另一种抗原性毫无关系 的病毒产生干扰现象。直到1 9 5 7 年，英国病毒生物学家舢i c ki s 硇c s 和瑞士研究人员j e 觚 l 砌e m 锄，在利用鸡胚绒毛尿囊膜研究流感干扰现象时了解到，病毒感染的细胞能产生 一种因子，后者作用于其他细胞，干扰病毒的复制，故将其命名为干扰素1 1 1 ( i n t e m r 0 i l ，i n d 。 自8 0 年代以来，许多研究显示，干扰素( 尤其是a 干扰素及t 干扰素) 除具有抗病毒、免疫 调节的作用外，还具有明显的抗细胞增殖作用。因此，目前干扰素已被用于治疗多种白血 病【2 训。干扰素是一类动物机体产生的多功能蛋白，主要是糖蛋白，它可由病毒感染而自发 产生并随血液循环至全身，激活细胞内抗病毒作用机制合成各种抗病毒蛋白以抵抗病毒的 侵扰。由于它高效的广谱抗病毒活性和免疫调节活性以及其无可替代的临床应用价值，从 人类发现干扰素开始，就从未停止过对它的探索研刭5 1 。干扰素是最早发现，研究最多， 第一个克隆化，第一个用于l 临床治疗疾病的细胞因子【6 】。 虽然i f n 最早发现于禽类，但由于禽和哺乳动物的i f n 差别较大，所表达的蛋白质与 针对哺乳动物的i f n 抗体交叉反应小，许多应用于哺乳动物i f n 研究中的方法并不适合于 禽类，因而禽类i f n 的研究尤其是分子生物学水平的研究一直比较滞后1 7 j 。通过基因和蛋 白水平的同源性比较及活性分析等，确定在禽类同样存在i 型和i i 型干扰素后【3 d ，禽类 i f n 的研究近些年来进展迅速【l 卜1 3 j 。 1 9 9 4 年s e k e l l i c k l l 4 】首次克隆出鸡i 型干扰素基因。s e k e l l i c k 通过比较哺乳动物i 型干 扰素氨基酸序列，选择保守区域，然后根据该区域的核苷酸序列设计出引物，应用i m p c r 技术从病毒诱导的鸡胚细胞中扩增得到一段长为2 6 9 b p 的片段，然后用它制备成探针，对 病毒诱导的鸡胚细胞构建c d n a 文库，用探针筛选目的克隆，从而得到了鸡类似于哺乳动 物的i 型干扰素基因。s c h u l t z 等用n o r t h e mb l o t 分析和生物学实验研究结果表明，鸡i 型 干扰素n 删a 产物与i 型干扰素诱导产物的特性一致【1 5 】。1 9 9 6 年，s i c k 等通过s o u t h e mb 1 0 t 杂交，用克隆的鸡i f nc d n a 作为探针，筛选基因组九噬菌体文库，并通过抗病毒和中和 试验表明，鸡i 型干扰素基因类似于哺乳动物i 型干扰素，也无内含子，其基因数量较多， 且至少编码两类血清型明显不同的、具有抗病毒活性的i f n 蛋白质，命名为c t d f n l 。 c h i f n l 是由无内含子的多拷贝基因编码的，产生3 1 个氨基酸的信号肽和1 6 2 个氨基酸组 成的成熟蛋白，估计成熟蛋白的分子量为1 9 l 。在国内夏春等克隆了我国地方品种惠阳 胡须鸡( 三黄鸡) 和丝羽乌骨鸡的i f n a 基因，发现两种新亚型鸡i f n a t l 6 1 7 j 。 中国是最大的养禽国，然而病毒的流行一直困扰着中国养禽业，给养禽业造成了巨大 的经济损失，目前一些禽类病毒性疾病仍然缺乏有效的治疗手段，化学药物的使用易造成 耐药性，而且容易引起动物体内药物残留而影响人类健康，疫苗的研制则须考虑病毒变异 和多样性。干扰素通过对自身免疫系统的调节来达到抗病毒的目的，没有耐药性和药物残 留的风险，以其广谱的抗病毒活性受到广泛的重视。 本研究克隆和表达了鸡a 干扰素( c h i f n a ) 基因，并实现了蛋白的高效表达，经十二烷 山西医科大学硕士学位论文 基硫酸钠聚丙稀酰胺凝胶电泳( s d s p a g e ，p o l y a c 巧l 锄i d eg e le l e c 仃o p h o r e s i s ) 检测，表达 产物主要以包涵形式存在，经过离心、超声波破菌、尿素溶解、镍柱亲和层析纯化，获得 了纯度较高的目的蛋白，并初步进行了活性测定，为进行鸡干扰素的下一步活性研究打下 了基础。 英文缩略词对照表 英文缩写 英文全称中文译名 a p s a m p b p c d n a d d h 2o d e p c d a d n a d n 弱e d m s o d n t p e c o l i e d t a a m m o l l i 啪p c 髑u l f a t e a m p i c i l l i n b a s ep a i r c o m p l e m e n t a 巧d n a d o u b l ed i s t i l l e dh 2o d i e t l l y lp y r o c 幽m 她 d a t o n d e o x ) ，r i b o 肌c l e i ca c i d d e o x 妒b o n u c l e a d i m e t h y l s u l f o x i d e d e o x 妒b o n u c l e o s i d et r i p h o s p h a t e e s c h e r i c l l i ac o h e t l l y l i 鹏d i 锄i n e t e m a 勰c e t i ca c i d i p t g i s o p r o p y l n l i o p - d - g a l a c t o s i d e k d a k 锄 l b m r n a o d p c r r t p c r s d s p ：f 惦e k i l o d a l t o n ka n a m v c 访 l u r i a b e n a n im e d i 砌 m e s s a n g e ri 矾a o p t i c a ld e i l s 埘 p o l v m e r 略ec h a i nr e a c t i o n i 沁v e r s e 砘觚s c r i p t i o n p o l y m e r 嬲e c l 试n r e a c t i o n s o d i u md o d e c y ls u l p h a t e p o l y 鳓呵l a i i l i d eg e le l e a 舡d p h o r e s i s 过硫酸胺 氨苄青霉素 碱基对 互补d n a 双蒸水 焦碳酸二乙酯 道尔顿 脱氧核糖核酸 脱氧核糖核酸酶 二甲基亚飒 脱氧核苷三磷酸 大肠杆菌 乙二胺四乙酸 异丙基硫代肛d 半乳糖苷 千道尔顿 卡那霉素 l b 液体培养基 信使r n a 光密度 聚合酶链反应 反转录聚合酶链反 应 聚丙烯酰胺凝胶电 泳 学位论文独创性声明 本人声明，所呈交的学位论文系在导师指导下本文独立完成的研究成果。文中任何引 用他人的成果，均已做出明确标注或得到许可。论文内容未包含法律意义上已属于他人的 任何形式的研究成果，也不包含本人已用于其他学位申请的论文或成果。与我一同工作的 同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。 本文如违反上述声明，愿意承担以下责任和后果： l 、交回学校授予的学位证书； 2 、学校可在相关媒体上对作者本人的行为进行通报； 3 、本文按照学校规定的方式，对因不当取得学位给学校造成的名誉损害，进行公开 道歉。 4 、本人负责因论文成果不实产生的法律纠纷。 q 论文作者签名：麴垒蛩 日期2 旦年月上日 学位论文版权使用授权书 本人完全了解山西医科大学有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留或向国家 有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅；本人授权山西医科 大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印 或其他复制手段保存论文和汇编本学位论文。 本人离校后发表或使用学位论文或与该论文直接相关的学术论文或成果时，署名单位仍然为山西医 科大学。 ( 保密论文在解密后应遵守此规定) 论文作者签名： 指导教师签名： ( 本声明的版权归 日期：业年月土日 日期：斗年上月孚同 经许可，任何单位及任何个人不得擅自使肺 山西医科大学硕士学位论文 第一章实验材料 1 1 实验动物 s p f 鸡购自山西农业大学实验动物中心。 1 2 菌种、质粒 d h 5q ：基因型为s u p e 4 4 l a c l 6 9 ( 巾8 0 l a c z m 1 5 ) h s d r l 7r e c a le n d a l g y r a 9 6 t h i lr e l a l ，可用于制作基因库、进行亚克隆，购自t a k a r a 公司。 b l 2 l ( d e 3 ) ：基因型h s d s g a l ( 入c it s 8 5 7 i n d ls 砌7n i n 51 a c u v 5 一t 7 基因1 ) ，该菌株 有0 i n p t 和l o n 两种蛋白酶缺陷，这有利于目的蛋白的高表达。该菌株为本实验室保存。 p m d l 8 - ts i m p l ev e c t o r 购自t a k a r a 公司。 p e t 3 0 a ：为本实验室保存。 1 3 主要工具酶和主要试剂 1 细d n a 聚合酶、限制性内切酶n d ei ( t a k a r a 公司) ；e c o ri 、x h oi 、t 4d n a 连接 酶( t a k a r a 公司) ；m b o n u c l e 嬲e1 1 1 h i b i t o r 、i p t g ( q i a g e n 公司) ；d e p c 、丙烯酰胺、甲 叉双丙烯酰胺、胰酶( s i g m a 公司) ；吲s 、s d s 、蝎、丽春红、d m s o ( r o c h e 公司) ； r p m i l 6 4 0 培养液、o p t i m e m i 培养液( 杭州四季青生物公司) ；考马斯亮蓝快速染液 ( s o l a r b i o 公司) ：l o o b p 、d l l 0 0 0 0d n al a d d e rm a d ( e r ( t a k a r a 公司) ：预染蛋白质 低分子量标准( 碧云天公司) ；兔抗鸡i n f a 多克隆抗体( a b c 锄公司) ；凝胶回收试剂盒 ( 瑚( a r a 公司) ；e z n a 诩e n d o f r e ep l a s m i dm i m 飚ti ( o m e g a 公司) ；h i s b i n d i n g r e s i n 纯化柱( a i p o o 公司) ；p r i m e s c r i p r tr e a g e n tl d t ( t a k a r a 公司) ；核酸共沉淀剂( t a k a r a 公司) ；p m d l 8 一ts i m p l ev e c t o r ( 聊 她公司) ；c o i 认( s i 鄹唿公司) 。 1 4 实验所用引物 实验所用引物均由p r i m e re x p r e s s 3 0 软件设计( a b i 公司) ，北京赛百盛生物公司合 成。 上游引物5 g aaa t t c a r a t g t g c a a c c a c c t t c g c c c c 3 ， 下游引物 5 c c g g aa t t c t c a g l l t g g g g a 兀a g t g c g 3 。 1 5 主要仪器 b 1 0 - r a dm jm i m 疆梯度p c r 仪( 美国b i o r a d 公司) ；电泳凝胶定量分析系统 ( 美国柯达公司) ；c h e m i d o c x r s 系统( 美国b i o r a d 公司) ；l _ 1 6 冷冻离心机( 珠 海黑马有限公司) 。 1 6 主要试剂配制方法 1 6 1 分子克隆用主要试剂的配制方法 ( 2 ) 琼脂糖凝胶电泳缓冲液( 5 t b e ) ：5 4 9t r i s 碱，2 7 5 9 硼酸，2 0 “ o 5 m o 此e d l a ( p h 8 o ) ，加去离子水至l 0 0 0 m l 定容。临用前稀释至0 5 t b e 。 ( 3 ) 1 2 琼脂糖凝胶：称取o 2 4 9 琼脂糖，加入2 0 m l0 5 t b e 后于微波炉加热至溶 化，冷却至5 5 左右，再加入l u l 核酸染料，轻轻摇匀，铺胶。 ( 4 ) l b 液体培养基：氯化钠1 0g ，胰化蛋白胨1 0g ，酵母菌提取物5g ，溶于8 0 0 m l 水中，搅拌使其完全溶解，用5 1 0 1 几n a o h 调p h 至7 4 ，加水定容至1 0 0 0m l ， 高压蒸气灭菌2 0m i n ，4 保存。 1 6 2 培养细胞所用试剂配制方法 o 2 5 胰酶消化液：称量0 2 5g 胰酶，溶于1 0 0m lp b s 中，4 过夜，0 2 2 帅滤 膜过滤分装，一2 0 保存。 1 6 3w e s t 锄b l o t 主要试剂的配制方法 ( 1 ) 3 0 丙烯酰胺：丙烯酰胺2 9g ，亚甲基丙烯酰胺lg ，加6 0l n l 去离子水，3 7 加热搅拌溶解，定容至l o oi i l l ，o 4 5 岫滤膜过滤，置于棕色瓶中4 避光保存。( 2 ) 1 0 s d s ：s d s1 0g ，溶于9 0 m l 去离子水中，加热至6 8 助溶，浓盐酸调p h 值至7 2 ， 去离子水定容至1 0 0m l ，室温保存。( 3 ) 1 0 a p s ：a p s1g ，1 0m l 去离子水搅拌溶解， 4 避光保存，溶液新鲜配制。 ( 4 ) 1 5m o l 几t r i s ( p h8 8 ) ：t r i s 碱1 8 1 7g ，去离 子水8 0i i l l ，搅拌溶解，浓盐酸调p h 至8 8 ，定容至1 0 0i i l l ，高压灭菌2 0m i n ，室温 保存。( 5 ) lm 0 1 lt r i s ( p h6 8 ) ：t r i s 碱1 2 1 1g ，去离子水8 0m l ，搅拌溶解， 浓盐酸调节p h 至6 8 ，定容至l o oi i i l ，高温高压灭菌2 0m i n ，室温保存。( 6 ) t e m e d ： 原液分装，4 避光保存。( 7 ) 5 t r i s 甘氨酸电泳缓冲液( 储存液) ：t r i s1 5 1 9 ，甘氨酸9 4g s d s5 0g ，去离子水8 0 0m l ，搅拌溶解定容至ll ，4 保存。( 8 ) 5 s d s p a g e 上样缓 冲液( 储存液) ：lm o l lt r i s h c l ( p h6 8 ) ，1 2 5m l ，s d s0 5g ，溴酚蓝2 5m g ，甘油 2 5m l ， 于1 0m l 塑料离心管中，加去离子水溶解定容至5m l ；小份5 0 0p l 分装后，室温保存， 使用前将2 5 “lp 巯基乙醇加到每小份中，加入d 巯基乙醇的上样缓冲液室温下可保存一 月左右。( 9 ) w e s t e mb l o t 膜转移缓冲液：t r i s 5 8g ，甘氨酸2 9g ，s d so 3 7g ， 去离子水6 0 0f i l l ，搅拌溶解，定容至8 0 0i i l l 后，加入2 0 0i i l l 甲醇，室温保存。( 1 0 ) 1 0 t r i s 盐缓冲液( t b s ) ：t r i s 2 4 2g ，n a c l8 0g ，去离子水8 0 0m l 搅拌溶解，定容至 1 0 0 0m l ，调p h 至7 6 ，4 保存。 ( 1 1 )膜封闭缓冲液( 5 脱脂奶粉) ：脱脂奶粉5g ， 溶于1 0 0 m l t b s tb u 舵r ，搅拌溶解，4 保存。( 1 2 )1 0 丽春红染液( 储存液) ：丽春红 s2g ，三氯乙酸3 0g ，磺基水杨酸3 0 g ，加去离子水溶解，定容至1 0 0m l ，室温保存。( 1 3 ) 5 封闭液：脱脂奶粉5 9 溶解于o 0 4 t b s tl0 0 m l 。 第二章实验方法 2 1c h i 附q 原核表达载体的构建 2 1 1 鸡血淋巴细胞的分离及培养n 町 ( 1 ) s p f 鸡提前1 2 周免疫新城疫苗。 ( 2 ) 从鸡翅静脉无菌采血1 0 m 1 ( 适量枸橼酸钠抗凝) 。 ( 3 )将采得的抗凝血在无菌状态下缓慢加入两倍f i c o l l 淋巴细胞分离液于上层，2 0 0 0 r m i n 离心1 0m i n 。 ( 4 ) 小心取云雾状的单核细胞层于一无菌试管中。 ( 5 ) 用含1 5 小牛血清的d m e m l 6 4 0 营养液稀释成o 5 1 0 6 个m 1 的细胞悬液加入2 4 孔培 养板中，每孔2 m 1 。 ( 6 ) 加入c o n a ，使每孔终浓度为1 5 2 0 u g m l ，3 7 ，5 c 0 2 培养8 1 0 小时。 2 1 2 鸡血淋巴细胞总r n a 的提取玎町 ( 1 ) 用t r i z o l 试剂从鸡血淋巴细胞中提取总r n a 。 收集经c o n a 刺激过8 小时的鸡血淋巴细胞；各加入l m lt r i z o l 液，充分裂解细胞，可 以用加样器反复吸打，移入1 5 m l 离心管中，室温静置5 m i n ；在离心管中加入0 2m l 预冷 的氯仿，振荡混匀；将离心管在4 ，1 2 0 0 0r m i n ，离心1 5m i n ；用移液器小心吸出上 层水相( 不要吸取中间白色的那层) ，加入另一离心管中，加入0 5m l 预冷的异丙醇，振 荡混匀；一2 0 沉淀过夜；4 ，1 2 0 0 0r m i n ，离心1 5m i n ；沉淀中加入lm l7 5 预冷 的乙醇洗涤r n a 沉淀，4 ，1 2 0 0 0r m i n ，离心5m i n ；重复用7 5 预冷的乙醇洗涤一次 r n a 沉淀，去上清，稍微凉干，r n a 略显透明，加入2 0plr n a s e f r e e 的水充分溶解。存 于一7 0 冰箱备用。 ( 2 ) 定量和检测总i 斟a ； 紫外定量和检测 i 用7 5 2 紫外光栅分光光度计检测r n a 的产量，在2 6 0 衄的吸光度，l o d = 4 0 肛g m l ； i i 根据在2 6 0n m 和2 8 0 姗处的吸光值，检测r n a 的纯度，纯r n a 的o d 2 6 0 o d 2 8 0 的 比值应接近2 0 ( 比值最好在1 9 2 1 之间) 。 琼脂糖凝胶电泳检测 i 配制1 的琼脂糖凝胶 a g r o s e0 2 5 9 5 x t b e 缓冲液2 5 i i l l 去离子水2 2 5 “ 微波炉加热熔解a g r o s e ，稍微冷却至5 5 ，加入1 u l 核酸染料，摇匀后倒胶，待胶 冷凝后，置于电泳槽中，浸于1 t b e 缓冲液中平衡1 0 分钟，待用。 i i 样品变性 山西医科大学硕士学位论文 5 l 0 a d i n gb u 仃e r 2 u l r n a 样品 l u g i t n a s e f j 雠 水调节至 l o u l 6 5 变性5m i n ，立即置于冰上冷却。 i i i 电泳 将处理好的i a 样品，稍微离心，加入加样孔中，6 0v 恒压电压1 0m 证 电泳结束后，在凝胶成像仪上观察结果。 2 1 3 i 玎p c r 扩增及c l l i f n q 回收纯化 ( 1 ) c l l i f n a 扩增 反转录反应 3 7 1 5m i i l ，后8 5 5 p c r 反应 反应条件： 5 p r i i m s c f i p tb u f 陆 2 u l p r i i n e s c r i p tr te n z ) r m em i x o 5 u l o l i 9 0d tp m e ( 5 0 u m ) 0 5 u l r a l l d o m6m e r s ( 10 0 u m )0 5 m r n a 模板 6 u l i 矾a s ef r e ed h 2 00 5 u l 1 0 p c rb u 丘e r d n t pm i x t u i e ( 2 5m m e a c ” i 玎产物 上游引物 下游引物 t a qd n a 聚合酶( 5 u u 1 ) d d h ，o 5 u l 4 u l 5 u l l u l l u l 0 2 5 m 3 3 2 5 u l t o t a l 5 0 u l 9 4 9 4 5 5 7 2 7 2 黧 3 l c 湖e 3 0 s i3 l c y c l e 1 m i i lj 4 ( 2 ) 分别取阳性对照和扩增产物各1 0 | i1 ，用1 2 琼脂糖凝胶电泳鉴定，其余存放于一2 0 备用。 ( 3 ) p c r 产物的切胶回收纯化 用1 t b e 配制1 2 低熔点琼脂糖凝胶，并且在制胶的过程中使用宽梳子； 将1 2 0i ll 扩增产物和2 5pl6 l o a d i n gb u f f e r 混匀后全部上样，8 5v 电泳4 0m i n ， 将凝胶小心放到长波紫外灯下，在紫外灯下照射的时间尽可能短，用一干净锋利的刀片从 琼脂糖凝胶中切取目的d n a 片段，尽可能减少胶的体积，将胶条转移到一个1 5m 1 的无 菌e p 管中； 称量凝胶的重量，以1 m g = 1 u l 换算凝胶体积；按1 2 低熔点琼脂糖凝胶，应该加 入5 个胶体积的b i n d i n gb u f f e r i i 总共1 5 m l 。 置于5 6 水浴中1 0m i n ，使胶彻底熔化。加热熔胶时，每2m i n 混匀一次； 将融化的胶溶液转移到套放在2m l 收集管内的u n i q - 1 0 柱中，室温放置2m i n ， 8 0 0 0 r m in 室温离心lm i n ； 取下u n i q _ 1 0 柱，倒掉收集管中的废液，将u n i q _ 1 0 柱放入同一个收集管中，加 入5 0 0 | llw a s hs o l u t i o n ，8 0 0 0r m i n 室温离心lm i n ； 重复步骤一次； 取下u n i q - 1 0 柱，倒掉收集管中的废液，将u n i q _ 1 0 柱放入同一个收集管中， 1 2 0 0 0 r m i n 室温离心2m i n ； 将u n i q _ 1 0 柱放入一根新的1 5m l 离心管中，在柱子膜中央加4 0ple 1 u t i o n b u f f e r ，3 7 放置5m i n ； 1 2 0 0 0r m i n 室温离心lm i n 以洗脱d n a ，离心管中的液体就是回收的d n a 片段， 可立即使用或置一2 0 保存；取2i l1 纯化产物进行1 2 琼脂糖凝胶电泳鉴定。 2 1 4p c r 产物双酶切及与质粒p m d l 8 t 的连接 ( 1 ) n d ei 酶切 1 0 hb u 疵r n d ei 纯化的d n a 底物 无菌去离子水 2 u l l l l l 5 u l 1 2 u l t o t a l 2 0 u l 加入内切酶后缓慢抽吸3 次进行混匀，3 7 水浴酶切过夜。 ( 2 ) 无水乙醇沉淀d n a 将2 0i ll ( 1 ) 中n d ei 酶切的产物移至1 5m le p 管中，加入4 0pl 冰预冷的无水 乙醇，混匀，在4 冰箱罩冰上放置lh ，1 2 0 0 0r m i n ，4 离心1 0m i n ，弃上清， 蒸发痕量乙醇。 ( 3 ) e c o ri 酶切 山西医科大学硕士学位论文 l o hb u 伍醯2 l l l e c o ril u l n d ei 酶切并沉淀后d n a 底物5 u l 无菌去离子水1 2 u l t o t a l 2 0 u l 2 0 i l l 加入内切酶后缓慢抽吸3 次混匀，3 7 水浴酶切过夜，同时行1 琼脂糖凝胶电泳 进行鉴定。 ( 4 ) 切胶回收纯化双酶切后p c r 产物 方法同2 1 3 ( 3 ) 。 ( 5 ) 切胶回收纯化双酶切后p c r 产物与质粒p m d l 8 一t 的连接 纯化p c r 产物 p m d l 8 ts i i i l p l ev e c t o r s o l u t i o ni 9 u l l u l 1 0 u l t o t a l 2 0 u l 混匀，1 6 水浴连接过夜。 2 1 5 将目的基因与质粒p m d l 8 t 的连接产物进行转化 ( 1 ) 重组载体转化入感受态阴5a 心伽 将上述1 0 虬连接产物加入到1 0 0 虬d h 5q 感受态细胞中，轻轻混匀，冰浴3 0 m i n ；再于4 2 水浴中热休克6 0s ，然后迅速放回冰中，将细胞冷却1m i n ，加入8 9 0 p l s o c 培养基，2 0 0r m i n ，3 7 振荡培养l 2h ；4 0 0 0r m i n 离心5m i n 浓缩 细菌，用适量l b 液体培养基重悬细菌；涂布于含a i n p + ( 终浓度为2 0 腿m l ) 的l b 平 板上，3 7 恒温箱培养过夜。 ( 2 ) 阳性菌落p c r 鉴定 从含a i n