（生物医学工程专业论文）声波对菊花基因差异表达影响的初步研究.pdf

至盎叁堂堡：生堂垡笙奎 墨壅塑翌 a b s t r a c t m u c hw o r kh a sb e e nd o n ea b o u ts o m ee n v i r o n m e n ts t r e s s e ss u c ha sd r o u g h t ，w a t e r f l o w , s a l i n i t ya n dm e c h a n i c a ls t i m u l a t i o ni n d u c i n gt h ed i f f e r e n t i a le x p r e s s i o no fg e n e s i np l a n t h o w e v e r , r e p o r t sa b o u tt h es t u d yo ft h ee f f e c t so ft h es o u n d ，aw i d e s p r e a d e n v i r o n m e n ts t r e s s ，o nt h eg e n ee x p r e s s i o no fp l a n t sa r er a r e o n l yt h ep r e l i m i n a r y s t u d ys h o w e dt h a th e r e d i t ys u b s t a n c eh a dn ov a r i a t i o nu n d e rs o u n ds t i m u l a t i o n ，b u t g e n ee x p r e s s i o nw a sa l t e r e d h o w e v e r , i ti s s t i l lu n c l e a rw h i c hg e n ef r a g m e n t si nt h e p l a n t a r e d i f f e r e n t i a l l ye x p r e s s e d u n d e r s o u n ds t i m u l a t i o n i nt h i s t h e s i s ， c h r y s a n t h e m u m i sc h o s e n a s t e s tm a t e r i a la n dt h ed i f f e r e n t i a l e x p r e s s i o n o f c h r y s a n t h e m u mg e n e sa r ep r e l i m i n a r i l ys t u d i e dt o s c r e e no u t g e n e si n d u c e db yt h e s o u n dw a v e f i r s t l nt h et o t a lr n a o f c h r y s a n t h e m u m i se x t r a c t e d t h ec h r y s a n t h e m u m s e e d l i n g i st r e a t e db ys o u n dw a v ew i t hac e r t a i ni n t e n s i t y ( 1 0 0 d b ) a n df r e q u e n c y ( 1 0 0 0h z ) f o r 6 0m i n u t e sad a y , a f t e r9d a y s ，t h et o t a lr n ao ft h et r e a t e dg r o u pa n dt h ec o n t r o lg r o u p a r ee x t r a c t e dw i t hr n a s ep l a n tm i n ik i t t h er e s u l t ss h o wt h a th i g h q u a l i t yt o t a lr n a h a sb e e no b t a i n e d t h ec o n c e n t r a t i o n ，t h ep u r i t ya n dt h ei n t e g r a l i t yo ft h et o t a lr n ac a n s a r i s f yt h en e e do f t h es u b s e q u e n tt e s t s m o r e o v e r , t h ey i e l dr a t eo ft o t a lr n ai sl a r g e r i nt h et r e a t e dg r o u pt h a ni nt h ec o n t r o lg r o u p ( t a b4 n a sat e m p l a t e ，t h et o t a lr n ae x t r a c t e df r o mt h et r e a t e dg r o u pa n dt h ec o n t r o lg r o u p i s r e v e r s e l yt r a n s c r i b e di n t oe d n a m r n a r e v e r s et r a n s c r i p t i o nd i f f e r e n t i a ld i s p l a y p c r ( d d r t - p c r ) i sa p p l i e dt o s c r e e no u tt h ed i f f e r e n t i a l e x p r e s s i o ng e n ef r a g m e n t s i n d u c e db yt h es o u n dw a v e 8p i e c e so fb a n d s ，w h i c ha r es a 5 - 1 ，s a 5 2 ，s a 7 ，c a 7 ， s c l ，s c 8 1 ，s c 8 2 ，c g lr e s p e c t i v e l y , a r e i s o l a t e d b yt h ep o l y p r o p y l e n ea c y lg e t e l e c t r o p h o r e s i s ( f i g5 7 ，5 8 ) a f t e rb e i n gr e a m p l i f i e d ，o n l yt h e3b a n d s ，w h i c ha r e s a 5 2 ，s c ja n d s c 8 1 ，a p p e a r o nt h ea g a r o s e g e l ( f i g5 9 ) t h em o l e c u l a rw e i g h t o f t h e t h r e e g e n ef r a g m e n t s o nt h e a g a r o s eg e l a n do nt h e p o l y p r o p y l e n ea w lg e l i s a p p r o x i m a t e t h e y a r et h ef r a g m e n t st h a ta r el o o k e d f o r n o r t h e r nd o th y b r i d i z a t i o ni su s e dt of u r t h e rc o n f i r mw h e t h e rs a 5 2 s c la n d s c 8 a r et h ed i f f e r e n t i a l e x p r e s s i o ng e n ei n d u c e db yt h es o u n dw a v eo rn o t t h e r e s u l t sd e m o n s t r a t et h a ts a 5 2a n ds c 8 一a r e r e a l l yt h ed i f f e r e n t i a le x p r e s s i o ng e n e s ， w h o s em o l e c u l a rw e i g h ta r e 2 9 0 b pa n d2 7 0 b pr e s p e c t i v e l y t h e r e i n t o ，s a 5 2 i s d o m i n a n t l ye x p r e s s e d ，a n ds c 8 1i sd i f f e r e n t i a l l ye x p r e s s e d w h i l es c li sf a k ep o s i t i v e l i 重庆大学硕士学位论文 英文摘要 f r a g m e n t ( f i g5 1 0 ，5 1 1 ，5 1 2 ) s a 5 2a n d s c 8 - 1a r eg o a i n gt ob ec l o n e da n d s e q u e n c e d ， a n dt h e nt h e i rf u n c t i o n sf u r t h e ra n a l y z e d b ya n a l y z i n gt h ed i f f e r e n t i a lg e n ef r a g m e n t s i nt h ec h r y s a n t h e m u ma n di nt h e a r a b i d o p s i st h a l i a n a ，i t i sf o u n dt h a ts a 5 2i nt h ec h r y s a n t h e m u ma n ds a 3i nt h e a r a b i d o p s i st h a l i a n aa r ev e r ys i m i l a r ( f i g5 1 3 ，5 1 4 ) ，w h i c h a r ea m p l i f i e df r o mp r i m e r c o m b i n a t i o nw i t ht h es a m ea n c h o r e dp r i m e r ：a a gc t tmt t tt t aa n dt h es i m i l a r r a n d o m p r i m e r t h es e q u e n c e o fr a n d o m p r i m e r i sa a g c t t a g t a g g ca n d a a g c t t t g g t c g a r e s p e c t i v e l yi na d d i t i o n ，t h em o l e c u l a rw e i g h to fs a 5 2a n ds a 3 i sa l s o v e r ya p p r o x i m a t e t h et w og e n ef r a g m e n t sw i l l b ef u r t h e r a n a l y z e di n t h e s u c c e d a n tt e s t s k e y w o r d s ：s o u n dw a v e ，c h r y s a n t h e m a m ，d d r t - p c r ，n o r t h e r nd o th y b r i d i z a t i o n i i i 重丛查堂堡主堂笪堡塞一 ! 堑篓 1绪论 植物生存的环境并不总是适宜的，经常会受到复杂多变的逆境胁迫，随着全 球性生态环境日渐恶化，各种各样的环境胁迫对植物的正常生长带来了越来越多 的影响，所导致的经济损失非常巨大。因此，关于植物抗逆性的研究也日益受到 重视。 1 1 植物整体抗逆性研究的兴起 胁迫( s t r e s s ) 系指对植物生存和生长不利的各种环境因素的总和。植物的环 境胁迫分为生物胁迫和非生物胁迫两大类。生物胁迫是指瘸害、虫害和杂草。而 非生物胁迫则指不利的理化因子。其分类见图1 1 辐射化学因素风、雪、雨、 厂 盐类离子、声、磁、电等 红可 紫童 气体、除草剂 凳冕凳 蠹 图1 ，1 非生物胁迫分类 f i 9 1 1t h e s o r t so f u n b i o l o g ys l r e s s 通常人们将植物受到的上述各种环境胁迫叫做逆境( l e s sf a v o r a b l e e n v i r o n m e n t s ) ，植物对这种逆境胁迫( s t r e s s ) 的抗性叫抗逆性( s t r e s sr e s i s t a n c e ) 。随 着环境胁迫类型的多样化和严重化，有关植物对逆境的反应及机理研究，以及刘 抗逆性的人工调控，在8 0 年代已受到全面重视。这也是生态学研究的热潮时期， 但更多的研究集中在生态因子与植物生长互作关系研究【l i ，特剐是植物生理学家所 做的很多基础理论研究工作。日本的植物和细胞生i t 望( p l a n t a n dc e l lp h y s i o l o g y ) 杂志 1 9 9 0 年开辟了“环境胁迫响应”( e n v i r o n m e n t a la n d s t r e s sr e s p o n s e ) 专栏，沿用至今； 美国的“植物生理”( p l a n tp l a y s i o l o g y ) 杂志也在同年开辟了“环境和胁迫生 理”( e n v i r o n m e n ta n ds t r e s sp h y s i o l o g y ) 专栏。9 0 年代初，植物抗逆性研究全方位发 展，走向更深层次的机理研究。1 9 9 5 年，p l a n t p h y s i o l o g y 杂志顺应世界科技潮流， 将“e n v i r o n m e n ta n ds t r e s s p h y s i o l o g y ”专栏改名为“植物整体，环境和胁迫生 理”( w h o l ep l a n t ，e n v i r o n m e n ta n ds t r e s sp h y s i o l o g y ) 专栏。从此植物整体抗逆性 水 一 激 蝻忑温一懈_觏 重庆大学硕士学位论文 绪论 ( w h o l ep l a n ts t r e s sr e s i s t a n c e ) 研究，在多学科交叉研究的同时，走向更加深入和广 泛的领域。 1 2 植物抗逆性分子机理的研究进展 分子生物学的发展，使植物抗逆性在分子水平遗传研究方面已取得了很大进 展。人们已经研究了多种逆境胁迫下植物基因表达的变化，能够在基因组成、表 达调控及信号传导等分子水平认识植物对逆境胁迫的耐( 抗) 性机理。并已克隆 到来自植物逆境胁迫信号传导的一些重要基因。 1 2 1 逆境下植物基因表达的变化 b r a a m 等对拟南芥受机械刺激后基因表达变化进行了深入研究，到目前为l 已 发现5 个与机械刺激相关的基因，它们分别是t c h l ( t o u c hg e n e ) 、t c h 2 、t c h 3 、 t c h 4 、t c h 5 。大量的比较实验发现，接触、风、喷水等不造成表面损伤的机械 刺激均对t c h 的表达产生正调控作用。随着研究的不断深入，发现t c h 还可以 被黑暗和温度变化等非机械性刺激诱导 2 4 】表达。a n t o s i e w i e z 5 1 等人也发现生长素 能对t c h 家族的部分成员产生正调控c f g 作用。到目前为止，已表明拟南芥t c h 存在两个显著的特点：第一、机械刺激后t c h m r n a 的含量明显上升；第二、机 械刺激后t c h 迅速表达，这种表达的动力学与特定的基因和相应的刺激有关。 b r a a m l 2 。j 通过n o r t h e m 分析指出，植物受刺激1 0 m i n 后t c hm r n a 含量明显升 高，但在受刺激后1 3 h 又基本恢复到原来水平。可见，t c h 表达的“启动”是快速 的，同样该基因表达被“关闭”也是快速的，从以上分析可以看出t c h 的表达是非 常复杂的。多种非相关的刺激可以起到同样的效果，其机制何在? b r a a m 6 等人还 提出了两种可能的模型，一种是接触、风、黑暗、温度变化等非相关的刺激均对 t c h 的表达产生正调控作用，每一种刺激通过作用特异的受体激活其相应的信号 传递通道，从而引起t c h 的表达，在这种情况下其调控机制同样依赖于刺激的类 型。接触可以把在5 端增强转录活性的反式作用因子激活，而黑暗则通过作用转 录区的序列元件进而调整m r n a 的稳定性；另一种可供选择的模型是认为各种刺 激均能作用于t c h 表达的前一步，可能存在相同引起t c h 表达第二信使。当然也 可能是这两种模型的结合。 1 2 2 逆境下基因水平的信号传导 逆境下基因表达水平的调控 由于分子生物学方法的应用，许多植物受体的研究发展很快。与逆境胁迫直 接相关的a b a 和乙烯的受体蛋白基因及逆境响应基因的报道在1 9 9 8 至1 9 9 9 年间 就有近2 0 0 篇，这些报道大多数集中在基因表达水平上。早期研究盐、干旱胁迫 和a b a 诱导基因表达水平的变化，主要集中在结构蛋白如l e a 蛋白基因、e m 蛋 2 重庆大学硕士学位论文 1 绪论 白基因、脱水素蛋白基因 7 】平口一些编码与渗透素生物合成有关的酶，如醛糖还原酶、 甜菜碱醛脱氢酶”1 ，以及具有调节功能和信号传导功能蛋白如r n a 结合蛋i 刍( r n a b o u n dp r o t e i n ) 、m y b l i k e 、b z i p t y p e 、转录因子( t r a n s c r i p t i o nf a c t o r s ) p 。1 、假想 蛋白激酶( p u t a t i v e p r o t e i n k i n a s e s ) ) 1 1 1 和组蛋白( h i s t o n e ) 7 1 等表达产物上。近两年则转 向对逆境应答的基因表达调控的研究，报道最多的是顺式作用元件和反式调节因 子。如已证明水稻中由a b a 诱导的r a b l 6 基因的启动子中t a c g t g g c 、 c g c c g c g c c t c c 和c g c g c g c g c t 定位在一2 9 5 2 5 之间，认为这段对a b a 的 应答是重要的，也有可能与核蛋白作用“，因此认为r a b l 6 基因是在a b a 应答 引起基因表达过程中起调控作用的顺式作用元件。大麦中由a b a 和干旱诱导的基 因h v a 2 2 ，至少有3 个元件，其中两个定位在启动子区，另一个定位于第一个内 含子中，高水平a b a 诱导其表达，启动子区的两个顺式元件即是典型的a b a r e 结构序列，消除其中一个元件便使a b a 应答极显著降低，其产物含有已知的调控 蛋白保守结构的特点【l ”。因此，a b a 和干旱诱导的基因表达是受多重顺式作用元 件顺序调控的。盐胁迫下水稻中a b r e 响应元件结合的两个多肽链的合成受g t p 调节，这两个多肽链可能为反式调节因子i i “。玉米中a b a 和水胁迫应答蛋白 r a b l 7 ( l e u 基因的产物) 高度磷酸化，定位于核内，与核内定位信号肽结合，以磷 酸化的形式在核内出现。r a b l 7 与n l s ( 核内定位信号肽) 的结合依赖于磷酸化【l “， 而n l s 是反式调节因子的典型结构序列。玉米中干旱和a b a 响应基因v p l 与核 内染色质的结合状态依赖于转录因子的磷酸化和脱磷酸化共激活( i 。玉米r a b 基因 中发现一个r n a 结合蛋白( r n a b o u n dp r o t e i n ) 的保守序列，它与g u 丰富的r n a s 作用有关7 。由此可知，逆境诱导的基因表达是通过信息传导对顺式作用元件和 反式调节因子的激活而实现的。 近两年对另一个与逆境相关的激素乙烯感受途径的研究也取得了很大进 展。乙烯信号传导途径的遗传学模型为e t o t 、e t 0 2 、 e t o e t r l c t r l e i n 2 一e i n3 一三重反应 1 8 】。其中一些成分是蛋白激酶，如 e t r l ，c t r i 蛋白的氨基酸序列与原核生物中双组分系统( t w oc o m p o n e n ts y s t e m ) 的蛋白质超家族具有显著的相似性，这种双组分信号调控系统由感受器( s e n s o r ) n 应答调节器：( r e s p o n s er e g u l a t o r ) 组成，位于细胞质膜上的组氨酸蛋白激酶作为感受 器，其n 末端部分具有感受环境信号的结构域，c 末端则为传递信号功能域，含 有2 4 0 氨基酸，有几个保守的小区域，其中之一为h 盒，应答调节器用于调节基 因表达或传递来自感受器的信号。这种结构为植物对外界环境变化的适应性反应 提供有效机制 1 9 】。e 1 n 3 可能是一种转录因子【2 0 】。拟南芥的两个反式调节因子 d r e b l 、d r e b 2 由干旱和低温诱导表达，结构分析表明，它们均含有一个d n a 结合域和一个乙烯应答区 2 ”。因此，逆境应答的基因转录调节这一信息传递过程 重庆大学硕士学位论文 1 绪论 正是利用了基本元素组合的原理。转录因子可分成两大类，一类是基本转录因子， 它们是一类较为通用的转录因子，例如与某些启动子序列的共有序列t a t a 盒子相 结合的t b p ( t a t a b o xb i n d i n gp r o t e i n ) ，即基本转录因子。另一类则为特异性较强 的转录因子，某些组织特异性转录因子即属此类。这些转录因子常与d n a 调控区 的某些特异识别部位，例如增强子序列相结合，使某些具组织特异的蛋白质得到 表达。多个转录因子与r n a 聚合酶构成复合酶系统，在接受特异信号传递后，可 能参与信号传导而调节特异基因的转录。但是，逆境信号和激素如何传递到这些 因子或元件上，这些蛋白质的浓度是否改变，蛋白质与蛋白质、蛋白质与d n a 结 合中是否涉及磷酸化、脱磷酸化等等问题尚待研究。 基因组变异水平的信号传导 由于分子生物学技术的深入应用，6 0 年代以后积累的大量资料证明，生物在 生活过程中由于环境的变化，可以产生新的性状以适应新的环境，这种性状可以 遗传。这显示逆境中获得的性状与d n a 顺序的增加或丢失有关。如亚麻栽培在高 氮土壤中2 3 代后，其基因组中d n a 发生扩增【2 ”。烟草培养细胞在受伤条件下 逆转座子t t o l 异常活跃，t t o lr n a 转录激活，并大量表达，结构分析表明t t o l 序列中有一个顺式调节区可以感受外界的刺激信号【2 ”。自1 9 8 3 年在玉米中发现【2 4 1 逆转座子以后又进一步证实其中有反转录酶基因，且此种酶可将r n a 逆转录为 d n a 2 ”。现有的大量资料表明，植物中存在反转录酶和r n a 逆转录为d n a 过程 已是事实 2 6 1 。逆境下植物中逆转座子被激活，反转录酶活性得到启动，促进r n a 逆转录为d n a ，于是合成新的或多拷贝c d n a 整合到基因组中 2 ”，从而获得新的 性状f 2 “2 9 o 外界信号如何启动此种逆转录过程，并引起d n a 序列变化的详细机 制还不清楚。 虽然人们在植物抗逆性机理的研究上取得了很大的进展，并且已克隆到对一 些环境胁迫响应的特异基因，但是这些研究对彻底弄清植物抗逆性的机理非常有 限。因为无论是从研究抗逆性机制的深度还是从研究环境胁迫的广度来说，这些 研究还不具有足够的代表性。因此有必要研究植物对其他环境胁迫响应的机理。 本文选用自然界中普遍存在但研究较少的一种环境胁迫声波来处理植 物，通过分子生物学方法筛选出响应声波胁迫的特异表达基因，以期对此差异基 因片段和它调控的功能蛋白进行序列和功能分析，探求声波这种胁迫方式和其他 非相关胁迫之间是否具有同效性，为进一步探索植物整体抗逆性机理做准备。 1 3 本文的研究目的和意义 在此之前，本实验室研究了声波对植物个体、组织、细胞三个层次的影响【”。 3 1 3 23 3 1 。然而，还没有深入到基因水平来研究响应声波的相关基因的表达及机理。 4 里垂奎堂堡主兰售! 垒塞 因此，寻找响应声波刺激的基因、分析其序列和功能，探索植物响应声音胁迫的 机理就成为了现在和将要进行研究的目标。 本文目的是在本实验室研究结果的基础上，在基因水平上研究声波作用下植 物( 菊花) 基因表达的变化，运用差异显示技术初步筛选出响应声波的特异表达 基因，通过n o r t h e r n 杂交找出真正的差异表达基因( 可能为新基因) ，为后续特异 表达基因测序、克隆和功能分析，并最终为探索植物抵抗声音胁迫的机理做准备。 1 4 本文的主要工作和技术路线 上述课题研究思路是一个完整的课题，受时间限制，本文只能完成其中的部 分工作，即从菊花苗的培养至差异基因片段真假阳性的鉴定。而对拟南芥的差异 基因的筛选则由张进完成。总的说来，本文需要完成的工作如下： 1 4 1 实验材料( 菊花苗) 的准备 本文以通过组织培养培育的菊花无菌苗作为实验材料，在菊花苗的培育过程 中，要确保其来源的一致性。在声波加载时，处理组和对照组的生长环境也要求 一致。采用的声波强度和频率，以及声波处理时间均参考王秀娟毕业论文 3 1 。 1 4 2 分离出受声波诱导的差异表达条带 这一部分是本文工作的重点。当用一定强度和频率的声波处理菊花苗时，其 基因表达会发生变化口”，通过差异显示技术分离出差异表达的基因片段，初步筛 选出受声波诱导的基因片段。 1 4 ，3 证实差异表达条带 由于通过逆转录差异显示技术筛选出来的差异表达条带具有很高的假阳性， 因此有必要对筛选出来的差异条带进行确证，以去掉假阳性条带，找出真正受声 波诱导的差异表达基因，为克隆测序和进行基因功能分析等后续工作打下基础。 技术路线如图1 3 1 5 本文的创新点 1 5 1 声波对植物影响在分子水平的深入 将声波作为胁迫手段和分子生物学的研究方法结合起来，从基因水平上探讨 声波对菊花基因差异表达的影响，为后续的研究打下基础，研究内容国内外未见 相关报道。 1 5 2 对获得的差异片段做横向和纵向比较 以模式植物拟南芥为中介，将声波处理菊花后获得的差异表达基因和处理模 式植物拟南芥后获得的差异表达基因作横向比较，分析声波对菊花和拟南芥基因 表达是否具有同效性。 5 重庆大学硕士学位论文 l菊花茎尖| j 接种 i 声波加载 小山 对照组c| j 刺激组sj il 提取c 组m r n a 提取s 组m r n a ， j 同一锚定引物对两种r n a 各自进行反转录 l 同一对引物组合分别对两种c n a 摸板进行p c r 扩增 j 相邻泳道聚丙烯酰胺凝胶电泳 无差异条带，换引物对 有条带、 切胶二次扩增 回收纯例 v n o r t h e r n 点杂交 声波处理模式植 物拟南芥后获得 获得阳性片段 的阳性片段 i 横向比较i v 结论 图i 2 本文技术路线 f i 9 1 2t h et e c h n i c a lr o u t ei nt h ep a p e r 6 重庆大学硕士学位论文 2 差异显示p c r 2 差异显示p c r 8 0 年代中期出现的p c r 技术为发展更简单、更迅速、更优越的分离鉴定差 异表达基因的方法提供了基础。1 9 9 2 年，哈佛医学院的p e n gl i a n g 3 4 1 博士等首次 提出并运用了m r n a 差异显示技术( m r n ad i f f e r e n t i a ld i s p l a y ，d d r l 斗c r ) 来 进行基因的分离。至今，在十多年时间里，运用m r n a 差异显示技术分离鉴定的 差异表达基因的报告逐年增加，其中关于动物发育调节的基因占大多数，范围遍 及动物组织器官发育、肿瘤发育有关的原癌基因及激素作用、代谢过程、神经发 育等。研究体系也从简单的单细胞到高等的哺乳动物。相对来说，利用m r n a 差 异显示技术鉴定植物发育调控基因的报告要少得多，但也在呈逐年增加之势。 2 1 差异显示技术的原理 该技术利用了绝大多数真核生物的m r n a 3 端都有p o l y ( a ) 尾巴，且紧靠 p o l y ( a ) 上游的两个碱基除去倒2 位的a 外只有十二种组合的特点，设计一段能够 与聚a 尾巴互补结合的引物即o l i g o d ( t ) 1 1 1 2 m n ( m = a 、g 、c ：n = a 、t 、g 、 c ) ，用一种引物延伸进行逆转录可将1 1 2 的m r n a 逆转录成e d n a ，如图2 1 5 - a g a 66 a a a 一3 5 g t a a a a a a a 3 5 - cg a a a a a a a 一3 5 - t t a a a a a a a 一3 5 一gg a a a a a a a 一3 5 a c a a a a a a a 3 5 t g a a a a a a a 一3 5 c c a a a a a a a 3 5 一a t a a a a a a a 一3 5 - g c a a a a a a a 3 5 一c t a a a a a a a 一3 5 一t c a a a a a a a 一3 图2 1 真核生物聚a 尾巴的碱基组合 f i 9 2 1b a s e ss e q u e n c e so f p o l y a t a i li nt h ee a k a r y o t e s 若改变引物3 端的两个碱基，就可对不同的m r n a 亚群进行逆转录。在有3 ， 端锚定引物存在的条件下，加入一个5 端随机引物( 一般为1 0 m e r ) 组成引物对 对e d n a 进行p c r 扩增，就可得到来自同一m r n a 亚群中不同的m r n a 扩增产 物。一对引物的扩增产物是一系列大小不同的片段，不同的引物组合从理论上就 能够扩增几乎所有的m r n a ，最大限度地反映了差异。如果在扩增中将产物用 a 一 3 5 s 一d n t p 标记，扩增后进行测序胶电泳分离，经放射自显影就可以找出一对 或一组细胞中差异显示的e d n a 片段，差异显示的片段就是特异表达基因的d n a 片段。从胶上切下这些c d n a 片段纯化后，再扩增克隆后进行序列分析，或用作 7 重庆人学硕士学位论文 2 差异显示p c r 探针与基因文库杂交就可筛选到全跃的基因。这就是差异显示法的全过程。其流 程图如2 2 ： 圈2 2 逆转录差异显示p c r 流程 f i 9 2 2t h ef l o wc h a r to f d d r t o p c r 2 2 差异显示技术的方法和策略 从上图可以知道，d d r t - p c r 实际上包括三个基本步骤和两个附加步骤，即 用一套锚定引物反转录每部分材料； 用一套随机引物和锚定引物从反转录的每一部分扩增e d n a ； 电泳分离产生扩增片段； 再扩增两种不同状态下有差异的片段，并且进行克隆和测序； 用r n a 分析技术( n o r t h e r nb l o t t i n g ) 证实差异表达。 差异显示技术的策略是通过一系列的锚定引物与随机引物组合把不同种细胞 进行分组反转录与p e r 扩增，这样极微小的基因表达差异就可被放大，通过电泳、 放射臼显影或银染得以检测出来35 1 。而其妙笔之处则在于由1 2 种p o l y t m n 或 3 种p o l y t m 锚定引物合成的e d n a 可以代表细胞中全部基因的表达种类和水平， 而由引物组合所进行的p c r 扩增则可将细胞之间有差异的基因表达片段显示出 来3 “。 2 3m r n a 差异显示的不足之处 m r n a 差异显示具有许多显而易见的优点 8 重庆大学硕士学位论文 2 差异显示p c r 各个关键步骤简单易行，如反转录技术，p c r 扩埔都是分子生物学实验 室的常规技术； p c r 扩增的灵敏度好； 无论基麈；】在m r n a 水平上是上调还是下调，都可以检测出来； 可以进行多份样品一一对应的比较； 只需少量的r n a ； 能通过n o r t h e r nb l o t 等方法迅速鉴定出真假阳性； 结果可重复性好。 正是由于m r n a 差异显示的这些优点，它已经成功地应用于动物及人类癌 症、心脏病、糖尿病、胚胎发生、脑发育、生长因子激活与抑制有关的基因的鉴 定与克隆。此外，该技术也成功地应用于与植物胚胎发育、无融合生殖、形态发 生、果实发育、信号传导、植物抗逆与抗病性及植物与真菌有关的基因的比较鉴 定和克隆。然而，该技术尚存在一些缺陷，主要表现为： 2 3 1 较高频率的假阳性 典型的差别显示会产生大量的表面上为特异条带而实际为假阳性的片段。这 些片段在n o r t h e r n 杂交中不能被证实。据估计这种假阳性片段在差别条带中常常 达到5 0 7 5 甚至以上【3 7 1 。l i a n g 掣3 4 峙艮道在2 0 个差示片段中，仅有两个n o r t h e r n 杂交得到证实。目前认为这种高频率的假阳性主要原因可能有： 引物片段过短，再扩增时产率低，甚至有些差异条带扩增不到。 非相关e d n a 污染，即若干d n a 片段可存于一条切割带中。 因扩增片段较短，n o r t h e m 杂交检测无信号或信号无差异，特别是小于2 0 0 b p 的片段。 p c r 高度敏感，扩增出一些稀有m r n a 片段。 序列胶上相邻条带间距较小，切割时又是在放射自显影或银染显示等条件下， 在切割时亦易造成假阳性的可能。 l i a n g 等 ”1 还认为假阳性的产生还与引物5 ，端的错配有关。 2 3 2 差别条带的短小且大多显示3 u t r 信息 p c r 扩增的差异表达基因片段一般在1 1 0 4 5 0 b p 之间，通常3 0 0 b p 左右，有 的称之为d d e s t 。因为反式p c r 引物被锚锭于p o l y ( a ) 尾处，那么通常扩增e d n a 片段位于p o l y 末端区，即仅仅显示3 - u t r 序列( 非翻译序列) 。这些区域有些是 不翻译或是重复的，大多数已知基因是不含3 - u t r 信息，且不同的生物体之间 这部分序列相差很大，因此，用差别显示得到的条带常常不能与g e n e b a n k 中的 基因相比，要尽可能地获得e d n a 全片段必须建立e d n a 文库，这是一项费时的 工作，成本高且成功率尚待提高 3 9 4 0 】。 9 重庆大学硕士学位论文 2 差异显示p c r 2 3 3d d p c r 对高拷贝m r n a 有很强的倾向。性 在f l n t p 浓度很低时，易造成竞争机制，p c r 产物更倾向于高拷贝m r n a ， 因此，d d p c r 不能正确反应低拷贝m r n a 。这是它的另一缺陷【4 ”。为解决 这个问题，可以提高d n t p 浓度即5 随机引物浓度相对提高，还可以将p c r 反应 参数优化以减少竞争性增加敏感性1 4 “。 2 3 4 差别条带的重现性与低丰度m r n a 的鉴定 有不少实验发现差别条带的重现性并没有想象的那么好，即在重复实验中仅 能有一些主要条带呈现高度可重现性，这就要求实验者对非重现性条带进行足够 的验证。另外，有些学者也提出，差别显示理论上的优点之一可鉴别低丰度m r n a 在实践中遇到的许多问题。 2 4m r n a 差异显示技术的改进及发展 由于m r n a 差异显示技术在操作或实验设计上存在明显的不足甚至是缺陷， 于是近几年不少实验对浚技术作了或大或小的改进，出现不少新的方法。 2 4 1 局部的改进和实验参数的优化 起始( 模板) m r n a 的质量与浓度 提取m r n a 应用无r n a 酶的d n a 酶消化，以去除污染d n a 。m r n a 浓度 不应小于0 1 g ，以免丢失稀有m r n a 而使结果错误。 引物的选择和改进 引物包括下游锚锭引物和上游随机引物。主要有锚锭能力、引物长度与数量、 中间和术端g c 含量、引物5 端的酶切位点的添加等。其中值得关注的是1 9 9 4 年l i a n g 【3 5 等将1 2 条引物精简为3 条，即3 条简并引物。1 9 9 5 年a y a l a 等创 新性地提出在锚锭引物的3 端和随机引物的5 端加上e c o ri 等酶切位点，使结 果的重复性与敏感性大大提高。 p c r 扩增条件与参数优化 这里包括d n t p 浓度、m 矿+ 离子浓度、退火温度、同位素的掺入和缓冲溶液 及聚合酶的选择与使用等。 电泳和差异片段的显示 除了使用变性聚丙烯酰胺凝胶( 测序胶) 之外，b a u r e r 等 4 4 1 采用非变性聚丙烯 酰胺凝胶电泳，使电泳带数明显减少。在片段显示上，除了传统的放射自显影， l o h m a n n 等建立银染法，i t o 等建立荧光显示法，将d n a 自动荧光测序技术 仪引入浚项技术，不仅避免同位素的应用，而且使操作简单化、自动化，同时提 高灵敏度。用溴化乙锭和s y b rg r e e ni 荧光染料染色等改进方法显示条带也有 报_ i ：酋 3 8 1 4 7 1 。 1 0 重庆大学硕七学位论文 2 差异显示p c r 差异c d n a 条带的回收、纯化和再扩增 从胶上割下的差异条带往往被尿素等杂质污染，凶此，在再扩增之前往往需 要纯化，纯化的方法通常有煮沸法、玻璃粉末洗脱法和碾磨法等。再扩增条件基 本上与r t - p c r 的条4 l ：n 同。 差异基因的鉴定 通常将再扩增的c d n a 片段作为探针，作n o r t h e m b l o t 检测m r n a 的表达差 异p ”。该方法对于少量的差异片段的确证尚可，但如差异片段较多时，此法工作 量太大。现在常用r e v e r s en o r t h e r nd o tb l o t 或s l o tb l o t 方法。该方法不是把c d n a 标记为探针，而是把来自各样品m r n a 逆转录c d n a 标记为探针，然后与点在杂 交膜上的c d n a 杂交，与一种探针杂交后有阳性信号者为阳性c d n a 。此法可用 少量的探针筛选大量差异片段，快速简便，灵敏度高，是目前筛选鉴定大量差异 片段的重要方法 ”1 。 2 5 差异显示技术在植物研究中的应用 2 5 1 基因表达差异 由于m r n a 差异显示技术有快速、简便、灵敏度高等特点，因而可以了解 植物不同发育阶段或不同环境下细胞之间基因表达的差异。张驰 4 8 1 等利用m r n a 差异显示技术比较了水稻7 7 1 7 0 与其耐盐突变体m 一2 0 在盐胁迫下基因表达的 差异，克隆了1 3 个分别在7 7 1 7 0 或m 一2 0 中盐诱导蛋白的c d n a 片段，这些 克隆的获得为进一步研究水稻盐诱导蛋白的表达特性打下了基础。崔凯荣等4 9 1 利 用m r n a 差异显示技术分析枸杞体细胞胚胎发生早期基因的差异表达，得到了三 个在体细胞胚胎发生早期组织中基因特异表达的片段。为了研究非乙烯敏感植物 的成熟机理，以未成熟和成熟的非乙烯敏感草莓果实为材料，应用差异显示技术 用3 对引物组合得到了5 个仅出现在成熟阶段的差异片段，其中3 个分别与可能 编码拟南芥，4 0 s 核糖体s 1 2 蛋白的c d n a 克隆y a p 2 6 7 t 7 、豌豆等的膜联蛋白 以及许多植物的查耳酮合酶基因有较高同源性，研究这些基因表达产物的生物学 功能将为从分子水平揭示果实成熟本质提供重要的线索t 5 ”。王光清等1 采用 m a d s 盒基因家族功能区保守序列p c r 引物，将水稻“珍汕9 7 b ”悬浮细胞、愈伤 组织、分化愈伤组织和再生试管苗等不同形态发生的组织的m r n a 反转录后选择 性放大，经测序胶分离鉴定出l 组差异表达的c d n a ，对命名为r m l c d n a 的5 端序列测定表明，r m l 与典型的m a d s 基因拟南芥a g a m o u s 蛋白保守区一 级结构同源性达6 3 ，模拟二级结构相似性显著，初步确认r m i 属于m a d s 基 因家族成员。此外，运用m r n a 差异显示技术研究基因表达差异，在玉米、家蚕、 水稻、豌豆、马铃薯、拟南芥等都有报道。 重庆大学硕士学位论文2 差异显示p c r 2 5 2 基因的鉴定与克隆 分析基因表达差异，寻找分子标记的目的是为了克隆基因，研究其对植物生 长和发育的影响。张景风等 5 2 1 利用m r n a 差异显示技术扩增并克隆了s m v - z k 基 因组中全部蛋白质编码区的c d n a ，通过对h c p r o 、n i b 和c p 编码区进行序列 测定和分析，发现与s m v - g 2 高度同源，从而在分子水平证明中国大豆作物中存 在s m v - g 2 类似株系，将s