（化学工程与技术专业论文）3羟基丙酸生物合成及辅因子代谢调控.pdf

学位论文数据集 中图分类号 q 7 8学科分类号 1 8 0 7 1 1o 论文编号 10 0 10 2 0 1 0 1 1 1 4 密级 学位授予单位代码 1 0 0 1 0 学位授予单位名称北京化工大学 作者姓名萨娜学号 2 0 0 8 0 0 1 1 7 7 获学位专业名称 化学工程与技术获学位专业代码 0 8 1 7 课题来源 国家自然科学基金研究方向代谢工程 论文题目 3 一羟基丙酸生物合成及辅因子代谢调控 甘油，3 一羟基丙酸，肺炎克雷伯氏菌，3 一磷酸甘油脱氢酶，3 一磷酸甘 关键词 油酯酶，醛脱氢酶，n a d 再生，重组菌，发酵 论文答辩日期 2 0 11 - 5 - 2 3 论文类型 应用研究 学位论文评阅及答辩委员会情况 姓名职称工作单位学科专长 指导教师田平芳副教授北京化工大学 分子生物学 评阅人1谭天伟教授北京化工大学生物工程 评阅人2张鹏副教授北京化工大学 生物工程 评阅人3 评阅人4 评阅人5 答辩委员会主席谭天伟教授北京化工大学 答辩委员1 苏海佳教授北京化工大学 答辩委员2罗施中副教授北京化工大学 答辩委员3 邓利副教授北京化工大学 答辩委员4张栩副教授北京化工大学 答辩委员5 注：一论文类型：1 基础研究2 应用研究3 开发研究4 其它 二中图分类号在中国图书资料分类法查询。 三学科分类号在中华人民共和国国家标准( g b t1 3 7 4 5 - 9 ) 学科分类与代码中 查询 四论文编号由单位代码和年份及学号的后四位组成。 3 一羟基丙酸生物合成及辅因子代谢调控 摘要 3 一羟基丙酸( 3 一h p ) 是一种重要的平台化合物，其产量直接影响着许多 高附加值化学品的生产。本文以肺炎克雷伯氏菌k l e b s i e l l a p n e u m o n i a e 作 为宿主，是因为它具有天然甘油的歧化途径，完整的d h a 调节酶系，并且 可耐受高浓度甘油。通过代谢途径的优化，构建了兼具甘油合成及3 羟基 丙酸合成的重组菌，既改善了菌体代谢过程中的辅酶平衡，又实现了3 羟基丙酸的高产。 本文克隆了酿酒酵母甘油合成的关键酶基因：3 磷酸甘油脱氢酶 ( g p d l ) 和3 磷酸甘油酯酶( g 纠誓) ，并利用构建了两个基因串联共表 达盒，在大肠杆菌内构建了一条以葡萄糖为底物生物甘油的途径，经 s d s p a g e 验证，两基因菌成功表达，摇瓶发酵甘油产量为1 o g 1 。渗透 压实验表明该重组大肠杆菌比原始菌应对环境渗透压变化的适应能力明 显增强。 为了增加可溶性蛋白的表达量及省却诱导剂i p t g ，在k p n e u m o n i a e 基因组中寻找组成型启动子，用于表达外源基因。克隆了甘油脱水酶的启 动子区域，将质粒p e t 一2 8 a 的t 7 启动子替换为该启动子，构建了一个可 在kp n e u m o n i a e 体内表达的载体，并将甘油合成途径的表达盒g 1 2 与该 载体连接，该途径可在宿主kp n e u m o n i a e 中表达，s d s p a g e 分析表明， 外源基因正确表达。 通过对甘油在kp n e u m o n i a e 厌氧发酵代谢途经分析，为了实现3 - 羟 北京化t 人学硕i j 学位沦文 基丙酸的高产，需要对代谢途径进行优化，实现还原力的平衡，因此将甘 油合成途径作为一个n a d 再生系统引入3 羟基丙酸合成途径，构建了一 个包含：3 磷酸甘油脱氢酶、3 磷酸甘油酯酶、醛脱氢酶、甘油脱水酶基 因的表达载体。这四个基因受控于两个组成型启动子的串联共表达，增加 了酶催化的空间邻近效应，有助于提高该途径的催化效率。经过 s d s p a g e 及初步表达鉴定，该载体可在kp n e u m o n i a e 内表达这四个基 因，打通了葡萄糖到3 羟基丙酸的代谢途径，以葡萄糖为底物发酵1 0 h 时3 羟基丙酸产量达到最大值o 5 2 9 1 。 为了提高3 羟基丙酸的产量，对构建的重组kp n e u m o n i a ek g a b 进 行微氧发酵，通过对比原始足p n e u m o n i a e 及未引入n a d 再生途径的3 羟基丙酸生产菌k a b ，研究辅酶平衡系统的引入对于生产的影响。发酵 结果表明，代谢途径的优化确实有助于产量的提高，k g a b3 羟基丙酸产 量达6 6 9 1 ，比k a b 提高了31 7 ，甘油转化率o 7 5m o l m o l g l y c e r o l ， 比k a b 提高了2 0 0 ，生产强度o 8 2 ( g l 1 o d 1c e l l h 1 ) ，提高了6 倍。 同时研究了添加葡萄糖对重组菌发酵特性的影响。在发酵培养基的基础上 添加2 9 l ，5 9 1 ，0 9 1 ，2 0 9 1 葡萄糖，进行微氧发酵。对于生物量的积累，2 0 9 1 葡萄糖的浓度是最优的，在发酵前期，甘油消耗速率在5 9 1 和2 0 9 1 浓度 下高于其浓度。通过分析添加不同葡萄糖浓度对于产量的影响，发现发酵 初期时，3 - h p 产量与添加葡萄糖的浓度成正比，再结合生物量，发现主 要是由于葡萄糖浓度大的菌生长快，生物量积累多的原因，在对单位细胞 3 - h p 产量进行分析，发现生物量的积累确实对总产量的提高有贡献。就 i i 单位细胞产量而言，添加o g 1 ，1 0 9 1 ，2 0 9 1 葡萄糖在发酵初期有利于3 一羟基 丙酸的产生。 关键词：甘油，3 羟基丙酸，肺炎克雷伯氏菌，3 磷酸甘油脱氢酶，3 磷 酸甘油酯酶，醛脱氢酶，n a d 再生，重组菌，发酵 i i i 北京化t 人学硕l ：学位论文 i v a b s t r a c t co f a c t o re n g i n e e r i n g i nt h ep r o c e s so f 3 - h v d a c i dp r o d u c t i o n b yl ( 1 e b s i e l l a r o x y o r o p i o n i c r on c t i o n l a y s l e l l a j n v dk l p n e u m o n a l e a b s t r a c t 3 - h y d r o x y p r o p i o n i ca c i d ( 3 - h p ) i sa ni m p o r t a n tp l a t f o r mc h e m i c a l ， w h i c hw i l le x e r ta nd i r e c ti n f l u e n c eo nt h ed e v e l o p m e n to fm a n yo t h e rh i g h v a l u e c h e m i c a l s ，s u c h a s 1 , 3 一p r o p a n e d i o l a n da c r y l i ca c i d k l e b s i e l l a p n e u m o n i a ec a nn a t u r a l l yd i s s i m i l a t eg l y c e r o l a n dc o n t a i nt h ec o m p l e t e d e n z y m e so fd h as y s t e m ，i tw a st h e r e b ye m p l o y e di nt h i ss t u d ya sh o s ts t r a i n a n dw a si n t r o d u c e dav e c t o ra b l et ob i o s y n t h e s i z eb o t hg l y c e r o la n d3 一h ea s ac o n s e q u e n c e ，t h en a d n a d hr a t i oi nt h ee n g i n e e r e ds t r a i nh a sb e e n b a l a n c e da n dt h ey i e l do f3 一h pw a se n h a n c e dd r a m a t i c a l l y t ob e g i nw i t h ，t h em e t a b o l i cp a t h w a yo fg l y c e r o l s y n t h e s i s w a s i n t r o d u c e di n t oe s c h e r i c h i ac o l ib l - - 21 b yc o n s t r u c t i o no ft h ec o - e x p r e s s i o n v e c t o rc o n t a i n i n gg e n e se n c o d i n gg l y c e r o l - 3 - p h o s p h a t ed e h y d r o g e n a s ea n d g l y c e r o l - - 3 - - p h o s p h a t a s ec o n f e r r i n gt h eg l y c e r o lp r o d u c t i o ni ns a c c h a r o m y c e s c e r e v i s i a e c o n s e q u e n t l y , ag l y c e r o lc o n c e n t r a t i o no f1gr 1w a sa c h i e v e di n f l a s kc u l t u r ea n dt h er e c o m b i n a n tc o u l dr e g u l a t ei n t r a c e l l u l a ro s m o t i cp r e s s u r e t or e s i s te n v i r o n m e n ts t r e s sb ys y n t h e s i so fg l y c e r o li nv i v o t oi m p r o v et h es o l u b l ep r o t e i ne x p r e s s i o na n do b v i a t et h ea d d i t i o no f i p t g , av e c t o rp e t o k p ( d e r i v e df r o mp e t - 2 8 a ) w a sc o n s t r u c t e db yr e p l a c e m e n t o ft 7p r o m o t e rw i t hn a t i v ec o n s t i t u t i v ep r o m o t e ro fk p n e u m o n i a e t h e nt h e g l y c e r o lb i o s y n t h e s i sc a s s e t t eg 12w a sl i g a t e dt ot h ep l a s m i dp e t - k pa n dt h e r e c o m b i n a n tp l a s m i dk g 12w a sc o n s t r u c t e da n dt r a n s f o r m e d s d s p a g e a n a l y s i ss h o w e dt h ew e l le x p r e s s i o no fk e ye n z y m e si nt a n d e mc o e x p r e s s i o n v 北京化丁人学倾i j 学位论文 p l a s m i d a n a l y s i so fg l y c e r o lm e t a b o l i cp a t h w a yi nkp n e u m o n i a es h o w e dt h a t t h e3 一h py i e l dc a n n o tb ei m p r o v e ds i g n i f i c a n t l yw i t h o u tr e a s o n a b l ep a t h w a y d e s i g na n do x i d a t i o n r e d u c t i o nb a l a n c ei n v i v o i no r d e rt o i m p r o v et h e r e g e n e r a t i o no fn a d i nv i v o ，a ne x p r e s s i o np l a s m i dh a r b o r i n gg d p i ，g p p l ， a m 4a n dd h a bg e n e sw a sc o n s t r u c t e da n dt r a n s f o r m e di n t ok p n e u m o n i a et o y i e l dar e c o m b i n a n ts t r a i nk g a b i nk g a b ，g l y c e r o lb i o s y n t h e s i ss y s t e m w a se m p l o y e df o rn a dr e g e n e r a t i o n s d s - p a g e a n a l y s i s s h o w e dt h e e x p r e s s i o n o f k e ye n z y m e si n t a n d e m c o - e x p r e s s i o np l a s m i d i n t h e f e r m e n t a t i o no fk g a b a3 - h pc o n c e n t r a t i o no fo 5 2 9 1w a so b t a i n e df r o m g l u c o s ei nf l a s kc u l t u r e t h e s er e s u l t si n d i c a t e dt h es u c c e s s f u lc o n s t r u c t i o no f t h ep a t h w a yr e s p o n s i b l ef o rt h eb i o s y n t h e s i so f3 一h pf r o mg l u c o s e t h ef l a s kc u l t u r eo ft h er e c o m b i n a n tk p n e u m o n i a eu n d e rm i c r o a e r o b i c c o n d i t i o nw a sa l s op e r f o r m e d t h ec o f a c t o r r e g e n e r a t es y s t e mi nk p n e u m o n i a ew a si n v e s t i g a t e db yp r o d u c t i o no f3 一h pu s i n gs t r a i n sk1 ，k a b a n dk g a ba tf l a s kl e v e l t h er e s u l t ss h o w e dt h a tt h eo p t i m i z a t i o no f m e t a b o l i cp a t h w a yp la y e di m p o r t a n tr o l ei n i m p r o v i n g3 一h pc o n c e n t r a t i o n a n dp r o d u c t i v i t y c o m p a r e dw i t hk a b ，t h e3 一h pc o n c e n t r a t i o no fk g a bi s 6 6 9 1 ，i n c r e a s e db y 317 ，g l y c e r o lc o n v e r s i o nr a t ei s2 0 0 h i g h e rt h a nk a b ， a n dt h ep r o d u c t i v i t y ( o 8 2g - l - 1 o d 一1c e l l h - 1 ) w a sn e a r l yi m p r o v e dt o6 0 0 i na d d i t i o n ，g r a d i e n tc o n c e n t r a t i o n so fg l u c o s eo f2 9 1 ，5 9 1 ，10 9 1 ，2 0 9 1w e r e a d d e da tt h eb e g i n n i n go fm i c r o a e r o b i cf e r m e n t a t i o n t h eg l u c o s eo f2 0 9 1i s m o s th e l p f u lt ot h eb i o m a s sa c c u m u l a t i o n i nt h ei n i t i a ls t a g eo ff e r m e n t a t i o n ， s t r a i n su n d e r5 9 1a n d2 0 9 1g l u c o s eh a v eh i g h e rg l y c e r o lc o n s u m p t i o nr a t e 3 一h pc o n c e n t r a t i o na n a l y s i ss h o w e dt h a ti nt h ei n i t i a ls t a g eo ff e r m e n t a t i o n ， 3 一h pc o n c e n t r a t i o ni si np r o p o r t i o nt ot h eg l u c o s ea d d i t i v ea m o u n t ，w h i c h m a ya t t r i b u t e t ot h eb i o m a s s c o n s i d e r i n gu n i tc e l l c o n c e n t r a t i o n ，t h r e e g l u c o s ea m o u n t ( 0 9 1 ，10 9 1 ，2 0 9 1 ) w i l lb eg o o df o r3 - h pp r o d u c t i o n a b s 仃a c t k e y w o r d s ：g l y c e r o l ，3 - h y d r o x y p r o p i o n i ca c i d ，k l e b s i e l l ap n e u m o n i a e , g l y c e r o l 一3 - p h o s p h a t ed e h y d r o g e n a s e ，g l y c e r o l - 3 - p h o s p h a t a s e a c e t a l d e h y d ed e h y d r o g e n a s e ，n a dr e g e n e r a t i o n ，r e c o m b i n a n t ， f e r m e n t a t io n v 北京化t 人学硕l ：学位论文 v 1 i i 目录 目录 第一章绪论1 1 1 甘油途径1 1 1 1 甘油的生理学意义1 1 1 2 酵母渗透压应答机制及甘油合成途径1 1 1 3 甘油作为重要的平台化合物2 1 2 生物鲁棒性3 1 33 羟基丙酸概况3 1 3 13 羟基丙酸理化性质与用途3 1 3 23 羟基丙酸的生产方法4 1 3 3 利用微生物发酵生产3 羟基丙酸5 1 3 4 生产菌种6 1 43 一羟基丙酸代谢途径的辅酶平衡7 1 5 本课题的立项意义8 第二章产甘油重组大肠杆菌构建及耐高渗透压性能测定11 2 1 引言1 1 2 2 实验材料1 2 2 2 1 菌株与质粒1 2 2 2 2 试剂与仪器1 2 2 2 3 培养基12 2 3 实验方法1 2 2 3 1 酿酒酵母& c e r e v i s i a e 基因组d n a 的提取1 2 2 3 2 培养条件13 2 3 3 聚合酶链式反应( p c r ) 扩增目的基因g p d l 和觥1 3 2 3 4 载体模块p e t - g p d l 和p e t g p p 2 的构建l5 2 3 5 质粒p e t g p d l 和p e t - g p p 2 的鉴定1 5 2 3 6 表达载体p e t g 1 2 的构建1 6 2 3 7 序列测定与分析1 6 i x 北京化t 人学硕i ：学化论文 2 3 8 重组质粒p e t g 1 2 化学转化法转化e c o l i b l 2 1 1 6 2 3 9 重组质粒p e t g 1 2 在ec o l ib l 2 1 中的表达1 7 2 3 1 0 甘油途径对重组大肠杆菌耐高渗胁迫能力的影响1 9 2 3 1l 发酵参数分析2 0 2 4 结果与讨论2 0 2 4 1sc e r e v i s i a e 基因组d n a 的提取2 0 2 4 2 聚合酶链式反应扩增基因g p d l 和g p p 2 2 1 2 4 3 载体模块p e t g p d l 和p e t g p p 2 的构建2 2 2 4 4 表达载体p e t g 1 2 的构建2 3 2 4 5g p d l g p p 2 基因的序列测定与分析2 4 2 4 6 重组菌ec o l ib g l 2 中3 磷酸甘油脱氢酶及3 磷酸甘油酯酶的表达2 4 2 4 7 重组菌产甘油发酵。2 5 2 4 8 大肠杆菌高渗溶液耐受浓度2 5 2 4 9 甘油的途径的表达对重组菌渗透压耐受能力的影响2 6 2 5 本章小结2 7 第三章甘油途径在肺炎克雷伯杆菌中的表达研究2 9 3 1 引。言2 9 3 2 实验材料3 0 3 2 1 菌株、质粒3 0 3 2 2 试剂与仪器3 0 3 2 3 培养基3l 3 3 实验方法3 l 3 3 1k p n e u m o n i a e 基因组的提取3 l 3 3 2k p n e u m o n i a e 组成型启动子的扩增3 1 3 3 3p k 启动子与质粒p e t 2 8 a 的连接、转化3 3 3 3 4 表达载体p k p g 1 2 的构建3 3 3 3 5k p n e u m o n i a e 感受态细胞的制备及电转化3 4 3 3 6 重组菌k g l 2 在表达kp n e u m o n i a e 中的表达3 4 3 4 实验结果3 4 3 4 1 足p n e u m o n i a e 基因组的提取3 4 3 4 2 足p n e u m o n i a e 组成型启动子臌的扩增一3 5 3 4 3 质粒p e t 一2 8 a 的提取3 6 x 目录 3 4 4 阳性克隆鉴定3 6 3 4 5 质粒p e t k p 提取3 7 3 4 6p g l 2 为模板扩增g 1 2 表达盒3 7 3 4 7 阳性克隆鉴定3 8 3 4 83 磷酸甘油脱氢酶及3 磷酸甘油酯酶的在kp n e u m o n i a e 中表达3 8 3 5 本章小结3 9 第四章在k p n e u m o n i a e 构建辅酶平衡系统4 l 4 1 引言4 l 4 2 实验材料4 2 4 2 1 菌株、质粒4 2 4 2 2 试剂与仪器4 2 4 2 3 培养基4 2 4 3 实验方法4 3 4 3 1 表达盒p k a l d 4 d h a b 的扩增4 3 4 3 2g p d l ，g p p 2 ，a l d 4 与d h a b 基因串联共表达质粒的构建4 4 4 3 3 重组质粒p k g a b 电击法转化kp n e u m o n i a e 4 5 4 3 43 磷酸甘油脱氢酶g p d l ，3 磷酸甘油酯酶，醛脱氢酶基因a l d 4 与甘油脱 水酶基因d h a b 在kp n e u m o n i a e 中的表达4 6 4 3 5 重组菌的发酵培养4 6 4 3 6 高效液相色谱( h p l c ) 检测代谢产物的浓度4 6 4 4 结果与讨论4 8 4 4 1 质粒p k p a b 的提取与表达盒k p a l d 4 d h a b 的扩增4 8 4 4 2 转化产物的鉴定4 9 4 4 4 重组菌的表达5 0 4 5 本章小结5l 第五章重组菌产3 羟基丙酸研究及n a d 再生系统引入对生产的影响5 3 5 1 引言5 3 5 2 实验材料5 3 5 2 1 菌株、质粒5 3 5 2 2 试剂与仪器5 3 5 2 3 培养基5 3 x t 北京化t 人学硕 j 学位论文 5 3 实验方法5 4 5 3 1 重组菌的发酵培养5 4 5 3 2 生物量的测定5 4 5 3 3 产物的检测5 4 5 3 4 底物的检测5 5 5 4 结果与讨论5 5 5 4 1 引入n a d 对于重组菌发酵参数的影响一5 5 5 4 2 发酵参数5 8 5 4 3 有机酸的产量5 9 5 4 4 添加葡萄糖对发酵产3 h p 的影响5 9 5 5 本章小结6 3 第六章实验总结与建议6 5 6 1 主要结论6 5 6 2 本论文的创新点6 6 6 3 问题与建议6 6 参考文献6 7 附录1 试剂7 1 附录2 仪器设备7 3 致谢 7 4 研究成果及发表的学术论文7 5 作者和导师简介7 6 x i i co n t e n t s c h a p t e r 1i n t r o d u c t i o n 1 1 1g l y c e r o lp a t h w a y 1 1 1 1p h y s i o l o g i c a ls i g n i f i c a n c eo f g l y c e r o l 1 1 1 2h i g ho s m o l a r i t yg l y c e r o li ns a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a e 1 1 1 3g l y c e r o la si m p o r t a n tp l a t f o r mc h e m i c a l 2 1 2r o b u t n e s s 3 1 33 - h y d r o x y p r o p i o n i ca c i d 3 1 3 1p h y s i c o c h e m i c a lp r o p e r t ya n du s a g eo f3 一h y d r o x y p r o p i o n i ca c i d 3 1 3 2m e t h o d so f3 h y d r o x y p r o p i o n i ca c i dp r o d u c t i o n 4 1 3 33 - h y d r o x y p r o p i o n i ca c i dp r o d u c t i o nb ym i c r o o g a n i s mf e r m w n t a t i o n 5 1 3 4s t r a i n s 6 1 4c o f a c t o rb a n l a n c eo f3 一h y d r o x y p r o p i o n i ca c i dm e t a b o l i cp a t h w a y 7 1 5w h yw ed ot h i s 8 c h a p t e r2e n g i n e e r i n ge s c h e r i c h i ac o l if o rp r o d u c t i o no fg l y c e r o la n d a s s a yf o ri t st o l e r a n c et oh i g ho s m o s i s 11 2 1i n t r o d u c t i o n 1 2 2 2m a t e r i a l s 1 2 2 2 1s t r a i a sa n dp l a s m i d s 12 2 2 2a g e n t sa n df a c i l i t i e s 12 2 2 3c u l t u r em e d i u m 1 2 2 3m e t h o d s 1 ：1 2 3 1e x t r a c t i n gi s ：c e r e v i s i a eg e n o m i cd n a 1 2 2 3 2c u l t u r ec o n d i t i o n 13 2 3 3p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n ( p c r ) a m p l i f yg e n e sg p d l a n d g p p 2 13 2 3 4c o n s t r u c tp e t g p d la n dp e t g p p 2 1 5 2 3 5i d e n t i f i c a t i o no f r e c o m b i n a n tp l a s m i d 1 6 2 3 6c o n s t r u c to fr e c o m b i n a n tp l a s m i dp e t - g 12 16 北京化t 人学硕i j 学位论文 2 3 7i d e n t i f i c a t i o no f r e c o m b i n a n tp l a s m i dp e t g 1 2 1 6 2 3 8t r a n s f o r m a t i o no f r e c o m b i n a n tp e t g 1 2t oe c o l i b l 一2 1 1 6 2 3 9e x p r e s s i o no f g p d l a n dg p 尸2i nec o l ib l 2 1 1 7 2 3 1ot h eh i g ho s m o s i sr e s i s t a n c eo f r e c o m b i n a n tec o l i 19 2 3 1 la n a l y s i so f f e r m e n t a t i o nd a t a 1 9 2 4r e s u l t sa n dd i a c u s s i o n ：! ( ) 2 4 1i s o l a t i o no f sc e r e v i s i a eg e n o m i cd n a 2 0 2 4 2p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n ( p c r 、a m p l i f yg e n e sg p d l a n d g p p 2 2 0 2 4 3c o n s t r u c tg p d l g p p 2c a s s a t t eb yo v e r l a pp c r 2 l 2 4 4i d e n t i f i c a t i o no f t h er e c o m b i n a n t 2 3 2 4 5s e q u e n c i n gg e n e sg p d - g p p 2 2 4 2 4 6e x p r e s s i o no f 1a n dg 尸! p 2i ne c o l ib g12 2 4 2 4 7f e r m e n t a t i o no f r e c o m b i n a n ts t r a i n s 2 4 2 4 8ec o l ib l 一2 1g r o w t hc o n d i t i o nu n d e rg r a d i e n tc o n c e n t r a t i o n so f n a c l 2 5 2 4 9a s s a yf o rec o l ib g l 2t o l e r a n c et oh i g ho s m o s i s 2 6 2 5s u m m a r y ：1 6 c h a p t e r3c o