（环境科学专业论文）废水生物处理过程的紫外与荧光光谱解析.pdf

中国科学技术大学博士论文 力停留时间、底物浓度和温度) 的响应关系，发现n a j ) h 的相对浓度与氢气分 压其有很好的一致性；建立了定量测定了高温厌氧反应器出水中的三种荧光物质 的标准加入法。 4 、研究了微生物燃料电池反应过程的紫外与荧光光谱变化。伴随着微生物 燃料电池豹产电过程，产电微生物释放出的产物导致u v 2 5 4 吸收值总体增加；这 些产物中蛋白和类富里酸是主要荧光物质，蛋白峰主要源于蛋白内色氨酸残基的 贡献，而类富里酸可能源于一些辅酶或富里酸物质的贡献；f e 2 + 的投加有助于燃 料电池的产电，并出现荧光物质的浓度变化。 5 、利用米散射理论计算了不同折射率条件下米散射系数与无因次粒径的关 系，并且分别对细菌结构所弓l 起的消光光谱进行了计算；以模拟细菌的聚苯乙烯 小球为饲，用米散射结合k v e n b c f g m a r q u a f t 最小二乘法对其紫外消光光谱进行 了解析，并估计出其粒径和浓度；初步探索了巨大芽孢杆菌豹多波长消光光谱。 关键词：紫外可见光谱；三维荧光；平行因子分析；蛋白；n a d h ；核黄素；类 富里酸物质：荧光强度得分；米散射 玎 中国科学技术大学博士论文摘要 a b s t r a c t t h eb i o l o g i c a lw a s t e w a t e rt r e a t m e n tr e a c t o r sw i t hv a r i o u sp o n u t a n t s衄d m i c r 0 0 唱a n i s m sa r ec o m p l e xs y s t c m s c b n v e n t i o n a lc h e m i c a la n a l y s i sc a nn o tm e e t t h er e q u i r e m e n to fr e a l t i m ea n do 1 i n em o n i t o r i n go fb i o r e a c t o r s s p e c t r o m e t r y m e t h o di san o 一i n v a s i v ea n dr c g e t 雠e0 c ，a n dc a nb ep e r f b n n e d0 n l i n ea n d 加 矗舭啊m s ，i ti sap m m i s h 唱m e t h o df o rm 0 i l i t o r i n gt h eb i o r e a c c o r ht h j ss c u d yt h ec h e m o m c t r i c a lm e t h o dw a si n t r o d u c c dt 0d e c o m p o s et h es p e c t r a o fm i c r o o r g a n i s m sa n dm ee f l u e n t s 缸髓v a r i o u sb i o r e a c t o i s ，i n d u d i ga 咖b 咄 a n a e r o b i c ，a n dn i t r i f y i i l g b i o r e a c t o r s 觚dam i c m b i a lf i l e lc e l l ( m f o 耽ei n f o r m a t i o w a s 蛔na n dr c l a t e dt ot h eb i o r c a m o rp m c e s sp a r a n 】e t e t s t h em a i no b j e c t i v eo f t h i sw o r kw a st od e v e l 叩an e wm e t h o do fc h a r a c t e r i z i i l gt h ep a r a m e t e fa i l ds t a t u so f b i o r e a c t o r s b a s e do ni r v ，sa n dn u o r e s c e n c es p e c 虹a m a i nc o m e n t s 趾dr e s u l t sa r c 嬲f o l l o w s ： i c h a p t e r2 ，t h ec o r r c l a t i o nm o d c lw 嬲e s t a b h s h c db e t w e e nt h eu vs p e c t r aa n d t h eo o n c e n t m t i o n so fn i t r a t ea n dn i t r i a t ef 如mai l i t r i f y i n gr e a c t o r - t h ef c 鹊i b i l i t yo f d e c 0 i n p o s 曲gt h e0 v e d a p p e ds p 眺ab yp a n i a ll e a s ts q u a r e s 口l s ) w 髂v e r i f i e d 1 扯i n gt h ef o l l rb i o g c i cn i l o r o p h o r e s 舔姐e x 卸1 p l e ，t h ef e a s i b i l i c yo fd e 唧o s i l l g m es e v e r c l yo v e d a p p e dn u o r e s c e n c cs p e c 咖b yp 啪n df a c t o ra n a l y s i s ( p a r a e a c ) r a sv e r i f i e d t h ei n f b 咖a t i o na b o u tt h er e l a t i v ec o n c e n t r a t i 0 ，l ce x c i t a t i o na n d e m i s s i o ns p e c 仃aw a sd b t a i n c d m c l l 印t c r3 ，t l l ec x c i t a t i o n _ e i n i s s i o nm a 妇m ) f l u o r e s 咖c es p e c t r aw e r e u s e dt oc h a r a c t e r i z et h es o l u b l em i c r o b i a lp r o d u c t s ( s m p ) ，i l r a c e l l u l a rs u b s t 卸c e s a n de x t r a c e l l u l a rp 0 1 y m e rs u b s t a n c e s 饵p s ) 拌皿a 】e a cw a sa p p l i e dt oe x t r a c tt h e p u r es p e c t m 丘d mt h eo v e d a p p e ds p e c t r a r e s u l t ss h o wt h a tp r o t e i n sa n dn i c o t i n a m i d e a d e n i ed i 肌c l e o t i d e ，r e d u c e df o 珊( n a d 田，w e r ei d e n t 墒e da st h et w om a i l l i n l r a c e l l u l a rn u o m p h o r e s ：i nt 1 1 ei n t r a o e l l u l a rs u b s t a n c e s n en u o r e s c e n c ei n t e n s i t y s c o r e so ft h ei n t r a c e l l u l a rn u o r o p h o f e sw e r ec l o s e l yr e l a t e dt 0t h eb i o r e a c t o r p e 渤瑚a n c e n ep r o f i l e so ft h ei n t r a c e l l u l a rp r o t e i n sw e r es i m i l a rt 0t h o s eo fv 0 1 a t i l e s u s p e n d e ds 0 1 i d s ( v s s ) ，a n dt h ei n i r a c e l l u l a rn a d hw a sc o n 弓l a t e dt ot h es p e c j f i c i i i 中匿科学技术太学博士论文 s u b s 虹丑t e d e 掣a d a t i o nr a t e t h r c em a i nc o m p o n e n t s ，i e ，p m t c i n s ，f u l v i c - a n d h u m i c l i k es u b s t a n c e s ，w e r ci d e n 痂丘e df 如mt i l es m 已t h e i rn u o r c $ c e n c ej n t e n s i t y s c o r e so ft h em r e en u o p h o r c si 芏lt 量l es m pc o u l d b eo o n n e c t e dw i t hp r o c e s sp a r 黜e t e r s t h r o u g ht h e 王七u d e k i n 9 0 i r e te q u a 垃o n n l ee x l f a c e l l m a rp r o t e i n s a n dh u m i c - l 汝e s u b s t a c e s 、张f es u b s t 豫t e u l i “z a t j o n a s s o c i a t e d a n d 出a t 也ef h 晡c l 濂es u b s t a n c e s w e r en o n 一乎o w 也- 8 s s o c i a e d p t c i n s 跹df i l l v i c _ l 像es u b s t a n c e sw e r ci d e n 虹f i e d 毫st h e t w dm a j nn u o r o p h o r 船i nt h ee p s t h eo n l i n em o n i b o r i i l gd a t ao ft h em i x t l l r ej nt h e r e a c t o rw e r ea b l et or e 日e c tt h ev a r i a t i o no ft h es l u d g ec o n c e n t r a t i o n ，b u tf a i l e dt o r e n e c tt 1 1 ee 岛e c to fs u b s t r a t ea d d i t i o n t h ev o l t a g eo ft h ep h o t o m u l t i p l i e rh m e ( p m d ， t h ec o u p l i n ge 伍d e n c yo ft h ef i b e ro p t i c sa d 氇ei n f l n e n c e0 ft h e 曲伽m s t a n c el i 醢t s h o 试db et a k c 主珏幻a e u n t h c h a p l e f4 ，m ee e m o fa na n a e m b i ch 2 - p r o d u c i n gb a t c hf e a a 【o rw e r ee 冲1 0 r e d ， 衄dt h cm 8 i nf l u 叩h o r c so ft l l er e a c t o re f e l u c n t s 、v e r ep r o t e i n sa n dn a d h 。i kr a 曲 o ft h en u o r e s c e c ei n t e n s i t ys c o r e so fm et 、v on u o r o p h o r c sw a sr e l a t e dt ot i l eh 2 p a n i a lp r e s s u r e ，a n dt h er c l a t i o n s h i pb e t w e e nt h e mc o l l l db ee x p r e s s e du s i n ga 珏曲e re q u a t i o n 1 1 1 0e e mf l u o r e s c c n c es p c c 妇o f 也ee 砸b e t s 宜o ma t h e 腿。曲越i c 婶f l d wa n a e f o b i cs l u d g eb e d ( u a s b ) h 2 一p r o d u c i 狂gr e a c t o rw e r ea l s o c x p l o f e d 。p r o t c 趣n a d 蠲dr i b 礤a v j n w e r em em a 主nn u o 咄r e s 袖ee 彘c l so f h y 出a u l i c 咒t e n t i o nl i 王e ，s l | _ b s t r a t ec o n c e n t r a t i o 珏a n dt e m p e 豫t u r eo nt h eb i o i 髓c t o r p c r f b 皿鳓c ew e r cc v a l u a t e d ，a n dt h er e s p o s eo ft h et l l i n u o r o p h o r 锚s c o r e sw 嬲 a l s oe x p l o r c d 髓ep m 行1 e so ft h e 悯s c o r e sw e r er e l a t e dt ot h ev a r i a t i o no ft h eh 2 p a n i a lp r e s s u r e s t a n d a r da d d 主t i o nm e t h o dw a su s e dt 0q u a n t “a t i v e l yd e t e r m i n a t ot h c c 0 嘶t r a t i o no ft h e s et h r c eb u o m p 圭l o r e s 蠡m 国eu a s be 雎u e 堪 h c h a p t e r 5 ，也ev a r i 8 t i o no f 氇e u v a n d f l u o r e s c c n c cs p e c 锄缸i m 托m f ( ：w a s i n v e s t i g a t 醯。衄o m p a 王c d 贼t h h e f e a c 童i o ni nn l em i c r o b i 啦趣c l 础，也c m i c r o o 曙a n i s m sr d e a s e ds o m em i c r o b i a lp r o d u c t s ，w h i c hl e d 幻a i li n c r e 髂ei nu v 2 5 4 p m t e i 璐a n df i l l v i c - l i k es u b s t a n c c sw e r ei d e n t i f i e da st h em a i nn u o m p h o r e sb y d e c o m p o s i n gt h ee e mn u o r e s c e n c es p e c t r ao f t h em f cw i t h 队r a e 虻n ep r o t e i n n u o r e s c e n c ew a sa t t r i b u t e dt ot h et r y p t 叩h a n er e s i d u e so ft h ep r o t e i n s ，w h i l ec h e f u l v i c - l i k es u b s t a n c c sm i 馥tb ea t t r i b u t e dt ot h ec o e n z y m ea n d 纯l v i ca c i d 1 m ed o s c i v 中国科学技术大学博士论文 摘要 0 ff c 抖p m m o t e dt h ee l e 曲o 窖衄髓i s0 ft h em f c ，衄dt h ep m 丘l 既0 ft h en u o r o p h o r r e i ed i f e b r e m6 0 mt h o s eo ft h ec o n t r 0 1 hc h 印t e r6 ，m i es c a t t c r i n gt h e o r yw 醛u s e dt oc a l c u l a t e d t h ec x t i c t i o n c o e f f i c i e n ta saf h c f i o n0 fd i m e n s i o n l e s sr a d i u sa td i 疵r 曲tr c n e c t i o ni n d e x e s t h e e x t i n c c i o ns p e c t r ap r o d u c e db yt h em a c r o s t r u c t u r ea n dj f e m a ls t r u c t u r ew e r ca l s o c a l c i l l a t e d 硒af i l n c i o no fw a v e l e n 垂h t a k i n gt h ep o l y s t y r e n ep e l l e ta sa nc x a m p l e ， i e v e n b e 略- m a r q u a nl e 硒ts q u 盯e s u p l e dw i l ht h em i et h c o r yw e r eu s e dt oc a l c i l l a t e t h ec x t i i l c t i o ns p e c t m m ，a n dm er a d i u sa n dc 0 o e n t r a t i 0 w e r ce s t i m a t e d 伯eu v 厂v j s s p e c t r a0 f 王k c 川淞小唧细_ 小w 觞唧l o r e d k e y w o r d s ：u v m ss p e c t 叫e x c i a t i o n - e m i s s i o n - m a t r i ) 【o 三e m ) ；p a r a l l e l f a c l o r a n a l y s i s ( 鼢r 舡e a q ；p r o t c i n ；n i c o 血a 面d ea d e 血d i n u c l e o t i d e ，r e d u c e df o 皿 田； d b o n a v i n ；如l v i c l i k e 如b s t a n c e ； n u o r e s o e c c i l l t c n s i t ys c o r e s ； m i c s c a t t e r i n g v 中国科学技术大学学位论文原创性和授权使用声明 本人声明所呈交的学位论文，是本人在导师指导下进行研究工作 所取得的成果。除已特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含任 何他人已经发表或撰写过的研究成果。与我一同工作的同志对本研究 所做的贡献均已在论文中作了明确的说明。 本人授权中国科学技术大学拥有学位论文的部分使用权，即：学 校有权按有关规定向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子 版，允许论文被查阅和借阅，可以将学位论文编入有关数据库进行检 索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。 保密的学位论文在解密后也遵守此规定。 作者签名： 年月 日 中国科学技术大学博士论文 第一章绪论 引言 第一章绪论 废水生物反应器就是利用微生物的生理功能，采取一定的人工技术措施，创 造有利于其生长、繁殖的良好环境，加速微生物的增殖及其新陈代谢生理功能， 从而使废水中的有机物污染物得以降解去除的废水处理设备。废水生物处理过程 相当复杂，传统的分析方法比如一些总体参数如化学需氧量( 涮c a l0 x y g e n d e n l a n 也c o d ) 或总有机碳( t o t a lo r g a i l i cc a r b o 玛t o c ) 可以来表示有机物总量的变 化，但测定程序繁琐，费时费力，部分测定过程还消耗大量的化学试剂，产生的 废液污染环境，且测量结果不能实时反映生物反应器的运行状态【l 捌。 与其他分析方法相比，光学测定的方法具有快速、灵敏、易于实现在线测定 的优点，能够及时反映生物反应器运行状态。紫外可见、荧光光谱、红外以及近 红外光谱常常被用于表征有机物或微生物代谢产物变化。一定频率的入射光照射 到样品上时，其中的有机物会吸收部分能量而发生电子能级、振动能级或转动能 级的变化，通过样品对入射光的特征吸收得到紫外可见吸收光谱、红外或近红外 光谱的特征，从而得到样品中有机物组成与含量的信息【5 1 。紫外或可见入射光照 射到细菌表面后，会发生米散射【6 7 】，多波长散射光谱可以反映细菌的尺寸大小 和浓度等信息【8 一。本章讨论紫外光谱和荧光光谱在废水生物反应器分析中的应 用。 1 1 紫外光谱 1 1 1 紫外光谱原理 1 1 1 1 分子光谱的分类 入射光作用于分子时，势必引起电子能级、振动能级及转动能级的变化，将 分子内部发生某种运动所吸收的光强度变化，或受光激发后产生的辐射光强度信 号按波长或波数递增的顺序记录下来，就得到下述各种光谱嘲。 中溺辩学技术大攀祷圭论文 第一章终论 分子转动光谱：由分子转动能级跃迁产生的光谱称为分予转动光谱，能级差 别较小，跃迁能量一般在5 l o l 3 l o 2 w 之间，相当予远红外光子的能量，故 又被称为远红外光谱。 分子振动光谱：由化学键的振动能级跃迁所产生的光谱称为分子振动光谱， 能级差别或跃迂能量一般在o 。0 5 l e v 7 之间，相当予近红外和中红外光子的能量， 它包括红外光谱和拉曼光谱。 电予光谱：电子具有动能与位能，般分子的电子状态能量介于 8 3 8 1 0 4 8 3 8 1 0 5 j 缅d ，只要施加这一范围的外界能量，有机物分予中的电子就 会发生电子跃迁。价电子能级跃迁的能量通常在l 2 0 e v 之间，相当于紫外及可 见光子的毖量，敖这一区域的光谱称为紫外及可见光谱 简称紫外光谱( u v 蹭e e 呱) 。电子的能级分布是量予化的， 不连续的。分子吸收特定波长的电磁波可以使电子从基态跃迁到激发态，产生电 子光谱。当有机物分子吸收不同的光波时，不同的分子会发生不同的能量变化。 正是根据能量变化谱可以判断和分辨有机化含物的结构和种类。 上述几种光谱中，电子光谱的能级差最大。电子能级涵盖了振动能级，而振 动能级涵该盖了转动能级。也就是说每一电子能级上宥许多间距较小的振动能 缀，在每个振动能级上又有许多阀距更小的转动戆级。南于电子能级豹变化都伴 随有振动能级和转动能级的变化，所以蘸个电子能级之阆的跃迂产生的不是单一 谱线，而是有很多相距不远的谱线所组成的谱带。 l 。重。1 2 分子轨道类型与电子能级跃迁 王、分子轨道的类型 任一分子的形成都是通过原子的外层电子配对实现的。有机化合物分子的紫 外一可见吸收、发射光谱是由予分子外层价电子跃迁弓l 起的，焉分子中价电子所 处的状态常用分子轨道的概念来描述。根据分子轨道理论，在多原子分子中，分 子轨道可以用原子轨道的线性组合来表示。组成分予轨道的原予轨道应当满足能 量近似条件、对称性匹配条件和轨道最大重叠条件。由于有机物分予是以碳原子 为基础的，其它的原子也只有h 、0 、n 等几种，有机化合物的分子绝大多数情 况下以共价键方式成键。由于成键方式不同，有机化合物的分子轨道有以下类型： 2 中国科学技术大学博士论文 第一章绪论 ( 1 ) o 和a 轨道：每个原子各出一个电子，形成电子对，称为。电子对( o 键) ，被 这种电子占有的分子轨道称为a 轨道。除了能量较低的成键。轨道外，还存在能量 较高的所谓反键o 。轨道。要使这类电子激发到反键o 。轨道上，需要相当大的能量， 意味着6 键的电子跃迁发生于真空紫外区( 波长短于2 0 0 n m ) 。 ( 2 ) 兀和兀轨道同一原子除了形成。键，还有第二( 或第三) 个电子形成双( 或三) 电子对，称为7 r 键。楗的电子与。键的电子不同，它可以在分子中自由移动，并 且常常分布于若干原子之间。兀电子形成的分子轨道称为鸦l i 道。能量较低的称为 成键兀轨道；能量较高的称为反键兀轨道。磁的吸收光谱出现在比。键较长的光 谱区，有共轭的7 c 键的分子视共轭度大小，可从紫外光区到可见光或近红外区。 共轭度越大，波长越长。兀电子跃迁的光谱落在我们要关注的波长范围，即 2 0 0 8 0 0 i 姐。 ( 3 ) n 轨道有些元素的原子的外层电子数多于4 个( 例如o 、n 、s 、卤素等原子) ， 在化合物中往往有未参与成键的价电子，这些电子称为n 电子( 也叫孤对电子) 。n 电子所在轨道称为n 轨道( 非键分子轨道) 。 2 、电子的能级跃迁 分子在基态时，电子优先占据成键分子轨道和非键分子轨道中。当用光照射 分子时，一定能量的光子被吸收。有机化合物吸收了激发光后，分子中的。电子、 兀电子或n 电子都可能跃迁到各自能量较高的。宰轨道或矿轨道上去而成为激发 态。电子的能级跃迁主要有四种类型：o - o ，l 卜啼a ，n _ 7 ，和元一兀，如图1 1 所示。 图l - 1 有机分子中价电子的能级和跃迁 、l厂 ； 菽 洼 ，； 疆一 一； 黾 嚣 o 中国科学技术大学博士论文 第一章绪论 ( 1 ) g _ o + 跃迁电子从。轨道跃迁到o + 轨道所需的能量很大，只有吸收高能量 的短波辐射才能实现跃迁，吸收光波长都在远紫外区( 2 0 0 n m 以下) 。例如饱 和碳氢化合物只含有结合牢固的。键，k 舣 n o + 兀_ 冗 n 一尢+ 。虽然在各种跃迁中，n _ 7 c + 跃迁所 需的能量最小，但是由于这种跃迁的几率远小于7 c _ 7 c 水跃迁的几率，因而最常发 生荧光的还是冗_ 兀跃迁。每个分子都可能存在着几种电子激发态，每种电子态 都以电荷的特殊分布来表征。大部分有机物分子，其紫外一可见光区的电子光谱 ( 吸光和发光) 仅涉及冗电子和n 电子的跃迁。 1 1 1 3 有机分子中的基团和吸收带分类 为了更好地理解、分析和研究生物反应器样品的紫外光谱，下面给出有机物 波谱学中的几个基础术语。 l 、生色团 在一定的波段范围内产生吸收，引起电子能级跃迁而出现谱带的某一基团或 4 中国科学技术大学博上论文第一章绪论 体系称为生色基( 团) 。有机化合物分子中，能在紫外一可见光区产生吸收的典 型生色团主要是那些具有不饱和键或不饱和键上连有杂原子的基团，如羰基、羧 基、酯基、硝基、偶氮基( n = n 一) 、及芳香体系等，它们的结构特征是含有 7 c 电子。如果一个化合物的分子中含有若干个生色团，当他们之间不发生共轭作 用时，该化合物的吸收光谱将包含这些生色团各自的吸收带，这些吸收带的相互 影响不大；如果两个或若干个生色团彼此间形成共轭体系，那么原来各自的生色 团吸收带将会消失，产生新的吸收谱带。新吸收谱带一般较原吸收带波长及吸收 强度都会明显增大，这与共轭后形成的新的分子轨道有关。孤立的c = c 或e ；c 键的h 。落在近紫外区之外，但已接近一般仪器可能测量的范围，具有测量极限 “末端吸收”，所以也可视为生色团。不同的分子内孤立地存在相同的这类生色团 时，它们的吸收峰将有相近的h 。和吸光系数。 2 、助色团 孤立存在于分子中不一定发生紫外。可见光区的吸收，但当它与生色团相连 时，能使吸收谱带明显向长波移动即红移( r e ds h i f ) ，而且吸收强度也相应地 增加。助色团的特点在于通常都含有n 电子。与生色团( 或共轭体系中的烯、炔、 芳香环) 相连时，n 电子与冗电子的d 呱共轭效应导致冗一矿跃迁能量降低，吸收波 长红移。常见的助色团有o h ，n h ，一s h ，卤素等。 1 1 2 紫外可见光谱在废水监测中的研究进展 紫外吸收光谱法具有不消耗样品、能够实时在线监测的特点，在具有快速简 便，无需消耗化学药剂，可实现实时在线监测的优点，因而受到了人们的普遍关 注。基于样品的紫外光谱可以被一系列标准光谱来解析的假定，主要应用是测定 特征化合物如硝酸盐、阴离子表面活性剂或整体参数如化学需氧量( c o d ) 、总有 机碳( 1 o c ) 和总悬浮固体( t s s ) 的估计另一方面应用在于进程控制或预警监测 l 。 利用硝酸盐、亚硝酸盐、苯酚、十二烷基磺酸盐和胡敏酸的标准光谱，采用 去卷积的方法从样品的光谱图中提取这些物质的浓度，预测浓度与化学方法测定 结果一致，孩方法简便快速，可结合便携式紫外光谱仪获取多组分数据 1 0 】。 t h o m a s 提出基于流动注射法建立一套光谱法快速测装置，可以快速地测定 中啜科学技术大学嬉士论文第一章缝谑 其中的化学需氧量( b o d ) 、c o d 、t o c 、t s s 以及含氮和含磷化合物 l l 】l 。 m 蛐提出，紫终竣瞧值与废永处理过程的c o d 之间具舂禳努耱相关性， 可被震于建立廉价的连续测定装露，并且不清耗试裁水2 1 。 l a 端嘲洳：乖! | 用实时在线测定仪器测定城市废承豹紫外可见光谱，并且蔫 偏最小二乘方法建立了紫外光谱与c o d 、t s s 和硝酸盐的关系校正模型，结果 显示回归线性较好，并且该模型具有较好的鲁棒性f 1 3 l 。 1 1 3 多波长游光光谱原理 介质中存在大量不均匀小区域是产生光散射的原因，有光入射时，每个小区 域成为散射中心，向四面八方发出同频率韵次波，这些次波闻无圜定榴位关东， 它 f 】在篥方向上豹菲程千叠热影成了该方向上豹教射毙。散射可分为弹经散射帮 非弹性散射。根据微粒的太小，弹性散射又可分为瑞利散射和米散射 1 4 1 弱。 由于细麓粒径是微米级豹，与波长榴近或者大于波长，因此，紫外或可见光 照射到细菌或细胞表面时，会发生米散射。细菌悬浮液的多波长透射光谱是幽吸 收和散射所引起的，它包含有细菌的大小，尺寸分布和其它光学特征的信息。 根据熟知的l a 瑚b e m b e e r 光透射定律，当一束强度为i 。的单色平行光入射到 含有均匀悬浮颡粒静介质时，由于颗粒对入射光的散射作用，蹴射光强会受到 一定程度的褒减。 夯质中豹微粒把a 射光肉疆周空闼散射出去，被散射豹光能量可默耀散射截 面c s 来表示，散射截蟊定义为单缎黠阔内一个颗粒所教射豹全部光能量e s 与入 射光强度i 。的比值； f c ，= 争( 1 1 ) j 0 入射光强b 酶单位楚w ，m 2 ，所以散射截面c s 有着面积的量纲。 散射系数q s 定义失敬射截面e s 与敏射颞粒在入射光方囱上投影面积g 两者 之阀的比值，即： 彰：至 仃 ( 1 国 显然，q s 是一个无量纲数，它在数值上替于菜一时间内一个颗粒对入射光 6 中国科学技术大学博士论文 第一章绪论 的全部散射光能量与入射到该颗粒上全部能量之间的比值。 散射常常伴随着吸收同时发生，当光线通过带有吸收性颗粒的介质时，一部 分被颗粒所吸收，另一部分被颗粒所散射，使得穿过介质后的光较入射光减弱了， 这种现象被称为消光。相应的消光系数被定义为： d 。生 】c 盯 ( 1 3 ) 对于球形颗粒，颗粒截面是册2 ，a 是颗粒半径。 有了消光系数q e ，可以计算出入射光经过含有悬浮颗粒的介质时，光强经 过d z 的变化量。 一以= 三d 2 q 。p 耽 ( 1 。4 ) 其中n p 为单位体积颗粒个数，d 为颗粒直径。 如果光路长为l ，上式经积分得透过率： z = 丢一p ( _ 号晚印) ( 1 5 ) 上式即为l a m b e r t b e e r 定律，如果颗粒呈现出一粒度分布，分布函数为 ( d ) ，对上式积分得： z = c x p 卜p 缮孚 ( d ) q 扣) ( 1 6 ) 通过消光系数计算可以测量颗粒浓度。这里消光系数是颗粒的折射率和粒径 的函数，可以通过米散射理论进行计算，米散射理论的详细介绍见第六章。 1 1 4 多波长消光光谱研究的进展 生物反应器中除了底物浓度、降解产物以及微生物的产生的中间产物受到人 们的关注外，微生物本身的也是人们关注的重点。另一方面，微粒子受紫外或 可见光照射后，会产生光的散射和吸收，这是电磁波与微粒子相互作用的重要特 征，而微粒对电磁辐射的吸收与散射与粒子的线度有密切关系，对于不同线度的 粒子必须应用不同的散射理论。由于细菌的粒径通常是几个微米，受到紫外或可 见照射后会产生米散射，因此可以利用紫外可见吸收光谱结合米散射模型进行解 7 中黼科学技术大学博士论文第一章绪论 析。 所谓颗粒就是种细小的分散物体。颖粒粒度是表征颗粒特性的一个重要指 标，关予颗粒粒度测量的方法与技术有很多，舀前比较常用的有重力或离心沉降 法、显徽镜图象分析法和基予米散射理论的光散射法，其中米散射方法能够实时 在线测量两弓| 起了广泛关注【1 6 1 7 1 。 基于经典m i e 光散射理论，徐贯东提出一种改进的多波长散射光通量测量 颗粒尺寸的方法，对标准颗粒及实际样品的实验研究表明，该方法不仅能测量颗 粒的平均直径，还能给出尺寸分布【1 8 l 。 基于限定模式反演算法，苏明旭等利用k v e n b e r g - m a r q l l a n 优化算法对消光 法测量衰减光谱进行反演处理，获得颗粒粒径和分布。讨论了目标函数构造、不 同粒径分布函数、单双峰分布及优化初值对予反演结果的影噙及重要性，表骧该 算法具有很好的稳定性和精确度【1 9 】。 利用米散射理论可以对大气溶胶中烟灰颗粒的m i e 散射、消光和吸收截面 以及散射场进行了计算，同时可以计算m i e 散射的散射场强度随散射角的变化 以及内部场强随粒子半径的变化【冽。 米散射理论主要用于从亚微米至微米的尺寸段，细菌大小正好处于此范围。 利稻米散射理论对细菌的光散射特性进行研究已经引起了许多学者的重视，并作 了大量研究王作，取得了一些进展。越毽筘a e i 等研究了大肠杆菌的多波长透射光 谱，提出光谱随波长的变化依赖于样品中细菌颗粒的大小、形状和光学特征，面 光学特征又与其中的化学组成、聚集状态及其中的生色团有关【2 u 。 c a l l a h a l l 等人提出多波长紫外可见吸收光谱包含了隐孢子虫的散射和吸收 特征。光谱的解析模型基于米散射理论、光谱去卷积技术以及活细胞光学特征的 近似，因此隐孢子虫的紫外可见光谱特征可用于其光学特征定量解析f 2 2 l 。 g a r c i a - r u b i o 等提磁多波长吸收光谱可以获得微米或亚微米颗粒的联合颗粒 特征仗小形状和组成) 的补充信息。基予米教射和光谱去卷积技术获取的定量信 息可用于微生物的检测和表征，并且证实该技术可用予实时在线监测【矧。 m a t t l e y 等认为多波长光谱提供了细胞表征和检测的定量信息，反映了化学 组成、大小、内部结构和颗粒数目。多波长光谱包含了样品的散射和吸收特征， 可被用于血细胞、细菌和原生动物的光谱指纹表征f 冽。 8 审星科学技术大学薅士论文第一章缝论 本文从米散射理论出发，根据细菌的紫外可见吸收光谱，对细菌的大小和浓 度进行计算，力细菌的辩别和表征作了一些探索。 1 2 荧光光谱 羔。2 。王荧光光谱原理 1 2 1 1 荧光光谱的产生原理 分子吸收紫外和可见光谱区的辐射后，其电子能级跃迁到激发态，这种激发 态的分子很不稳定，随即发生分子内或分子间的去活化过程。如果激发态的分子 先以无辐射跃迁降至第一电子激发态的最低振动能级后，再以辐射跃迁的方式回 到基态，则伴随发出一定波长的光，这就是荧光。能够发荧光的物质，大多为有 机芳族化合物或它们与金属离子形成的配合物。 荧光光谱分析技术具有灵敏度高( 比紫外一可见分光光度法高2 3 个数量 级) ，选择性好，而且能够提供激发光谱、发射光谱、发光强度、发光寿命、量 予产率、偏振和各向异性诸多信息等优点，已经成为一种重要的痕量分析技术 1 2 5 】 o 室温下，大多数分子处于基态的最低振动能层。处于基态的分子吸收能量( 电 能、热能、化学能或光能等后被激发为激发态。激发态不稳定，将缀快衰变必 基态。多数分子将通过与其他分予的碰撞，以热的形式散发搏多余的这部分能量； 部分分子则以光的形式释放出这郝分熊量，放射出光的波长大于所吸收辐射的波 长，后一种过程称为荧光过程。下面将主要从分子结构理论来讨论荧光产生机理。 每个分予具有一系列严格分立的能级，称为电子能级，而每个电子能级中又 包含一系列振动能层和转动能层，见图1 2 。图中基态用s o 表示，第一电子激发 单重态和第二电子激发单重态分别用s 1 和s 2 表示。m 为第一电子激发三重态。 电子激发态的多重度用m = 2 s + l 表示，s 为魄子盘旋量子数的代数和，其数 值为0 或王。根据p 麟l i 不相容原理，分子中网一孰道所占据的两个电子必须具 有相反的自旋方向，即自旋配对。假如分子中全部轨道里的电子都是自旋配对的， 即：要s = o ，分子的多重度m = l ，则该分子体系便处于单重态，用符号s 表示。 大多数有机分子的基态是处于单重态的。分子吸收能量后，若分子在跃迁过程中 9 中国科学技术大学博士论文第一章绪论 不发生自旋方向的改变，这时分子处于激发单重态，如图1 2 中的s 1 和s 2 。如 果分子在跃迁过程中还伴随着自旋方向的改变，这时分子便具有两个自旋不配对 的电子，即s = 1 ，分子的多重度m = 3 ，分子处于激发三重态，用符号t 表示。 处于分立轨道上的非成对电子，平行自旋要比成对自旋更稳定些( 洪特规则) ，因 此三重态能级总是比相应的单重态能级略低，如图1 2 中的t l 。 s l n l 3 l te 淞1 1 e ds t a 弧：1 诩p l e te ) 簖l t e ds 1 a 难 kbb 图1 。2 荧光和磷光体系能级图 处在激发态的分子不稳定，它可能通过辐射跃迁和非辐射跃迁等去活化过程 返回基态，其中以速度最快、激发态寿命最短的途径占优势。有以下几种基本的 去活化过程，( 1 ) 振动驰豫( b r a t i o n a lr e l a x a t i o n ) ；( 2 ) 荧光发射；( 3 ) 内转换 ( i i l t e m a l c o n v e r s i o n ) ；( 4 ) 外转换( e x t e m a l e o n v e r s i o n ) ；( 5 ) 系间跨越( h t e r s y s t e m c r o s s i n 曲；( 6 ) 磷光发射( 见图1 2 ) 捌。 1 2 1 2 荧光和分子结构的关系 分子产生荧光必须具备两个条件：( 1 ) 分子必须具有与所照射的辐射频率相适 应的结构，才一能够吸收激发光；( 2 ) 吸收了与其本身特征频率相同的能量后， 必须具有一定的荧光量子产率。荧光量子产率( 驴) 也称荧光效率或量子产率，它 1 0 中国科学技术大学博士论文 第一章绪论 表示物质发射荧光的能力，通常应用一下式表示： 妒：煞燃 ( 1 7 ) 吸收的光量子数 ” 许多吸光物质并不能够发射荧光，因为在激发态分子释放激发能的过程中除 荧光发射外，还有许多上述的辐射和非辐射跃迁过程与之竞争。荧光量子产率与 上述每一个过程的速率常数有关。用数学公式表示如下： k ， 旷再素 ( 1 8 ) 式中k f 为荧光发射过程的速率常数，屯为其他有关过程的速率常数的总 和。从上式可知，凡是能使k f 值升高而使其他1 ( i 值降低的因素，都能使荧光增 强一般而言，k f 值主要取决于化学结构，而t 则主要取决于化学环境，同 时也于化学结构有关。 1 2 1 3 荧光光谱的分类 二维荧光光谱包括激发光谱和发射光谱，从两个不同侧面分别反映荧光强度 随着激发光波长和发射光波长变化的函数关系。激发光谱、发射光谱都可以用于 荧光物质的定性鉴别和定量分析1 2 5 一。 1 、激发光谱 在某一固定的发射波长下，扫描激发波长而获得的观测荧光强度随激发波长 变化的关系曲线称为激发光谱。换句话说，激发光谱是在特定发射波长上记录不 同波长激发时的荧光强度。荧光物质吸收能量的过程也就是激发过程，所以激发 光谱的形状和吸收光谱的形状极为相似，但不完全等同于物质的吸收特性。 2 、发射光谱 在某一固定的激发波长下，扫描发射荧光的波长进行荧光测量所获得的荧光 强度随发射波长变化的关系曲线称为荧光发射光谱，简称荧光光谱。它反映了在 相同的激发条件下，物质分子在不同波长上发射荧光的相对强度。由于振动弛豫 和溶剂分子的作用使其能量受到损失，分子的荧光发射波长总是大于其相应的吸 收( 或激发) 光谱的波长。这种荧光发射波长位移的现象称为s t o k e s 位移。由于 中函科学技术大学博士论文第一章绪论