（微生物学专业论文）大肠杆菌甲羟戊酸途径的构建与调控.pdf

山东大学硕士学位论文 摘要 甲羟戊酸是大多数真核生物和高等植物细胞中普遍存在的一种重要的有机 酸，是甲羟戊酸途径( m v ap a t h w a y ) 的中间产物。甲羟戊酸在高等动物体内的 浓度可以指示固醇的含量水平；在合成有价值的萜类物质的发酵培养基中添加甲 羟戊酸可成倍的提高萜类产量；此外它在化工行业也有重要的用途，这使得对甲 羟戊酸，尤其是天然r 型的甲羟戊酸的需求大大增加。而常见的化学合成法， 酶催化法合成具有原料难得、结构复杂、成本较高，不适于大规模生产，合成的 甲羟戊酸多为外消旋混合物等缺点，因此利用生物体合成甲羟戊酸成为发展趋 势。大肠杆菌作为一个成熟的遗传操作系统成为首选宿主，而且大肠杆菌不能利 用甲羟戊酸，更有利于甲羟戊酸的生产。 甲羟戊酸途径是大多数真核细胞，少数原核细胞和高等植物合成异戊二烯焦 磷酸( i p p ) 和二甲基烯丙基焦磷酸( d m a p p ) 的经典途径，i p p 和d m a p p 是 萜类合成的前体物。另外有一条新发现的1 脱氧d 木酮糖5 磷酸途径( d x p p m h w a y ) ，存在于多数真细菌和高等植物细胞中，也是生物合成萜类前体的途径。 本课题将来源于粪链球菌的m v a 途径的m v a s ，m v a e ，m v a k l ，m v a d ，m v a k 2 五个酶基因通过质粒克隆到大肠杆菌体内。m v a 途径的上游基因m v a s ，m v a e 和下游基因m v a k l ，m v a d ，m v a k 2 分别克隆到两个相互兼容的载体上，得到质 粒p z y s e 和p z y k d k 。同时，使用定点突变的方法，将3 羟基3 甲基戊二酸 单酰辅酶a 合酶( h m g s ) 中1 1 0 位的丙氨酸突变为甘氨酸的时候，可以将h m g s 的酶活提高1 4 0 倍。在此基础上克隆3 羟基3 一甲基戊二酸单酰辅酶a 还原酶 ( h m g r ) 基因，得到载体p z y s e ，d h 5 a a p t s g p z y s e 发酵结果在g c 检测色 谱图上有新的峰出现，经标准品证实为甲羟戊酸，产量为16 8m g l 。经过代谢 调节，使用基因敲除手段，将磷酸转运系统的p t s g 基因，催化丙酮酸，乙酰辅 酶a 转化为副产物乙酸的酶基因p o x b 和p t a 阻断，得到菌株 m g l 6 5 5 a p t s g a p o x b a p t a p z y s e 。对这个菌株进行发酵培养，甲羟戊酸的产量为 2 8 4m g l ，进一步在发酵培养基中加入0 3 的甘油，甲羟戊酸的产量提高到7 4 7 m g l 。 通过基因敲除，甲羟戊酸途径起始物乙酰辅酶a 和丙酮酸得到积累，增强 3 山东大学硕士学位论文 了流向m v a 途径的代谢流，甲羟戊酸产量的提高实验也证明了这一点。甲羟戊 酸途径的下游途径由m v a k l ，m v a d ，和m v a k 2 三个基因催化甲羟戊酸生成i p p 。 成功构建的含有这三个基因的载体p z y k d k 可以和p z y s e 共存，将这两个质粒 共转化大肠杆菌后，一条完整的m v a 途径在大肠杆菌体内构建成功，它和内源 性d x p 途径一起合成i p p 和d m a p p 。理论上增加m v a 途径的代谢流量可以增 加前体物i p p 和d m a p p 的积累，为利用大肠杆菌生产药用萜类提供基础。这个 菌株可作为生产有价值萜类的平台，转入目的萜类合成酶基因，即可达到生产这 种萜类的目的。 关键词：甲羟戊酸；m v a 途径；萜类；代谢工程； 4 山东大学硕士学位论文 a b s t r a c t m e v a l o n i ca c i d ，p r o d u c e di nt h em e v a l o n a t ep a t h w a y ( m v ap a t h w a y ) o fm o s t e u k a r y o t e sa n dh i g h e rp l a n t s ，i sav e r yi m p o r t a n to r g a n i ca c i d m e v a l o n i ca c i dc a nb e u s e da sa ne f f e c t i v e s u b s t r a t ea d d e dt ot h em e d i u mt os y n t h e s i z ef u n c t i o n a lt e r p e n o i d s i ta l s oh a sp o t e n t i a lf u n c t i o n si nt h ec h e m i c a li n d u s t r y t h e s eh a v ec a u s e dag r e a t n e e do nm e v a l o n i ca c i dp r o d u c t i o n ，e s p e c i a l l yn a t u r a l3 r m e v a l o n a t e m v ap a t h w a yi sac l a s s i c a lb i o l o g i c a lp a t h w a ye m p l o y e db ym o s te u k a r y o t e s a n dh i g hp l a n t st os y n t h e s i z ei s o p e n t e n y lp y r o p h o s p h a t e ( i p p ) a n dd i m e t h y l a l l y l d i p h o s p h a t e ( d m a p p ) ，w h i c ha r et h ep r e c u r s o r so ft e r p e n o i d ss y n t h e s i s h a v i n gt h e s a m ef u n c t i o nw i t hm v a p a t h w a y , a n e w l y f o u n d p a t h w a y i s 1 - d e o x y d x y l u l o s e - 5 - p h o s p h a t ep a t h w a y ( d x pp a t h w a y ) ，w h i c he x i s t s i nm o s t p r o k a r y o c y t e sa n dh i g h e rp l a n t s g e n e sc o n s t i t u t et h em e v a l o n a t ep a t h w a yf r o me n t e r o c o c c u sf a e c a l i sw e r e c l o n e di n t oe s c h e r i c h i ac o l ii nt w os e p a r a t ec o m p a t a b l ev e c t o r s t w on e wp a s m i d s a r ep z y s ea n dp z y k d k ，w h i c hc a r r yu p s t r e a ma n dd o w n s t r e a mg e n e so fm v a p a t h w a y ，r e s p e c t i v e l y t h r o u g hs i t e d i r e c t e dm u t a g e n e s i s ，t h ea l a l10r e s i d u eo f 3 - h y d r o x y - 3 一m e t h y l g l u t a r y l c o as y n t h a s e ( h m g s ) w a sm u t a t e di n t og l y llo ，w h i c h w a s r e p o r t e d t o i m p r o v e t h e a c t i v i t y o fh m g st o14 0 一f o l d a s 3 - h y d r o x y - - 3 - m e t h y l g l u t a r y l - - c o ar e d u c t a s e ( h m g r ) w a sc l o n e d i n t ot h es a m e v e c t o r ( f o r m e dp z y s e ) ，an e wp e a ke m e r g e di ng cc h r o m a t o g r a p hm a p ，w h i c hw a s s u b s e q u e n t l yp r o v e d t ob em e v a l o n i c a c i d q u a n t i t a t i v ee x p e r i m e n t s o n d h 5 a a p t s g p z y s ef e r m e n t a t i o n o b t a i n e dam e v a l o n a t ep r o d u c t i o no f16 8m g l m e t a b o l i cf l o ww a sf u r t h e rr e g u l a t e db yg e n ek n o c k o u tt e c h n i q u e g e n e se n c o d i n g e n z y m e sw h i c hc o n v e r ta c e t y l - c o a ，p y r u v a t ei n t oa c e t a t e ，a n dp t s gi np h o s p h a t e t r a n s p o r ts y s t e mw e r ei n t e r r u p m di nt h es t r a i nm g 16 5 5 a p t s g a p o x b a p t a p z y s e f e r m e n t a t i o no ft h i ss t r a i nr e a c h e dam e v a l o n a t ep r o d u c t i o no f2 8 4m g l w h e n0 3 g l y c e r o l w a sa d d e di n t ot h ef e r m e n t a t i o n m e d i u m ，m e v a l o n a t ep r o d u c t i o nw a s e l e v a t e dt o7 4 7m g l 5 山东大学硕士学位论文 t h r o u g hg e n ek n o c k - o u t ，t h ei n i t i a t o r s o fm v ap a t h w a yw e r ea c c u m u l a t e dt o e n h a n c et h ed e s i r e dm e t a b o l i cf l o w , w h i c hw a sp r o v e db ym e v a l o n a t ep r o d u c t i o n w i t ht h ea d d i t i o no fp l a s m i dp z y k d kc o n t a i n i n gm v a k l ，m v a d ，a n dm v a k 2 ，t h e c o m p l e t em v ap a t h w a yw a sc o n s t r u c t e di n t oe c o l ii na d d i t i o nt od x pp a t h w a y t h i se n g i n e e r e ds t r a i nc a na l s ob eu s e da sau n i v e r s a lv a l u a b l et e r p e n o i d ss y n t h e s i s p l a t f o r m w h e nc l o n e dd i f f e r e n tt e r p e n o i d ss y n t h e t i cg e n e si n t ot h i ss t r a i n ，d i f f e r e n t t e r p e n o i d sc a l lb es y n t h e s i z e d k e yw o r d s ：m e v a l o n i ca c i d ；m v ap a t h w a y ；t e r p e n o i d s ；m e t a b o l i ce n g i n e e r i n g 6 山东大学硕士学位论文 i p p d m a p p g p p f p p f p s g g p p m m v a l m e p d x p h m g c o a h m g s m v a s m v a s 6 1 1 0 h m g r m v a e m k m v a k l m p k 本论文的缩写词表 a b b r e v i a t l 0 n 异戊二烯焦磷酸( i s o p e n t e n y lp y r o p h o s p h a t e ) 二甲烯丙基焦磷酸( d i r n e t h y l a l l y lp y r o p h o s p h a t e ) 栊牛儿基焦磷酸( g e r a n y lp y r o p h o s p h a t e ) 法尼基焦磷酸( f a m e s y lp y r o p h o s p h a t e ) 法尼基焦磷酸合酶 栊牛几栊牛儿基焦磷酸( g e r a n y lg e r a n y l p y r o p h o s p h a t e ) 甲羟戊酸( m e v a l o n i ca c i d ) 甲羟戊酸内酯( m e v a l o n l a c t o n e ) 2 甲基一d 一赤藓糖醇- 4 一磷酸( 2 c m e t h y l - d e r y t h r i t o l 4 - p h o s p h a t e ) 脱氧木酮糖一5 - 磷酸( d e o x y x y l u l o s e - 5 - p h o s p h a t e ) 3 羟基3 甲基戊二酸单酰辅酶a ( 3 - h y d r o x y - 3 一m e t h y l g l u t a r y l c o a ) 3 羟基3 一甲基戊二酸单酰辅酶a 合酶 ( 3 一h y d r o x y - 3 一m e t h y l g l u t a r y l - c o as y n t h a s e ) h m g s 编码基因 1 1o 位丙氨酸突变成甘氨酸的h m g s 基因 3 羟基3 甲基戊二酸单酰辅酶a 还原酶 ( 3 - h y d r o x y 一3 一m e t h y i g l u t a r y l c o ar e d u c t a s e ) h m g r 基因 甲羟戊酸激酶( m e v a l o n a t ek i n a s e ) m k 基因 磷酸甲羟戊酸激酶( p h o s p h o m e v a l o n a t ek i n a s e ) 7 山东大学硕士学位论文 m v a k 2 m p d m v a d p t s p t s g p o x b p t a i c l r o c m a g e a m p b p d n t p s d a e d t a h i p t g k b p k m l l b m m m c s m l n m 0 1 n m p k 基因 甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶( d i p h o s p h o m e v a l o n a t e d e c a r b o x y l a s e ) m p d 基因 磷酸转运系统( p h o s p h a t et r a n s p o r ts y s t e m ) 葡萄糖通透酶基因 丙酮酸氧化酶( p y r u v a t eo x i d a s e ) 基因 磷酸乙酰转移酶( p h o s p h a t ea c e t y l t r a n s f e r a s e ) 基因 d n a b i n d i n gt r a n s c r i p t i o n a lr e p r e s s o r 基因 摄氏度( g r a dc e l s i u s ) 质量单位 琼脂糖凝胶电泳( a g a r o s eg e le l e c t r o p h o r e s i s ) 氨苄青霉素( a m p i c i l l i n ) 碱基对( b a s ep a i r ) d a t p ，d c t p ，d g t p ，d t t p 四种碱基的等比例混合物 道尔顿( d a l t o n ) 乙二胺四乙酸( e t h y l e n d i a m i n et e t r a a c e t a t e ) 小时( h o u r s ) 异丙基硫代b - d 一半乳糖苷( i s o p r o p y l 一1 3 d t h i o g a l a c t o p y r a n o s i d e ) 千碱基对( k i l o b a s e p a i r s ) 卡那霉素( k a n a m y c i n ) 公升( l i t e o 细菌全营养培养基l u r i a b e r t a n i m 米( m e t e r ，m i l l i ，1x1 0 。) 甲硫氨酸，摩尔( m e t h i o n i n e ，m o l a r , m o l 1 ) 多克隆位点( m u l t i p l ec l o n i n gs i t e ) 分钟( m i n u t e ) 摩尔( 6 , 0 2 3x1 0 2 3 ) n a n o ( 1x1 0 9 ) r 山东大学硕士学位论文 n p a g e p c r r n a r p m s t t a b u v v v v p p m n o r m a l ，n i t r o g e n ，a s p a r a g i n e 聚丙烯酰胺凝胶电泳( p o l y a c r y l a m i d eg e l e l e c t r o p h o r e s i s ) 聚合酶链式反应( p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n ) 核糖核酸( r i b o n u c l e i ca c i d ) 转速( r o t a t i o np e rm i n u t e ) 秒( s e c o n d ) 温度，苏氨酸，胸腺嘧啶( t e m p e r a t u r e ，t h r e o n i n e ， t h y m i n e ) 表格( t a b l e ) 紫外( u l t r a v i o l e t ) 缬氨酸，伏特( v a l i n e ，v o l t ) 体积比( v o l u m ep e rt o t a lv o l u m e ) p a r t sp e rm i l l i o n ，1 0 - 6 9 原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指 导下，独立进行研究所取得的成果。除文中已经注明引用的 内容外，本论文不包含任何其他个人或集体己经发表或撰写 过的科研成果。对本文的研究作出重要贡献的个人和集体， 均已在文中以明确方式标明。本声明的法律责任由本人承 担。 论文作者签名：孤园园e l 期：2 0 p t 方。 关于学位论文使用授权的声明 本人完全了解山东大学有关保留、使用学位论文的规定， 同意学校保留或向国家有关部门或机构送交论文的复印件 和电子版，允许论文被查阅和借阅；本人授权山东大学可以 将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索， 可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文和汇编本学位 论文。 ( 保密论文在解密后应遵守此规定) 论文作者签名：孤l 司j 訇导师签名 日期：衫反夕 山东大学硕士学位论文 1 1 甲羟戊酸简介 第一章绪论 1 甲羟戊酸 甲羟戊酸c 6 h 1 2 0 4 ( m e v a l o n i ca c i d ) ，又称3 ，5 二羟基3 一甲基戊酸，最初 是m e r c k 公司研究人员在酒精发酵废液中作为乳酸菌的乙酸替代因子被发现的， 最初称为二榭斗酸( d i v a l o n i ca c i d ) 1 】，后来田村学造又在日本清酒中作为火落 菌生长因子发现了这种物质，命名为火落酸( h i o t i ca c i d ) 。 p h 4 8 一 专 图1 1 1甲羟戊酸和甲羟戊酸内酯及其相互转化示意 甲羟戊酸呈油状，易溶于水和极性有机溶剂，其结构如图1 1 1 所示。在酸 性条件下容易内酯化，产生甲羟戊酸内酯c 6 h 1 0 0 3 ( m e v a l o n l a c t o n e ) 。甲羟戊酸 的3 位碳是一个手性碳，因此存在两种旋光异构体，但是存在于生物体内的天然 甲羟戊酸只有3 r 构型，生物体也只能利用r 一构型的甲羟戊酸。 甲羟戊酸是甲羟戊酸途径生成i p p 的中间代谢物质，因此是甾类、萜烯类 ( t e r p e n e ) 等类异戊二烯合成的重要中间体。在植物细胞培养过程中添加适量 的m v a ，可成倍地提高一些天然产物的产量。研究发现甲羟戊酸可以抑制人体 皮肤的老化，因此它可以用来制造化妆品。而它的手性碳原子能起到旋光作用， 预计它还可以广泛应用于抗菌素和光学材料的合成。 1 2 甲羟戊酸的合成 随着国内外生物技术的飞速发展，m v a 内酯的需求量越来越大，市场前景 广阔。有关合成m v a 内酯的文献已有多篇报道，有的采用酶法合成【2 】，有的利 1 0 山东大学硕士学位论文 用生物催化和化学催化相结合的方法合成 3 】，再就是用化学合成【4 】，在化学合 成中，有的合成路线较简洁，有的较为复杂。但是从总体上看，以上合成方法都 有共同的不足之处：原料难得，结构复杂，且成本较高，不适于大规模生产。并 且由于天然型甲羟戊酸内酯难于用化学法合成并在工业上生产，因此只有一种不 含旋光作用的合成外消旋混合物才被用作试剂销售于市场。 在生物细胞中甲羟戊酸是通过甲羟戊酸途径合成的，由乙酰辅酶a 经过三 步酶催化反应得到。合成产物只有一种3 r 型具有旋光性的甲羟戊酸，具有极大 的利用价值。因此生物法合成甲羟戊酸是非常有前景的。 日本旭电化工业公司最近成功地大量生产能起旋光作用的天然型甲羟戊酸 内酯，这在世界上还是首次，产品己开始销售于市场，价格每公斤2 0 0 万日元( 1 4 3 万r m b ) 。而目前的外消旋光混合物的价格仍然为每公斤4 0 0 万日元( 2 8 7 万 r m b ) 。 1 3 甲羟戊酸( w a ) 途径 m v a 途径是1 9 6 7 年首次被阐明的 5 】，它普遍存在于真核生物细胞，某些 古细菌，一些革兰氏阳性细菌，以及高等植物细胞质中 6 】。 甲羟戊酸途径是指由乙酰c o a 开始，经过乙酰辅酶a 硫解酶，3 羟基3 甲 基戊二酸单酰辅酶a ( h m g c o a ) 合酶和h m g c o a 还原酶等催化生成甲羟戊 酸，最后生成异戊二烯焦磷酸( i p p ) 的代谢途径，具体途径如图1 3 1 所示。 m v a 途径是一个非常重要的代谢途径，在许多细胞活动中都有重要作用，因为 它参与许多重要萜类的前体物i p p 的合成，是萜类生物合成的重要途径。 基因组分析显示，葡萄球菌，链球菌和肠球菌均拥有m v a 途径中的所有酶 基因 7 。系统发生和比较基因组分析结果显示，革兰氏阳性球菌中甲羟戊酸合 成途径的酶基因和其对应的哺乳动物基因有很大的差异性，推测革兰氏阳性球菌 中这些酶基因是由远古的真核细胞水平转移过去的 8 。 m v a 途径中有6 个酶参与，分别为：乙酰乙酰c o a 硫解酶( a c e t y l c o a a c e t y l t r a n s f e r a s e ，e c2 3 1 9 ) ，h m g - c o a 合酶( h m g s ，e c4 1 3 5 ) ，h m g - c o a 还原酶( h m g 凡e c1 1 1 3 4 ) ，甲羟戊酸激酶( m e v a l o n a t ek i n a s e ，m k ，e c 2 7 1 3 6 ) ，磷酸甲羟戊酸激酶( p h o s p h o m e v a l o n a t ek i n a s e ，m p k ，e c2 7 4 2 ) m 目 * ! 和甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶( d i p h o s p h o m e v a l o n a l ed e c a r b o x y i b s e ，m p d ，e c 41 i 3 3 ) 。编码这六个酶的基因对革兰氏阳性球菌的生存根重要，h m g c o a 合 酶等位替换实验造成菌体甲羟戊酸营养缺陷，若不加入甲羟戊酸，细胞虽然存活， 但不再生长f 9 ，lo 】。因此m 、r a 途径可以成为针对革兰氏阳性球菌的抗菌药的靶 点。 l 酰己酰辅 酪 谳姒一；c o 热z h 姒一一 强勰 嚣：义 图1 , 3 1 甲羟虎酸途径示意图 以粪链球菌( e n t e r o c o c c u s f a e c a l i s ) 为倒，e f a e c a l i s 利用m 、a 途径从乙酰 - c o a 生物合成异戊烯焦磷酸( i m p e n t c n y l 雌p l l o s p h a t e , i p p ) 用到的酶如表 13 t 所示。 表1 3 】f f a e c a l i s m v a 途径的酶基因信息 g 朗e ss i z e s h m g s ( l m g c o a1 1 5 2 b da c a c - c o p t + a c - c o a m v a s s y n t h a s e ) 3 8 3 船_ + 皿“g - c o a a a c t ( a c c t o a c c l y l - c o a 2 4 1 2 h d2a e - c o a 呻a c a e - c o a m v a e t h i o l a s e ) 8 0 3 a a m g c o a 呻m e v a l o n a t e h m g r 一一 一咒 斗聃 一 义 啪 一 弘 从 炊 山东大学硕士学位论文 ( h m g c o ar e d u c t a s e ) m k ( m e v a l o n a t e9 4 5 b p m v a k lm e v a l o n a t e _ m e v a l o n a t e p k i n a s e ) 3 1 4 a a m p k m v a k 2 ( p h o s p h o m e v a l o n a t e 1 1 0 7 b p m e v a l o n a t e p m e v a l o n a t e - p p 3 6 8 a a k i n a s e ) m p d ( m e v a l o n a t e 9 9 6 b p m e v a l o n a t e p p i p pm v a d d i p h o s p h a t e 3 3 2 a a d e c a r b o x y l a s e ) 在ef a e c a l i s 基因组中，这5 个酶存在于两个基因簇中，如图1 3 2 所示， 基因下方数字表示两个基因间的碱基数 8 】。注意m v a e 表达的基因产物是一个双 功能酶，同时行使乙酰乙酰c o a 硫解酶和h m g c o a 还原酶两种功能。 m v a km v a dm v a km v a sm v a e 一1 r 2黼bp p 匐懈i 一“2 4 1 2 b p 图1 3 2m v a 途径酶基因在e f a e c a l i s 基因中位置示意图 1 4 甲羟戊酸的检测 前面提到多数真核生物的萜类前体物的合成是通过甲羟戊酸途径来完成的， 因此甲羟戊酸是人类包括其他真核生物体内的普遍含有的物质 1 1 】。人类等高等 动物体内的甾类物质是通过甲羟戊酸途径合成的，实验证明，甲羟戊酸浓度的变 化和固醇合成息息相关 1 2 1 4 ，通过检测甲羟戊酸的浓度，可以获得固醇合成情 况的信息，因此甲羟戊酸在体内的浓度的检测可以作为很好的固醇合成的指示 剂，是临床上衡量血脂水平的重要手段 1 5 1 7 】。 顺应要求，检测甲羟戊酸的技术和手段也在不断发展。甲羟戊酸最初的检测 方法是日本的研究者在1 9 7 3 年提出的，将甲羟戊酸内酯化后，使用了薄层层析 和g c 的方法【l8 】。而之后用的最多的分析手段是g c m s 1 9 ，2 0 】，也有研究者 将甲羟戊酸衍生化后使用l c 和荧光检测 2 1 】。 山东大学硕士学位论文 2 1 简介 2 萜类物质 萜类化合物，也称为异戊二烯类化合物，是由异戊二烯为骨架的五碳单位异 戊二烯焦磷酸( i s o p e n t e n y lp y r o p h o s p h a t e ，i p p ) 和它的异构体二甲烯丙基焦磷 酸( d i m e t h y l a l l y lp y r o p h o s p h a t e ，d m a p p ) 通过侧链重复连接起来的一类化合 物，常称为类异戊二烯( i s o p r e n o i d s ) 。 异戊烯焦磷酸( i p p ) + 二甲烯丙基焦磷酸( d m a p p ) i i g 丹i 厶酶 上 栊牛儿二焦磷酸( g p p ) 兰堕堕全壁 单萜 法尼 栊牛 1 l 更高分子量的多碳化合物 二萜( 赤霉素) 图2 1 - 1 以i p p 和d m a p p 为底物生成种类多样的萜类示意图 甾体 类胡萝卜素) 萜类化合物在自然界中种类最为多样 2 2 ，2 3 】，存在于所有有机体中，有着 很重要的作用，是自然界中所有的生物体不可缺少的，现分离得到的大约有 5 5 0 0 0 多种产物，并且这个数字仍然在增长 2 3 ，2 4 】，其中包括哺乳动物的甾类激 素，植物中的色素( 类胡萝卜素) ，细菌中的泛醌或甲基奈醌类等电子载体物质， 以及通信和防御机制的中介物等 2 5 ，2 6 】。尤其广泛分布于植物及微生物初级代 谢物和次生代谢物中，其中某些萜类具有重要的药用价值，包括抗菌，消炎，抗 1 4 山东大学硕士学位论文 过敏、痉挛，抗高血糖，抗癌，以及免疫调节的作用 2 7 3 1 1 。如倍半萜中的青蒿 素 3 2 ，3 3 、双萜中的紫杉醇可分别作为抗疟疾、抗癌的有效药物 3 4 】。但是萜类 在生物体内的产量很低，在植物体内的含量往往只达到p p m 级另j j 3 5 ，而且分离 和纯化操作复杂 3 6 】。同时，由于化学合成方法收率低、成本高、毒性大，大大 限制了它们的应用。图2 1 1 展示了在生物体内，以这两个单体为骨架，可以生 成种类多样的萜类物质。 2 2 萜类种类 根据所含异戊二烯单位数目不同可分为半萜( 含一个异戊二烯单位) 、单萜、 倍半萜、双萜和三萜等。单萜和倍半萜多具有特殊香气的油状液体，在常温下可 以挥发，如柠檬醛、香茅草、樟脑、薄荷醇等，此类化合物多有止咳、平喘、解 热、抗菌消炎等作用；二萜和倍半萜多为结晶性固体，如青蒿素、维生素a 等； 三萜类多含有一些特殊生物活性；四萜化合物主要是胡萝卜烃类色素；多聚萜类 主要为橡胶。 单萜类化合物( m o n o t e r p e n e ) 有直链型、单环型、双环型三种类型。广泛分布 于高等植物的腺体、油室和树脂道等分泌组织中。单萜类的含氧衍生物( 醇类、 醛类、酮类) 具有较强的香气和生物活性，是医药、食品和化妆品工业的重要原 料，常用作芳香剂、防腐剂、矫昧剂、消毒剂及皮肤刺激剂。如樟脑有局部刺激 作用和防腐作用。另外许多研究表明，摄入某些单萜具有防癌抗癌的作用 3 7 4 0 ， n 羟基斑蝥胺( n h y d r o x y c a n t h a r i d i m i d e ) 具有抗癌活性。图2 2 1 为几种单萜结构。 香茅醇香叶醛1 薄荷醇薄荷酮樟脑1 龙脑斑蝥素 图2 2 1 各种单萜结构式 倍半萜类化合物( s e s q u i t e r p e n e ) 分为直链型、单环型、二环型、三环型和四 环型等，具有挥发性，其含氧衍生物具有较强的香气和生物活性。在植物中多以 山东大学硕士学位论文 醇、酮、内酯、苷类和生物碱形式存在。近年来在海洋生物中的海藻、海绵、腔 肠和软体动物中发现了大量的倍半萜类化合物。倍半萜内酯具有抗炎、解痉、抑 茵、强心、降血脂和抗肿瘤等药理活性。从黄花蒿( a r t e m i s i aa n n u a 三) 中分离 到的青蒿素具有很强的抗疟原虫的生物活性，临床上用于治疗恶性疟疾 3 4 】。其 经结构改造的半合成衍生物双氢青蒿素、蒿甲醚、青蒿琥珀酸单酯等具有抗疟效 价高、原虫转阴快、速效、低毒等特点，现己制成多种制剂应用于临床。图2 2 2 是三种倍半萜结构式。 青蒿素双氢青蒿素a 山道年 图2 2 2 几种倍半萜萜结构式 二萜类化合物( d i t e r p e n e ) 几乎都呈环状。广泛分布于植物分泌的乳汁、树脂 中，松柏科植物多含有二萜类化合物，另外海洋生物、菌类代谢产物也分离到许 多二萜类化合物。二萜的含氧衍生物具有多方面的生物活性，如维生素a ( v i t a m i n a ) 与眼睛的视网膜内的蛋白质结合生成光敏感色素，是保持夜间正常视力的必须 物质。紫杉醇( t a x 0 1 ) 是从红豆杉等植物中分离到的抗肿瘤化合物，临床上用于治 疗卵巢癌、乳腺癌和肺癌。银杏内酯类化合物具有抑制血小板活化因子的药理作 用。 2 3 萜类合成 所有生物体的萜类都是由i p p 和d m a p p 五碳骨架衍生而来的，每种萜类物 质都是通过由不同的异戊二烯单体重复数，经过连接，环化，或者重排，和碳骨 架的进一步氧化反应而生成 2 5 ，4 1 】。在自然界中，有机体合成这两个五碳单体 除了通过上节介绍的甲羟戊酸途径( m v a 途径) 之外，在大多数真细菌，绿藻， 某些古细菌，动物，以及高等植物的叶绿体中 6 ，9 】，还新发现了另外一条甲基 赤藓糖醇磷酸途径( m e p 途径) ，也被称为d x p 途径( 脱氧木酮糖5 磷酸途径) 1 6 m 末大学碗学位论文 【心4 3 。一般一种生物体内只存在这两条途径中的一条，但是植物同时利用这 两条途径合成萜类前体，继而生成各种单萜、类胡萝h 素、脱落酸、赤霉素、叶 绿素、维生素e 、叶绿醌、质体醌等州】。 丙酮酸r甘油! - - r p 、t 一引殳一。 脱氧木酮糖导磷酸 ( d x p l 异戊烯焦磷酸 。，。燃彩o 。 ，乏三苎耋耋糖醇4“z 。 2 e lj m 。2 甲基赤藓糖 m 、； 。i i 、，、j 。够。、 “。八、m “。人入 d x p 途径如图2 + 31 所示，总共包括六步酶催化反应。起始于丙酮酸和3 磷酸甘油醛在脱氧木酮糖- 5 - 磷酸合成酶催化下生成脱氧木酮糖一5 一磷酸由脱氧 木酮糖- 5 - 磷酸还原异构酶继续催化生成2 甲基赤藓糖醇_ 4 焦磷酸，后者被2 甲 基赤藓糖醇4 - 焦磷酸合成酶催化为2 甲基赤藓糖醇4 胞苷二磷酸，2 甲基赤藓 糖醇_ 4 一二磷酸激酶催化2 - 甲基赤藓糖酵4 胞昔= 磷酸转化为2 磷酸2 甲基赤薛 糖醇- 4 一胞苷二磷酸，后者经2 甲基赤藓糖醇- 2 ，4 - 环焦磷酸合成酶作用生成2 甲基赤藓糖醇2 。4 _ 环焦磷酸【4 5 】。大肠杆菌就是利用d x p 途径来生产 p p 和 d m a p p ( d i m e t h y i a i l y ld i p h o s p h a t c ) 。 k p 一 靛 斗髓 山东大学硕士学位论文 3 1 代谢工程 3 代谢工程手段在甲羟戊酸途径中的应用 代谢工程( m e t a b o l i ce n g i n e e r i n g ) ，也称途径工程( p a t h w a ye n g i n e e r i n g ) ， 是指利用d n a 重组技术，有目的的改造活细胞体内的代谢网络，从而大量生产 某种目的产物的一种手段 4 6 ，4 7 】。常用的代谢工程的手段可分为三种：( 1 ) 引 入外源目的产物合成基因，使宿主体内最终前体物质转化成目的产物；( 2 ) 增强 某途径的代谢流，从而增加最终前体物的产量，这可用两种方法来实现：加快速 率限制反应和消除反馈抑制；( 3 ) 减少流向其他生物合成方向的代谢流，从而增 加前体物的产量。 利用代谢工程改造细胞m v a 代谢途径为提高萜类产量提供了一个很好的操 作平台，国内外己取得了很大进展。 3 2w a 途径代谢工程研究进展 萜类的代谢工程研究常在大肠杆菌和酵母中进行。植物中的操作也取得了一 些进展，主要是内源性操作。下面将分别概述这方面的研究进展。 3 2 1 细菌m v a 代谢工程 这里主要指在大肠杆菌中的代谢工程。大肠杆菌本身没有m v a 途径，它通 过前面提到的d x p 途径合成萜类物质，但是合成量非常少。萜类化合物的生产 受到一些因素的限制，体内异戊二烯合成的前体物质的缺乏就是一个重要的限制 因素，将m v a 途径中的一系列关键酶基因转入大肠杆菌中，可构建一条新的代 谢路径，生成萜类物质前体i p p 4 8 】，而且关键酶基因活性的强弱直接影响生成 产物的含量 4 9 】。增加基因的拷贝数，可为萜类合成提供更多的前体物质。 m a r t i n 等为了防止大肠杆菌自身基因的控制机制干扰，在大肠杆菌中导入包 括m v a 途径的1 0 个来自植物、真菌和其它细菌的基因，加上经过密码子改造 后人工合成的紫穗槐二烯合酶基因，重建了一个完整而自主的植物异戊二烯代谢 途径，最终生成青蒿素合成的前体物紫穗槐二烯，产率达到2 4 烬石竹烯当量 山东大学硕士学位论文 m 1 1 3 4 】。 经代谢工程改造后的大肠杆菌所生成的萜类化合物的产量与环化酶的种类、 宿主菌、表达载体、培养基等条件也存在一定关系。m a r t i n 等 2 0 】将杜松烯合酶、 马兜铃烯环化酶等基因导入大肠杆菌，分别采用阿拉伯糖诱导启动子和i p t g 诱 导启动子融合的表达载体，比较在3 种培养基( l b 、2 x y t 、m 9 + 0 2 甘油培养 基) 及不同生长温度条件下倍半萜的产量，表明以仃c 启动子引导的高拷贝质粒 t r c 9 9 a 为载体转化d h 5 a 菌株，并在含0 2 甘油的m 9 培养基中生长时，倍半 萜的产量最高；不同的基因表达量最高时的最适温度也各不同。 h i s a s h ih a m d a 等把来自于链霉菌的m v a 途径克隆到大肠杆菌中，然后转入 了a 蛇麻烯合酶，番茄红素合成酶系等，均检测到了目的产物的生成 5 0 】。 3 2 2 酵母m v a 代谢工程 与大肠杆菌相比较，酵母具有更为活跃的异戊二烯代谢功能，在细胞膜中有 大量的三萜类物质麦角固醇积聚。 y a m a n o 等在酿酒酵母中导入细菌类胡萝卜素合成关键酶基因后，能使原本 流向麦角固醇的代谢流部分转向类胡萝卜素的合成 5 1 】。j a c k s o n 等将青蒿的雪松 醇合酶基因表达在酿酒酵母中，野生型酵母体内固醇合成代谢途径生成的f p p 在外源萜类合酶的作用下生成酵母中不存在的萜类雪松醇，发现在f p p 前体产 量高的菌株中产物产量更高 5 2 】。 增加酵母内异戊二烯途径中关键酶基因的拷贝数，可导致其终端产物的产量 提高，但仅此操作并不一定能达到体内增加有用萜类产量的目的。h m g c o a 还 原酶是m v a 途径中的关键酶，c 端为催化域，n 端跨膜域和酶的稳定性有关。 p o l a k o w s k i 等将n 端切除掉的h m g c o a 还原酶基因表达在酵母中，引起固醇 合成前体鲨烯类的大量生成，而麦角固醇和其它固醇类复合物并无增$ 1 1 4 6 。 s h i m a d a 等在产朊假丝酵母( c a n d i d au t i l & ) 中转入类胡萝卜素( 番茄红素) 合成的3 个关键酶基因c r t e 、c r t b 和c r t i ，在本无番茄红素合成的酵母中生成番 茄红素，产量为1 1m g g ( 干重) ，同时酵母内源性产物麦角固醇的积累量显著低 于对照( 降低一半) ；当转入h m g c o a 还原酶基因，提高其拷贝数时，番茄红